4. DISKUSSION
4.2 Zur allgemeinen Immunzellrekonstitution
Ein entscheidendes Therapieprinzip der allogenen SZT stellt die Etablierung eines durch Spenderlymphozyten getragenen Immunsystems im Empfänger dar. Im Rahmen der Konditionierungsprotokolle wird ein Großteil des Empfängerimmunsystems vor der Transplantation zerstört. Über einen langen Zeitraum nach der Transplantation (mindestens bis zu 180 Tagen) muss eine medikamentöse Immunsuppression verabreicht werden, um eine Abstoßung des Transplantates durch Empfängerlymphozyten sowie eine akute schwere GvHD zu verhindern. Nach Ausbildung eines vollständigen Spenderchimärismus stammen die Immunzellen letztlich nur vom Spender und es besteht im günstigsten Falle eine Toleranz zwischen Empfänger und Spenderzellen. (siehe 1.1)
Einfluss der Patientencharakteristika. Die PBSCT geht im Vergleich zur BMT aufgrund ihrer hohen Zahlen kotransplantierter CD34+ Stammzellen und CD3+ T-Lymphozyten mit einem schnelleren Engraftment und beschleunigter zellulärer Immunrekonstitution einher.
[Ottinger et al. 1996; Storek et al. 2001] In vielen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die transplantierte Dosis der CD34+ Stammzellen und CD3+ T-Lymphozyten dafür ausschlaggebend sind. [Baron et al. 2005; Carvallo et al. 2004; Zaucha et al. 2001] Sowohl in der BMT [Mavroudis et al. 1996] als auch in der allogenen PBSCT [Przepiorka et al.
1999] verringern höhere Stamm- und T-Zelldosen durch schnelleres Engraftment und geringeres GvHD-Risiko die Therapieassoziierte Mortalität (TRM).
Die Patienten beider Gruppen erhielten vergleichbare Mengen an hämatopoetischen Stamm- und T-Zellen bezogen auf das Empfängerkörpergewicht. (siehe 3.1) Auch die vor Beginn der Therapie bei den Patienten ermittelten Werte für die unterschiedlichen Immunzellen waren im Median ohne signifikanten Unterschied in beiden Gruppen gleich verteilt. (siehe 3.3)
Zusätzlich nimmt auch das Konditionierungsschema wesentlichen Einfluss auf die Immunrekonstitution nach allogener SZT mit schnellerer Erholung der Immunzellen nach dosisreduzierter Konditionierung. [Carvallo et al. 2004] Hinsichtlich der Konditionierung (Standard vs. RIC) zeigten die Patienten ebenso eine Gleichverteilung. (siehe 2.1.2)
Somit waren insgesamt die Ausgangsbedingungen und Patientencharakteristiken bezüglich wichtiger grundlegender Einflussfaktoren auf die zelluläre Immunrekonstitution gut vergleichbar, was insbesondere in Anbetracht der kleinen Fallzahl von entscheidender Bedeutung ist.
Einflussfaktoren auf die Rekonstitution der CD45+ Leukozyten. Die CD45+ Leukozyten erholten sich im Verlauf der Beobachtung deutlich schneller in der Kein Antikörper-Gruppe. An allen Messtagen zeigten die ATG-Patienten deutlich geringere Leukozytenzahlen, obwohl beide Patientengruppen ähnliche Ausgangsniveaus aufwiesen.
Die CD14+ Monozyten und neutrophilen Granulozyten boten eine schnelle Rekonstitution.
Bereits sehr früh nach der SZT waren für beide Zellpopulationen normale Zellzahlen nachweisbar. Bis Tag +150 stellten sich in der ATG-Gruppe zunehmend geringere monozytäre und granulozytäre Zellzahlen als in der Kein Antikörper-Gruppe ein, wobei letztere einen signifikanten Unterschied an diesem Messtag aufwiesen. (siehe 3.3.1)
Monozyten und neutrophile Granulozyten rekonstituieren nach einer allogenen SZT am schnellsten und etablieren somit bereits in der frühen Rekonstitutionsphase das neue unspezifische Immunsystem im Empfänger. Die Lymphozyten hingegen zeigen in der frühen Rekonstitutionsphase eine ausgeprägte Zytopenie, die sich nur langsam erholt.
[Auffermann-Gretzinger et al. 2002; Chklovskaia et al. 2004; Storek et al. 2001] Da die Leukozyten neben den Monozyten und Granulozyten auch die Lymphozyten mit einem Anteil von 20 bis 40 % einschließen, handelt es sich bei den starken Unterschieden in der Rekonstitution der Leukozyten zwischen beiden Gruppen am ehesten um einen Summationseffekt. Aufgrund ihrer vielfältigen Wirkmechanismen und Polyklonalität bedingen ATGs eine ausgeprägte Depletion aller Leukozytensubpopulationen, einschließlich der Monozyten und Granulozyten, was die geringeren Werte in der ATG-Gruppe über den gesamten Verlauf mit zunehmendem Unterschied gegen Ende des Beobachtungszeitraumes erklären könnte. (Tab. 25)
Tab. 25: Übersicht der bisher bekannten Zielantigene von ATG.
Dargestellt sind die drei Hauptsäulen der Wirkungsweise von ATG und die ihnen zugeordneten Zielantigene. Bei den Oberflächenepitopen CD3/ TCR und CD152 handelt es sich um T-zell-spezifische Antigene. Die Epitope CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD25 und CD28 werden nicht ausschließlich, aber vorwiegend von T-Zellen exprimiert. CD2 findet sich auf NK-Zellen, CD25 auf B-Lymphozyten und Monozyten. Monozyten exprimieren außerdem die Antigene CD11a/ b, CD16, LFA, CD32 den Panleukozytenmarker CD45. LFA (Leukocyte Function associated Antigen), ICAM (Intracellular Adhesion Molecule), VLA (Very Late Antigen = Integrine, Liganden für VCAM [Vascular Adhesion Molecule]), LPAM (Lymphocytic Adhesion Molecule), CCR und CXCR (Chemokinrezeptoren) [Mohty 2007]
Auslösung einer Immunantwort
Zelladhäsion und Zellinteraktion
Heterogene Pathways (Entzündung, Apoptose,
Proliferation)
CD1a CD11a/ CD18 (LFA-1) CD2
CD3/ TCR CD44 CD5
CD4 CD49/ CD29 (VLA-4) CD6
CD6 CD50 (ICAM-3) CD11b
CD7 CD51/ 61 CD29
CD8 CD54 (ICAM-1) CD38
CD16 CD56 CD40
CD19 CD58 (LFA-3) CD45
CD20 LPAM-1 (Integrin alpha4beta7) CD95
CD25 CD102 (ICAM-2) CD126
CD28 CD195 (CCR5) CD138
CD30 CD197 (CCR7)
CD32 CD184 (CXCR4)
CD40
CD80
CD86
CD152 (CTLA-4)
HLA Klasse I
HLA Klasse II
Beta2-M
Einflussfaktoren auf die Rekonstitution der CD16/56+ NK-Zellen. Die CD16/56+ NK-Zellen gehören zum angeborenen Immunsystem, welches sich nach einer SZT wesentlich schneller erholt als das adaptive. In der frühen Rekonstitutionsphase sind sie die ersten Lymphozyten, die bereits nach ungefähr zehn bis vierzehn Tagen nachgewiesen werden können und erreichen in der Regel innerhalb des ersten Monats erneut normale Zellzahlen.
Nach zwei weiteren Monaten bilden sie die größte Lymphozytensubpopulation, bis später erneut die T-Zellen des adaptiven Immunsystems dominieren. [Chklovskaia et al. 2004;
Eyrich et al. 2003; Vitale et al. 2000]
In den vorliegenden Untersuchungen zeigten die NK-Zellen einen ähnlichen Verlauf in beiden Patientengruppen. Diese Zellpopulation verhielt sich bezüglich ihrer Zellzahlen über den gesamten Beobachtungszeitraum am stabilsten in beiden Patientengruppen.
Bereits ab Tag +30 lagen die NK-Zellzahlen wieder innerhalb des Normbereiches. (siehe 3.3.2) Dementsprechend waren letztlich anhand der vorliegenden Ergebnisse keine Unterschiede zwischen beiden Gruppen zu erkennen.
Über einen eventuellen Einfluss von ATG auf die Rekonstitution der NK-Zellen ist aktuell nur wenig bekannt. Während einige Daten einen Effekt von ATG auf die NK-Zellzahlen verneinen [Giebel et al. 2005], wurde im Gegensatz dazu in anderen Analysen ein stark unterschiedlicher Einfluss verschiedener ATG-Typen auf die NK-Zellen angedeutet [Penack et al. 2007].
Zwar ist außerdem bekannt, dass die polyklonalen ATGs die Epitope CD2, CD16 und CD56 auf der Oberfläche von NK-Zellen erkennen und binden können. (Tab. 25) Jedoch weisen die vorliegenden Daten darauf hin, dass ATG als Teil der Konditionierungstherapie vor allogener SZT zumindest in dieser kleinen Patientenpopulation keinen relevanten Einfluss auf die NK-Zellrekonstitution zu haben scheint. Das unspezifische Immunsystem etablierte sich in allen acht Patienten sehr schnell bereits in der frühen Rekonstitutionsphase (Tag +30 bis +60). Ein geringfügiger Einfluss von ATG auf NK-Zellen kann letztlich anhand der kleinen Fallzahl der vorliegenden Untersuchung jedoch nicht sicher beurteilt werden.
Einflussfaktoren auf die Rekonstitution der CD19+ B-Zellen. Die CD19+ B-Zellen erwiesen sich während der gesamten Posttransplantationsphase als schwer nachweisbar, so dass für die ATG-Gruppe keine verwertbaren Zahlen vorliegen. (siehe 3.3.3) Aufgrund methodischer Grenzen war in vielen Fällen eine valide Quantifizierung der CD19+
B-Im Großteil der Blutproben aus der ATG-Gruppe waren nicht genug B-Zellen vorhanden, so dass die Antikörper aufgrund ihres Überschusses keine optimale Bindung mit den Oberflächenepitopen eingehen konnten und folglich in der FACS-Analyse kaum messbare Signale vorlagen.
Ähnliche Beobachtungen wurden bereits mehrfach beschrieben. In den ersten zwei Monaten der frühen Rekonstitutionsphase nach der Transplantation sind B-Zellen in der Peripherie kaum nachweisbar. Erst mit einer Verzögerung von ungefähr ein bis zwei Jahren erreichen sie erneut normale Zellzahlen. Diese liegen dann oft sogar oberhalb des Normbereiches. [Hong et al. 2008; Kook et al. 1996; Storek et al. 1993]
Als eine entscheidende Ursache für die oben beschriebene Beobachtung kann die Polyklonalität der ATGs angesehen werden. ATGs erkennen unter anderem die B-Zell-spezifischen Oberflächenproteine CD19 und CD20 sowie die Epitope CD40, CD 80, CD30, CD38 und CD95, was die starke B-Zelldepletion in der ATG-Gruppe erklären könnte. [Pistillo et al. 2002; Rebellato et al. 1994; Zand et al. 2005] Weiterhin ist bekannt, dass ATGs sowohl naive, aktivierte B-Zellen [Zand et al. 2005] als auch von den B-Zellen abstammende Myelomzellen [Timm et al. 2006] effektiv in eine komplementunabhängige Apoptose führen können. Vergleichende Untersuchungen zwischen ATG- und nicht-ATG-haltigen Therapieschemata hinsichtlich der B-Zellentwicklung fehlen.
Für eine ausreichend valide Interpretation des Einflusses von ATGs auf die B-Zellrekonstitution nach allogener SZT werden letztlich größere Fallzahlen vonnöten sein, wenngleich sich eine prospektive Analyse der B-Zellzahlen in der frühen Rekonstitutionsphase auch in naher Zukunft aufgrund methodischer Limitierungen wahrscheinlich als schwierig erweisen wird.
Einflussfaktoren auf die Rekonstitution der CD3+ T-Lymphozyten. In den vorliegenden Untersuchungen konnte eine stark verzögerte Rekonstitution der CD3+ T-Lymphozyten festgestellt werden, welche sich über den gesamten Beobachtungszeitraum bis Tag +150 erstreckte. Die CD8+ cT-Zellen erholten sich in beiden Patientengruppen schneller als die CD4+ Th-Zellen und erreichten bis Tag +150 normale Werte. Bei mit ATG behandelten Patienten waren deutlich weniger CD4+ T-Zellen nachweisbar, wobei der Unterschied zur Kontrollgruppe an den Tagen +60, +90 und +150 statistische Signifikanz erreichte. Die rasche Rekonstitution der cT-Zellzahlen bei konstant niedrigen Th-Zellzahlen bedingte eine invertierte CD4/ CD8-Ratio, welche in beiden Gruppen bis zum Ende der Beobachtung nachweisbar blieb. (siehe 3.3.4)
Die oben beschriebene Dynamik der T-Zellrekonstitution deckt sich mit zahlreichen Untersuchungen anderer Forschungsgruppen. Die Lymphozytenzahlen erreichten in einer Vielzahl der Fälle erst zwei Jahre nach der Transplantation stabile Normwerte. [Eyrich et al. 2003; Kook et al. 1996; Pavletic et al. 1998; Tayebi et al. 2001]
Für die starke Verzögerung der Zellrekonstitution wird unter anderem eine gestörte T-Zellreifung im Thymus verantwortlich gemacht. Diese ist zum Einen Folge des physiologischen Involutionsprozesses im Erwachsenenalter. Zum Anderen entsteht sie im Rahmen einer Konditionierungstherapie und durch weitere Faktoren wie zum Beispiel ausgeprägten Zytokinmangel. Im Thymus reifen die zuvor aus dem Knochenmark eingewanderten Progenitor-T-Zellen und emigrieren nach erfolgreicher positiver und negativer Selektion als naive T-Zellen in die Peripherie. Dort werden sie unter anderem durch direkten Antigenkontakt aktiviert [Haynes et al. 2000]
Auch auf einem anderen Weg kann es zu einer T-Zellregeneration nach allogener SZT kommen: der so genannten „homöostatischen peripheren Expansion“ (HPE), in deren Rahmen durch eine klonale Vermehrung in der Peripherie Klone aus reifen T-Zellen des Spenders entstehen. [Mackall et al. 1995; Mackall und Gress 1997]
Es wird angenommen, dass die frühe T-lymphozytäre Rekonstitution nach allogener SZT zunächst auf einer klonalen Expansion reifer Spender- oder Empfänger-T-Zellen in der Peripherie beruht und erst später eine erneute zusätzliche Lymphopoese im Thymus einsetzt. Larosa et al. konnten dementsprechend zeigen, dass in ihren Untersuchungen die rekonstituierten CD8+ cT-Zellen aus der Peripherie stammten und am ehesten durch klonale Expansion aus reifen T-Zellen entstanden waren. [Larosa et al. 2005] Einige Faktoren, welche die HPE beeinflussen, wurden bereits identifiziert, so zum Beispiel die Zytokine IL-7 [Fry et al. 2003; Rosenberg et al. 2006] und IL-15 [Anichini et al. 2003; Li et al. 2005] als wichtige fördernde Faktoren. Des Weiteren konnte den regulatorischen T-Zellen ein die T-Zellrekonstitution behindernder Effekt zugeordnet werden [Shen et al.
2005], was auf deren Produktion des direkten IL-15-Antagonisten Transforming Growth Factor Beta (TGF-β) zurückgeführt werden könnte [Ahmadzadeh und Rosenberg 2005;
Lucas et al. 2006; Lucas et al. 2000; Zheng 2008].
Vor dem Hintergrund dieser Erkenntnisse ist zu diskutieren, ob ein erhöhtes Treg -Vorkommen nach ATG-Gabe, wie es in dieser Pilotstudie beobachtet wurde und in der weiteren Diskussion noch eingehend betrachtet wird, demnach zu einer verzögerten Regeneration von CD4+ Th- und CD8+ cT-Zellen geführt haben kann. (siehe 3.3 und 3.4)
Der Einfluss von ATG. Die in dieser Studie beobachteten signifikanten Unterschiede der T-Zellzahlen sind jedoch zu allererst der depletierenden Wirkung der ATG-Präparate zuzuschreiben. (siehe 1.2) Sie haben eine stark T-zelldepletierende Wirkung und können somit die T-lymphozytäre Immunrekonstitution deutlich verzögern. Die T-Zelldepletion stellt dabei den bisher am besten untersuchten Wirkmechanismus der ATGs dar. Bei den Oberflächenepitopen CD3/ TCR und CD152 handelt es sich um T-zellspezifische Antigene. Die Epitope CD2, CD4, CD5, CD6, CD8, CD25 und CD28 werden ebenfalls nicht ausschließlich, aber vorwiegend von T-Zellen exprimiert. (Tab. 25) ATGs bedingen zudem eine dosisabhängige Abnahme der T-Zellzahlen sowohl im peripheren Blut als auch in peripheren lymphatischen Organen und der Milz, wobei der Thymus ausgespart zu bleiben scheint. [Preville et al. 2001]
Die unterschiedlichen Quellen zur Herstellung der ATGs scheinen ebenso Auswirkungen auf die zelluläre Immunrekonstitution zu haben. [Penack et al. 2007] Während ATG-G aufgrund seiner Herstellung aus nativen humanen Thymozyten eine größere Anzahl an Oberflächenantigenen erkennt und eine ausgedehntere Depletion erreicht, ist ATG-F insbesondere gegen aktivierte T-Zellen gerichtet. Ein Grund dafür liegt darin, dass die zur Herstellung verwendeten Jurkat-Zellen einer lymphozytären Tumorzelllinie entstammen.
Des Weiteren resultieren die meisten verfügbaren in vitro-Daten zu den Wirkmechanismen bisher aus Untersuchungen mit ATG-G. [Craddock 2008; Mohty 2007] Aufgrund der geringen Fallzahl der vorliegenden Untersuchungen und der Tatsache, dass die beiden ATG-Typen mit je zwei Patienten in der ATG-Gruppe gleich verteilt waren (siehe 2.1.2), wird in den weiteren Betrachtungen keine Trennung der beiden ATGs vorgenommen.
Außerdem deuteten Penack et al. in ihren Untersuchungen an, dass der Unterschied zwischen beiden ATGs bezogen auf die zelluläre Immunrekonstitution nicht so groß zu sein scheint wie bisher vermutet, wenngleich die Autoren speziell über Treg in ihren Untersuchungen jedoch keine Aussagen machten. [Penack et al. 2007]
Nach einer ATG-Infusion nimmt ihre Konzentration im Sinne eines einfachen exponentiellen Abfalls im Serum allmählich ab und zeigt eine lange Halbwertszeit von durchschnittlich 30 Tagen im menschlichen Blutplasma. [Bunn et al. 1996] Zusätzlich wurde festgestellt, dass selbst fünf Wochen nach Transplantation zwar noch immer ATG-Moleküle im Serum nachgewiesen werden können. [Remberger und Sundberg 2005]
Jedoch wurden diese Untersuchungen mit Hilfe von Enzymgekoppelten Radio-Absorptions-Assays (ELISA) durchgeführt, einer Methode, welche auch inaktive Antikörper detektiert und somit sehr wahrscheinlich falsch-hohe Ergebnisse liefert.
Waller et al. haben auf diese Tatsache hingewiesen und in ihren Analysen eine korrigierte geringere Halbwertszeit von ungefähr sechs Tagen für die biologisch wirksame Fraktion des zirkulierenden ATG konstatiert. Sie wiesen bereits fünfzehn Tage nach der Transplantation subtherapeutische Konzentrationen (< 1 µg/ml) von biologisch aktivem ATG-G in ihren Patienten nach. [Waller et al. 2003]
Bezugnehmend auf diese Ergebnisse muss davon ausgegangen werden, dass die biologisch aktiven ATG-Moleküle zum Beginn der vorliegenden Untersuchungen an Tag +30 nach der Transplantation zwar nicht mehr in therapeutisch wirksamen Dosen vorhanden waren.
Jedoch wird das Transplantat am Tag Null in ein Milieu gegeben, in dem viele ATG-Moleküle biologisch aktiv sind, welche einen maximalen Einfluss auf das Transplantat ausüben können. Diese biologisch aktiven ATG-Moleküle beeinflussen somit zum Zeitpunkt der Transplantation die kotransplantierten CD3+ T-Lymphozyten nachhaltig.
Diese Annahme wird durch die Beobachtung der ausgeprägten Verzögerung der zellulären Immunrekonstitution in der ATG-Gruppe unterstrichen. (siehe 3.3) Besonders wichtig diesbezüglich ist jedoch die schnellere Rekonstitution aller untersuchten regulatorischen T-Zellpopulationen nach Behandlung mit ATG bei gleichzeitig niedrigeren CD4+ T-Zellzahlen. (siehe 3.3.4 und 3.4) Die sich daraus ergebende Annahme einer direkten Induktion von Treg aus mit dem Transplantat übertragenen T-Lymphozyten durch ATG soll im folgenden Kapitel diskutiert werden.