Allgemeines Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion

Überstandes werden in ein neues, mit 1ml “Zeitsparalkohol“ [Lösung aus absolutem Alkohol und 1/20 Volumenteil Natrium-Acetat-Lösung (3 mol, pH 5,2)], gefülltes Eppendorfreaktionsgefäß pipettiert. Die Lösung wird vorsichtig etwa 5-10 Minuten geschwenkt, bis die DNA ausgefällt und keine Schlieren mehr in der Lösung zu erkennen sind. Die Lösung wird dann für 30 Minuten bei –30°C gekühlt und nochmals bei RT für 15 Minuten mit 13000 rpm zentrifugiert. Der alkoholische Überstand wird verworfen und das Pellet zweimal mit 70% Alkohol gewaschen. Die gefällte DNA wird nochmals 10 Minuten bei 13000 rpm und RT zentrifugiert und das Eppendorfreaktionsgefäß samt Inhalt für ca. 5 Minuten auf einer Reinraumbank getrocknet. Das getrocknete Pellet wird mit 500µl Tris-Puffer-Lösung, die als RNA spaltendes Enzym für eventuell eingeschleppte RNA 1 µl RNase A enthält, resuspendiert und über Nacht bei 50°C im Wasserbad inkubiert. Die fertige Lösung wird bis zur weiteren Verwendung bei 5-8°C im Kühlschrank portioniert gelagert.

3.9.4 Allgemeines Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion

Form eines zum Matrixstrang komplementären Oligonukleotids mit einem freien 3‘-Hydroxylrest vorhanden sein. Diese Primer können komplementär an die DNA, die als Zielsequenz amplifiziert werden soll, binden. Die Ziel-DNA

[Template] kann unterschiedlicher Herkunft sein und in Form genomischer DNA [cDNA] oder klonierter DNA als Template eingesetzt werden. Als drittes werden Desoxyribonukleotidtriphosphate [dATP, dGTP, dCTP, dTTP] in ausreichender Konzentration benötigt.

Eine thermostabile DNA-Polymerase führt den Schritt der DNA-Synthese durch.

Sie verlängert die Primer in 3’-Richtung komplementär zum DNA-Template.

Zuerst entstehen an beiden Enden der Zielnukleinsäuresequenz kurze

Hybriddoppelstränge zwischen Ziel-DNA und Primer [Annealing]. An diesen Startsequenzen beginnt die zugegebene DNA-Polymerase mit der Transkription – Extension – eines zum jeweiligen DNA-Strang komplementären neuen Stranges und kann über den ganzen Nukleinsäureabschnitt hinaus fortfahren. Nach der dafür veranschlagten Reaktionszeit bricht man die DNA-Synthese ab und denaturiert erneut die DNA. Die neuen Stränge aus dem ersten Zyklus sind an ihrem 5’-Ende durch die Primer eindeutig begrenzt, während das 3’-Ende eine variable Länge aufweist. Ab dem zweiten Zyklus entstehen an diesen DNA-Abschnitten erstmals Amplifikate, die in ihrer Länge exakt durch die beiden Primer definiert sind. Bei jeder Abfolge von Denaturierung, Annealing und Extension wird der durch die Primer definierte Nukleinsäureabschnitt verdoppelt.

Da die entstandenen Produkte wiederum Substrate des nächsten Zyklus sind, kommt es zu einer theoretisch exponentiellen Mengenzunahme der Zielsequenz.

Dabei nimmt die Menge der beidseitig genau begrenzten Produkte, die ab dem zweiten Zyklus erscheinen, annähernd exponentiell zu, während die einseitig und damit weniger genau begrenzten Produkte nur linear mit der Anzahl der Zyklen

anwachsen. Die DNA-Polymerasen, deren Temperaturoptimum in den meisten Fällen zwischen 68-75°C liegt, entdeckte man in thermophilen Bakterien, die vorzugsweise in heißen Quellen leben. Die Standard-DNA-Polymerase, die auch heute noch am häufigsten für die PCR verwendet wird, ist die Taq-Polymerase aus Thermophilus aquaticus [Temperaturoptimum: 72°C].

Für einen PCR-Ansatz benötigt man neben einem Template, den Primern und der DNA-Polymerase auch einen auf das Enzym abgestimmten Puffer sowie einen Nukleotidmix, der die vier verschiedenen Desoxynukleotidtriphosphate [dATP, dCTP, dGTP, dTTP] enthält. Diese einzelnen Komponenten werden nun in den für die Reaktion optimalen Konzentrationen in einem

Eppendorf-Reaktionsgefäß vereinigt. Die Reaktion startet man in einem "Thermocycler", der eine zyklische Abfolge der einzelnen Reaktionsschritte erlaubt. Durch die Zugabe weiterer Chemikalien wie DMSO, MgCl2, Betain oder Triton X-100 kann eine Erhöhung der PCR-Produktmenge erreicht sowie die Synthese unspezifischer Amplifikate verhindert werden.

Der Reaktionszyklus, der ca. 25-35 mal wiederholt wird, startet im allgemeinen mit einem Denaturierungsschritt. Hierbei wird die Template-DNA bei 92° bis 94°C für eine bestimmte Zeit [30-60 sec] erhitzt. Dieser Schritt dient der

Auftrennung des DNA-Doppelstrangs in die komplementären Einzelstränge, die nun als Matrize für das Amplifikat eingesetzt werden. Der folgende zweite Schritt ist durch eine vorübergehende Abkühlung der Reaktion charakterisiert. Hierbei binden die Primer in Minutenbruchteilen bei Temperaturen von 37° bis 72°C an die antiparallelen 5’-Enden des Amplifikates ["Primerannealing”]. Die Temperatur sollte unterhalb der Schmelztemperatur der Primer liegen, aber hoch genug sein, daß die Primer an ihre spezifische Zielsequenz binden, denn mit der Temperatur

kann die Spezifität der Reaktion gesteuert werden. Durch die Wahl einer zu niedrigen Temperatur ist eine Hybridisierung an eine nicht perfekt passende, aber genetisch verwandte Matrix-DNS möglich. Die Primerbindungsstellen werden möglichst so ausgewählt, daß sie einen Guanin-Cytosin-Gehalt von etwa 50% bis 60% aufweisen. Dies gewährleistet, daß man die Temperatur für das Annealing, also die Stringenz für die Hybridisierung der Primer an den Matrixstrang, relativ hoch wählen kann, was wiederum die Spezifität der Amplifikation gewährleistet.

Zu beachten ist auch, daß Primer weder zu sich selbst noch innerhalb eines Primerpaares längere, komplementäre Basenabfolgen tragen. Existieren längere, komplementäre Basenabfolgen in einem Primerpaar, so entstehen gehäuft Primer-Dimere und der Amplifikationsfaktor sinkt. Der nächste Schritt dient der

eigentlichen DNA-Synthese. Die sogenannte Extensionstemperatur sollte dem Temperaturoptimum der DNA-Polymerase entsprechen. Die Extensionszeit muß der Größe der Ziel-Sequenz angepaßt werden [1 min pro Kilobase (kb)]. Nach Vervollständigung der Stränge beginnt der Zyklus von neuem.

Diesem PCR-Grundschema wird häufig noch ein finaler Verlängerungsschritt [1 x 5-10 min] angehängt. Auch kann die Reaktion mit einem einmaligem

Denaturierungschritt gestartet werden [1 x 2-3 min]. Aufgrund der Abnahme der Aktivität der DNA-Polymerase mit zunehmender Reaktionsdauer kann trotz theoretischer Verdopplung der DNA pro Zyklus praktisch kein exponentieller Anstieg der DNA-Menge erreicht werden. Eine 106-107 fache Anreicherung stellt im allgemeinen die durchschnittliche Vermehrungsrate dar.

Falls nach einer PCR mit 30 bis 40 Zyklen noch nicht genügend DNA vorliegt, kann eine zweite PCR, aufbauend auf dem Produkt der ersten, angeschlossen werden. Dabei hat es sich bewährt, neue Primerbindungsstellen für “nested“

Primer etwas innerhalb der Enden des initial amplifizierten DNA-Abschnittes zu wählen. Da hier zusätzlich auch die inneren „nested“ Primer spezifisch an die DNS-Matrix hybridisieren müssen, um ein Produkt der erwarteten Länge zu ergeben, wird bei einem solchen Vorgehen nicht nur die Sensitivität erhöht, sondern auch gleichzeitig die Spezifität der Verfahrens verbessert (117).