1-ACT 1-Antichymotrypsin
1-AT 1-Antitrypsin
1-PI 1-Protease-Inhibitor
AGT Angiotensinogen
Ak Antikörper
ARE Adenin-Uracil-reiche Elemente
ARF1 ARF1-GTPase
ARF-GAP ARF1-spezifisches GTPase-aktivierendes Protein
AS Aminosäure
ATIII Antithrombin III
BiP „binding protein“
BSA bovines Serum Albumin
CaM2 Calmodulin 2
CIP „calf intestinal phosphatase“
CBP2 Collagen-bindendes Protein 2
CF1 „cleavage factor 1“
CF2 „cleavage factor 2“
CGN cis-Golgi-Netzwerk
COPI „coating protein complex 1“
COPII „coating protein complex 2“
CPSF „cleavage and polyadenylation stimulation factor“
CstF „cleavage stimulation factor“
CMA Carboxymethylaspartat
cv „column volume“
ddNTP 2', 3'-Didesoxynukleotid-5'-Triphosphat
dNTP 2'-Desoxynukleotid-5'-Triphosphat
ECL „enhanced chemiluminescence“
ECM extrazelluläre Matrix
ER endoplasmatisches Retikulum
ERAD ER-assoziierte-Degradation
EST „expressed sequence tags“
FPLC „fast protein liquid chromatography”
GRP94 Glukose-reguliertes Protein 94 kD
GST Glutathion-S-Transferase
HCII Heparinkofaktor II
HIS6 Markierung mit 6 Histidinresten
HRP „horse radish peroxidase“
HSP47 Hitzeschockprotein 47 kD
MALDI-TOF-MS „matrix assisted laser desorption / ionization - time of flight“
MASP Mannose-bindende Lektin-assozierte Serinprotease
MCS „multiple cloning site“
NEI Monozyten / neutrophiler Elastaseinhibitor NIa „nuclear inclusion a“-Protein von TEV
NTA „nitrilotriacetic acid“
ODxxx optische Dichte bei xxx nm
ORF „open reading frame“
PAI1 Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 PAI2 Plasminogenaktivator-Inhibitor-2
PAP Poly(A)-Polymerase
PABPI Poly(A)-bindendes Protein I
PC Prohormon- / Proproteinkonvertase
PCI Protein C-Inhibitor
PDI Protein-Disulfid-Isomerase
PEDF „pigment epithelium-derived factor“
Pol II-CTD C-terminale Domäne der großen Untereinheit der RNA-Polymerase II
QC Qualitätskontrolle
RCL „reactive center loop“
RLM-RACE „RNA ligase-mediated rapid amplification of 5' and 3' cDNA ends“
SCCA1 „squamous cell carcinoma antigen 1“
SCCA2 „squamous cell carcinoma antigen 2“
SRP „signal recognition particle“
TAP „tobacco acid pyrophosphatase“
TBG Thyroxin-bindendes Globulin
TEV „tobacco etch virus“, Tabakätzvirus
TGN trans-Golgi-Netzwerk
TRITC Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (rot fluoreszierender Farbstoff)
UTR „untranslated region“
VTC vesikuläre tubuläre Cluster
Abkürzungen für Chemikalien s. C.1.2
G.4
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Branchiostoma lanceolatum... 4
Abbildung 2: Schematischer Längs- und Querschnitt von Branchiostoma lanceolatum... 4
Abbildung 3: Molekülstruktur eines Serpins... 6
Abbildung 4: „Branched pathway“-Modell... 8
Abbildung 5: Biologische Funktionen einiger humaner Serpine... 10
Abbildung 6: Darstellung der an der Polyadenylierung beteiligten Faktoren... 12
Abbildung 7: Modell zur Rückführung ER-residenter Proteine mit KDEL-Signal...17
Abbildung 8: Gelbild der DNA-Längenstandards...31
Abbildung 9: Schematische Darstellung einer reversen Transkription...37
Abbildung 10: Schema der FPLC-Anlage ... 60
Abbildung 11: Kontrolle der reversen Transkription durch Calmodulin 2-spezifische PCR... 69
Abbildung 12: Schematische Darstellung der Primerpositionen zur Amplifikation des 3'-Bereichs der Serpin1-cDNA...70
Abbildung 13: PCR-Produkte von Branchiostoma lanceolatum-cDNA mit Serpin1-spezifischen Primern... 71
Abbildung 14: Seminested PCR zur Produkt-Charakterisierung (Primerkombination BL2_f2 / GeneRacer3'nested)...72
Abbildung 15: Schematische Darstellung der Plasmidinserts und die Zuordnung zu den Sequenzgruppen... 74
Abbildung 16: Kontrolle der reversen Transkription mittels Amplifikation des 5'-Bereichs der Calmodulin 2-cDNA... 76
Abbildung 17: Nested PCR mit der Primerkombination GeneRacer5'-nested / BL2_r2 zur Amplifikation des 5'-Bereichs der cDNA von Serpin1... 77
Abbildung 18: PCR-Amplifikation des gesamten kodierenden Bereichs der cDNA von Serpin1 mit der Primerkombination BL2_b5'+ / BL2_b3'-... 79
Abbildung 19: Ermittlung der optimalen Anlagerungstemperatur des Primers BL2_r3a...80
Abbildung 20: Sequenz der cDNA für Serpin1 von Branchiostoma lanceolatum... 82
Abbildung 21: Aminosäuresequenzen der reaktiven Schleifen (Positionen P17 - P2') von humanem Antithrombin III und Serpin1 von Branchiostoma lanceolatum... 84
Abbildung 22: 5'-Bereich der Serpin1-cDNA und die abgeleitete Proteinsequenz... 86
Abbildung 23: Modell der Tertiärstruktur von Serpin1... 88
Abbildung 24: Sekundärstrukturelemente des Serpin1-Proteinmodells... 89
Abbildung 25: Alignment der kodierenden 3'-Bereiche der cDNA von Grupppe a und b ... 90
Abbildung 26: Alignment der nicht translatierten 3'-Bereiche der cDNA-Sequenzen der Gruppen a und b... 93
Abbildung 27: Primer zur Konstruktion des GST / TEV / Serpin1-Konstrukts... 96
Abbildung 28: Karte des Konstrukts pUT19... 97
Abbildung 29: Wachstumskurven unter dem Einfluss von IPTG...99
Abbildung 30: Einfluss verschiedener IPTG-Konzentrationen auf die Proteinexpression...100
Abbildung 31: Einfluss verschiedener IPTG-Konzentrationen auf die Proteinexpression nach Normierung auf eine OD600 von 1,85... 100
Abbildung 32: Elutionsprofil einer Fusionsprotein-Aufreinigung an Glutathion-Sepharose. 102 Abbildung 33: SDS-Polyacrylamid-Gelelektophorese der Elutionsfraktionen einer Fusionsprotein-Aufreinigung an Glutathion-Sepharose... 103
Abbildung 34: Spaltung des Fusionsproteins mit TEV-Protease...105
Abbildung 35: Versuch zur Entfernung der His6-markierten GST und TEV-Protease...107
Abbildung 36: Darstellung der Teilergebnisse einer Serpin1-Aufreinigung... 109
Abbildung 37: Bildung SDS-stabiler Komplexe zwischen Thrombin und Serpin1... 111
Abbildung 38: Nachweis der Spezifität und Ermittlung der Nachweisgrenze von Serpin1 mittels der Antiseren von 3 Kaninchen... 112
Abbildung 39: Nachweis von gereinigtem Serpin1 bzw. GST-Serpin1-Fusionsprotein und der Thrombinkomplexe mit dem Antiserum von Kaninchen 1...113
Abbildung 40: Nachweis von Serpin1 im Rohextrakt von Branchiostoma lanceolatum... 114
Abbildung 41: Versuche zur immunhistologischen Lokalisation von Serpin1 in Querschnitten von Branchiostoma lanceolatum ... 116
G.5
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Größen der für den 3'-Bereich der Calmodulin 2-spezifischen PCR-Produkte... 68
Tabelle 2: Abstände der Serpin1-spezifischen Plus-Strangprimer...70
Tabelle 3: Plasmidkonstrukte mit PCR-Produkten des 3'-Bereichs der cDNA von Serpin1....73
Tabelle 4: Aufbau der Plasmidinserts mit den 3'-cDNA-Varianten von Serpin1... 75
Tabelle 5: Größen der für den 5'-Bereich der Calmodulin 2-spezifischen PCR-Produkte... 76
Tabelle 6: Nukleotidzusammensetzung und GC-Gehalt der cDNA von Serpin1...83
Tabelle 7: Merkmale der cDNA von Serpin1... 83
Tabelle 8: Charakteristische Merkmale der abgeleiteten Proteinsequenz von Serpin1... 87
Tabelle 9: Basensubstitutionen zwischen den Gruppen a und b... 91
Tabelle 10: Positionen von Basensubstitutionen mit Auswirkungen auf die Aminosäuresequenz und die Lokalisation im Strukturmodell von Serpin1...92
Tabelle 11: Substitutionen im nicht translatierten 3'-Bereich der Gruppen a und b... 94
Tabelle 12: Postulierte Polyadenylierungssignale der verschiedenen cDNA-Varianten... 95
Tabelle 13: Verlauf der OD600 unter dem Einfluss verschiedener IPTG-Konzentrationen... 98
Tabelle 14: Vergleich der auf eine OD600 von 1,85 normierten Fusionsprotein-Banden... 101
Tabelle 15: Konzentration des Fusionsproteins in den Fraktionen einer Glutathion-Sepharose-Aufreinigung...103
Tabelle 16: Relative Serpin1-Menge (% der Kontrolle K) im Überstand...107
Tabelle 17: Relative GST-Menge (% der Kontrolle K) im Überstand... 107