2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.3 Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine Methode zum Trennen und Identifizieren von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe. Wird an ein mit DNA-Molekülen beladenes Agarosegel eine Spannung angelegt, wandern diese aufgrund ihrer negativen Ladung im elektrischen Feld zur Anode. Die Gelmatrix sorgt dabei durch den sogenannten Molekularsiebeffekt für die Trennung unterschiedlich großer Nukleinsäuremoleküle, da diese ein fast konstantes Masse/Ladungs-Verhältnis aufweisen. Rechnerisch ist der Logarithmus der elektrophoretischen Beweglichkeit von Nukleinsäuremolekülen proportional zur Konzentration der Agarose im Gel (die Geschwindigkeit, mit der die Moleküle das Gel durchwandern, ist hierbei abhängig von deren Größe, Konformation und Eigenladung).
Typischerweise werden Agarosegele in Konzentrationen von 0,5 bis 2 % zum Auftrennen von DNA-Fragmenten von 80 bp bis 25 kb eingesetzt.
Lösung:
Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer: 40 mM Tris-Acetat; 2 mM EDTA; pH 8,0
Für die Herstellung eines 1 % -igen Agarosegels wurde 1 g Agarose zunächst in 100 ml Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer unter Erwärmen vollständig gelöst und in eine zuvor vorbereitete Gelkammer mit eingesetztem Kamm (dieser bildet nach der Polymerisation die Geltaschen) luftblasenfrei gegossen. Das nach der Polymerisation feste Gel wurde in eine Gelkammer
eingesetzt und diese mit TAE Puffer befüllt, bis das Gel vollständig bedeckt war. Der Kamm wurde entfernt und der Puffer mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid (EtBr) versetzt. Im Anschluss wurden die zuvor mit Ladepuffer (verhindert das Ausschwemmen der Proben) versetzten Proben in die Geltaschen pipettiert. Zusätzlich wurde ein Größenstandard (1,5 kb Ladder plus, Fermentas) aufgetragen, der anschließend zur Größenbestimmung der DNA-Fragmente und gleichzeitiger positiver Beladungskontrolle diente. Zum Auftrennen wurde eine Spannung von 120 Volt angelegt. Für die Identifikation der DNA-Fragmente wurde das Gel mit UV-Licht bei einer Wellenlänge von 360 nm bestrahlt. Das EtBr, welches sich zwischen den Basen der DNA-Moleküle eingelagert hat, emittiert hierbei ein optisch sichtbares, orangenes Licht mit dem sich DNA-Mengen ab ca. 20 ng im Gel nachweisen lassen.
2.2.3.1 Reinigung von DNA Molekülen mittels Agarose-Gelelektrophorese
Um unerwünschte Substanzen wie Primer und/oder restliche Enzyme zu entfernen und die gewünschten DNA-Fragmente zu isolieren, z.B. nach einer PCR oder einem Restriktionsverdau, können diese wie unter 2.2.3 beschrieben aufgetrennt werden. Die entsprechende DNA-Bande wird dann unter UV-Licht mit einem Skalpell möglichst verlustfrei ausgeschnitten und mittels eines Kits (QiaQuick Gel Extraktion (Qiagen)) aufgereinigt.Zu beachten ist bei dieser Methode, dass unter UV-Licht möglichst schnell gearbeitet wird, da dieses die DNA schädigen kann (u.a. kann es zu Depurinierungen, Strangbrüchen oder der Bildung von Basendimeren kommen).
2.2.3.2 QiaQuick Gel Extraktion (Qiagen)
Wie unter 2.2.1 beschrieben, wird auch bei dieser Reinigungsmethode ein chaotropes Salz eingesetzt, um Nukleinsäuremoleküle von unerwünschten Substanzen zu trennen und ein möglichst reines Produkt zu erhalten. Im Unterschied zur Lyse der RNA aus Viruspartikeln wird im Folgenden die Extraktion von DNA-Molekülen aus Agarosegel beschrieben.
Das QiaQuick Gel Extraktions Kit der Firma Qiagen wurde nach dem vom Hersteller angegebenen Gel Extraktion Zentrifugationsprotokoll verwendet.
Lösungen:
Tris-EDTA (TE) Puffer: 10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 7,5 QG Puffer: chaotroper Salzpuffer
PE Puffer: 10 mM Tris-HCl; pH 7,5; 80 % Ethanol
Um die mittels unter 2.2.3.1 beschriebenen ausgeschnittenen DNA-Moleküle zu reinigen, wurden die entsprechenden Agarosestücke gewogen und mit dem dreifachen Volumen an QG Puffer in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß versetzt. Um die Agarose aufzulösen, wurde das Reaktionsgefäß bei 50°C für 10 min inkubiert, wobei alle 2 min der Auflösungsprozess durch Vortexen beschleunigt wurde. Um die DNA-Fragmente aus der Lösung zu präzipitieren wurde ein einfaches Volumen (ausgehend vom ursprünglichen Gelvolumen) Isopropanol zugegeben, vorsichtig über Kopf gemischt und die Lösung im Anschluss in eine mit Silikaoberfläche ausgestattete Säule gegeben. Durch Zentrifugation für 1 min bei 16.100 x g wurde der Überstand entfernt, der Durchfluss verworfen und die an das Säulenmaterial gebundene DNA durch Zugabe von 500 µl QG Puffer gewaschen, erneut für 1 min bei 16.100 x g zentrifugiert und ebenfalls der Durchfluss verworfen. Im zweiten Waschschritt wurden 750 µl PE Puffer zugesetzt und 5 min bei RT inkubiert, um alle Salze zu entfernen. Der Überstand wurde erneut durch Zentrifugation für 1 min bei 16.100 x g entfernt, der Durchfluss verworfen und die Säule durch einen weiteren Zentrifugationsschritt bei 16.100 x g für 1 min getrocknet. Die Elution erfolgte durch zweimalige Zugabe von je 20 µl Tris-EDTA (TE) Puffer, eine einminütige Inkubation und anschließende Zentrifugation für 1 min bei 16.100 x g. Die gereinigte DNA wurde bei -20°C gelagert.
2.2.3.3 Fällung von Nukleinsäuremolekülen (Präzipitation)
Bei der Präzipitation handelt es sich um ein Verfahren zur Aufreinigung und Konzentration von Nukleinsäuremolekülen. Die Lösung wurde hierfür mit dem zweieinhalbfachen Volumen absoluten Ethanols und dem 0,1-fachen Volumen einer 3 M Natriumacetat (NaAc) (pH 5,7)-Lösung versetzt und über Nacht bei -20°C inkubiert. Am folgenden Tag wurde die 5,7)-Lösung für
60 min bei 4°C und 16.100 x g zentrifugiert, wobei die Nukleinsäuremoleküle pelletiert wurden. Diese wurden im Anschluss zweimal mit je 500 µl 70 % -igem Ethanol gewaschen und jeweils für 10 min bei 4°C und 16.100 x g zentrifugiert. Nachdem die Überstände verworfen wurden, wurden die Nukleinsäuremoleküle bei RT getrocknet und in einer entsprechenden Menge Tris-EDTA (TE) Puffer resuspendiert.
2.2.3.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäure-Lösungen
Die Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäurelösungen wurde mit einem NanoDrop 1000 Spektralphotometer der Firma Thermo SCIENTIFIC durchgeführt. Hierbei wird die OD bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Die Berechnung der Konzentration ergibt sich aus einem Multiplikationsfaktor (dsDNA = 50, bei RNA = 40) und dem jeweiligen Verdünnungsfaktor.
Formel: DNA-Konzentration [µg/ml] = OD260 x 50 x Verdünnungsfaktor
Verunreinigungen einer solchen Lösung (z.B. durch Proteine) werden durch eine zweite Referenzwellenlängen-Messung bei 280 nm erfasst (2.1.1.5). Bei einer proteinfreien Nukleinsäurelösung entspricht das Verhältnis von OD260 zu OD280 1,8 bis 2,0.