AF Alexa Fluor
APC Allophycocyanin
BSA engl. bovine serum albumine:
Rinderserum-albumin
CCL C-C chemokine ligand
CCR C-C chemokine receptor
CCR2ko engl.: CCR2 knockout: CCR2-Knockout
CX3CR1 chemokine (C-X3-C motif) receptor 1
Cy Cyanine
d engl. day: Tag
DAPI 4',6-Diamidino-2-phenylindol
DMEM Dulbecco's modified eagle medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Deoxyribonucleic acid
EAE Experimentelle autoimmune
Encephalomy-elitis
eGFP engl. enhanced green fluorescent protein
FACS Fluorescence-activated cell sorting
FITC Fluorescein isothiocyanate
HBSS- Hanks balanced salt solution w/o Ca2+/Mg2+
HBSS+ Hanks balanced salt solution w Ca2+/Mg2+
i. p. Intraperitoneal
IBA1 ionized calcium-binding adapter molecule 1
IL Interleukin
ko engl. knockout: Knockout
MACS Magnetic-activated cell sorting
MCP-1=CCL2 Monocyte Chemoattractant Protein 1
mRNA messenger RNA
P/S Penicillin/Streptomycin
PBS phosphate-buffered Saline
PE Phycoerythrin
PerCP Peridinin-chlorophyll-protein complex
PFA Paraformaldehyd
RPM engl. revolutions per minute: Umdrehungen
pro Minute
RT Raumtemperatur
RTQ-PCR Real-Time quantitative PCR
TAM Tumor assoziierte Mikroglia/Makrophagen
TZI Tumorzellimplantation
WHO World Health Organization
wt engl. wildtype: Wildtyp
7.3 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Übersicht über die Herkunft monozytärer Zellen. ... 14
Abb. 2: Übersicht über die phänotypischen Erscheinungen von Mikrogliazellen. ... 16
Abb. 3: In-vitro-Modell zur Einteilung des Aktivierungsstatus von Mikroglia/Makrophagen. ... 18
Abb. 4: Übersicht über die etablierten Gruppen im Rahmen der Chimärengenerierung. ... 23
Abb. 5: Übersicht über alle generierten Chimärengruppen. ... 30
Abb. 6: Bleischutz zum Schutze des Kopfes bei Bestrahlung. ... 31
Abb. 7: Box zur intravenösen (i. v.) Injektion sowie zur Blutentnahme. ... 32
Abb. 8: Beispielhafte Darstellung eines Voxels über drei MRT-Schichten im Rahmen einer spektroskopischen Messung. ... 35
Abb. 9: Übersicht über die Gating-Strategie zur Erfassung der Reinheit an kultivierten Makrophagen. ... 44
Abb. 10: Gating-Strategie zur Detektion myeloider Zellen. ... 45
Abb. 11: Reinheitsbestimmung von isolierten Mikroglia/Makrophagen mittels MACS aus Hirnzellsuspensionen. ... 46
Abb. 12: CCR2-Expression von Mikroglia und Makrophagen. ... 59
Abb. 13: Knochenmarkanalyse von naiven C57BL/6J-, CX3CR1-eGFP- und CCR2ko-Mäusen. ... 61
Abb. 14: Rekonstitutionseffizienzen aller Chimärengruppen nach 6-8 Wochen. ... 63
Abb. 15: Blutanalysen der Chimärengruppen hinsichtlich T- und B-Zell-Anteilen. .... 64
Abb. 16: Die CCR2-Defizienz hatte einen großen Einfluss auf die Infiltration von Mikroglia und Makrophagen in die tumortragende Hemisphäre. ... 67 Abb. 17: Eine Einwanderung von Makrophagen in die kontralaterale Hirnhemisphäre fand kaum statt. ... 68 Abb. 18: Der Anteil der CD45high-Fraktion sank durch den CCR2ko in Mikroglia und Makrophagen drastisch. ... 69 Abb. 19: CCR2ko führte zur signifikanten Reduktion von Mikroglia und Makrophagen in der CD45high-Fraktion. ... 70 Abb. 20: Die CD45low-Fraktion bestand nahezu ausschließlich aus Mikroglia. ... 71 Abb. 21: Die CCR2-Defizienz zeigte einen heterogenen Einfluss auf die CD45high- und CD45low-Fraktionen. ... 74 Abb. 22: Die CCR2-Defizienz zeigte insgesamt einen moderaten Einfluss auf die verbliebenen Mikroglia in der CD45high-Fraktion. ... 76 Abb. 23: Die CCR2-Defizienz zeigte große Auswirkungen auf die verbliebenen Makrophagen in der CD45high-Fraktion. ... 78 Abb. 24: CCR2ko führte zu einer Änderung der Akkumulation von Mikroglia und Makrophagen im Tumorgewebe. ... 80 Abb. 25: Stimulation von Mikroglia und Makrophagen führte sowohl bei CX3CR1-eGFP als auch bei CCR2ko Zellen zum Anstieg der mittleren Fluoreszenzintensität. ... 83 Abb. 26: Mikroglia und Makrophagen zeigten durch eine CCR2-Defizienz nur geringe Einschränkungen bezüglich ihrer Phagozytosefähigkeit. ... 85 Abb. 27: Die CCR2-Defizienz zeigte keine Auswirkungen auf die Tumorvolumina. . 86 Abb. 28: Die spektroskopischen Messungen ergaben lediglich einen signifikanten Unterschied für den Metaboliten Taurin. ... 88 Abb. 29: Sowohl myeloide Zellen aus C57BL/6J- als auch aus CCR2ko-Tumormäusen exprimierten anti- und proinflammatorische Moleküle. ... 90
7.4 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Übersicht über verwendete Geräte, deren Hersteller sowie Standort. ... 24 Tab. 2: Übersicht über verwendete Materialien sowie deren Hersteller. ... 25 Tab. 3: Übersicht über verwendete Reagenzien/Kits und deren Hersteller. ... 25 Tab. 4: Übersicht über verwendete Zellkulturmedien und -zusätze und deren Hersteller. ... 26
Tab. 5: Übersicht über verwendete Puffer/Lösungen sowie deren Zusammensetzung
und Hersteller. ... 26
Tab. 6: Übersicht über verwendete Software und deren Hersteller/Entwickler. ... 27
Tab. 7: Überblick über verwendete Mauslinien und deren Herkunft bzw. Standort. . 27
Tab. 8: Zusammensetzung der Narkose... 29
Tab. 9: Übersicht des Phagozytose-Assays mit allen Konditionen. ... 40
Tab. 10: Übersicht der CD45-Stimulierung in vitro mit allen Konditionen. ... 40
Tab. 11: Übersicht über verwendete Antikörper zur Färbung von Blutproben. ... 43
Tab. 12: Übersicht über verwendete Antikörper zur Bestimmung der Monozyten/Makrophagen-Progenitorzellen. ... 44
Tab. 13: Übersicht über verwendete Antikörper zur Bestimmung des Ausreifungs- bzw. Reinheitsgrades der Makrophagenkultur. ... 44
Tab. 14: Übersicht über verwendete Antikörper zur Färbung von unfixierten Hirnzellsuspensionen... 45
Tab. 15: Übersicht aller verwendeten Antikörper an fixierten Zellen. ... 48
Tab. 16: Übersicht über alle Isotypenkontrollen. ... 48
Tab. 17: Übersicht über verwendete Antikörper zur Färbung von kultivierten Mikroglia. ... 49
Tab. 18: Übersicht über verwendete Antikörper zur Färbung von kultivierten Makrophagen. ... 49
Tab. 19: Bestandteile des Mastermixes aus Schritt 1 zur Eliminierung von DNA. .... 54
Tab. 20: Bestandteile des Mastermixes aus Schritt 2 zur Herstellung von cDNA. .... 54
Tab. 21: Übersicht über den bei der RTQ-PCR verwendeten Mastermix. ... 56
Tab. 22: Übersicht über verwendete Primersequenzen. ... 56
Tab. 23: (Vorläufer-)Zellen des Knochenmarks und ihre verschiedenen Oberflächenmarker. ... 60
Tab. 24: Übersicht über alle durchflusszytometrisch untersuchten Moleküle. ... 72
8 Anhang
8.1 Eidesstattliche Versicherung
Ich, Alexander Bungert, versichere an Eides statt durch meine eigenhändige Unter-schrift, dass ich die vorgelegte Dissertation mit dem Thema: „Charakterisierung CCR2-defizienter Mikroglia/Makrophagen im murinen Glioblastom“ selbstständig und ohne nicht offengelegte Hilfe Dritter verfasst und keine anderen als die angegebenen Quel-len und Hilfsmittel genutzt habe.
Alle Stellen, die wörtlich oder dem Sinne nach auf Publikationen oder Vorträgen ande-rer Autoren beruhen, sind als solche in korrekter Zitierung kenntlich gemacht. Die Abschnitte zu Methodik (insbesondere praktische Arbeiten, Laborbestimmungen, sta-tistische Aufarbeitung) und Resultaten (insbesondere Abbildungen, Graphiken und Tabellen werden von mir verantwortet.
Die Bedeutung dieser eidesstattlichen Versicherung und die strafrechtlichen Folgen einer unwahren eidesstattlichen Versicherung (§156,161 des Strafgesetzbuches) sind mir bekannt und bewusst.“
Datum Unterschrift
8.2 Curriculum vitae
Mein Lebenslauf wird aus datenschutzrechtlichen Gründen in der elektronischen Ver-sion meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
Mein Lebenslauf wird aus datenschutzrechtlichen Gründen in der elektronischen Ver-sion meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
Mein Lebenslauf wird aus datenschutzrechtlichen Gründen in der elektronischen Ver-sion meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
8.3 Publikationsliste
Brandenburg S, Müller A, Turkowski K, Radev YT, Rot S, Schmidt C, Bungert AD, Acker G, Schorr A, Hippe A, Miller K, Heppner FL, Homey B, Vajkoczy P: Resident microglia rather than peripheral macrophages promote vascularization in brain tumors and are source of alternative pro-angiogenic factors. Acta Neuropathol.
2016;131(3):365-78.
Turkowski K, Brandenburg S, Mueller A, Kremenetskaia I, Bungert AD, Blank A, Felsenstein M, Vajkoczy P: VEGF as a modulator of the innate immune response in glioblastoma. Glia. 2018 Jan;66(1):161-174.