4. DISKUSSION
4.1 A NALYSE VON LUNGENKREBSSPEZIFISCHEN DNA-M ETHYLIERUNGSMUSTERN
Unmethylierte CpGs (< 20% Methylierung) konnten mit Promotor-assoziierten CpG-reichen Regionen (CpG-Inseln) in Verbindung gebracht werden (Abbildung 2 B). CpGs mit hohem Methylierungsgrad wiederum treten in CpG-armen Regionen auf (Abbildung 2B, C). Dieses Phänomen ist bereits in zahlreichen früheren Studien beschrieben worden (Cocozza et al, 2011; Jones, 2012).
Die Sonden des Illumina 450k Arrays decken darüber hinaus auch die Promotorbereiche von Genen ohne Promotor-CpG-Insel (40%) ab, jedoch mit nur ca. 4% der Sonden des Arrays. Die nicht-CpG-Insel Promotoren waren in den untersuchten Lungenkrebszelllinien, aber auch in normalen Bronchialepithelzellen (NHBEC) stark methyliert (Abbildung 2C). Gene, die keine CpG-Insel assoziierten Genpromotoren aufweisen, sind meist mit der Regulation von Genen verbunden, die gewebsspezifisch exprimiert werden (Takai & Jones, 2002).
In früheren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass CpG-arme Promotoren in somatischen Zellen präferentiell hypermethyliert vorliegen, dies aber nicht mit einer Beeinträchtigung ihrer Aktivität verbunden ist (Weber et al, 2007). Anhand verschiedener Beispiele (LAMB3, RUNX3) wurden an anderer Stelle jedoch auch Belege dafür gefunden, dass bei Genen mit geringer CpG-Dichte in ihren Promotorregionen, die DNA-Methylierung in diesen Regionen auch mit einer Reduktion der Genexpression verbunden ist (Han et al, 2011). Eine Überlegung für zukünftige Untersuchungsansätze wäre die gewonnenen Methylierungsdaten von den analysierten Lungenkrebszelllinien (A427, A549, H322) und Bronchialepithelzellen mit genomweiten Expressionsprofilen zu kombinieren. Dadurch ließen sich Aussagen über die Konsequenzen der Ausbildung krebsspezifischer Methylierungsmuster sowohl bei Genen, deren Promotorregion mit einer CpG-Insel assoziiert ist, als auch bei nicht-CpG-Insel-Promotor Genen, treffen.
Für eine detaillierte Analyse der Promotor-Methylierung wurde dieser Bereich in die Regionen TSS1500, TSS200, 5’UTR und 1stes E on aufgeschlüsselt. In den Regionen TSS200, 5’UTR und 1stes Exon konnten für die Lungenkrebszelllinien und die normalen Bronchialepithelzellen generell die niedrigen Methylierungsniveaus in diesem Bereich bestätigt werden (Vgl. Abbildung 2B und Abbildung 8). Die TSS200-Region, d.h. der Bereich 200 bp upstream einer Transkriptionsstartstelle (TSS) bis zum Transkriptionsstart war sowohl in den Krebszelllinien als auch in normalen Bronchialepithelzellen am niedrigsten methyliert (Abbildung 8). Erstaunlicherweise zeigte sich jedoch für den 5’UTR Bereich ein signifikanter Anstieg der mittleren DNA-Methylierung im 5’UTR im Vergleich zur TSS200-Region bzw. dem 1sten Exon (Abbildung 8). Darüber hinaus zeigte sich jedoch auch eine stärkere Streuung der 5’UTR-Methylierungsdaten im Vergleich zur TSS200- und 1st Exon-Gruppe. Dieser Effekt konnte sowohl bei Lungenkrebs- als auch bei NHBE-Zellen beobachtet werden.
In einer früheren Studie bei der die Methylierungsprofile verschiedener somatischer Gewebe nach denselben Analysegruppen aufgeschlüsselt wurden, konnte dieser Effekt ebenfalls beobachtet werden. In dieser Studie wurden die Methylierungsdaten von TSS200, 5’UTR und 1stem E on zusätzlich in 10 Quantile aufgegliedert: Dabei zeigte sich bei den 5’UTR-Daten, dass die meisten CpGs in dieser Region unmethyliert vorliegen (<10% Methylierung). Ein Teil der Methylierungsdaten weist jedoch ein besonders hohes Methylierungsniveau auf (>80% Methylierung), wodurch die starke Streuung innerhalb dieser Gruppe erklärt wird (Lokk et al, 2014). Das 5’UTR scheint tendenziell heterogener im Bezug auf das auftretende Methylierungsniveau zu sein (Abbildung 8). Dies könnte eventuell durch Unterschiede im GC-Gehalt, in der Länge oder der Lage dieser Region relativ zu einer CpG-Insel bedingt sein. Die Annotation der Sonden des Illumina 450k Arrays liefert nur wenige Kategorien von Gen-assoziierten Positionen. Für eine detaillierte Analyse wurden die Transkriptionsstart-assoziierten Sonden bei Price et al., 2013 in weitere Gruppen untergliedert
2013). Eine Analyse unter Verwendung dieser Kategorien könnte ein differenziertes Bild der Promotor-assoziierten DNA-Methylierung im Bezug auf 5’UTR und 1stes E on liefern.
Die TSS1500-Region zwischen -1500 bp und dem Transkriptionsstart zeigte im Vergleich von H322 Lungenkrebszellen zu NBHEC-Zellen die stärksten Unterschiede bei der mittleren Methylierung und der Streuung der Datenpunkte. Die hohe Variabilität der Methylierung in dieser Region wurde bereits in früheren Studien beschrieben und in diesem Zusammenhang wurde auch gemutmaßt, dass diese Regionen als potentielle Kandidaten für differentiell methylierte Regionen angesehen werden könnten (Wang et al, 2012a). Die DNA-Methylierung innerhalb des restlichen Genkörpers und des 3’UTR war bei allen untersuchten Proben sehr hoch (Abbildung 8). Der Übergang vom Genkörper zum 3’UTR war darüber hinaus mit einem weiteren nstieg der Methylierung verbunden (Abbildung 8). Es gibt Indizien dafür, dass die Transkriptionselongation durch DNA-Methylierung an beiden Enden eines Gens reguliert wird. Im Rahmen einer Studie von Choi et al, 2009 wurde gemutmaßt, dass durch epigenetische Inhibition der RNA Polymerase II-Elongation die Aufnahme von konstitutiven Exons während des Splicing-Prozesses erleichtert zu werden scheint. Besonders die DNA-Methylierung im letzten kodierenden Exon scheint dieses vor einem Skipping-Event zu bewahren (Choi et al, 2009).
Bei der Analyse des Methylierungsniveaus von CpG-Inseln, welche innerhalb des Genkörpers liegen, konnte in den untersuchten Lungenkrebszelllinien, aber auch in NHBE-Zellen eine starke Methylierung festgestellt werden (Abbildung 2C, Abbildung 10 B, C). Die meisten Genkörper-assoziierten DNA-Sequenzen sind CpG-arm, stark methyliert und enthalten unterschiedlichste repetitive und transponierbare Elemente (Hahn et al, 2011). Die Funktion von intragenischen CpG-Inseln, aber auch von CpG-Inseln in Regionen ohne kodierende Bereiche (gene deserts) wurde noch nicht ausgiebig untersucht. Ursprünglich wurde angenommen, dass die Funktion der CpG-Insel Methylierung außerhalb eines Promotorkontextes primär der Stilllegung von repetitiven DNA Elementen (wie retrovirale Sequenzen, ALU oder LINE1 Elemente, etc.) dient (Yoder et al, 1997). Auf Grundlage von Beobachtungen, dass H3K36 Trimethylierung (H3K36me3) mit der Transkriptionselongation in Verbindung steht und dass H3K36me3 wiederum an der Rekrutierung von DNA-Methyltransferasen (DNMTs) involviert ist, wurde die Hypothese aufgestellt, dass der Prozess der Transkriptionselongation an sich einen stimulierenden Effekt auf die DNA-Methylierung hat (Hahn et al, 2011).
Innerhalb von CpG-Inselsequenzen, die mit Genkörperbereichen und 3’UTR zusammenfallen, lassen sich beim Vergleich von NHBE- und H322-Zellen eine krebsspezifische Zunahmen der DNA-Methylierung feststellen. Dies deutet darauf hin, dass intragenische CpG-Inseln in normalen Zellen nicht per se stark methyliert vorkommen, sondern dass dies erst im Laufe der Tumorgenese erfolgt.
Dies lässt sich ebenfalls mit den Befunden, dass intragenische CpG-Inseln ein präferentielles Ziel für de novo Methylierung in Krebszellen darstellen, in Einklang bringen (Jones, 2012; Nguyen et al, 2001). In einer wiederführenden Analyse müsste festgestellt werden welche Gene intragenische hypermethylierte CpG-Inseln aufweisen und mit welchen GO-Terms diese assoziiert sind. Zur Bewertung der Konsequenzen, die sich aus der Hypermethylierung ergeben wäre eine Analyse, ob die hypermethylierten CpG in Exon- oder Intronsequenzen liegen, sinnvoll. Es konnte bereits gezeigt werden, dass Exonsequenzen höher als Intronsequenzen methyliert sind und das es an Exon-Intron-Grenzen zu einem Wechsel des Methylierungsgrades kommt (Laurent et al, 2010). Diese Befunde wurden als Hinweise für eine Rolle der intragenischen DNA-Methylierung bei der Regulation des Spleißings gedeutet (Laurent et al, 2010). Zusätzlich konnte eine Verbindung zwischen der methylierungssensitiven Bindung von CTCF in Genkörperbereichen und dem Prozess des alternativen Splicings gezogen werden (Shukla et al, 2011).
Die Verbindung aus DNA-Methylierung und Genexpression ist komplex und nicht generell mit einem repressiven Effekt verbunden (Wagner et al, 2014). Der regulatorische Einfluss einer methylierten Sequenz wird durch dessen Position relativ zu einer Transkriptionseinheit bestimmt. Die DNA-Methylierung im Bereich des Transkriptionsstarts inhibiert die Initiation der Transkription.
Paradoxerweise korreliert jedoch die DNA-Methylierung im Genkörper positiv mit der Genexpression (Jones, 2012). Yang et al., 2014 konnte zeigen, dass die Behandlung von HCT-116 Kolorektalkarzinomzellen mit 5-Aza-2'dC nicht nur mit einer generellen Reaktivierung der Genaktivität verbunden war, sondern ebenfalls mit einer Abnahme der Expression bestimmter Gene.
Diese 5-Aza-2'dC-bedingte Repression konnte einer Demethylierung von Genkörpersequenzen zugeschrieben werden. Die Wiederherstellung der ursprünglichen Genaktivität war mit einer Remethylierung dieser Bereiche durch DNMT3B verbunden (Yang et al, 2014). Darüber hinaus hat die Methylierung des Genkörpers einen stimulierenden Effekt auf die Transkriptionselongation (Yang et al, 2014). Intragenische, hypermethylierte Inseln enthalten, wie die promotorassoziierten CpG-Inseln, repressive Histon-Modifikationen (wie H3K9m3) und werden von Methyl CpG Binding Protein 2 (MECP2) gebunden. Diese Faktoren sind jedoch nur mit der Transkriptionsrepression verbunden, wenn sie an Transkriptionsstartsequenzen vorkommen (Jones, 2012).
Beim Vergleich der DNA Methylierungsmuster, die mit dem Illumina 450k Array von Lungenkrebszelllinien zu normalen Bronchialepithelzellen gewonnen wurden, fällt auf, dass CpG-Insel Bereiche in normalen Bronchialepithelzellen generell niedriger methyliert sind als in Krebszelllinien.
Dies wird vor allem durch die niedrigere DNA-Methylierung von NHBE-Zellen in intragenischen, nicht-Transkriptionsstart-assoziierten CpG-Inseln bedingt (Abbildung 2C, Abbildung 10 B). Intragenische CpG-Inseln konnten bereits in früheren Studien als präferentielles Ziel für die de novo Methylierung in Krebszellen identifiziert werden (Jones, 2012; Nguyen et al, 2001). Durch Erstellung von Expressionsprofilen der verwendeten Zelllinien könnte in einem zukünftigen Projekt eine funktionelle Charakterisierung der Konsequenzen einer krebsspezifischen Hypermethylierung in intragenische CpG-Inseln erfolgen.
Erstaunlicherweise zeigen sich zwischen den untersuchten Lungenkrebszelllinien starke Unterschiede im Bezug auf die mittlere Methylierung (Median) und der Streuung der Daten. Dies gilt bei der Betrachtung des kompletten Spektrums an Methylierungsinformationen (Abbildung 9A), aber auch wenn nur die DNA-Methylierung in bzw. außerhalb von CpG-Insel Bereichen berücksichtigt wird (Abbildung 2, Abbildung 9B-D). Bei den untersuchten Lungenkrebszelllinien handelt es sich um nicht-kleinzellige Lungenkrebs- (NSCLC)- Zelllinien. Nicht-nicht-kleinzellige Lungentumore sind weltweit die Ursache für die meisten Krebs-bedingten Todesfälle (Walter et al, 2012). Zu dieser Gruppe gehören verschiedene histologische Subtypen, die unter anderem Adenokarzinome (AD), Plattenepithelkarzinome (PEK) und großzellige Karzinome umfassen. Es gibt Befunde, dass die Histologie der Krebszellen einen Einfluss auf das Ansprechverhalten verschiedener Chemotherapeutika (Bevacizumab, Erlotinib und Pemetrexed) und damit auf die Therapiegestaltung bzw. den Erfolg der Krebstherapie haben (Walter et al, 2012). Im Rahmen einer früheren Studie konnten spezifische Genexpressionsmuster von Krebszellen identifiziert werden, welche in vitro mit einer Sensitivität bzw. Resistenz gegen den Tyrosinkinase-Hemmer Erlotinib verbunden war. Auf Grundlage dieser Genexpressionsprofile war eine Klassifizierung von NSCLC-Zelllinien in epithelial-like oder mesenchymal-like möglich (Yauch et al, 2005). In vielen Tumortypen ist der Übergang von einem epithelialen zu einem mesenchymalen Typ mit einer Zunahme der Aggressivität der Krebserkrankung, aufgrund erhöhter Motilität, Invasivität und Resistenz gegen Chemotherapeutika,
verschiedenen NSCLC-Zelllinien wurde mit phänotypischen Gesichtspunkten, der Zugehörigkeit zum epithelialen oder mesenchymalen Typ, und dem Tumorstadium korreliert (Daten nicht gezeigt). Es konnte dabei jedoch keine Korrelation festgestellt werden. Exemplarisch wurde darüber hinaus für die Lungenkrebszelllinien A427, A549, H322 und H358 die Expression der DNA-Methyltransferasen DNMT1, DNMT3A und DNMT3B bestimmt. Auf Grundlage dieser Daten konnte festgestellt werden, dass mit steigendem Expressionsniveau von DNMT1, DNMT3A bzw. DNMT3B ebenfalls die Höhe der mittleren Methylierung der Lungenkrebszelllinie zunahm (Abbildung 42). Zur Validierung dieser Korrelation wäre in weiterführenden Experimenten eine Ausweitung dieser Analyse auf andere NSCLC-Zelllinien zu empfehlen.
Repetitive Sequenzen, wie sie an den Zentromeren vorkommen, weisen einen hohen Methylierungsgrad auf. Die Hypermethylierung dieser Sequenzen liefert einen wichtigen Beitrag für die Stabilität der Chromosomen (z.B. bei der Trennung der Chromosomen während der Mitose).
Durch DNA-Methylierung wird auch die Expression von transponierbaren Elementen reprimiert und damit ebenfalls ein Beitrag zur genomischen Stabilität geleistet (Jones, 2012). Die krebsspezifischen Veränderungen des Methyloms ziehen neben Hypermethylierungen auch Hypomethylierungen von verschiedenen Bereichen des Genoms nach sich. Der Großteil des Genoms ist dabei einer Reduktion des Methylierungsgrades (Hypomethylierung) ausgesetzt, die besonders an repetitiven DNA Sequenzen, wie heterochromatischen DNA repeats, Retrotransposons und endogenen retroviralen Elementen auftritt (Dammann et al, 2010). Hypermethylierungen konnten dagegen überwiegend nur in CpG-Insel Regionen beobachtet werden (Ehrlich, 2002).
Auf Grundlage der Methylierungsdaten des Illumina 450k Arrays konnten für jede Analysegruppe ein höheres Methylierungslevel in den Lungenkrebszelllinien im Vergleich zu den NHBE-Zellen festgestellt werden (Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 8, Abbildung 11). Krebsspezifische Hypomethylierungen konnten nicht festgestellt werden. Dies liegt höchstwahrscheinlich an den Limitierungen des Illumina 450k Assays durch fehlende Sonden in repetitiven Sequenzen. Auf dem Illumina 450k Array sind 64% der Sonden mit CpG-Insel-Bereichen assoziiert, jedoch sind von den ca.
29,8 Mio. CpGs des humanen Genoms nur 1,9 Mio. CpGs in CpG-Inseln lokalisiert (Rollins et al, 2006).
Die meisten CpGs sind in Transposonelementen lokalisiert, diese werden jedoch auf dem Illumina 450k Array nur teilweise berücksichtigt (5% der Sonden liefern spezifische Informationen zur Methylierung in repetitiven Bereichen) bzw. stellen potentielle Fehlerquellen durch unspezifische Hybridisierung dar (Price et al, 2013). Durch die starke Überrepräsentation von CpG-Inselbereichen außerhalb von repetitiven Elementen werden die Bereiche in denen typischerweise Hypomethylierungen auftreten von der Analyse ausgenommen. Dies muss auch bei der Betrachtung der relativen Abundanz verschiedener Methylierungsniveaus berücksichtigt werden (Abbildung 1 A-C). Darüber hinaus wurden bereits generelle Array-bedingte Schwachstellen des Illumina 450k Arrays beschrieben: Im Hinblick auf das Sonden-Design konnten Cross-Hybridisierungen der Sonden mit nicht-Zielsequenzen festgestellt werden (Chen et al, 2013b). Zusätzlich konnten „batch“-Effekte, d.h.
systematische Fehler, die durch Aufteilung der analysierten Proben auf mehrere Arrays entstehen, als Ursache von Problemen bei nachfolgenden Analysen beobachtet werden (Harper et al, 2013). Für beide Probleme konnten jedoch verschiedene Lösungen entwickelt werden, die diese Fehlerquellen bei der Daten-Analyse ausschließen (Chen et al, 2011; Fortin et al, 2014).
Die Etablierung der genomweiten Methylierungsmuster erfolgt im Anschluss an die Implantierung des Embryos in die Gebärmutter durch die Aktivität von de novo DNA-Methyltransferasen (DNMT3A, DNMT3B). CpG-dichte Regionen werden durch einen gegenteilig wirkenden, noch nicht vollständig verstandenen Mechanismus vor einer Methylierung bewahrt (Cedar & Bergman, 2009). Zur Erklärung
wie CpG-Inseln frei von DNA-Methylierung gehalten werden, wurden verschiedene Modelle entwickelt: Ein Modell geht von einem aktiven DNA Demethylierungsmechanismus aus, bei welchem es zu einer spezifischen Entfernung der 5-Methylreste von den Cytosinbasen innerhalb von CpG-Inseln kommt. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt konnte jedoch in somatischen Geweben noch kein Faktor mit einer entsprechenden Demethylase-Aktivität identifiziert werden (Illingworth & Bird, 2009). Ein weiterer möglicher Mechanismus geht davon aus, dass die Anwesenheit von Transkriptionsfaktoren an CpG-Inselbereichen die Assoziation von DNMTs mit den entsprechenden Sequenzen aus sterischen Gründen verhindert. Am Beispiel des Aprt Gens konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass durch die Entfernung von Bindestellen des ubiquitär exprimierten Transkriptionsfaktors Sp1 aus der Promotor CpG-Insel des Aprt Gens, die de novo Methylierung dieser DNA Sequenzen induziert werden konnte (Illingworth & Bird, 2009). Ein anderes Modell bringt das Erscheinen von DNA-Methylierung an bestimmten Stellen im Genom während der Frühentwicklung des Embryos mit speziellen Histonmodifikationen in Verbindung. Vor allem das Auftreten der Methylierung von Histon H3 an Lysin4 (H3K4 - Mono-, Di- und Trimethylierung) scheint einen Einfluss auf die Verhinderung der Ausprägung von DNA-Methylierung an CpG-Inseln zu haben.
Die Methylierung von H3K4 wird durch H3K4 Methyltransferasen katalysiert, welche zur initierenden Form der RNA Polymerase II rekrutiert werden. Die RNA Polymerase II bindet im frühen Embryo überwiegend an CpG-Inseln und nur diese Regionen werden mit H3K4 Methylierung modifiziert. De novo DNA-Methylierung wird durch die DNA-Methyltransferasen DNMT3A und DNMT3B katalysiert.
Die Rekrutierung von DNMT3A und DNMT3B zu ihren Zielsequenzen erfolgt durch DNMT3L, einem Faktor, der wiederum an Histon H3 bindet. Die Bindung von DNMT3L an Nukleosomen wird durch die Methylierung von H3K4 verhindert. Als Konsequenz daraus tritt eine de novo Methylierung an CpGs überall im Genom auf, CpG-Inseln werden jedoch ausgespart (Cedar & Bergman, 2009).
Generell ist jedoch davon auszugehen, dass mehr als eines der vorgestellten Modelle bei der Entstehung von CpG-Inseln und an der Hypomethylierung dieser Sequenzen, welche normalerwiese auch nach der Differenzierung bestehen bleibt, beteiligt sind (Illingworth & Bird, 2009). Diese Modelle liefern darüber hinaus auch Ansätze bei der Untersuchung, wie es zur Entstehung aberranter DNA-Methylierungsmuster in Krebs kommen kann.