Ähnlich wie für acbp3 wurde für die acbp4-Isoform eine spezifische Sonde, hier aus dem 3’-untranslatierten Bereich, abgeleitet. Diese Sonde ergab jedoch unter den gegebenen Bedingungen keinerlei detektierbare Signale. Eine mögliche Erklärung dafür wäre eine Unterrepräsentation der acbp4-Transkripte in den untersuchten mRNA-Populationen. Aus der Tatsache, daß acbp4-cDNA-Klone gar nicht (in PEMs-cDNA-Bank) bzw. nur in geringem Maße (1 von 26 detektierten ACBP-Klonen in der
Blätter-cDNA-Bank) in den verwendeten Banken auffindbar waren, ließ sich bereits eine geringere Transkriptionsrate dieser Isoform postulieren.
Eine weitere Erklärung für das Auffinden eines acbp4-cDNA-Klons ohne die Detektion der entsprechenden Transkripte in den untersuchten mRNA-Populationen könnte in der Verwendung einer 3’-spezifischen Sequenz als Sonde liegen. Da beim Herstellen einer cDNA-Bank nur Transkripte mit intakter Poly-A-Sequenz und somit intaktem 3’-untranslatierten Bereich amplifiziert werden, konnte hier ein vollständiger acbp4-Klon detektiert werden. Bei der Untersuchung frisch isolierter mRNA-Populationen liegen jedoch auch alle unvollständigen und im 3’-Bereich verkürzten Transkripte vor. Damit wäre die Anzahl und Konzentration an intakten Transkripten, die mit einer 3’-Sonde detektierbar sind, weiter verringert. Dies spielt besonders dann eine Rolle, wenn das entsprechende Transkript sowieso nur in geringem Maße exprimiert wurde. Die alternative Verwendung einer 5’-Sonde zur Detektion von acbp4-Transkripten kam auf Grund des sehr limitierten 5’-untrans-latierten Bereiches von acbp4 (nur 27 bp) nicht in Frage. Eine mögliche Lösung des Problems läge in der Verwendung von mRNA-angereicherten Aufarbeitungen verschiedener Pflanzenteile für die Northern-Analyse, da bei der mRNA-Anreicherung ebenfalls nur 3’-intakte Transkripte mit vollständiger Poly-A-Sequenz amplifiziert werden.
Die Tatsache, daß das korrespondierende Protein ACBP4 nur in einer Aminosäureposition vom nativ gereinigten Protein ACB1_DIGLA abwich, wobei diese Abweichung auf den Austausch einer einzigen Base zurückzuführen wäre, sprach dafür, daß es sich bei den beiden Proteinen um dieselbe ACBP-Isoform handelte, wobei der Basenaustausch beim Anlegen der cDNA-Bank oder durch eine Mutation im Genom der PEMs aufgetreten sein könnte. Damit würde es sich bei acbp4 um ein tatsächlich exprimiertes Gen und nicht um ein Artefakt des cDNA-Bank-Screenings handeln, wobei das Gentranskript auf Grund der geringen Transkriptionsrate in den untersuchten Geweben unter der Nachweisgrenze lag.
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Zur Aufklärung der genomischen Organisation der ACBP-Isoformen in 'LJLWDOLV ODQDWD EHRH. sollten zwei Strategien verfolgt werden. Zum einen sollte durch eine genomische Southern-Analyse die Anzahl ACBP-homologer Sequenzen im partialverdauten 'LJLWDOLV-Genom bestimmt werden. Zum anderen wurde durch das Durchsuchen einer genomischen Bank aus 'LJLWDOLV ODQDWD EHRH. die Klonierung und Sequenzierung ACBP-homologer Sequenzen angestrebt, um Zugang zu regulatorischen Promotorsequenzen zu erlangen.
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Generell stellte sich die Handhabung genomischer 'LJLWDOLV-DNA als problematisch heraus. Durch den hohen Gehalt an Sekundärstoffen, und hier besonders an phenolischen Verbindungen, war die nach verschiedenen Methoden gereinigte genomische DNA meist mit einem hohen Anteil störender Sekundärstoffe behaftet.
Wurde durch wiederholte oder radikalere Reinigungsschritte die gDNA von einem Großteil der Verunreinigungen befreit, konnte ebenfalls eine zunehmende unspezifische Degradierung der gDNA festgestellt werden. Diese Proben waren dann
für einen Southern-Partialverdau nicht mehr geeignet. Die aus PEMs gewonnene gDNA war zwar weitaus weniger verunreinigt, jedoch war hier der Partialverdau durch bestimmte Restriktionsenzyme durch den ausgesprochen hohen Methylierungs-grad der gDNA beeinträchtigt (SCHOLZE, Dissertation 1999).
Nach Evaluierung verschiedener Methoden zur Gewinnung genomischer DNA sowie mehrerer Varianten zur Durchführung des Southern Blots wurden die in B.3.1.
beschriebenen Methoden ausgewählt. Dabei erbrachten nur die Restriktionsenzyme BamHI und KpnI auswertbare Resultate. Eine Auswertung von nur zwei Restriktionen kann keinen definitiven Rückschluß auf die Anzahl ACBP-homologer Sequenzen im Genom geben. Dennoch gibt diese Analyse zumindest einen Hinweis auf die genomische Organisation. So wurden bei Restriktion mit BamHI 3 Banden (bei 2200 bp, 4200 bp sowie im hochmolekularen Bereich bei rund 15000 bp) detektiert. Die Restriktion mit KpnI ergab 4 detektierbare Banden (bei 2600 bp, 4200 bp, 9200 bp sowie 10000 bp). Dies ließ die Schlußfolgerung zu, daß im partialverdauten Genom von 'LJLWDOLVODQDWD EHRH. mindestens drei, eventuell sogar vier ACBP-homologe Fragmente zu finden waren. Da eine genomische Southern-Analyse keinen Rückschluß auf die Funktionalität der detektierten genomischen Fragmente erlaubt, können hier auch repetitive oder inaktive Sequenzen erfaßt worden sein.
Die bisherigen Erkenntnisse aus der genomischen Southern-Analyse stehen also in Übereinstimmung mit der Annahme, daß mindestens drei verschiedene ACBP-Isoformen (ACBP3, ACBP4/ACB2_DIGLA sowie ACB1_DIGLA) in 'LJLWDOLV ODQDWDEHRH. aufzufinden sind.
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Zur Identifizierung ACBP-homologer Sequenzen wurde eine genomische Bank aus 'LJLWDOLV ODQDWD EHRH. durchsucht. Die detektierten positiven Klone konnten nach Restriktionsanalyse in zwei Gruppen eingeordnet werden, die jeweils unterschiedliche Restriktionsmuster aufwiesen. Im Southern-Blot der partialverdauten Phagen-DNA konnten die jeweiligen ACBP-homologen Fragmente nachgewiesen werden. Durch eine Auswahl verschiedener Restriktionsenzyme einzeln oder in Kombination sollte versucht werden, diese homologen Fragmente auf eine für die Zwischenklonierung handhabbare Größe zu reduzieren. Enzyme und Enzymkombinationen, die Fragmente kleiner als 400 bp bzw. größer als 4000 bp ergaben, wurden von der Analyse ausgeschlossen, da diese Fragmentgrößen entweder keine weiterreichende Sequenzinformation für regulatorische Sequenzen versprachen oder aber zu groß für weitere Klonierungsschritte waren. Für die Enzyme und Enzymkombinationen, die detektierbare Fragmente im gewünschten Größenbereich erbrachten, standen keine Vektoren mit dementsprechenden Schnittstellen für die Zwischenklonierung zur Verfügung. Es mußte daher auf eine EOXQW HQG-Klonierung zurückgegriffen werden, die weitaus weniger effektiv als die angestrebte VWLFN\ HQGKlonierung war. Ein weiteres Problem bei der Klonierung von Fragmenten mit glatten Enden ist die geringere Fragmentgröße, die mit dieser Methode kloniert werden kann.
Für die beiden genomischen Klongruppen konnten Restriktionsbedingungen ermittelt werden, die ACBP-homologe Fragmente im Größenbereich von 2000 bis 3500 bp ergaben. Auf Grund der geringen DNA-Mengen, die bei einer -DNA-Isolation zur
Verfügung stehen, den für die EOXQW HQG-Klonierung nötigen Zwischenschritten, die die Fragmentkonzentration weiter verringerten, sowie die für diese EOXQW HQG-Klonierung ungünstige Fragmentgröße konnte keines dieser Fragmente erfolgreich kloniert werden. Es waren nur kleinere Fragmente klonierbar, die jedoch nicht mit den bekannten acbp-Sequenzen überlappten und somit nicht als die gesuchten regulatorischen Sequenzen der ACBP-Familie zu identifizieren waren.
Die Tatsache, daß nur zwei unterschiedliche genomische Klone aufgefunden werden konnten, steht nur scheinbar im Widerspruch zur postulierten Existenz von drei oder mehr ACBP-Isoformen im 'LJLWDOLV-Genom. Zum einen ist es bei einer detektierten Fragmentgröße von 2000-3500 bp nach Restriktion der -DNA durchaus denkbar, daß sich bei einer ungefähren Länge der beiden bekannten acbp-Sequenzen von ca. 500 bp (ohne Introns) zwei verschiedene acbp-Sequenzen innerhalb desselben Fragments befinden. Eine wahrscheinlichere Erklärung, die auch vom Ergebnis des genomischen Southerns unterstützt wird, ist jedoch eine unvollständige Klonierung des 'LJLWDOLV-Genoms in die -Vektoren der genomischen Bank. In beiden Restriktionen der genomischen Southern-Analyse waren jeweils Signale im hochmolekularen Bereich detektierbar, im Falle der BamHI-Restriktion lag die Fragmentgröße dabei bei über 15000 bp. Solche Fragmente sind nur mit wesentlich geringerer Effizienz beim Anlegen einer gDNA-Bank klonierbar und würden damit einem genomischen Screening nicht zugänglich sein. Dies würde besonders dann eine Rolle spielen, wenn wie für die genomische 'LJLWDOLV-DNA beschrieben die Restriktion der gDNA zusätzlich durch störende Sekundärstoffe und den hohen Methylierungsgrad der DNA erschwert ist.
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Die Sequenzierung zweier so hoch homologer cDNA-Sequenzen wie acbp3 und acbp4 warf die Frage nach der Funktion dieser Isoformen auf. Zur Erklärung der Existenz zweier beinahe identischer Genprodukte ließen sich verschiedene Hypothesen aufstellen. So wäre eine differentielle Expression der beiden Isoformen denkbar, wobei sowohl eine gewebespezifische als auch eine streß- oder entwicklungsbedingte Regulation in Frage käme. Die Expressionsanalyse für acbp3 deutete dabei auf eine bevorzugte Expression in Blättern, Frucht und Fruchtknoten hin, während sich für dieses Transkript keine streßbedingte Veränderung feststellen ließ. Es wurde offensichtlich konstitutiv in den untersuchten undifferenzierten Kulturen exprimiert. Da die spezifische acbp4-3’-Sonde keine Signale ergab, ließen sich keine Rückschlüsse auf das Transkriptionsverhalten dieser Isoform ziehen.
Eine weitere Erklärung für die Existenz von Isoformen wäre ein unterschiedliches Ligandenspektrum für die jeweiligen korrespondierenden Proteine. Aus dem Vergleich der Sequenzen von ACBP3 und ACBP4 (Abb. C.7.) wird ersichtlich, daß neben dem C-Terminus, dem keine Bedeutung für die Ligandenbindung zugesprochen wird (KRAGELUND et al. 1999b), nur die Aminosäuren in Position 19 und 23 nicht homolog sind. Es sollte daher untersucht werden, welchen Einfluß diese Aminosäuren auf die Spezifität der Ligandenbindung haben. Dabei sollten die Aminosäuren 19 und 23 des einen Proteins gegen die des jeweilig anderen ausgetauscht werden. Zur Untersuchung des additiven Effekts dieser Mutationen wurden sowohl AS19- und AS23-Einzelmutanten als auch die entsprechenden Doppelmutanten generiert.
Die zur Einführung einer Punktmutation verwendete Variante der gerichteten Mutagenese wurde mit sehr hoher Effizienz optimiert. Die dabei verwendeten Primer waren so gewählt, daß ihre 5’-Enden bei Anlagerung an die Wildtyp-DNA jeweils lückenlos aneinandergrenzten und jeder Primer jeweils eine der für die zu mutierenden Aminosäuren kodierenden Sequenz abdeckte, wobei die vom 5’- zum 3’-Ende verlaufende PCR die gesamte Vektorsequenz einschließlich des einklonierten Inserts umlief. Der mutierte Primer der einen Isoform entsprach dabei der Wildtyp-Sequenz der jeweils anderen Isoform. Die Primer konnten somit sowohl als mutierte Primer zur Einführung einer Punktmutation als auch als Wildtyp-Primer zur Erhaltung der jeweiligen Sequenz eingesetzt werden. Damit waren mit der Kombination von nur vier Primern vier Einzelmutanten (jeweils ein mutierter und ein Wildtyp-Primer) und zwei Doppelmutanten (zwei mutierte Primer) zugänglich.
Das offenkettige mutierte PCR-Produkt stand nach Re-Ligation direkt der Überexpression zur Verfügung, da bei der Mutagenese der Expressionsvektor des Wildtyp-Klons nicht verändert wurde. Der hier verwendete pET3a-Expressionsvektor erlaubte eine hohe Überexpressionsrate, wobei die in B.5.3. beschriebene Vorgehensweise bei der Aufarbeitung der rekombinanten Proteine eine sehr hohe Ausbeute an reinem Protein erbrachte. Die durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie untersuchten Nebenprodukte der Überexpression stellten sich dabei als unvollständig prozessiertes genuines Protein (Start-Methionin nicht abgespalten) oder als von den Wirtszellen posttranslational modifiziertes Protein heraus. Diese Verunreinigungen konnten jedoch chromatographisch abgetrennt werden, so daß sie keine Rolle für die folgenden Bindungstests spielen konnten. Diese Aufarbeitungsmethode stellte sich als wesentlich ergiebiger als die zuvor für die überexprimierten Wildtyp-Proteine (siehe Kapitel B.4.) vorgestellte Variante heraus.
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Durch den Biosensor-Test sollte untersucht werden, welchen Einfluß die Aminosäuren in Position 19 und 23 auf die Bindungsspezifität der ACBP-Isoformen in 'LJLWDOLV haben. Als Arbeitshypothese wurde angenommen, daß sich die Existenz zweier fast identischer Isoformen durch deren unterschiedliches Ligandenspektrum begründen ließe. Nachdem die Funktionalität der beiden rekombinanten Wildtyp-Proteine im Gelshift-Assay qualitativ aufgezeigt werden konnte, sollte nun eine genauere quantitative Untersuchung der Ligandenbindung durch Bestimmung der jeweiligen Dissoziationskonstanten erfolgen.
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Bevor der Biosensor-Test zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten anderer ACBPs genutzt werden konnte, mußten zunächst die kD-Werte für das Biosensor-Protein selbst für alle in Frage kommenden Liganden bestimmt werden. Dieses modifizierte bovine ACBP, das nach Bindung eines Liganden verstärkt bei einer Wellenlänge von 460 nm fluoreszierte, wurde dabei in einer Doppelbestimmung mit den verschiedenen Acyl-CoA-Estern bis zur Sättigung titriert. Durch nichtlineare Regression wurde für diese Titrationskurven im Datafit-Programm eine EHVWILWKurve ermittelt, für die aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten, Biosensor- und Ligandenkonzentration jeweils die Dissoziationskonstanten ermittelt werden konnten.
Bei der Erstellung der Titrationskurven konnte festgestellt werden, daß der Anstieg im linearen Bereich dieser Kurve, vor allem jedoch die Meßwerte im Bereich des Sättigungswertes maßgeblich den kD-Wert beeinflußten. Die Berechnung der kD -Werte reagierte dabei sehr empfindlich auf geringe Abweichungen in diesem Bereich.
Im folgenden soll der Vergleich der EHVWILWKurven für die Titration des Biosensors mit Myristyl-CoA sowohl für die tatsächlich bestimmte Dissoziationskonstante von 21 nM als auch für eine simulierte Konstante von 15 nM diese Probleme näher darstellen (Abb. D.2.). Durch Einbeziehung der Standardabweichung der Meßwerte in die Berechnung konnte diese Auswertungsmethode jedoch verbessert werden. Wie aus Abb. D.2. ersichtlich, sind die Unterschiede der beiden Kurven im Sättigungsbereich zwar gering jedoch signifikant, während der Anstieg der Kurve selbst nur geringen Einfluß auf die Dissoziationskonstante hat.
Obwohl die Bestimmung der absoluten Biosensor-kD-Werte also mit einer methodengegebenen Unsicherheit behaftet war, spielte dies für die spätere Bestimmung der Dissoziationskonstanten der Mutanten keine wesentliche Rolle. Da für die Berechnung aller ACBP-Isoformen der gleiche Biosensor-kD-Wert zugrunde gelegt wurde, konnte zwar der absolute kD-Wert der einzelnen Mutante nicht jedoch das Verhältnis der kD-Werte aller Mutanten zueinander beeinflußt werden. Für die in dieser Arbeit angestrebten vergleichenden Untersuchungen war die Genauigkeit der Biosensor-kD-Bestimmung also ausreichend. Für eine Verwendung des Testes zur absoluten Bestimmung einer Dissoziationskonstante müßte der Test durch Mehrfachbestimmungen und durch Auswahl von mehr Meßpunkten im Bereich des Sättigungswertes statistisch abgesichert werden.
$EE ' Vergleich der tatsächlichen Titrationskurve (berechnete kD von 21 nM, durchgezogene Linie) mit einer simulierten Titrationskurve (simulierte kD von 15 nM, gestrichelte Linie) für die Titration des Biosensors mit Myristyl-CoA (Meßwerte siehe C.6.1.2.)
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