APS Ammoniumpersulfat
APC Adenomatosis Polyposis Coli, Tumor Suppressor BLAST Basic Local Alignment Search Tool
BSA bovines Serumalbumin
Ca2+ Kalzium
CaM Calmodulin
CamKII Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II
cDNA komplementäre DNA
cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat
CI Zellindex, Cell Index
c-jun Jun-Onkogen
CK Casein-Kinase
ctl Kontrolle, control
DAPI 4‘,6-Diamidino-2-phenylindol
DEP Dishevelled/EGL-10/Pleckstrin protein
DIX Dishevelled-Axin-Domäne
DMSO Dimethylsulfidoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure, desoxyribonucleic acid
DVL Dishevelled
E.Coli Escherichia coli
ECL verstärkte Chemilumineszenz, enhanced chemiluminescence ECM extrazelluläre Matrix, extracellular matrix
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGF Epidermaler Wachstumsfaktor, epithelial growth factor EGFR EGF-Rezptor, epithelial growth factor receptor
EMT Epithelial-mesenchymale Transition
ER Östrogenrezeptor
FCS fetales Kälberserum, fetal calf serum
141 FITC Fluoresceinisothiocyanat
fwd vorwärts, forward
Fz Frizzled
GSK Glykogensynthase-Kinase
HBS HEPES-gepufferte Salzlösung, HEPES buffered saline
Her2 humaner, epithelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor 2, human epidermal growth factor receptor 2
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure HRP Meerrettichperoxidase, horseradish peroxidase
IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat JNK C-jun-N-terminale-Kinase
LB Luria-Bertani
LPS Lipopolysaccharid
MCF-7 humane Mamma-Karzinomzelllinie der Michigan Cancer Foundation MMP Matrixmetalloproteinase
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenytetrazoliumbromid NES Kernexportsignal, nuclear export signal
NLS Kernlokalisationssignal, nuclear localisation signal
PA Polyacrylamid
SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung, phosphate buffered saline PCP planare Zellpolarität, planar cell polarity
PCR Polymerase-Kettenreaktion, polymerase chain reaction
PDZ post synaptic density Protein 95/ Discs large Septate junction Protein aus Drosophila melanogaster/ Zonula occludentes-1 Tight junction Protein
PFA Paraformaldehyd
PIP2 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat
PKC Proteinkinase C
rev rückwärts, reverse
RNA Ribonukleinsäure, ribonucleic acid ROC Rho-assoziierte-Kinase
RT Reverse Transkription
SDS Natriumdodecylsulfat, sodium dodecyl sulfate
142
TBS-T Tris-gepufferte Kochsalzlösung (Tris-buffered saline) mit Tween 20 TEMED Tetramethylethylendiamin
TNF-α Tumornekrosefaktor-α
Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TRITC Tetramethylisothiocyanat
UV ultraviolett
VEGF Gefäßendothelwachstumsfaktor, vascular endothelial growth factor
wg Wingless
WHO World Health Organization
Wnt Wingless type MMTV integration site
wt Wildtyp
xDsh Xenopus Dishevelled
Maßeinheiten:
% (v/v) Volumenprozent (Volumen/Volumen)
% (w/v) Massenprozent (Gewicht/Volumen, weight/volume)
bp Basenpaare
rpm Umdrehungen pro Minute, rounds per minute
V Volt
143 7.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 Übersicht über die Wnt-induzierten Signalwege und ihre Abhängigkeit von
DVL und seinen Domänen.. ... 7
Abbildung 1.2 β-Catenin-abhängiger Signalweg in Anwesenheit von Wnt. ... 8
Abbildung 1.3 Wnt/Calcium-Signalweg.. ... 10
Abbildung 1.4 PCP-Signalweg.. ... 12
Abbildung 1.5 β-Catenin-unabhängige Signalwege über ROR.. ... 14
Abbildung 1.6 Hochkonservierte Domänen von DVL und ihre Funktionen in den Wnt-Signalwegen.. ... 18
Abbildung 2.1 Übersicht über die verwendeten DVL3-Konstrukte.. ... 24
Abbildung 2.2 Beispielhafter Aufbau eines Konfrontationsassays im 2-Well-Chamberslide™.. ... 54
Abbildung 3.1 Untersuchung der Mammaepithelzelllinie hTERT-HME1 und der Brustkrebszelllinien MCF-7, SkBr3 und MDA-MB 231 in der Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und im Western Blot.. ... 62
Abbildung 3.2 Feststellung der Überexpression von ROR2 in den stabil transfizierten MCF-7 Brustkrebszellen im Vergleich mit der Leervektorkontrolle. ... 64
Abbildung 3.3 Untersuchung der Brustkrebszelllinien MCF-7 pcDNA und MCF-7 ROR2 im Western Blot und der qRT-PCR.. ... 67
Abbildung 3.4 Funktionelle Untersuchungen der ROR2-überexprimierenden MCF-7 Brustkrebszellen. ... 69
Abbildung 3.5 Überexpression der DVL3-Konstrukte in den stabil transfizierten MCF-7 Zellen.. ... 71
Abbildung 3.6 Untersuchung der mRNA-Expressionsmuster der mit DVL-Konstrukten stabil transfizierten Brustkrebszellen mittels qRT-PCR. ... 743
Abbildung 3.7 Untersuchung der stabil transfizierten MCF-7-Zellen DVL3 wt, DVL3 ΔDIX, DVL3 ΔDEP und MCF-7 pcDNA (ctl) im Western Blot.. ... 75
Abbildung 3.8 Untersuchung der mit DVL-Konstrukten stabil transfizierten MCF-7 Brustkrebszellen in der Immunfluoreszenz.. ... 76
Abbildung 3.9 Funktionelle Untersuchungen der stabil transfizierten MCF-7 Brustkrebszellen.. ... 77
Abbildung 3.10 Funktionelle Untersuchungen der stabil transfizierten MCF-7 Brustkrebszellen.. ... 79
Abbildung 3.11 Auswertung des Migrationsassays DVL3 ΔPDZ ΔDEP.. ... 81
Abbildung 3.12 Auswertung der Migrationsassays der stabil transfizierten MCF-7 Zellen. .. 82
144
Abbildung 3.13 Beispielhafte Auswahl aus den mikroskopischen Aufnahmen der DVL3-Hirnmetastasenfärbungen. ... 84 Abbildung 3.14 Auswertung der Hirnmetastasenfärbungen auf DVL3. ... 85 Abbildung 4.1 Theorie zur Funktionsweise der Konstrukte DVL3 ΔDIX und DVL3 ΔDIX ΔPDZ. ... 94 Abbildung 4.2 Theorien zur Entstehung und Bedeutung der dynamischen Aggregate. ... 102 Abbildung 4.3 Wnt-Signalwege als komplexes Netzwerk von Signalkaskaden. ... 108
7.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Charakterisierung der Tyrosinkinase-ähnlichen Rezeptoren ROR1 und ROR2. ... 15 Tabelle 2 Bindungspartner von Dsh. ... 19
145 Publikationen
Ergebnisse der vorliegenden Promotion präsentierte ich auf dem Wnt Symposium: Stem Cells, Development and Disease in Heidelberg, 2013 in Form eines Posters mit dem Titel „Signaling and functional analysis of ROR overexpression in the luminal A cell line MCF-7“ (Schubert A, Klemm F, Binder C, Pukrop T).
Im April 2016 werden Ergebnisse im Rahmen des Manuskripts „β-catenin-independent Wnt signaling and Ki67 in contrast to the estrogen receptor status are prognostic and associated with poor prognosis in breast cancer liver metastases” (Bleckmann A, Conradi LC, Menck K, Schmick NA, Schubert A, Rietkötter E, Arackal J, Middel P, Schambony A, Liersch T, et al.) im Journal Clinical & Experimental Metastasis (33 (4), 309-323) publiziert.
146 Danksagung
Prof. Dr. med. Tobias Pukrop Vielen Dank, dass du mir dieses spannende und weit gefasste Thema anvertraut, mir so viel Raum gelassen hast, selbst planend und gestalterisch tätig zu werden und die Selbstständigkeit, die dies gefördert hat. Danken möchte ich dir auch für all die Unterstützung, die du mir über den eigentlichen Rahmen dieser Doktorarbeit hinaus hast zukommen lassen. Die Einblicke in wissenschaftliches Arbeiten, Arzt- und Mensch-Sein, die ich so erhalten konnte, haben mich sehr geprägt.
Prof. Dr. med. Claudia Binder Danke für die zahlreichen wissenschaftlichen Diskussionen, Anregungen und Verbesserungsvorschläge. Durch dich habe ich gelernt, immer wieder die eigenen Ergebnisse kritisch zu hinterfragen, jedoch im entscheidenden Moment auch in der Lage zu sein, eigene Ansichten vor anderen zu verteidigen.
Dr. med. Christina Dicke und Dr. med. Florian Klemm Herzlichen Dank euch beiden für den guten Start in die Doktorarbeit. Ohne euch wäre dies nicht so unkompliziert gelungen.
Dr. med. Annalen Bleckman Danke dir, für deine Hilfe mit der Statistik und die Möglichkeit, einen Teil dieser Promotion in deine klinischen Untersuchungen einzubringen.
Besonderer Dank gilt auch dem Rest des Laborteams für mannigfaltige Unterstützung über die Jahre.
147 Lebenslauf
Am 02. Dezember 1988 wurde ich als Tochter von Jens Daniel und Barabara Theresia Schubert, geborene Thamm, in Dresden geboren.
Von 1999 bis 2008 besuchte ich das St. Benno-Gymnasium in Dresden. Das Schuljahr 2005/06 durfte ich als Stipendiatin des Parlamentarischen Patenschaftsprogramms des Deutschen Bundestags in Fort Worth/Dallas, Tx, USA verbringen.
Ich schloss die gymnasiale Oberstufe im Jahr 2008 mit der Allgemeinen Hochschulreife (Durchschnitt 1,1) ab.
Im folgenden Herbst nahm ich das Studium der Humanmedizin an der Georg August-Universität in Göttingen auf. Den ersten Abschnitt der ärztlichen Prüfung absolvierte ich im Sommer 2010 mit der Gesamtnote „gut“ (2,0).
Im Wintersemester 2011/12 wurde ich in die Deutsche Studierendenförderung durch die Konrad-Adenauer-Stiftung aufgenommen.
Den schriftlichen Teil des zweiten Staatsexamens bestand ich im Frühjahr 2014 mit der Note
„gut“ (2,0), im Mai 2015 die mündlich-praktische Prüfung mit „sehr gut“ (1,0).
Die Arbeiten zur vorliegenden Promotion begann ich in der Arbeitsgruppe um Prof. Dr.
Tobias Pukrop und Prof. Dr. Claudia Binder im Herbst 2011, wobei ich im Wintersemester 2011/12 hierfür ein Forschungssemester nahm.
Für die bis dahin erlangten Zwischenergebnisse und zur Förderung weiterer experimenteller Arbeiten erhielt ich im Frühjahr 2012 das Stipendium „Gö4Med“ der Universitätsmedizin Göttingen.
Seit Oktober 2015 arbeite ich in der Klinik für Hämatologie und Medizinische Onkologie der Universitätsmedizin Göttingen als Assistenzärztin.