Allgemeine Nukleinsäuretechniken

Die 0,5 ml-Aliquots der eingefrorenen Zellen wurden schnell in einem 37 °C-Wasserbad aufgetaut und durch kurzes Vortexen mit 1-6 µg der Plasmid-DNA gemischt. Die Zellen wurden dann in vorgekühlte 0,2 cm-Elektroporationsküvetten überführt und für 20 min im Eisbad inkubiert. Anschließend wurde mit dem Elektroporator ein einzelner Strompuls verabreicht (1,6-2,5 kV, 25 µF, 200 Ω). Unmittelbar darauf wurde die Zellsuspension 1 : 10 in LBSPG-Medium bei RT verdünnt und im Thermoschüttler für 90 min bei 37 °C mit 180 rpm zur Expression der Antibiotika-Resistenzmarker inkubiert. Nach dem Pelletieren der Zellen für 5 min bei 5.000 x g und Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 600 µl LB-Medium resuspendiert. Hiervon wurden jeweils 100 µl auf Selektionsplatten ausgestrichen.

Von den restlichen, nicht ausplattierten Zellen wurde eine Glycerinkultur angelegt.

doppelsträngigen DNA-Fragmenten ist das Verhältnis von Ladung zu Masse konstant und die Laufstrecke ist innerhalb eines bestimmten Bereichs (< 5 - 8 kb) umgekehrt proportional zum Logarithmus der Fragmentlänge. Agarosekonzentrationen und die jeweiligen Fragmentlängen-Trennbereiche sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.

Fragmentlänge Agarosekonzentration (w/v) Bromphenolblau Xylencyanol

1,0 bis 30 kb 0,5 % 1,0 kb 10,0 kb

0,8 bis 12 kb 0,7 % 0,7 kb 6,0 kb

0,5 bis 7 kb 1,0 % 0,3 kb 3,0 kb

0,4 bis 6 kb 1,2 % 0,2 kb 1,5 kb

0,2 bis 3 kb 1,5 % 0,12 kb 1,0 kb

0,1 bis 2 kb 2,0 % < 0,1 kb 0,8 kb

Tab. 3.1: Trennbereich von Agarosegelen in Abhängigkeit von der Agarosekonzentration. Zusätzlich angegeben sind Längen der Fragmente, die mit den Farbstoffen Bromphenolblau und Xylencyanol komigrieren.

Die entsprechende Menge Agarose wurde in 1x TAE-Puffer aufgenommen (siehe Tab.

3.1) und in der Mikrowelle aufgekocht, bis beim Schwenken keine Schlieren mehr sichtbar waren. Für analytische Gele wurde die Lösung mit Ethidiumbromid-Färbelösung versetzt (Endkonzentration 0,5 µg/ml) und in einen "Elektrophoreseschlitten" gegossen. Nach dem Erstarren des Gels wurde die Elektrophorese in einer mit 1x TAE-Puffer gefüllten Flachgelkammer bei 60 - 120 mA durchgeführt. Die Proben wurden mit ¹/₅ Volumen DNA-Probenpuffer gemischt. Zur Ermittlung der Größe der DNA-Fragmente in den Proben wurden parallel kommerziell erhältliche Größenstandards auf das Gel aufgetragen. Unter langwelligem UV-Licht (306 nm) fluoreszieren die Nukleinsäuren durch interkalierte Ethidiumbromidionen als leuchtend orangene Banden.

3.2.3.2 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)

TBE-Puffer (10x konz.) 890 mM Tris

890 mM Borsäure

20 mM EDTA pH ∼ 8,3

RNA-Probenpuffer (2x konz.): 2,6 M Harnstoff 66 % (v/v) Formamid

0,02 % (w/v) Bromphenolblau

0,02 % (w/v) Xylencyanol

in 2x TBE

Hier entsteht die Gelmatrix durch eine radikalische Polymerisationsreaktion von Acrylamid-Monomeren und N,N´-Methylenbisacrylamid, die durch TEMED katalysiert und durch APS gestartet wird. Der Grad der Quervernetzung der linearen Acrylamid-Polymere wird durch die Menge des in geringerer Konzentration vorliegenden Bisacrylamids bestimmt.

Die standardmäßig verwendete Stammlösung setzte sich aus 48 % Acrylamid und 2 % Bisacrylamid in H₂O_bidest zusammen.

Für die Größenbestimmung einzelsträngiger Nukleinsäuren verwendet man denaturierende Gele mit 7 bis 8 M Harnstoff, welcher die zur Ausbildung von Sekundär- und Tertiärstrukturen benötigten Wechselwirkungen der Moleküle unterbindet. Damit die Proben bereits beim Einlaufen in die Gelmatrix im denaturierten Zustand vorliegen, enthält auch der Probenpuffer Harnstoff sowie Formamid, welches ebenfalls denaturierende Eigenschaften besitzt. Im Rahmen dieser Arbeit war zum Nachweis der RNase P-spezifischen Spaltungsaktivität die Auftrennung von prä-tRNA und deren 5´-Flanke notwendig. Hierfür wurden denaturierende PAA-Gele mit 20 % (v/v) Acrylamidkonzentration verwendet, deren optimaler Trennbereich zwischen 12 und 55 Nukleotiden liegt.

Die Gellösung setzte sich zusammen aus: 7 M Harnstoff 1x TBE-Puffer

20 % (v/v) Acrylamid/Bisacrylamid

Nachdem der Harnstoff vollständig gelöst war, wurde die Gellösung filtriert und die Polymerisation durch Zugabe von ¹/100 Volumen 10 % (w/v) APS und ¹/1000 Volumen TEMED gestartet. Die Lösung wurde zwischen zwei gut gesäuberte, mit Ethanol abgeriebene und horizontal übereinander liegende Glasplatten gegossen. Ein zwischen die Glasplatten gesteckter Teflonkamm ermöglichte die Bildung von Probentaschen mit 20 - 50 µl Inhalt. Die Stärke des Gels richtete sich nach dem jeweiligen Verwendungszweck und wurde durch die Wahl geeigneter spacer, die zwischen die Glasplatten geklammert wurden, festgelegt. Sie betrug in der Regel 1 mm.

Um ein nachträgliches Polymerisieren von noch nicht umgesetztem Acrylamid am Boden der Probentaschen zu verhindern, wurden diese sofort nach dem Entfernen des Kammes mit

1x TBE gespült. Um die Gele vorzutemperieren und eventuelle Konzentrationsunterschiede der Ionen zwischen Gelmatrix und Puffertank auszugleichen, wurde die Elektrophorese bereits 10 bis 30 min vor dem Auftrag der Proben gestartet. Unmittelbar vor dem Auftragen der Nukleinsäuren wurde der Stromfluss unterbrochen und die Taschen wurden erneut gespült. Die Elektrophorese wurde zunächst für 10 min bei 15 mA und anschließend konstant bei 25 mA durchgeführt. Der Fortschritt der Elektrophorese konnte anhand der im Probenpuffer enthaltenen Farbstoffe verfolgt werden. In 10 % igen PAA-Gelen wandern einzelsträngige DNA- bzw. RNA-Moleküle mit 12 bzw. 55 Nukleotiden Länge auf gleicher Höhe mit dem Bromphenolblau- bzw. Xylencyanol-Farbstoff.

3.2.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

TE-Puffer: 10 mM Tris/HCl pH 8,0

1 mM EDTA

Durch Messung der Lichtabsorption (Extinktion) bei 260 nm läßt sich auf Grundlage des Lambert-Beerschen Gesetzes

E = ε ⋅ c ⋅ d

die Konzentration von Nukleinsäuren bestimmen (E = Extinktion; ε = molarer Extinktionskoeffizient; c = Konzentration der Nukleinsäure; d = Schichtdicke der Küvette).

Dazu wurde die Absorption einer geeigneten Verdünnung der Nukleinsäure in 1x TE-Puffer bei 260 nm gegenüber dem reinen Puffer in einer Quarzküvette mit 1 cm Schichtdicke bestimmt. Eine Absorptionseinheit bei 260 nm (A₂₆₀) entspricht etwa folgender Nukleinsäuremenge:

1 A₂₆₀ dsDNA entspricht 50 µg/ml 1 A₂₆₀ ssDNA entspricht 37 µg/ml 1 A260 RNA entspricht 40 µg/ml

Durch die Bestimmung des Verhältnisses der Absorption sowohl bei 260 nm (ungefähres Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren) als auch bei 280 nm (Absorptionsmaximum Proteine) läßt sich die Reinheit einer Nukleinsäurelösung unter Vorbehalt abschätzen

(Sambrook et al., 1989; Wilfinger et al., 1997). Eine reine DNA-Lösung besitzt einen A₂₆₀/A₂₈₀-Wert von 1,8 und eine reine RNA-Lösung einen Wert von 2,0. Bei Kontamination mit Protein oder Phenol ist dieser Wert signifikant kleiner.

3.2.3.4 Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen

Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die mit Ethidiumbromid angefärbten DNA-Banden mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten und nach folgenden Methoden isoliert:

Isolierung mittels Glasmilch

Diese Methode beruht auf der Eigenschaft von Silica-Material (z.B. Glasmilch), DNA in Anwesenheit hoher Konzentrationen chaotroper Salze zu binden. Nach einem Waschschritt kann die DNA dann durch Lösungen mit geringen Salzkonzentrationen wieder eluiert werden. Entsprechend dem Protokoll des Gene Clean II-Kits (Bio101) wurden die ausgeschnittenen Agarosegelstücke in einem Natriumjodid-haltigen Hochsalzpuffer bei 55 °C gelöst und mit der Silica-Suspension inkubiert. Nach den vorgegebenen Waschschritten wurde das pelletierte Silica-Material getrocknet und die DNA anschließend mit H2Obidest oder TE-Puffer eluiert.

Isolierung mittels spin column-Elution

Bei dieser Methode wird die DNA aus den Agarosegel-Stücken herauszentrifugiert.

Hierfür wurden die Agarosegel-Stücke in ein Plastikgefäß gegeben, welches als Minisieb funktioniert. Vorwiegend verwendet wurden die kommerziell erhältlichen Ultrafree®-MC Centrifugal Filter Units von Millipore. Alternativ hierzu wurden auch selbst angefertigte Plastikgefäße verwendet (Abbildung 3.1). Diese bestanden aus einem 0,5 ml PCR-Reaktionsgefäß, bei welchem in den Boden mittels einer Kanüle ein Loch gestochen wurde.

Der Boden des Reaktionsgefäßes wurde dann mit einem Stück silanisierter Glaswolle ausgestopft (maximal ¹/5 des Gefäßvolumens). Das Gelstück wurde in das 0,5 ml Gefäß gegeben und dieses auf ein zweites 2 ml-Reaktionsgefäß aufgesetzt. Nach einem 10-minütigen Zentrifugationsschritt bei 5.000 x g konnte die DNA-haltige Lösung aus dem unteren Auffanggefäß entnommen werden. Das Zentrifugat enthält ca 70 % der DNA. Eine

größere Ausbeute wurde erzielt, wenn die Agarose-Gelstücke vor dem Zentrifugieren in dem angefertigten Plastikgefäß für 1 h bei –20 °C eingefroren und dann schnell bei 37 °C aufgetaut wurden.

Agarose-Gelstück Glaswolle

Abb. 3.1: Gelelution mittels Zentrifugation. Darstellung eines selbstgebastelten Minifilters

3.2.3.5 Phenol-/Chloroform-Extraktion

Diese Methode dient zur Entfernung von Proteinen aus Nukleinsäurelösungen. Hierzu wurde die Nukleinsäurelösung nacheinander mit einem Volumen Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1, (v/v)) und einem Volumen Chloroform bei RT kräftig ausgeschüttelt. Nach dem Ausschütteln wurde jeweils zur besseren Phasentrennung 5 min bei 13.000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert und die obere wässrige Phase unter Vermeidung der Interphase in ein neues Gefäß überführt. Auf diese Weise wurden die Proteine denaturiert und sammelten sich in der organischen Phase bzw. der Phasengrenze, während die Nukleinsäuren in der wässrigen Phase gelöst waren. Verbleibende Phenolreste wurden durch die Chloroformextraktion und eine anschliessende Alkoholfällung (3.2.3.6) entfernt.

3.2.3.6 Alkohol-Fällung

Die Fällung von Nukleinsäuren mit bestimmten Alkoholen ist die gebräuchlichste Methode, um DNA oder RNA aus wässrigen Lösungen zu konzentrieren. Hierzu versetzt man eine Nukleinsäurelösung mit einem monovalenten Salz und gibt Ethanol bzw.

Isopropanol dazu. Nach kräftigem Mischen fällt die Nukleinsäure aus und kann durch Zentrifugation pelletiert werden. Durch anschliessendes Waschen mit 70 % (v/v) Ethanol

werden Salz- und Alkoholreste entfernt. Neben Salzen bleiben auch viele andere kleine, wasserlösliche Substanzen im Überstand gelöst, so daß ein Reinigungseffekt erzielt wird.

Zur Fällung wurde die wässrige Lösung mit ¹/₁₀ Volumen 3 M Natriumacetat-Lösung (pH 4,5-5,0) und mit 2,5-fachem Volumen absolutem Ethanol versetzt, gut gemischt und in der Kälte gefällt. In der Regel wurde der Ansatz für 20 min bei –80 °C oder über Nacht bei –20

°C inkubiert. Anschliessend wurden die präzipitierten Nukleinsäuren durch eine 1 h dauernde Zentrifugation mit 15.000 x g bei 4 °C pelletiert. Der Überstand wurde mit einer zur Kapillare ausgezogenen Pasteurpipette vorsichtig abgenommen, das Pellet mit 70 % (v/v) Ethanol (ca.

1/₃ des Fällungsvolumens) gewaschen und erneut 30 min mit 15.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet an der Luft getrocknet und in H₂O_bidest bzw. 1x TE-Puffer gelöst.

Bei großvolumigen Lösungen wurde Isopropanol zur Fällung verwendet, welches Nukleinsäuren effektiver als Ethanol fällt. Bei RT wurde bereits mit dem 0,6-0,8-fachem Volumen Isopropanol eine quantitative Fällung erzielt. Nach der Zentrifugation wurde das Pellet mit 70 % (v/v) Ethanol gewaschen (s.o.), um restliche Salze bzw. restliches Isopropanol zu entfernen.

3.2.3.7 Konzentrierung von Nukleinsäuren mittels der Speed-Vac

Bei der Speed-Vac handelt es sich um eine Tischzentrifuge, an die ein Vakuum angelegt werden kann. Das Vakuum führt zu einer Siedepunkterniedrigung bei Flüssigkeiten und damit zu einem raschen Verdampfen. Auf diese Weise konnten kleine Volumina Nukleinsäurelösungen mittels der Speed-Vac in kurzer Zeit eingetrocknet werden. Zu berücksichtigen ist allerdings, daß es beim Verdampfen des Lösungsmittels unter Umständen zu einer Anreicherung an Salzen in der Lösung kommt. Ausserdem können Nukleinsäure-Pellets leicht „übertrocknet“ werden, so daß sie sich anschließend nur noch schwer in Lösung bringen lassen.