A NTIBAKTERIELLE A KTIVITÄT DER β -D EFENSIN :I G -F USIONSPROTEINE

Zum Nachweis, dass die rekombinant exprimierten β-Defensin:Ig-Fusionsproteine die für die Familie der β-Defensine charakteristische antibakterielle Wirkung besitzen, wurden antibakterielle Assays mit verschiedenen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienstämmen durchgeführt.

In den Tests wurde jeweils ein Stamm von E. coli (ATCC 25922), B. subtilis (ATCC 6633), P. aeruginosa (ATCC 27853) und S. aureus (ATCC 25923) eingesetzt (siehe 2.1.10). Aus den ü. N. herangezogenen Kulturen wurde ein Aliquot in frisches und antibiotikumfreies LB-Medium angeimpft und bei 37° C geschüttelt. Hat die Kultur eine OD600 von 1,0 erreicht, konnte die Bakterienlösung mit ABA-Puffer auf eine Zellzahl von 1 x 10³ Zellen in 100 µl eingestellt und mit 1, 2 oder 5 µg/ml β-Defensin:Ig-Fusionsprotein versetzt werden. Als Kontrolle wurde eine entsprechende Menge PBS-Puffer ohne β-Defensin:Ig-Fusionsprotein eingesetzt. Zusätzlich wurde als weitere Kontrolle das hIgG1 ohne β-Defensin verwendet, um auszuschließen, dass der Fc-Teil das Überleben der Bakterien beeinflusst. Nach 3 h Inkubation bei 37° C wurde eine 1:10 Verdünnung des jeweiligen Ansatzes auf LB-Platten ausgestrichen und ü. N. bei 37° C inkubiert. Schließlich wurden die jeweils gewachsenen Kolonien gezählt (siehe 2.2.9). Die Versuche wurden stets in Triplikaten durchgeführt und die daraus erhaltenen Mittelwerte ± SD grafisch dargestellt.

Gegen E. coli (Gram-negativ) zeigte das Fusionsprotein mBD14:Ig eine deutliche antibakterielle Wirkung. Schon ab einer Konzentration von 2 µg/ml waren keine Kolonien mehr auf den LB-Agarplatten gewachsen, d. h. die Bakterien wurden vollständig abgetötet (Abb. 19a+b). Gegen S. aureus (Gram-positiv) hingegen zeigte sich keine antibakterielle Aktivität des eingesetzten mBD14:Ig (Abb. 19c). Der Gram-negative Keim P. aeruginosa reagiert wiederum empfindlich auf mBD14:Ig, lässt sich aber auch mit einer Konzentration von 5 µg/ml mBD14:Ig nicht vollständig am Wachstum hindern (Abb. 19d). B. subtilis (Gram-positiv) zeigte nach der Behandlung mit mBD14:Ig in einer Konzentration von 5 µg/ml keine Kolonien mehr auf den LB-Agarplatten d. h. alle Bakterien wurden abgetötet (Abb. 19e).

Abb. 19: Antibakterielle Aktivität des mBD14:Ig. a) E. coli ATCC 25922 auf LB-Agarplatten, b) E. coli ATCC 25922, c) S. aureus ATCC 25923, d) P. aeruginosa ATCC 27853, e) B. subtilis ATCC 6633. Aus einer Vorkultur wurden die Bakterien bis zu einer OD600 von 1,0 herangezogen und auf 1 x 10³ Zellen in einem Volumen von 100 µl eingestellt. Anschließend wurden die Bakterien mit 1, 2 oder 5 µg/ml mBD14:Ig oder mit PBS-Puffer (Puffer) über 3 h bei 37° C inkubiert. Daraufhin wurde jeweils eine 1:10 Verdünnung auf LB-Agarplatten ausplattiert und ü. N. bei 37° C inkubiert. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt und die Mittelwerte ± SD aufgetragen.

Das mBD4:Ig demonstrierte ebenfalls antibakterielle Wirksamkeit gegenüber E. coli, wie in Abb. 20a gezeigt. S. aureus hingegen zeigte wieder keine veränderte Überlebensrate nachdem mBD4:Ig zugegeben wurde (Abb. 20b). Die Überlebensrate von P. aeruginosa sinkt wiederum mit steigender mBD4:Ig Konzentration, aber auch mit 5 µg/ml mBD4:Ig überlebten noch einzelne Bakterien (Abb. 20c). B. subtilis wurde wiederum mit der höchsten eingesetzten mBD4:Ig Konzentration vollständig abgetötet, sodass keine einzige Kolonie mehr gewachsen war (Abb. 20d).

Abb. 20: Antibakterielle Aktivität des mBD4:Ig. a) E. coli ATCC 25922, b) S. aureus ATCC 25923, c) P. aeruginosa ATCC 27853, d) B. subtilis ATCC 6633. Aus einer Vorkultur wurden die Bakterien bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 herangezogen und auf 1 x 10³ Zellen in einem Volumen von 100 µl eingestellt.

Anschließend wurden die Bakterien mit 1, 2 oder 5 µg/ml mBD4:Ig oder mit PBS-Puffer (Puffer) über 3 h bei 37° C inkubiert. Daraufhin wurde jeweils eine 1:10 Verdünnung auf LB-Agarplatten ausplattiert und ü. N. bei 37° C inkubiert. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt und die Mittelwerte ± SD aufgetragen.

Die Versuche zur antibakteriellen Aktivität des hBD3:Ig zeigten, dass E. coli erst mit einer Konzentration von 5 µg/ml hBD3:Ig vollständig abgetötet wurde (Abb. 21a). Die Versuche mit S. aureus zeigten auch hier wieder keine bakterizide Wirkung des verwendeten hBD3:Ig-Fusionsproteins (Abb. 21b).

Abb. 21: Antibakterielle Aktivität des hBD3:Ig. a) E. coli ATCC 25922, b) S. aureus ATCC 25923. Aus einer Vorkultur wurden die Bakterien bis zu einer OD600 von 1,0 herangezogen und auf 1 x 10³ Zellen in einem Volumen von 100 µl eingestellt. Anschließend wurden die Bakterien mit 1, 2 oder 5 µg/ml hBD3:Ig oder mit PBS-Puffer (Puffer) über 3 h bei 37° C inkubiert. Daraufhin wurde jeweils eine 1:10 Verdünnung auf LB-Agarplatten ausplattiert und ü. N. bei 37° C inkubiert. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt und die Mittelwerte ± SD aufgetragen.

Auch das hBD2:Ig-Fusionsprotein wurde bezüglich einer antibakteriellen Wirkung überprüft.

Im Test mit E. coli waren schon ab einer hBD2:Ig Konzentration von 2 µg/ml keine Kolonien mehr auf den LB-Agarplatten gewachsen (Abb. 22a). Im Gegensatz dazu zeigt das hBD2:Ig gegen S. aureus auch in der höchsten eingesetzten Konzentration von 5 µg/ml kein vollständiges Abtöten der Bakterien. Allerdings nimmt mit steigender Konzentration die Zahl an Kolonien ab (Abb. 22b).

Abb. 22: Antibakterielle Aktivität des hBD2:Ig. a) E. coli ATCC 25922, b) S. aureus ATCC 25923. Aus einer Vorkultur wurden die Bakterien bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 herangezogen und auf 1 x 10³ Zellen in einem Volumen von 100 µl eingestellt. Anschließend wurden die Bakterien mit 1, 2 oder 5 µg/ml hBD2:Ig oder mit PBS-Puffer (Puffer) über 3 h bei 37° C inkubiert. Daraufhin wurde jeweils eine 1:10 Verdünnung auf LB-Agarplatten ausplattiert und ü. N. bei 37° C inkubiert. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt und die Mittelwerte ± SD aufgetragen.

Als Kontrolle wurden E. coli und S. aureus mit hIgG1, dem Expressionsprodukt des SIg+-Leervektors auf die gleiche Art und Weise behandelt wie zuvor mit den β-Defensin:Ig Konstrukten. Die Ergebnisse demonstrieren, dass der Fc-Teil keinen Einfluss auf die Überlebensrate der Bakterien hat (Abb. 23).

Abb. 23: Antibakterielle Versuche mit hIgG1. a) E. coli ATCC 25922, b) S. aureus ATCC 25923. Aus einer Vorkultur wurden die Bakterien bis zu einer OD₆₀₀ von 1,0 herangezogen und auf 1 x 10³ Zellen in einem Volumen von 100 µl eingestellt. Anschließend wurden die Bakterien mit 1, 2 oder 5 µg/ml hIgG₁ oder mit PBS-Puffer (PBS-Puffer) über 3 h bei 37° C inkubiert. Daraufhin wurde jeweils eine 1:10 Verdünnung auf LB-Agarplatten ausplattiert und ü. N. bei 37° C inkubiert. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt und die Mittelwerte

± SD aufgetragen.

In der folgenden Tabelle ist eine Übersicht über die antibakterielle Wirkung der β -Defensin-Fusionsproteine gezeigt. Die Stärke der antibakteriellen Aktivität ist unterteilt in vollständiges Abtöten der Bakterien (+ + +), unvollständiges Abtöten, aber deutlich bakterizider Effekt (+ +), leicht bakterizider Effekt (+) und keine bakterizide Wirkung (-). Nicht getestete Kombinationen wurden mit (x) gekennzeichnet.

mBD14:Ig mBD4:Ig hBD3:Ig hBD2:Ig hIgG1

E. coli

ATCC 25922 + + + + + + + + + + + + -

S. aureus

ATCC 25923 - - - + -

P. aeruginosa

ATCC 27853 + + + + x x x

B. subtilis

ATCC 6633 + + + + + + x x x