Developmental neurotoxicity (DNT) is caused by exposure to toxicants during sensitive periods of neurodevelopment. It can lead to neurobehavioral alterations persisting long after removal of the original stimulus. Additionally, evidence has been accumulating that exposure to some compounds can influence susceptibility to and severity of psychiatric disorders in later life. Although there is increasing awareness for DNT in western countries, animal-based testing for DNT according to the OECD test guideline 426 has only been done for a few chemicals. The major concern about such animal studies is that they may not predict human health effects. Also human data on DNT from epidemiologic studies are limited, as cause-effect relationships are hard to identify in this field. Thus, there is an urgent need for human based in vitro test systems for DNT. In this study we have successfully established two new human-cell-based toxicological in vitro test systems to assess DNT.
First, we established an assay using a human neuronal precursor cell line (LUHMES) that can be differentiated efficiently to fully mature neurons. In these cells, differentiation is naturally accompanied by neurite outgrowth. As disturbance of neurite outgrowth has been associated with DNT, we used fully automated analyses of neurite outgrowth as a functional read-out for this test system. In a second step, we established a test system to assess chemical’s effects on early patterning of the brain. This was done using human embryonic stem cells (hESC). To develop the test system, we first showed that hESC can be differentiated efficiently to neuroepithelial precursor cells. This differentiation process was investigated using expression levels of marker genes that specify the fate of the differentiating cells according to time and to region. Exposure scenarios have been tested and chemicals specifically interfering with distinct differentiation processes have been applied to validate the test system. We found that prolonged, but not short, exposure to the well-known DNT compound valproic acid altered neural differentiation in a similar manner as other inhibitors of histone deacetylases (HDACi).
Moreover, exposure to HDACi altered histone methylation patterns at the promoters of deregulated marker genes. We finally investigated if the altered histone methylation pattern might represent the switch from altered histone acetylation to altered neural differentiation.
We found that a transient increase in acetylation caused by HDACi can be associated with an accumulation of epigenetic alterations after chronic treatment. This in turn can lead to altered neural development as examined by massive whole genome transcriptome profiling.
In summary, we developed two in vitro test systems which can be used to identify chemicals that potentially cause DNT. In the hESC based test system we identified a mechanism whereby chemicals can interfere with neurodevelopmental processes. Finally, we provide first evidence that epigenetic mechanisms could act as persistence sensors and therefore act as switch between innocuous short exposures to chemicals and adverse effects due to prolonged exposure.
Zusammenfassung
Entwicklungsneurotoxizität wird durch Giftstoffexposition während sensitiver Entwicklungsphasen des Gehirns verursacht. Sie kann zu neurologischen Verhaltensänderungen führen, die lange nach der Entfernung der Ursache weiterbestehen. Des Weiteren finden sich immer mehr Belege dafür, dass frühe Exposition gegenüber manchen Substanzen im späteren Leben Einfluss auf die Anfälligkeit für psychiatrische Erkrankungen und deren Schwere nehmen können. Obwohl in westlichen Ländern das Bewusstsein für Entwicklungsneurotoxizität wächst, wurden lediglich einige wenige Substanzen darauf in Tierversuchen getestet, die nach der OECD Testrichtlinie 426 durchgeführt wurden.
Erhebliche Besorgnis herrscht darüber, dass solche Tierversuche die Effekte auf die menschliche Gesundheit nicht vorhersagen. Zusätzlich sind Daten über Entwicklungsneurotoxizität aus humanen epidemiologischen Studien limitiert, da Ursache-Wirkungs-Relationen in diesem Studienfeld schwer zu identifizieren sind. In der vorliegenden Doktorarbeit haben wir erfolgreich zwei neue toxikologische in vitro Testsysteme, die auf menschlichen Zellen basieren, entwickelt, um Entwicklungsneurotoxizität zu beurteilen.
Zuerst haben wir eine Untersuchungsmethode in einer menschlichen neuronalen Vorläuferzelllinie (LUHMES) entwickelt, die effizient zu voll ausgereiften Neuronen differenziert werden kann. In diesen Zellen wird die Differenzierung natürlicherweise durch das Auswachsen von Zellfortsätzen (Neuriten) begleitet. Eine Störung dieses Wachstums wird mit Entwicklungsneurotoxizität in Verbindung gesetzt. Deshalb benutzten wir die vollautomatische Analyse des Neuritenwachstums als funktionalen Messparameter für dieses Testsystem. In einem zweiten Ansatz etablierten wir ein Testsystem, um die Effekte von Substanzen auf die Strukturierung des Gehirns einzuschätzen. Dies taten wir mit Hilfe von humanen embryonalen Stammzellen, bei denen wir zuerst zeigten, dass sie effizient zu neuroepithelialen Vorläuferzellen differenzieren können. Dieser Differenzierungsprozess wurde untersucht anhand der Expressionsstärken von Markergenen, die das Schicksal der differenzierenden Zellen bezüglich Zeit und Region in der Gehirnentwicklung darlegen.
Expositionsmöglichkeiten wurden getestet und das Testsystem wurde validiert, indem Substanzen angewandt wurden, die auf spezifische Art und Weise den Differenzierungsprozess stören. Wir fanden heraus, dass längere, nicht aber kurze, Exposition gegenüber dem bekannten entwicklungsneurotoxischen Stoff Valproinsäure die neurale Differenzierung der Stammzellen in gleicher Weise wie andere Inhibitoren von Histondeacetylasen (HDACi) störte. Des Weiteren führte die HDACi-Exposition zu veränderten Histonmethylierungsmustern an den Promotoren von Markergenen, deren Expression beeinflusst wurde. Schließlich untersuchten wir, ob diese veränderten Histonmethylierungsmuster eventuell den Schalter repräsentieren könnten, der veränderte Histonacetylierung mit veränderter neuraler Differenzierung verbindet. Wir fanden heraus,
mit einer Akkumulation von epigenetischen Veränderungen nach chronischer HDACi-Behandlung einhergehen kann. Dies wiederum kann zu veränderter Neuroentwicklung führen, die wir durch genomweite Transkriptionsanalyse untersucht haben.
Zusammenfassend haben wir zwei in vitro Testsysteme entwickelt, die benutzt werden können, um Substanzen zu identifizieren, die möglicherweise Entwicklungsneurotoxizität verursachen. Im stammzellbasierten Testsystem identifizierten wir einen Mechanismus über den Substanzen Neuroentwicklungsprozesse stören können. Schließlich zeigen wir erste Hinweise darauf, dass epigenetische Mechanismen als Beständigkeitssenoren fungieren könnten und somit von harmlosen, kurzen Substanzexpositionen durch längere Exposition zu schädlichen Auswirkungen führen können.