116
117 ESCRT endosomal sorting complex required for transport
et al. et aliter (und andere)
Ex. Extinktion
F Fusionsprotein
FCS fötales Kälberserum
FISH Fluorescent in situ hybridization
g gramm
G Glykoprotein
GA Glutaraldehyd
GM130 Golgi Matrixprotein 130
GP3 Serum eines NiV-infizierten Meerschweinchens G3BP1 RasGAP SH3-domain-binding protein 1
h Stunde
HeLa humane Zervixzellen
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure HeV Hendravirus
hMPV Humanes Metapneumovirus hPIV Humanes Parainfluenzavirus
HRP Horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase) Huh7 humane Hepatom Zelllinie
IB inclusion body
IFA Immunfluoreszenzanalyse
IFN Interferon
IG ImmunoGlobe
IgG Immunglobulin G IKKε IκB kinase-ε Imp-α Importi-α
IP Immunpräzipitation ISG IFN-stimulierten Genen
k Kilo
kb Kilobasenpaare
KLD Kinase-Ligase-DpnI
KV Kumasivirus
l Liter
L Polymerase
Lamp1 Lysosomal-associated membrane protein 1 LASV Lassavirus
LB liquid broth
LFA 2000 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent LMB Leptomycin B
118
m Meter
m mili
M Matrixprotein
M molar (mol/l)
M Monomer
MAB monoklonaler Antikörper MAPs microtubule associated proteins MARV Marburgvirus
mCherry monomeric red fluorescent protein Cherry MCS multiple cloning site
MD Multimerisationsdomäne
MDCK Madin-Darby canine kidney cells
ME Mercaptoethanol
MEM Minimal essential medium min Minuten
mol Mol
MOI multiplicity of infection MojV Mojiangvirus
mRNA messenger RNA
MT Mikrotubuli
MTOC microtuble organizing center
mut mutiert
MuV Mumpsvirus
MV Masernvirus
n Nano
N Nukleoprotein
NDV Newcastle Disease Virus
NES nuclear export signal (Kernexportsignal) NEB New England Biolabs
NiV Nipahvirus
NLS nuclear localization signal (Kernimportsignal) Noco Nocodazol
NPC nuclear cor complex NTR N-terminale Region
O Oligomer
OD optische Dichte
ORF open reading frame
p Piko
P Phosphoprotein
PAGE polyacrylamide gel electrophoresis PBS phosphate buffered saline
PBMEC primary porcine brain microvascular endothelial cells PCR Polymerase-Kettenreaktion
PFA Paraformaldehyd pH potential hydrogenii
119 PI Protease-Inhibitor
p.i. post infection (nach der Infektion)
PM Plasmamembran
PMP70 70-kDa peroxisomal membrane protein
PP Probenpuffer
p.t. post transfection (nach der Transfektion)
qPCR Quantitative Real-Time-PCR
RABV Tollwutvirus rel. relativ
RNA Ribonukleinsäure RNP Nukleokapsid ROI region of interest
rpm rounds per minute (Umdrehungen pro Minute) RSV Respiratorisches Synzytialvirus
RT Raumtemperatur
SAP shrimp alkaline phosphatase
sec Sekunde
SeV Sendaivirus
SDS Natriumdodecylsulfat
T Tetramer
Tab. Tabelle
TBE TRIS-Borat-EDTA
TCID50 tissue culture infective dosis
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin TRIM Tripartite Motif
TRITC Tetramethylrhodamine Tsg101 Tumor susceptibility gene 101
TWEEN-20 Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat
TX Triton X-100
U units (Einheiten) UV Ultraviolett
ÜS Überstand
vgl. vergleiche
VLP virus-like particle (Virus-ahnliches Partikel) VP40 Matrixprotein (Filoviren)
X beliebige Aminosaure XD C-terminale X Domäne
wt Wildtyp
z. B. zum Beispiel
120
µ Mikro
λ Wellenlänge
Abkürzungen der Aminosäuren
A Ala Alanin M Met Methionin
C Cys Cystein N Asn Asparagin
D Asp Aspartat P Pro Prolin
E Glu Glutamat Q Gln Glutamin
F Phe Phenylalanin R Arg Arginin
G Gly Glyzin S Ser Serin
H His Histidin T Thr Threonin
I Ile Isoleucin V Val Valin
K Lys Lysin W Trp Tryptophan
L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin
A.2 Tabellenverzeichnis
Tabelle I.1: Taxonomie der Mononegavirales (modifiziert nach Afonso et al., 2016) . 5 Tabelle III.1: Verwendete templates und Primer zur Umklonierung von NiV-N und -P.
... 74
Tabelle III.2: Verwendete Primer zur Herstellung der NiV-M-Mutanten ... 76
Tabelle III.3: Verwendete Zelllinien ... 82
Tabelle III.4: Aussäen der Zellen auf unterschiedliche Kulturgefäße ... 83
Tabelle III.5: Transfektionsansätze mit LFA 2000 und FuGENE HD ... 84
Tabelle III.6: Auslistung der verwendeten rekombinanten Viren ... 86
Tabelle III.7: Antikörper zur Färbung von NiV Proteinen in der Einzelexpression ... 88
Tabelle III.8: Antikörper zur Färbung von NiV-M, -N und -P in infizierten Vero76-Zellen ... 89
Tabelle III.9: Verwendete Antikörper zur Färbung von zellulären Kompartimenten ... 90
Tabelle III.10: Verwendete Antikörper zur Färbung viraler Matrixproteine ... 91
Tabelle III.11: Verwendete Antikörper zur Färbung von NiV M und Zytoskelett-Markern in transfizierten Vero76-Zellen ... 92 Tabelle III.12: Plasmid-Kombinationen zur Untersuchung der getaggten NiV Proteine 96
121
A.3 Abbildungsverzeichnis
Abbildung I.1: Schematische Darstellung (A) des NiV-Partikels und (B) des NiV-
Genoms. ... 7
Abbildung I.2: Schematische Darstellung des NiV-Replikationszyklus. ... 9
Abbildung I.3: Schematische Darstellung des reversen Genetik-Systems (modifiziert nach Frau Prof. Dr. A. Maisner 2002 Habilitationsschrift). ... 11
Abbildung I.4: Darstellung der NDV-M Struktur mittels Kryo-Elektrotomographie (aus Battisti et al., 2012). ... 16
Abbildung I.5: Schematische Darstellung des NiV-Ms und sein intrazellulärer Transportweg (modifiziert nach Watkinson und Lee, 2016). ... 17
Abbildung I.6: Schematische Darstellung der Zytoskelett-Bestandteile. ... 21
Abbildung II.1: Lokalisation von NiV-M und NiV-M-Mutanten in unterschiedlichen Zelllinien. ... 25
Abbildung II.2: Lokalisation von IB und M in rNiV-infizierten und kotransfizierten Vero76-Zellen. ... 29
Abbildung II.3: Kolokalisation von NiV-IB mit zellulären Kompartimenten. ... 31
Abbildung II.4: Kolokalisationsstudien von NiV-N, NiV-P und NiV-M. ... 33
Abbildung II.5: Live cell imaging-Studien zur IB-Bildung. ... 35
Abbildung II.6: Elektronenmikroskopische Untersuchung von NiV-N, -P und -M transient exprimierenden Zellen. ... 37
Abbildung II.7: Kolokalisation von NiV-IB und anderen viralen Matrixproteinen. ... 40
Abbildung II.8: Kolokalisation von IB mit NiV-M Kernimport- und Kernexport- Mutanten. ... 43
Abbildung II.9: Charakterisierung einer rekombinatem NiV-Mutante (rNiV-MNESmut). 46 Abbildung II.10: Oligomerisierung der M-Mutanten. ... 48
Abbildung II.11: Kolokalisation von M mit Tubulin bzw. Aktin in An- und Abwesenheit von Nocodazoal bzw. Cytochalasin D. ... 50
Abbildung II.12: Kolokalisation von M und IB mit Tubulin oder Aktin in An- und Abwesenheit von Nocodazoal oder Cytochalasin D. ... 52
Abbildung II.13: Lokalisationsstudien eines M mit deletierten C-Terminus. ... 55
Abbildung III.1: Modell zum NiV-M und Aktin-abhängigen NiV-RNP Transport an die Plasmamembran. ... 70
122 Abbildung IV.1: Schematische Darstellung der gerichteten Mutagenese mittels Site- Directed Mutagenesis Kit. ... 75 Abbildung IV.2: Austitrieren der optimalen Konzentration von Zytoskelett-Inhibitoren.
... 85 Abbildung IV.3: Einzelschritte bei der Verwendung des ImageJ-Makros NukLoM. ... 94 Abbildung IV.4: Verteilung von eGFP- und mCherry-getaggten NiV-Proteinen. ... 97
123
A.4 Publikationsliste
Veröffentlichungen
Laura Behner, Louisa Zimmermann, Marc Ringel, Michael Weis und Andrea Maisner (2017): Influence of oligomerization, glycosylation and endocytosis on the bioactivity of an African bat henipavirus G protein with unknown zoonotic potential. (submitted).
Marc Ringel, Sandro Halwe, Anja Heiner, Laura Behner, Lucie Sauerhering, Nico Becker, Michael Weis, Erik Dietzel, Larissa Kolesnikowa, Stephan Becker, Veronika von Messling und Andrea Maisner (2017): Nipah virus nucleocapsid transport to the cell periphery requires functional matrix proteins and intact actin filaments. (manuscript in preparation).
Vorträge
Marc Ringel, Pauline Schepsky, Boris Lamp and Andrea Maisner (2016): Nipah virus matrix protein nuclear trafficking is cell-type independent. 26th Annual Meeting of the Society for Virology (GFV 2016), 06.04 – 09.04.2016, Münster, Deutschland
Poster
Boris Lamp, Erik Dietzel, Marc Ringel, Larissa Kolesnikova, Andrea Maisner (2013):
Studies on fluorescently labeled Nipah virus matrix protein. Negative Strang Virus Meeting (NSV 2013), Granada, Spanien
Marc Ringel, Pauline Schepsky, Kevin Wittwer, Boris Lamp and Andrea Maisner (2016):
Nuclear trafficking of Nipah virus matrix protein is cell-type independent. 35th Annual Meeting for the American Society for Virology (ASV 2016), 18.06. – 22.06.2016, Blacksburg, Virginia, USA.
124 Julian Hüther, Laura Behner, Cornelius Rohde, Verena Krähling, Marc Ringel, and Andrea Maisner (2017): Induction of the unfolded protein response by Henipavirus glycoproteins. 27th Annual Meeting of the Society for Virology (GFV 2017), 22.03 – 25.03.2017, Marburg, Deutschland
Julian Hüther, Laura Behner, Cornelius Rohde, Verena Krähling, Marc Ringel, and Andrea Maisner (2017): Henipavirus glycoproteins induce the unfolded protein response. 68.
Mosbacher Kolloquium – „Cell Organelles – Origin, Dynamics, Communication“, 30.03 – 01.04.2017, Marburg, Deutschland
125
A.5 Verzeichnis der akademischen Lehrer
Meine akademischen Lehrer waren folgende Damen und Herren in Göttingen:
Ackermann, Braus, Dickmanns, Diederichsen, Feußner, Ficner, Fischer, Friedl, Gatz, Göpfert, Heineke, Hodac, Kappler, Köhler, Leuschner, Lipka, Morgenstern, Pöggeler, Schwerdtfeger, Stalke, Stülke, Teichmann, Valerius, Willmann, Wimmer,
Meine akademischen Lehrer waren folgende Damen und Herren in Marburg:
Bauer, Baumeister, Becker, Bremer, Brune, Conrad, Heider, Huber, Frenzel, Lingelbach, Maisner, Przyborski, Rexer, Sogaard-Andersen, Thanbichler.
126
A.6 Danksagung
Ich möchte Frau Prof. Dr. Andrea Maisner danken, dass sie mir ermöglicht hat in ihrer Arbeitsgruppe meine Doktorarbeit anzufertigen. Ich danke Ihr für die stets konstruktiven Diskussionen, für die Unterstützung bei wissenschaftlichen und organisatorischen Fragen, für das Korrekturlesen der Arbeit und für die Bereitstellung dieses spannenden Themas.
Herrn Prof. Dr. Stephan Becker danke ich für die hervorragenden Arbeitsbedingungen und ein rundum angenehmes Arbeitsklima am Institut für Virologie. Auch möchte ich mich für das rege Interesse und die ständige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft im Rahmen der Marphili-Simulation bedanken.
Herrn Prof. Dr. Stefan Finke danke ich für die Bereitstellung des Hendravirus-Serums und des HeV-M Expressionsplasmids.
Frau Dr. Larissa Kolesnikowa danke ich für Ihre Mühe, Zeit und die gelungenen Elektronenmikroskopie-Bilder sowie für die Erklärung was man auf diesen erkennen kann.
Der Jürgen Manchot Stifung danke ich für die Finanzierung meiner Arbeit.
Bei allen jetzigen und ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppe möchte ich für die freundliche Aufnahme, die stetige Hilfsbereitschaft und für ein „Wohlfühloasen“-artiges Arbeitsumfeld danken.
Boris danke ich für die tolle Einarbeitung in sein/mein Thema, für die Einführung in die Konfokal- und Lebendzell-Mikroskopie, für das Überlassen des M-Projekts und nicht zu zuletzt für einen Arbeitskollegen mit dem das Lachen nie zu kurz kam.
Anja, Erik, Laura, Lucie und Michael danke ich besonders für die Klonierungen der Vollen-Länge-Plasmiden, die virus rescues und für die aufwendigen Infektionsversuche im BSL-4-Labor.
Anja danke, dass du den Laden zusammenhälst und mich bei meinen Experimenten unterstützt hast.
Der morgendlichen und nachmittaglichen Kaffeerunde möchte ich für die liebevolle Aufnahme und die vielen Tränen danken. Auch wenn ich aus dem zweitcoolsten Labor komme, weiß ich doch, dass ich jederzeit bei euch herzlichen willkommen bin. Ebenfalls bedanken möchte ich mich für die mittlerweile zahlreichen amüsanten, außerdienstlichen Unternehmungen und freue mich auf viele weitere.
Kevin, Nico, Pauline, Pia, Steffen und Tay möchte ich danken, dass sie im Rahmen ihrer Bachelor- oder Masterarbeit und Praktika an dem M-Projekt mitgewirkt haben.
Vorallem möchte ich Nico für die Zuverfügungstellung seines Flotationsassay danken.