Überprüfung der Spezifität der konstruierten Sonden

Um die Spezifität der hergestellten Sense- (S/200-1; S/200-2; S/200-3; S/200-Q1; S/200-Q2) und Antisense-Sonden (AS/normal; AS/588) überprüfen zu können wurden zunächst HCV-spezifische RNA-Moleküle beider Polaritäten (Kontrolltranskripte) konstruiert. Sie umfassten den kompletten Bereich der HCV-Sonden und besaßen eine Länge von etwa 670 Nukleotiden.

Für die Herstellung der Kontrolltranskripte wurde ein 665 bp-langes Insert aus der 5’NTR/

Core-Region der HCV-cDNA des infektiösen Plasmides p90/HCV in die Vektoren pSP64 und pSP65 ligiert und somit unter die Kontrolle des SP6-Promotors gebracht (siehe 4.1.2).

Die Wahl von zwei Systemen statt einem bidirektionalen Vektor sollte dabei sicherstellen, dass bei der nachfolgenden in vitro Transkription nur RNA-Moleküle einer definierten Polari-tät entstehen konnten. Bemerkenswert war, dass die Ligation von Vektor und Insert insgesamt gesehen deutlich erfolgreicher verlief, wenn die 665 bp-langen HCV-Inserts vor ihrem Ver-dau mit Hind III und EcoR I zunächst einer Blunt End Ligation unterzogen wurden (siehe 4.1.2). Vermutlich wurden die endständig gelegenen Restriktionsschnittstellen im unligierten Insert von den Restriktionsenzymen nicht so gut erkannt wie die Schnittstellen, die nach der Blunt End Ligation der Inserts in eine zentralere Position gebracht wurden. Der vermeintlich bessere Verdau der ligierten Insert wirkte sich somit positiv auf die gesamte Ligation von Vektor und Insert aus.

Die Überprüfung der Spezifität der HCV-Sonden erfolgte schließlich mit unterschiedlichen Konzentrationen der synthetisch hergestellten Kontrolltranskripte über den HDA. Es zeigte sich, dass sowohl die Sense- als auch die Antisense-Sonden sehr spezifisch für ihre jeweiligen Kontrolltranskripte waren. Die Kreuzreaktion der Sense-Sonden mit dem Sense-Transkript

lag insgesamt zwischen 0 % und maximal 4 % (siehe Tab. 4.1-2 bis Tab. 4.1-4). Die Fehl-hybridisierungen der Antisense-Sonden mit den Kontrolltranskripten in Antisense-Orien-tierung lag hingegen stets unter 1 % (siehe Tab. 4.1-5).

Auffallend waren dabei die Unterschiede zwischen den Sense-Sonden, die über eine normale Phenol/Chloroform-Extraktion (S/200-1, S/200-2 und S/200-3) oder den Kit der Firma Qia-gen (S/200-Q1 und S/200-Q2) aufgereinigt wurden. Beispielsweise waren die maximalen Lumineszenzwerte der herkömmlich aufgereinigten Sense-Sonde (S/200-3) mit dem Anti-sense-Transkript, trotz der höheren Sondenkonzentration, deutlich niedriger als die vergleich-baren Werte mit den über den Kit aufgereinigten Sonden (siehe Tab. 4.1-4). 10 fmol der Sense-Sonde S/200-3 erreichten hier mit dem Kontrolltranskript in Negativstrangorientierung eine Lumineszenz von 89.434 LCPS/100 bei einer Kreuzreaktion von 0,54 %. Eine Hybridi-sierung von nur 2 fmol der Sense-Sonde S/200-Q2 mit der gleichen Menge Antisense-Trans-kript führte hingegen in demselben HDA zu einem Lumineszenzwert von 154.995 LCPS/100 bei einer Kreuzreaktion von 0,52 %. Die Ursache ist sicherlich im Reinheitsgrad der unter-schiedlich aufgereinigten Sonden begründet, da die übrigen Versuchsbedingungen identisch waren. Möglicherweise sind bei der herkömmlichen Isolierung über eine Phenol/Chloroform-Extraktion u.a. Phenolreste in der Probe zurück geblieben, die die Hybridisierung der Sonde mit der Target-RNA negativ beeinflusst hat. D.h. je nach Art der Aufreinigung benötigt man mehr oder weniger der konstruierten Sonden, um vergleichbar hohe Messwerte zu erzielen.

Interessant war außerdem, dass Sonden, die unter identischen Bedingungen synthetisiert und isoliert wurden, ebenfalls geringfügige Unterschiede in ihrer Qualität vorwiesen (vgl. S/200-Q1 und S/200-Q2; Tab. 4.1-4). Zudem konnte auch mit ein und derselben Sonde von HDA zu HDA eine Schwankung in den Signalintensitäten beobachtet werden, obwohl die identische Menge an Sonde und Kontrolltranskript verwendet wurde. Das zeigt, dass Ungenauigkeiten bei der Bestimmung der Sondenkonzentration und kleine Abweichungen in der Versuchs-durchführung des jeweiligen HDA zusätzlich einen geringen Einfluss auf die Lumines-zenzwerte haben können.

Ein wichtiger Faktor für die Signalstärke in einem HDA stellt auch die Qualität des Antikör-pers dar. In dieser Arbeit erzielte der Antikörper mit der Lot-Nr. 5366cx01 deutlich höhere Lumineszenzwerte als der Antikörper mit der Lot-Nr. 1416cx97 (vgl. S/200-3 in Tab. 4.1-3 und Tab. 4.1-4).

Diskussion 110 Aufgrund der unterschiedlichen Parameter, die die Spezifität einer Sonde beeinflussen kön-nen, sollten daher die absoluten Messwerte nur innerhalb eines HDA verglichen werden. Au-ßerdem muss die Qualität jeder konstruierten Sonde in mehreren Vorversuchen überprüft und ihre geeignete Konzentration stets individuell ermittelt werden, bevor sie für weitere Versu-che zum Einsatz kommt. Die Kreuzreaktion sollte dabei so klein wie möglich ausfallen. In dieser Arbeit wurden dementsprechend nur noch Sonden verwendet, bei denen die Fehlhybri-disierung unter 2 % lag.

Eine wichtige Vorraussetzung für den Nachweis der viralen RNA in biologischem Probenma-terial über den HDA ist, dass es nicht zu einer übermäßigen Fehlhybridisierung der spezifi-schen Sonden mit zellulärer RNA kommt. Zusätzlich ist bei der Detektion des Replikationsin-termediates immer mit einem hohen Überschuss an Positivstrang-RNA zu rechnen. Im Leber-gewebe von Schimpansen oder HCV-infizierten Patienten konnte beispielsweise die virale Plusstrang-RNA in einer maximal zehnfach höheren Menge als der Negativstrang nachgewie-sen werden (Shimizu et al., 1992; Lanford et al., 1995; Craggs et al., 2001). In PBMC betrug das Verhältnis von Plus- zu Minusstrang-RNA sogar bis 1:100 (Wang et al., 1992; Lerat et al., 1996). Es wurde daher in weiteren Versuchen getestet, welchen Einfluss der Zusatz von zellulärer RNA auf die Spezifität der Sonden hat und inwieweit sich ein 50facher Überschuss der Kontrolltranskripte in Positivstrang-Orientierung auf die Detektion des Antisense-Transkriptes auswirkt. Zusätzlich wurde untersucht, ob und in welchem Ausmaß die Sense-Sonde mit dem vollständigen HCV-Genom (isoliert aus der Plasmaprobe Nr. 4) hybridisiert.

Während nach der Hybridisierung der Sense-Sonde S/200-1 mit 3 µg der HCV-RNA aus dem Blutplasma eines chronisch infizierten Patienten (HCV-Plasmaprobe Nr. 4) keine Kreuzreak-tion beobachtet werden konnte (siehe 4.1.4; 3 µg HCV-RNA entsprechen einer Menge von etwa 900 fmol), war in einem weiteren HDA mit der S/200-3 Sonde eine Fehlhybridisierung von nur 0,3 % mit 1 µg HCV-RNA des gleichen Patienten zu verzeichnen (siehe Tab. 4.1-6).

Bei der hohen Konzentration der viralen RNA ein sehr gutes Ergebnis.

Etwas anders verhielt es sich bei der Hybridisierung der Sonden mit zellulärer RNA. In ver-schiedenen HDA trat nach der Reaktion der Antisense-Sonde AS/588 mit 1 µg zellulärer RNA eine Kreuzreaktion von 0,7-0,9 % und mit der Sense-Sonde S/200-3 von immerhin 2,7 % auf, während mit der Sense-Sonde S/200-Q2 kein Lumineszenzsignal messbar war (siehe Tab. 4.1-6). Zunächst wurde ein Sonden-spezifisches Phänomen vermutet. Weitere

Untersuchungen zeigten jedoch, dass nach einer Hybridisierung von ein und derselben Sonde mit 1 µg zellulärer RNA, unabhängig von der verwendeten Zellinie, die Kreuzreaktion recht unterschiedlich ausfiel (vgl. Tab. 4.1-6, Tab. 4.1-7, Abb. 4.1-9 und Abb. 4.1-10). Dement-sprechend wichtig war es daher, für die spätere Detektion von HCV in Zellextrakten, diese Kontrolle stets mitzuführen und gegebenenfalls von den anderen Lumineszenzwerten abzu-ziehen, wenn der Wert über dem der Substratkontrolle liegen sollte.

In einem weiteren Experiment wurde schließlich überprüft, welchen Einfluss ein 50facher Überschuss des Sense-Transkriptes auf die Detektion des Antisense-Transkriptes hat. In zwei unabhängig voneinander initiierten HDA mit jeweils 10 fmol Sense-Sonde S/200-3, 1 µg zel-lulärer RNA und 100 amol des Negativstrang-Transkriptes konnten keine signifikanten Aus-wirkungen auf den Nachweis des Antisense-Transkriptes durch die erhöhte Menge des Sense-Transkriptes beobachtet werden (siehe Tab. 4.1-7). Im Gegensatz dazu nahmen die Lumines-zenzwerte nach der Hybridisierung von 2,5 fmol Antisense-Transkript mit der 50fachen Men-ge des Sense-Transkriptes (im Vergleich zum Ansatz ohne Zugabe des Überschusses) um etwa 30 % ab (siehe Tab. 4.1-7). Vermutlich kam es beim Einsatz von 2,5 fmol des Anti-sense-Transkriptes und dem 50fachen Überschuss des Sense-Transkriptes vermehrt zu einer Hybridisierung der beiden komplementären Transkripte miteinander, was dazu führte, dass die Sense-Sonde insgesamt weniger Target-Moleküle binden konnte. Bei einer verringerten Transkriptmenge, trat dieser Effekt nicht mehr auf, da vermutlich die räumliche Nähe zwi-schen den komplementären Transkripten nicht mehr so stark gegeben war und sich die stärke-re Bindungsaffinität zwischen der Sonde und dem Antisense-Transkript durchsetzte.