Proteindesign zur Veränderung der Sequenzspezifität
der Restriktionsendonuklease EcoRI
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Daniela Gerschon
aus Hannover
Hannover 2000
1. Gutacher: Prof. Dr. E. Töpfer-Petersen 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Otto
Tag der mündlichen Prüfung: 28.11.2000
I NHALTSVERZEICHNIS
1 Einleitung 1
1.1 RESTRIKTIONSENZYME 1
1.2 DIE RESTRIKTIONSENDONUKLEASE ECORI 2
1.3 UNSPEZIFISCHE DNA-BINDUNG UND LINEARE DIFFUSION 5
1.4 ERKENNUNG DER SPEZIFISCHEN DNA-SEQUENZ UND KOPPLUNG ZUR KATALYSE 6 1.5 STRUKTUR DER RESTRIKTIONSENDONUKLEASE ECORI IM VERGLEICH MIT ANDEREN
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 9
1.6 KATALYSE 16
1.7 ZIEL DER ARBEIT 18
2 Material und Methoden 20
2.1 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 20
2.1.1 Bakterienstämme 20
2.1.2 Verwendete Vektoren 21
2.1.3 Herstellung kompetenter Zellen 22
2.1.4 Transformation von Bakterienzellen 23
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 24
2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA 24
2.2.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA 24
2.2.3 Ligation 25
2.2.4 Elektrophoretische Trennung von DNA 25
2.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese 25
2.2.4.2 Polyacrylamidgel-Elektrophorese 26
2.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) 27
2.2.6 Mutagenesestrategien 28
2.2.6.1 Gapped duplex-Mutagenese 28
2.2.6.2 PCR-Mutagenese 31
2.2.6.3 Mutageneseprimer 34
2.2.6.4 Klonierung der Mutanten mit StrepTag II 34
2.2.7 DNA-Sequenzierung 35
2.2.7.1 DNA-Vorbereitung und Annealingreaktion 36
2.2.7.2 Markierungsreaktion 36
2.2.7.3 Terminationsreaktion 37
2.2.7.4 Sequenziergel 37
2.3 PROTEINCHEMISCHES ARBEITEN 38
2.3.1 Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen nach Laemmli 38
2.3.2 Expressionstest 40
2.3.3 Fermentation 41
2.3.4 Ultraschallzellaufschluß 42
2.3.5 Chromatographische Verfahren 42
2.3.5.1 Affinitätschromatographie mit Hexahistidintag 42
2.3.5.2 Affinitätschromatographie mit StrepTag II 43
2.3.5.3 Ionenaustauschchromatographie 44
2.3.6 Dialyse 45
2.4 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ECORI-MUTANTEN 46
2.4.1 UV-Spektroskopie 46
2.4.2 λ-DNA-Kinetiken 46
2.4.3 Gelretardationsexperimente (Mobility-Shift-Assays) 47
2.4.3.1 Bindung an ein 174Bp-Fragment 47
2.4.3.2 Mobility-Shift-Assay mit modifizierten Oligonukleotiden 49
2.4.3.3 Mobility-Shift-Assay unter Ca2+-Zusatz 50
2.4.4 Spaltung von Oligonukleotiden 51
2.4.5 Gelfiltration (HPLC) 52
2.4.6 Circulardichroismus (CD) 52
3 Ergebnisse 53
3.1 DARSTELLUNG DER MUTANTEN 53
3.1.1 PCR-Mutagenese zur Generierung der Mutanten G140A/N141AHis6 und
G140A/N141SHis6 53
3.1.2 Gapped duplex-Mutagenese zur Generierung der Mutanten G140S/R145KHis6 und
G140S/N141S/R145KHis6 55
3.1.3 Klonierung des StrepTag II 57
3.2 AUFREINIGUNG DER MUTANTEN 57
3.2.1 Aufreinigung der Mutanten mit Hexahistidintag 57
3.2.2 Aufreinigung der Mutanten mit StrepTag II 63
3.3 CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN MIT HEXAHISTIDINTAG 65
3.3.1 DNA-Bindung der Mutanten mit Hexahistidintag 65
3.3.2 Kinetische Charakterisierung der Mutanten mit Hexahistidintag 66
3.3.2.1 Spaltverhalten auf λ-DNA 66
3.3.2.2 Spaltkinetiken mit λ(dam-, dcm-)-DNA 69
3.4 CHARAKTERISIERUNG DER MUTANTEN MIT STREPTAG II 71
3.4.1 Gelfiltration 71
3.4.2 Circulardichroismus 73
3.4.3 Bestimmung der DNA-Bindung der Mutanten mit StrepTag II 74
3.4.3.1 DNA-Bindung an das 174Bp-Fragment 74
3.4.3.2 DNA-Bindung an modifizierte Oligonukleotide 75
3.4.4 Charakterisierung der Spaltaktivität der Mutanten mit StrepTag II 79
3.4.4.1 Spaltaktivität auf λ(dam-, dcm-)-DNA 79
3.4.4.2 Spaltaktivität auf modifizierten Oligonukleotiden 82
4 Diskussion 91
5 Zusammenfassung 106
6 Summary 107
7 Literaturverzeichnis 108
A BKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A Ampère
AA Acrylamid
AAP Agarose-Auftragspuffer
ad auffüllen auf
Amp Ampicillin
APS Ammoniumperoxodisulfat ATP Adenin-5‘-triphosphat Bis N,N-Methylen-bisacrylamid
Bp Basenpaar(e)
BSA Bovines Serumalbumin
c Konzentration
C- Carboxyl-
CD Circulardichroismus
Chl Chloramphenicol
dd didesoxy
ddH2O bidestilliertes Wasser
DMS Dimethylsuberimidat
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosid-5´-triphosphat
DTB Desthiobiotin
DTT 1,4-Dithiothreitol E.coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz
εxxxnm Extinktionskoeffizient bei xxx nm
EtBr Ethidiumbromid
g Gramm oder Erdbeschleunigung
GTP Guanosin-5´-triphosphat Gua/HCl Guanidiniumhydrochlorid
h Stunde(n)
HPLC High pressure liquid chromatography
k kilo
kDa Kilo-Dalton
Konz. Konzentration
l Liter
LB Luria Bertani
M molar
m milli oder Meter
min Minute(n)
µ mikro
MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure
n nano
N- Amino-
NTA Nitrilotriessigsäure
NTP Ribonukleosid-5´-triphosphat
ODxxxnm optische Dichte bei xxxnm
Oligonukleotid oligomeres Desoxyribonukleotid
p pico oder Plasmid
PCR Polymerase chain reaction Pi anorganisches Phosphat T4-PNK T4-Polynukleotidkinase
r ribo
RNA Ribonukleinsäure
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylphosphat
s Sekunde(n)
ST Saline tris buffer
Taq Thermus aquaticus
TBS Tris buffered saline
TCA Trichloressigsäure
TE Tris-EDTA-Puffer
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin TPE Tris-Posphat-EDTA-Puffer
Tris Tris(hydroxymethyl)aminoethan TTE Tris-Taurin-EDTA-Puffer
TTP Thymidin-5´-triphosphat
U Unit (Einheit)
ÜN über Nacht
UV Ultraviolett
V Volt
% (v/v) Volumenprozent pro Volumen
% (w/v) Gewichtsprozent pro Volumen
wt Wildtyp
Aminosäuren werden nach dem internationalen Ein- oder Drei-Buchstabencode abgekürzt.
Eine Zahl hinter der Bezeichnung kennzeichnet die Position der Aminosäure innerhalb des Proteins.
Mutanten werden benannt, indem an die auszutauschende Aminosäure mit
anschließender Positionsnummer das Kürzel der eingeführten Aminosäure angehängt wird.
1 E INLEITUNG
1.1 Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme sind ubiquitär in Prokaryonten vorkommende Endonukleasen, welche spezifisch kurze DNA Sequenzen erkennen und in beiden Strängen spalten [Luria & Human, 1952]. Als Bestandteil von sogenannten Restriktions/Modifika- tionssystemen (R/M-System) stellen sie einen Abwehrmechanismus gegen das Etablieren von Fremd-DNA in der Bakterienzelle dar, indem sie dieser durch Spaltung in Teilstücke die Infektiosität nehmen. Die zelleigene DNA muß durch Methylierung in der Erkennungssequenz geschützt werden, die durch ein korrespon- dierendes Modifikationsenzym erfolgt. Dabei ist sowohl die Methylierung einer hemi- methylierten Erkennungssequenz als auch eine de novo-Methylierung möglich. Das Enzym führt eine Methylgruppe in die DNA ein, wobei die Methylasen danach unter- schieden werden, ob eine Methylierung des Ringkohlenstoffatoms zum C5-Methyl- cytosin oder eines exocyclischen Stickstoffatoms zum N4-Methylcytosin bezie- hungsweise N6-Methyladenin stattfindet [Cheng, 1995]. Für Restriktionsenzym und Methylase ist eine hohe Spezifität unabdingbar, da ein Schutz des Bakteriengenoms sonst nicht möglich ist.
R/M-Systeme lassen sich in vier Klassen einteilen, die sich aufgrund der Zusammen- setzung ihrer Untereinheiten sowie der verwendeten Kofaktoren unterscheiden [Heitmann, 1993; Pingoud & Jeltsch, 1997]. Weiterhin bestehen Unterschiede in der Erkennung der spezifischen Sequenz und nachfolgender Spaltung der DNA. Allen gemeinsam ist die notwendige Anwesenheit divalenter Kationen (Mg2+), die eine katalytische Aktivität ermöglichen.
Bei den R/M-Systemen vom Typ I handelt es sich um einen aus drei Untereinheiten (R, M, S) bestehenden Komplex [Murray, 2000]. Dabei steht R für Restriktion, M für Modifikation und S für Spezifität des Enzymkomplexes. Als Kofaktoren werden ATP, S-Adenosylmethionin (AdoMet) und Magnesiumionen benötigt. Die Spaltung der DNA erfolgt in großer Entfernung zur sieben Basenpaare (Bp) umfassenden, unter- brochenen Erkennungssequenz.
R/M-Systeme des Typs II beinhalten zwei voneinander unabhängige Enzyme: Einer- seits die Restriktionsendonuklease, welche als Homodimer auftritt und DNA in Anwe-
senheit von Mg2+ spaltet, andererseits die monomere Methyltransferase, die AdoMet als Kofaktor braucht. Die Spaltung erfolgt innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der vier bis acht Basenpaare langen palindromen Erkennungssequenz, wobei entweder glatte (blunt ends) oder überhängende (sticky ends) DNA-Enden entstehen.
Innerhalb des Typ II R/M-Systems wurden aufgrund ungewöhnlicher Eigenschaften einiger dort klassifizierter Enzyme Untergruppen eingeführt. Bei den Restriktions- enzymen der Klasse IIe erfolgt eine allosterische Aktivierung durch Bindung einer zweiten als Effektor wirkenden Erkennungssequenz [Krüger et al., 1995]. Enzyme des Typs IIs erkennen vier bis sieben Basenpaare lange Erkennungssequenzen, die Spaltung erfolgt in definiertem Abstand außerhalb derselben.
Typ III-Systeme bestehen aus zwei Untereinheiten (R und M). Während die Methyl- transferase allein in Anwesenheit von AdoMet katalytisch aktiv ist, erfordert die Restriktion ein Zusammenwirken beider Untereinheiten sowie ATP [Meisel et al., 1995].
Erkennungssequenzen der Typ III-Systeme bestehen aus einem Enzymkomplex mit jeweils einer Untereinheit für Restriktion und Modifikation. Die Erkennungssequenz ist asymmetrisch und die Spaltung erfolgt in definiertem Abstand von etwa 25 Basenpaaren [Bickle, 1993].
Bei den Typ IV-R/M-Systemen treten Restriktionsendonukleasen auf, deren Spaltung einerseits durch AdoMet stimuliert wird, andererseits jedoch ATP unabhängig ist. Die Spaltung erfolgt in definiertem Abstand außerhalb der asymmetrischen sechs Basenpaare langen Erkennungssequenz [Janulaitis et al., 1992].
Restriktionsenzyme, die unterbrochene Sequenzen erkennen und DNA in definiertem Abstand auf beiden Seiten außerhalb dieser Sequenz spalten, werden dem Typ BcgI zugeordnet [Kong et al., 1993].
1.2 Die Restriktionsendonuklease EcoRI
Die zuerst aus dem Bakterium Escherischia coli isolierte Restriktionsendonuklease EcoRI gehört neben EcoRV zu den am besten untersuchten Typ II-Endonukleasen.
Sie besteht aus 276 Aminosäuren bekannter Sequenz [Greene et al., 1981; Newman et al., 1981]. Das Enzym zeigt seine katalytische Aktivität im Homodimer [Alves et al.,
1982]. Weiterhin können in höheren Konzentrationen spaltaktive Tetramere gebildet werden [Modrich & Zabel, 1976], darüber hinaus entstehen unlösliche Komplexe [Luke & Halford, 1985].
Die EcoRI-Methylase zeigt keine Homologie zur Endonuklease. Beide Enzyme er- kennen jedoch spezifisch die palindrome Sequenz GAATTC, welche von der Endo- nuklease zwischen G und A gespalten und von der Methylase an der N6-Amino- gruppe der zentralen Adenine methyliert wird (Me; siehe Abbildung 1.1).
Abb. 1.1: Spaltung und Methylierung an der EcoRI-Erkennungssequenz
Durch die Methylierung der Erkennungssequenz wird eine vollständige Spaltung des DNA-Doppelstrangs verhindert [Jost & Saluz, 1993; McClelland et al., 1994].
Eine sehr langsame Spaltung unspezifischer oder methylierter Sequenzen ist mög- lich, wobei es vorwiegend zu Einzelstrangbrüchen in der DNA kommt [Jen-Jacobson et al., 1996]. Diese können durch die zelleigene Ligase repariert werden und stellen so keine Gefahr für die Zelle dar [Taylor et al., 1990].
In Gegenwart von Magnesiumionen werden kognate Sequenzen erkannt und ge- spalten. Sequenzen, die in einem Basenpaar davon abweichen, werden Starsequen- zen genannt. Ihre Spaltung erfolgt um den Faktor 103 bis 106 langsamer [Lesser et al., 1990; Thielking et al., 1990]. Unter bestimmten Pufferbedingungen relaxiert die hohe Genauigkeit des Enzyms. Dazu zählen erhöhter pH-Wert (pH8,8) bei er- niedrigter Salzkonzentration [Polisky et al., 1975], Verwendung von Manganionen anstelle des Magnesiums [Hsu & Berg, 1978] oder der Zusatz organischer Lösungs- mittel [Goodman et al., 1978]. Unter diesen Bedingungen steigt die Spaltaktivität für Starsequenzen um den Faktor 103, während die Spaltgeschwindigkeit für die kanoni- schen Sequenzen bis auf den Level der Staraktivität absinkt.
C T A A G C T T A A G
T M e
M e
Vier Jahre nach Veröffentlichung der ersten Röntgenstruktur der Restriktionsendo- nuklease EcoRI im Komplex mit dem Oligonukleotid d(TCGCGAATTCGCG) [McClarin et al., 1986] folgte 1990 nach Analyse weiterer EcoRI-Schwermetall-Deri- vate eine Korrektur dieses Strukturmodells [Kim et al., 1990]. Die beiden EcoRI-Un- tereinheiten bilden im Dimer eine nahezu globuläre Struktur aus, welche die DNA umschließt. Dabei umgreift jede Untereinheit die DNA mit armähnlichen Gebilden, den so genannten Inner arms und Outer arms (siehe Abbildung 1.2).
Abb. 1.2: Schleifenmodell der dimeren EcoRI im Komplex mit DNA
Bei Bindung des Enzyms an die spezifische DNA-Sequenz kommt es zu ausgepräg- ten Konformationsänderungen, wobei die große Furche der DNA um 28° entwunden [Rosenberg, 1991] und ein Knick von etwa 30° induziert wird [McClarin, 1986].
α4 α5
ß3
(Katalyse) Outer arm Inner
arm
Extended chain
Daraus ergibt sich eine Aufweitung der großen Furche um etwa 0,35nm, was die Einlagerung von je zwei α-Helices (α4 und α5) und einem ausgestreckten Abschnitt der Polypeptidkette (Extended chain) pro Untereinheit der Restriktionsendonuklease in die große Furche für die Erkennung der Basensequenz ermöglicht. Die kleine Furche der DNA bleibt dem Lösungsmittel zugewandt.
Das zentrale Strukturmotiv jeder Untereinheit wird gebildet durch ein fünfsträngiges β-Faltblatt sowie vier α-Helices, wobei die Faltblätter β1 und β3 eine antiparallele Ausrichtung erfahren und die katalytisch bedeutungsvollen Aminosäurereste Asp91, Glu111 und Lys113 enthalten. Durch die Faltblätter β3 und β5 sowie den Helices α4 und 5 entsteht ein α/β-Bindungsmotiv. Dieses weist Ähnlichkeiten zu der in zahl- reichen Dehydrogenasen vorkommenden nukleotidbindenden Rossman-Falte auf [Rossman et al., 1975]. Durch die innere (α4) und die äußere (α5) Erkennungshelix wird im Homodimer ein Vier-Helix-Bündel gebildet, welches zur DNA hin ausgerichtet ist.
1.3 Unspezifische DNA-Bindung und lineare Diffusion
Um ihrer Funktion als Abwehrenzym gegen Fremd-DNA gerecht werden zu können, muß EcoRI ihr Substrat zunächst erkennen und binden, bevor es zur Spaltung kom- men kann. Die Bindung kann sowohl an spezifischen als auch an unspezifischen Se- quenzen erfolgen [Langowski et al., 1980; Woodhead & Malcolm, 1980]. Bedingt da- durch, daß die spezifischen Bindungsstellen deutlich unterrepräsentiert sind, bindet das Enzym in der überwiegenden Zahl der Fälle sein Substrat zunächst an unspezifi- schen Bindungsstellen. Anschließend erfolgt eine eindimensionale Diffusion auf die Erkennungssequenz mit einer Geschwindigkeit von etwa 7 × 106 Basenpaaren pro Sekunde [Ehbrecht et al., 1985]. Bei Bindung der DNA durch EcoRI wird diese dann von den Strukturen des Inner arm (Aminosäuren 124-136) und Outer arm (Amino- säuren 176-193) umschlossen.
Unspezifische Bindung in Anwesenheit von Magnesium ist möglich (Kass≅105 [Langowski et al., 1980; Terry et al., 1985]), wobei jedoch die Bindung spezifischer Sequenzen deutlich stärker erfolgt (Kass>108, [Grabowski et al., 1995]). Dabei liegen
der unspezifischen Bindung elektrostatische Wechselwirkungen zugrunde. Diese sind sowohl anziehender als auch abstoßender Natur und müssen in einem Gleich- gewicht miteinander stehen, um eine optimale lineare Diffusion zu ermöglichen.
Diese stellt keine gleichmäßige Bewegung dar, vielmehr ist sie abhängig von Se- quenz und Struktur der DNA. Sie folgt den Windungen der großen Furche in der DNA [Jeltsch et al., 1994]. Starsequenzen können vom Enzym wesentlich besser gebun- den werden als unspezifische DNA [Lesser et al.,1990; Thielking et al., 1990]. Dieses führt zu längeren Pausen (bis zu 20 Sekunden) während der linearen Diffusion, ohne daß es zur Spaltung kommt [Jeltsch et al., 1994].
Die Bedeutung einer optimalen linearen Diffusion liegt in der schnellen Spaltung der Fremd-DNA durch die Restriktionsendonuklease, was für die Zelle von entscheiden- der Bedeutung ist, da eine schnellere Methylierung der kognaten Sequenzen zu ei- nem Schutz der Fremd-DNA führt.
1.4 Erkennung der spezifischen DNA-Sequenz und Kopplung zur Katalyse
Zu den herausragendsten Eigenschaften der Restriktionsendonukleasen gehört ihre hohe Präzision in der Substraterkennung und Katalyse, welche sich aus einer Viel- zahl von Wechselwirkungen des Enzyms mit der zu spaltenden DNA-Sequenz ergibt.
Es handelt sich dabei um van der Waals-Kontakte, ionische Kontakte und Wasser- stoffbrückenbindungen zwischen Protein und DNA. Als Erkennung bezeichnet man die Summe dieser bevorzugten Wechselwirkungen; sie beginnt mit dem Übergang vom unspezifischen in den spezifischen Komplex und schließt mit der Aktivierung des katalytischen Zentrums ab.
Die spezifische Bindung durch die Restriktionsendonuklease EcoRI führt zu einer Entwindung der DNA um 28° in der großen Furche. So entsteht Platz, um die Einla- gerung der Erkennungshelices α4 und α5 und der Extended chain (Aminosäuren 137-142) zu ermöglichen. Das Extended chain-Motiv bildet eine Vielzahl spezifischer Kontakte zu den Basen aus. Es wird durch das Vier-Helix-Bündel α4/α5 und das an- tiparallele Faltblatt (β1/β3) ausgerichtet. Ein Peptid der Sequenz des Extended chain-
Motivs ist in der Lage, an die spezifische Erkennungssequenz zu binden [Jeltsch et al., 1995; Vennekohl 1999]. Für diese Arbeit von besonderer Wichtigkeit sind die Kontakte zum äußeren AT-Basenpaar, in dem sich die Erkennungssequenz von EcoRI von der von BamHI (GGATCC) unterscheidet.
Dabei wird das äußere Thymin durch einen van der Waals-Kontakt durch Gly140 kontaktiert. Diese Aminosäure bildet einen vergleichbaren Kontakt zum inneren Thy- min [Küster, 1998]. Das äußere Adenin wird durch eine Wasserstoffbrückenbindung vom Arg145 kontaktiert. Diese Aminosäure bildet gleichzeitig einen Kontakt zum in- neren Adenin aus und einen ionischen Kontakt zu Glu144 der anderen Untereinheit.
Gleichzeitig besteht eine doppelseitige Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asn141 und dem äußeren Adenin [Fritz et al., 1998].
Die katalytischen Aminosäuren Glu111 und Lys113 sind im Faltblatt β3 lokalisiert. Es enthält ebenso die zur Kopplung wichtigen Aminosäuren Gln115 und Lys117. Als Kopplung wird die Kommunikation zwischen einzelnen Proteinteilen bezeichnet, die dafür sorgt, daß nach Bindung der spezifischen DNA-Sequenz die Spaltung erfolgt.
Gln115 bildet neben einem Kontakt zur DNA ebenfalls Kontakte zum Extended chain aus (vergleiche auch Abbildung 1.3) [Jeltsch et al., 1993a]. Durch die Lage im β3- Faltblatt ist eine Kommunikation mit dem katalytischen Zentrum wahrscheinlich.
Weiterhin wichtig für die Kopplung von Erkennungssequenz und Spaltung ist die Aminosäure Glu144, die durch Kontakte zur eigenen Untereinheit (Asn141 und Arg203) und zur anderen Untereinheit (Arg145 und Lys148) für eine effektive Ver- netzung sorgt. So führt auch ein Austausch von Aminosäuren, die nicht direkt an der Katalyse beteiligt sind, durch Störung dieses Netzwerkes zu einer unter Umständen gravierenden Einbuße in der Spaltaktivität [Jeltsch et al., 1993a].
Insgesamt bildet die Restriktionsendonuklease EcoRI sowohl mit Purin- als auch mit Pyrimidinbasen in der GAATTC-Sequenz spezifische Wechselwirkungen aus. Dabei entstehen 18 Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Protein und DNA, 14 davon sind Protein-Purin, vier sind Protein-Pyrimidin Wechselwirkungen. Weiterhin beste- hen Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der Guaninbase, einem Wassermolekül und den zwei Aminosäureseitenketten Arg200 und Arg203 sowie eine Vielzahl von van der Waals-Wechselwirkungen zwischen Protein und DNA [Rosenberg, 1991]
(siehe Abbildung 1.3).
Abb. 1.3: Schematische Darstellung aller Kontakte der dimeren EcoRI zur kognaten Sequenz GAATTC
Zur Ausbildung der Kontakte ist eine strukturelle Adaption von DNA und Enzym nötig (Induced fit), da erst durch die konformationellen Änderungen optimale Abstände entstehen. Für die DNA sind diese Strukturänderungen leicht aus einem Vergleich mit der Struktur des freien Oligodesoxynukleotids [Drew et al., 1981; Rinkel et al., 1987] zu ersehen. Für das freie Enzym ist bisher keine Strukturuntersuchung im mo- lekularen Detail gelungen. Allerdings zeigen Experimente zur schnellen Reaktionski- netik einen Einfluß zweiwertiger Kationen auf die Geschwindigkeit des Überganges in den aktiven Zustand [Alves et al., 1989b] und es sind Mutanten generiert worden, die sogar zweiwertige Kationen wie zum Beispiel Ca2+-Ionen benötigen, um an die DNA
Arg203 Arg200 Ile197
Ala142 HN142 Glu144 Arg145 Lys148
Asn149 Lys117
Gln115 Lys113
Glu111
Asp91 HN89 H O
Met137 CO138
Gly140 Asn141 Lys130
Mg
2
HN89 Asp91
Mg Asn149
Lys148 Arg145 Glu144 HN142 Ala142
Ile197 Arg200 Arg203
Glu111 Lys113
Gln115 Lys117 Asn141
Gly140 CO138
Met137
Lys130
H O2 αααα4
α αα α4
α αα α5
α αα α5
ββββ3 ββββ3
Extended chain
Extended chain
H-Brücke Ionenkontakt van der Waals-Kontakt HN87
Asn85
HN87 Asn85
G C A T A T T A T A C G
p p
p p p
p
p
p
p p p p
binden zu können [Windolph et al., 1997]. Beides spricht eindeutig für verschiedene Konformationen, die das Enzym einnehmen kann.
Nach Betrachtung aller Wechselwirkungen ergibt sich die Schlußfolgerung, daß es sich bei dem Erkennungsprozeß der Restriktionsendonuklease EcoRI um ein redun- dantes System handelt. So kommt es bei Verlust einzelner Wechselwirkungen zwar zu einer spezifischen Substraterkennung durch die verbleibenden Kontakte, jedoch resultiert häufig auch eine verminderte Spaltaktivität [Wolfes et al., 1986; Yanofsky et al., 1987; Geiger et al., 1989; Alves et al., 1989a; Needles et al., 1989; King et al., 1989; Wright et al., 1989; Osuna et al., 1991; Selent et al., 1992; Jeltsch et al., 1993a; Flores et al., 1995; Fritz et al., 1998].
1.5 Struktur der Restriktionsendonuklease EcoRI im Ver- gleich mit anderen Restriktionsendonukleasen
Ein Vergleich der bis heute sequenzierten und biochemisch charakterisierten 50 Typ II-Restriktionsendonukleasen zeigt keine, beziehungsweise nur geringe Homologien in den Gesamtsequenzen mit Ausnahme einiger Iso- und Neoschizomere. Klassische DNA–Bindungsmotive wie Helix-turn-helix oder basische Helix-loop-helix Strukuren, Zinkfinger oder basische Zipper sind nicht ersichtlich [Pingoud & Jeltsch, 1997]. Be- stimmte Teilbereiche enthalten jedoch Übereinstimmungen in Struktur und Funktion [Siksnys et al.,1995]. Von neun Restriktionsendonukleasen sind die Kristallstrukturen bekannt. Ihre Eigenschaften zeigt die nachfolgende Tabelle:
Tab. 1.1: Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannter Struktur
Restriktions- endonuklease
Autoren der Röntgenstruktur
Anzahl Aminosäuren
Erkennungs- sequenz
EcoRI Kim et al., 1990 276 G↓AATTC
EcoRV Winkler et al., 1993 245 GAT↓ATC
BamHI Newman et al., 1995 213 G↓GATCC
PvuII Athanasiadis et al., 1994
157 CAG↓CTG
Cfr10l Bozic et al., 1996 285 Pu↓CCGGPy
FokI Wah et al., 1997 583 GGATGN9/N14
BglI Newman et al., 1998 299 GCCNNNN↓NGG
C
MunI Deibert et al., 1999 203 C↓AATTG
NaeI Huai et al., 2000 162* GCC↓CGG
* den Restriktionsenzymen verwandte Domäne des Enzyms
Die Abbildung 1.4 zeigt den strukturellen Aufbau der Restriktionsendonukleasen im Komplex mit DNA beziehungsweise ohne (Cfr10I und NaeI).
Abb. 1.4: Vergleich der Strukturen von Restriktionsendonukleasen im Komplex mit und ohne DNA (Cfr10I, NaeI). Die Komplexe sind so angeordnet, daß die große Furche am Mittelpunkt der Erken- nungssequenz nach oben weist.
Obwohl es an Sequenzhomologien mangelt, weisen die Enzyme Strukturhomologien auf. Allen acht Enzymen gemeinsam ist das zentrale Strukturmotiv, bestehend aus einem fünfsträngigen ß-Faltblatt, welches die für die Katalyse wichtigen Aminosäuren
NaeI
PvuII BglI
Cfr10I
EcoRV
EcoRI BamHI MunI
enthält. Hinsichtlich des Spaltverhaltens lassen sich die Enzyme in zwei Gruppen einteilen. Während sich die Enzyme, die einen 5´-Überhang erzeugen, der DNA von der großen Furche her nähern (obere Reihe der Abbildung 1.4), befindet sich bei den blunt end-Schneidern und Enzymen, die einen 3´-Überhang erzeugen, die größte Masse des Enzyms im Bereich der kleinen Furche (untere Reihe der Abbildung 1.4).
Dieses liegt begründet in den unterschiedlichen relativen Positionen der zu spalten- den Phosphodiesterbindungen. Während die Spaltung von DNA zu glatten Enden (EcoRV und PvuII) aus der kleinen Furche geschehen kann, ist die kognate Sequenz bei der Erzeugung eines 5´-Überhanges nur von der großen Furche zugänglich [An- derson, 1993]. Gemeinsamkeiten und Unterschiede der Gruppen werden im Ver- gleich der Topologien der Enzyme deutlich. In Abbildung 1.5 sind die Sekundärstruk- turelemente der Enzymgruppe dargestellt, die sich von der großen Grube her nähert.
Abb.1.5: Vergleich der Topologien der Sekundärstrukturelemente von EcoRI, BamHI, MunI und Cfr10I, die sich der DNA von der großen Furche her nähern
E98 D83 K100
MunI
D91 E111
K113
EcoRI
E111 D94 E113
BamHI
D134 S188
K190 E204
Cfr10I
Das fünfsträngige β-Faltblatt durchzieht die Strukturen (blau markiert). Die vier En- zyme verwenden ein gemeinsames Dimerisierungsmotiv, das durch zwei Helices gebildet wird (rot markiert in Abb. 1.5). Nach diesen Strukturen erscheint es wahr- scheinlich, daß die Ausrichtung des Enzyms zur DNA durch die Dimerisierungsfläche bestimmt wird. BamHI, EcoRI und MunI enthalten dabei einen Loop in der Dimerisie- rungsfläche, der die gleiche Ausrichtung zum Faltblatt aufweist.
In Abbildung 1.6 sind die Sekundärstrukturelemente derjenigen Enzyme dargestellt, die sich von der kleinen Furche her ihrer DNA Sequenz nähern.
Abb. 1.6: Vergleich der Topologien der Sekundärstrukturelemente von EcoRV, PvuII, BglI und NaeI, die sich der DNA von der kleinen Furche her nähern
EcoRV PvuII
BglI NaeI
Alle Strukturen zeigen das fünfsträngige β-Faltblattmotiv. Die Enzyme PvuII und die Endonukleasendomäne der NaeI weisen dabei große Ähnlichkeiten untereinander auf. Sie zeichnen sich beide durch eine geringe Größe aus. Die Erkennungssequen- zen von EcoRI und MunI unterscheiden sich lediglich im äußeren Basenpaar (EcoRI:
G↓AATTC; MunI: C↓AATTG), wobei die zu spaltende Bindung neben dem zentralen AATT-Motiv gleich positioniert ist. So ergeben sich viele Gemeinsamkeiten zwischen den Enzymen. Neben dem schon erwähnten ähnlichen Dimerisierungsmotiv zeigt der strukturelle Vergleich der DNA-Strukturen der spezifischen Sequenzen von MunI und EcoRI ebenfalls eine große Ähnlichkeit: beide DNA-Sequenzen tragen zentral die Sequenz AATT, die bei der spezifischen Bindung in gleicher Weise geknickt wird.
EcoRI verwendet für die Erkennung zwei armähnliche Strukturen (Inner arm, Outer arm). Der Outer arm ist bei MunI nicht vorhanden, der Inner arm ist verkürzt und in einer anderen Konformation. Während die Erkennung des äußeren Basenpaars von MunI durch eine einzelne Aminosäure (Arg115) erreicht wird, kontaktiert EcoRI die DNA an dieser Stelle durch ein gebundenes Wassermolekül an den Aminosäuren Arg200 und Arg203, das Cytosin direkt durch Met137 und das Peptid-NH von Ala138.
Aufgrund der Ähnlichkeit der Dimerisierung wurde für EcoRI und BamHI ein gemein- samer evolutionärer Ursprung postuliert [Newman et al., 1994], der nun auf MunI ausgedehnt werden kann. Unterschiede zwischen EcoRI und BamHI zeigen sich in der DNA-Struktur und DNA-Erkennung. Während bei EcoRI eine Verzerrung der DNA eintritt, ersichtlich durch einen Knick von 28° im zentralen AATT-Motiv, fehlt diese Erscheinung bei BamHI bei der spezifischen DNA-Bindung. BamHI zeigt keine vergleichbaren Strukturen zu Inner und Outer arm sowie zum Extended chain-Motiv.
Jedoch wird hier eine zusätzliche C-terminal angeordnete α-Helix nur einer Unterein- heit in die kleine Furche der DNA eingelagert. Auf diese Weise kontaktiert BamHI die Basen eines Stranges und das Phosphatrückrat des jeweils anderen Stranges (über- Kreuz-Kontakt).
Im Vergleich zu EcoRI nähert sich EcoRV ihrer Erkennungssequenz von der kleinen Furche her. Sie entwindet die DNA in der Mitte der Erkennungssequenz, wobei ein Knick von 50° entsteht. Dadurch folgt eine Erweiterung der kleinen Furche sowie eine Verengung der großen Furche, so daß dem Enzym ein besserer Zugriff auf die
zu spaltenden Phosphodiesterbindungen möglich wird. Der größte Teil des Erken- nungsmotives von EcoRV wird als Erkennungsschleife bezeichnet (R-loop), die um die DNA herum in die große Furche gelegt wird. Einen kleineren Anteil an der DNA- Erkennung trägt die glutaminhaltige Schleife (Q-loop) bei. Der R-loop bildet zwölf der 18 direkten Wasserstoffbrückenbindungen, zwei van der Waals-Kontakte sowie zwölf wasservermittelte Wasserstoffbrückenbindungen zum Phosphatrückrat. Beim Q-loop sind es vier Wasserstoffbrückenbindungen zu den Basen der kleinen Grube.
Bei der Restriktionsendonuklease PvuII ist zwar große Ähnlichkeit zu EcoRV vorhan- den, es tritt jedoch hier keine Verzerrung der DNA in der spezifischen Bindung auf.
Ein zweisträngiges, antiparalleles Faltblatt mit zwölf direkten Wasserstoffbrückenbin- dungen und van der Waals-Kontakten zu Basen und Phosphatrückrat dient als Er- kennungsmotiv.
Obwohl die einzelnen Restriktionsendonukleasen unterschiedliche Strategien zur DNA-Bindung und -Erkennung anwenden, gibt es bei der Anordnung der katalyti- schen Aminosäuren große Ähnlichkeiten, die in der Superposition eine hohe Über- einstimmung aufweisen (siehe Abbildung 1.7). Dies impliziert eine Ähnlichkeit im Katalysemechanismus. Eine vergleichbare Organisation der aktiven Aminosäuren ist auch bei anderen DNA-modifizierten Enzymen zu finden, zum Beispiel bei der λ-Ex- onuklease oder dem Reparaturenzym MutH.
Abb. 1.7: Superposition der katalytischen Zentren der Restriktionsendonukleasen bekannter Kristall- struktur und anderer DNA-modifizierter Enzyme
Das katalytische Zentrum ist auf einem β-Faltblatt lokalisiert. Im überwiegenden Fall werden zwei saure und eine basische Aminosäure verwendet. Dabei gibt es folgende Ausnahmen: BamHI verfügt über drei saure Aminosäuren (Asp91; Glu111; Glu113).
Bei Cfr10I dagegen steht zwar ein Serin anstelle einer der sauren Aminosäuren (Asp134; Ser188; Lys190), dafür wird aber von einem anderen Strukturteil ein Glu- tamat ins aktive Zentrum rekrutiert.
Für die aktiven Zentren von Restriktionsendonukleasen wurde ein allgemein gültiges Sequenzmotiv entwickelt, das die Zusammensetzung PDX9-18(E/D)ZK aufweist [Se- lent et al., 1992]. Dabei ist X eine beliebige Aminosäure, während Z eine hydrophobe Aminosäure darstellt. Das Auftreten des Motivs ist jedoch zu unbestimmt, um definitiv sein zu können. So weist EcoRI zwei solcher Strukturmotive pro Untereinheit auf, aber nur ein aktives Zentrum.
EcoRV PvuII BglI
Lys144 Asp142
Asp116
Lys92 Asp90
Asp74
Lys70 Glu68
Asp56
Cfr10I
Lys190 Ser188
Asp134
MutH λλλλ-Exo
Lys79 Glu77
Glu56
Lys131 Glu129
Asp119
FokI
Lys469 Asp467
Asp450 Lys113 Glu111
Asp91
EcoRI BamHI
Glu113 Glu111
Asp91
MunI
Lys100 Glu98
Asp83
NaeI
Lys97 Asp95
Asp86
1.6 Katalyse
Im Vergleich der Kristallstrukturen (siehe Kapitel 1.5 und Abbildung 1.6) wird die räumliche Anordnung der für die Katalyse entscheidenden Aminosäuren zu den zu spaltenden Phosphodiesterbindungen deutlich. Die Spaltung der Phosphordiester- bindung entspricht einem Angriff eines Wassermoleküls in Form einer SN2-Reaktion [Connolly et al., 1984]. Dabei sind folgende Elemente nötig:
1. Erhöhung der Elektrophilie des Phosphoratoms durch eine Lewissäure 2. Aktivierung des Wassers durch eine Base
3. Stabilisierung der negativen Ladung im Übergangszustand durch eine Lewissäure 4. Protonierung der Fluchtgruppe
Ein 1992 entwickeltes Modell der substratunterstützten Katalyse für EcoRI und EcoRV als möglicher Mechanismus der DNA-Spaltung erfüllt die genannten Forde- rungen [Jeltsch et al., 1992] (siehe Abbildung 1.8, nächste Seite).
Im Fall der substratunterstützten Katalyse wird das Wasser durch den pro-Rp- Phosphorylsauerstoff der Phosphatgruppe am 3‘-Ende der zu spaltenden Bindung aktiviert. Die negative Ladung dieses Sauerstoffatomes ist für die Katalyse bedeu- tungsvoll, da durch die Aktivierung des Wassermoleküles dessen Nukleophilie erhöht wird [Jeltsch et al., 1993b]. Spaltexperimente mit sogenannten Missing phosphate- Substraten belegen die Aktivierung des Wassers auf die beschriebene Weise [Jeltsch et al., 1993b]. Bei Verwendung von H-Phosphonaten tritt demnach eine Verlangsamung der Spaltgeschwindigkeit um den Faktor 104 ein. Die Phosphat- gruppe kann von dem aktivierten Wasser in Richtung der aufzulösenden Phosphat- bindung angegriffen werden, wobei die Hydrolyse unter Inversion der Konfiguration der reaktiven Phosphatgruppe erfolgt [Connolly et al., 1984]. Eine Erhöhung der Elektrophilie des Phosphoratoms erfolgt dadurch, daß die Aminosäuren Asp91 und Glu111 das Magnesiumion gegenüber der zu spaltenden Bindung positionieren [Jeltsch et al., 1992], was wiederum eine Polarisierung der nicht zum DNA-Rückgrat gehörenden P-O-Bindung des Phosphates bewirkt. Ein Sauerstoffatom der Phos-
Abb. 1.8: Modell der substratunterstützten Katalyse [Jeltsch et al., 1992] und der Zwei-Metallionen- Katalyse [Kostrewa & Winkler, 1995]
phatgruppe wird beim Übergang der tetragonalen Geometrie des Phosphatesters in den trigonal bipyramidalen Übergangszustand Teil der Koordinationssphäre des Ma- gnesiumatoms [Heitman, 1992]. Bei diesem Übergangszustand tritt zusätzliche ne- gative Ladung auf, welche durch die basische Aminosäure Lys113 neutralisiert wird.
Die Protonierung der Fluchtgruppe erfolgt mit Hilfe eines Wassermoleküls aus der Koordinationssphäre des Mg2+-Ions.
Für die Restriktionsendonuklease EcoRV existiert, anders als bei EcoRI, ein Pro- tein/DNA-Kokristall mit den zweiwertigen Kationen Mg2+, Mn2+ und/oder Ca2+. Es konnten in diesen DNA-Kokristallen zwei Metallbindungsstellen lokalisiert werden.
Dabei sind die Aminosäuren Asp74/Asp90 an den Wechselwirkungen zum Kation beteiligt und weisen eine hohe Elektronendichte auf, während Asp74/Asp45 eine ge-
T T T
O:
P O
O H H
O:
O P O
O H
O
O P
H
O OO
O H
O Mg
O P #
:O
Glu111 Lys113
O H H
Mg Glu111 Lys113
O H H P
O H
P O H
Mg Glu111 Lys113
:O H O
O
O
G
A A
A
G G
..
O:
P O
O H
O:
P
O O
O H
O
O P
H
O OO
O H
OO
#
O H H
Mg
O H H
Mg
:O H
A A
Asp74
A
Asp90 Lys92
Mg
.. Mg
Glu45
Asp74 Asp90 Lys92 Mg
Glu45
Asp74 Asp90 Mg
Glu45
Modell der Zwei-Metallionen-Katalyse Modell der substratunterstützten Katalyse
Asp91 Asp91 Asp91
Lys92
ringe Elektronendichte aufweist und nicht immer alle Kriterien für eine Magnesiums- bindungsstelle erfüllt. Es konnte jedoch eine zweite Bindungsstelle experimentell nachgewiesen werden: Nach Zugabe von Kalziumionen trat bei Vorhandensein von Manganionen eine Erhöhung der Spaltgeschwindigkeit ein, auch wenn dieses Re- sultat durch Kalzium allein nicht erzielt werden konnte [Vipond et al., 1995]. Diese Ergebnisse führten zur Einführung der Zwei-Metallionen-Katalyse als Alternative zur substratunterstützten Katalyse [Kostrewa & Winkler, 1995; Vipond et al., 1995] (siehe Abbildung 1.7).
Bei diesem Mechanismus entstammt das angreifende Wasser der Hydrathülle des einen Metallions, es wird durch dieses aktiviert, während das zweite Metallion eine P- O-Bindung im Phosphat polarisiert.
Bei den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PvuII trifft die Zwei-Metallionen-Kata- lyse nicht zu, weil sich die potentiellen Bindungspartner für ein zweites Metallion (EcoRI: Asp59; PvuII: Glu55) als katalytisch unbedeutend erwiesen haben [Grabowski et al., 1996; Nastri et al., 1997].
1.7 Ziel der Arbeit
Die Restriktionsendonuklease EcoRI entwickelt zu ihrer Erkennungssequenz GAATTC eine hohe Anzahl von Wechselwirkungen, wodurch die hohe Spezifität vermittelt wird. Hauptverantwortlich für diese spezifischen Interaktionen mit der DNA sind die Aminosäuren Met137 bis Arg145, die man auch als Extended chain-Motiv bezeichnet. Diese Aminosäurereste bilden eine Reihe von Wasserstoffbrückenbin- dungen, hydrophoben Wechselwirkungen und ionischen Interaktionen zu den Basen und Phosphatresten der DNA.
Die Aminosäure Glycin 140 dieses Extended chain-Motivs bildet eine hydrophobe Wechselwirkung zum Thymin der Erkennungssequenz [Rosenberg 1991]. Für einen Aminosäureaustausch des Glycins an der Position 140 zu Alanin konnte gezeigt werden, daß diese Mutante eine erhöhte Spaltgeschwindigkeit auf einem Oligo- nukleotid zeigt, dessen äußeres Thymin durch ein Uracil ersetzt wurde [Küster, 1998].
Basierend auf diesen Erkenntnissen sollen in dieser Arbeit Mehrfachmutanten her- gestellt werden, die in Kombination mit der Mutation an Position 140 eine relaxierte Spezifität für das dem Thymin komplementäre Adenin zeigen.
Hierbei handelt es sich um die Aminosäuren Asn141 und Arg145.
Diese Aminosäuren wurden in Kombination mit der Aminosäure Glycin 140 ausge- wählt, da durch die Röntgenstruktur [Rosenberg, 1991] sowie Mutageneseexperi- mente [Geiger et al., 1989; Alves et al., 1989b; Fritz et al., 1998] sowohl die Wasser- stoffbrückenbindung von Arg145 als auch von Asn141 zu dem äußeren Adenin der Erkennungssequenz belegt werden konnte.
Mit Hilfe der in dieser Arbeit hergestellten Mehrfachmutanten soll eine Änderung der Spezifität erzielt werden, die eine Erkennung von GGATCC ermöglichen würde (BamHI).
2 M ATERIAL UND M ETHODEN 2.1 Mikrobiologische Methoden
2.1.1 Bakterienstämme
Bei den unterschiedlichen Arbeitsschritten im Verlauf dieser Arbeit werden die nach- folgend aufgeführten Bakterienstämme (Abkömmlinge des Stammes K12) verwen- det:
LK111(λ)
Genotyp: (rK- mK+), thi-1, thr-1, leuB6, tonA21, supE44, lacIqYZ ∆M15, Hfr, λ+
Es handelt sich um einen λ-lysogenen Stamm, welcher den λ-Repressor cI konstitu- tiv exprimiert. Dadurch werden Proteine, die unter der Kontrolle des PL-Promoters stehen, reprimiert. Verwendung findet er in der Vermehrung von Plasmid-DNA.
TGE900(pEcoR4)
Genotyp: (rK- mK+), F-, su-1, ilv-1, bio[λcI857 ∆Bam ∆H1]
Dieser λ-lysogene Stamm dient der Expression von Mutanten der Restriktionsendo- nuklease EcoRI, er exprimiert eine thermosensitive Mutante des λ-Repressors (cl857). Oberhalb einer Temperatur von 42°C liegt dieser Repressor als bindungsin- aktives Monomer vor, dadurch kann eine Expression eines plasmidkodierten Gens unter Kontrolle des PL-Promoters durch Temperaturerhöhung induziert werden [Bot- termann & Zabeau, 1985].
Zusätzlich enthält dieser Stamm das Plasmid pEcoR4, welches die zu EcoRI korre- spondierende Methylase kodiert. Auf diesem Weg wird die toxische Wirkung des ex- primierten Genproduktes EcoRI minimiert.
WK6mutS(λ)
Genotyp:(rK- mK+), ∆[lac proAB], galE, strA, mutS215: Tn 10 [F´, proAB, lacIq Z∆M15], λ+ Hierbei handelt es sich auch um einen λ-lysogenen Stamm, welcher in der Vermeh- rung von Mismatch-Plasmiden aus der Gapped duplex-Mutagenese eingesetzt wird.
Es ist ein reparaturdefizienter Stamm, bei dem das für die Mismatch-Reparatur ver- antwortliche mutS-Gen durch Tn10 zerstört wurde.
2.1.2 Verwendete Vektoren
pRIF309+(His6) (5068Bp) [Wolfes et al., 1986; Rotzal, 1992]
Es handelt sich um ein pBR322-Derivat, welches für die Replikation den CoIE1-Re- plikationsursprung (Ori) besitzt. Für die Herstellung des einzelsträngigen Plasmids liegt der Replikationsursprung des filamentösen Phagen f1 vor. pRIF309+ trägt das β- Lactamasegen. Dieses wird durch den Tn903-TetR-Promotor konstitutiv exprimiert, wodurch die plasmidhaltigen Zellen über eine Ampicillin-Resistenz verfügen.
Auf dem Plasmid liegt das ecoRI-Gen. Es wird durch den PL-Promotor und den fd- Terminator kontrolliert. Dieses System ermöglicht die Haltung des toxischen Gens in E.coli-Zellen, die den λ-Repressor cl produzieren. Am C-Terminus der codierenden Sequenz des ecoRI-Gens sind sechs Histidinreste angefügt (Hexahistidintag), um das Genprodukt (EcoRIHis6) über eine Ni2+-NTA-Affinitätsmatrix aufreinigen zu kön- nen. Das Plasmid dient der Mutagenese und der Expression von EcoRI-Mutanten.
pRIF309+ findet Verwendung als Template während der PCR-Mutagenese.
pEcoR4 (5929Bp)
Bei dem Plasmid pEcoR4 handelt es sich um einen Abkömmling des Vektors pACYC184. Es trägt das ecoRI-Methylasegen, welches konstitutiv exprimiert wird und eine Chloramphenicol-Resistenz. Durch die EcoRI-Methylase wird die zelleigene DNA vor dem toxischen Genprodukt EcoRI geschützt, eine Überproduktion wird so ermöglicht. Das Plasmid enthält den Replikationsursprung p15A und ist dadurch zu pRIF309+(CH6) kompatibel, welches das ecoRI-Gen trägt.
pRIStrep (5074Bp) [Vennekohl, 1999]
Ausgehend vom Vektor pRIF309+(CH6) erfolgte ein Austausch des C-terminalen He- xahistidintags durch einen Affinitätstag nach Vorlage des StrepTag II, welcher acht Aminosäuren enthält. Dadurch erhöht sich die Anzahl der Basenpaare auf 5074Bp.
Man bezeichnet das EcoRI-Fusionsprotein mit diesem Affinitätstag als EcoRIStrepII.
pUC8 (2665Bp) [Viera & Messing, 1982; Pouwels et al., 1985]
pUC8 ist ein käuflicher Klonierungsvektor mit CoIE1-Replikationsursprung. Das Plasmid trägt ein Ampicillin-Resistenzgen. Es enthält in der Multiple cloning site eine singuläre EcoRI-Erkennungssequenz und wird hier für kinetische Spaltexperimente verwendet.
2.1.3 Herstellung kompetenter Zellen
Die in dieser Arbeit verwendeten chemisch kompetenten Zellen werden nach der Rubidiumchlorid-Methode hergestellt, einem modifizierten Verfahren nach Hanahan (1993). Bei dieser Methode können Kompetenzen von >107 cfu/µg eingesetzter DNA erreicht werden. Die Zellen sind dann bis zu einem Jahr bei -70°C stabil.
Aus einer Übernachtkultur in Luria-Bertani-Medium (LB-Medium) wird eine 100ml Kultur des betreffenden E.coli-Stammes angeimpft. Bei OD600nm=0,4- 0,6 werden die Zellen sedimentiert (1300g, 10min, 4°C), in 100ml eiskalter TFB1-Lösung aufgenommen und 5min auf Eis inkubiert. Die folgenden Ar- beitsschritte müssen auf Eis und mit gekühlten Gefäßen ausgeführt werden.
Nach einer erneuten Sedimentation erfolgt eine Resuspension in 10ml eis- kalter TBF2-Lösung und anschließender 15-60 minütiger Aufbewahrung auf Eis.
100µl Aliquots werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C gelagert.
LB-Medium: 10g Caseinhydrolysat (Gibco-BRL) 10g Hefeextrakt (Gibco-BRL)
5g NaCl
ad 1l ddH2O; pH7,5 einstellen
TBF1: 30mM K-Acetat 100mM RbCl 10mM CaCl2
50mM MnCl2
15% Glycerin
pH8,5; einstellen mit 0,1M Essigsäure, sterilfiltrieren
TBF2: 10mM Mops oder Pipes
75mM CaCl2
10mM RbCl
15% Glycerin
pH6,5; einstellen mit 0,1M KOH, steril filtrieren
2.1.4 Transformation von Bakterienzellen
Da Bakterienzellen normalerweise keine DNA aus dem umgebenden Medium auf- nehmen, müssen sie speziell darauf vorbereitet werden (siehe 2.1.3).
Die kompetenten Zellen können dann mit dem Zielplasmid transformiert werden.
Ein 100µl-Aliquot der kompetenten Zellen wird in einem Eisbad aufgetaut.
Nach Zugabe von etwa 100ng der zu überführenden Plasmid-DNA wird der Ansatz für 45min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgt ein 2minütiger Hitze- schock, welcher die Aufnahme von DNA in die Zellen fördern soll. Die Tem- peratur ist abhängig vom verwendeten Zelltypus, sie liegt 5-7°C über der op- timalen Bebrütungstemperatur.
Nach einer kurzen Abschreckphase auf Eis werden die Zellen mit 900µl LB- Medium versetzt und 1h bei optimaler Wachstumstemperatur inkubiert. Nach schonender Zentrifugation (4°C, 1000g, 5min) werden die Zellen auf festem Selektivmedium ausplattiert und über Nacht bei optimaler Temperatur be- brütet.
Tabelle 2.1 gibt die Temperaturen für die verwendeten Stämme wider.
Tab. 2.1: Bebrütungs- und Hitzeschocktemperatur in Abhängigkeit des Bakterienstammes
Stamm Hitzeschocktemperatur Bebrütungstemperatur
LK111(λλλλ) 42°C 37°C
TGE900(pEcoR4) 37°C 30°C
WK6mutS(λλλλ) 42°C 37°C
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA
Die Gewinnung von Plasmid-DNA aus E.coli erfolgt mit den Produkten der Firma Qiagen. Mit dem QIAprep Spin Miniprep System werden bis zu 10µg DNA erhalten (aus 3ml LB-Kulturen). Eine größere Ausbeute an DNA gewinnt man mit QIAGEN-tip 20 (20ml Kulturvolumen) beziehungsweise QIAGEN-tip 100 (100ml Kulturvolumen).
Die Ausbeute beträgt dann 20µg beziehungsweise 100µg.
Zur Rückgewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wird mit dem QIAquick Gel Extraction Kit durchgeführt.
Die Durchführungen richten sich nach den jeweiligen Protokollen des Herstellers.
2.2.2 Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA
Enzymatische Plasmidspaltungen werden auf verschiedenen Stufen des Klonie- rungsprozesses durchgeführt. Sie dienen einerseits der Überprüfung des Klonie- rungserfolges (analytische Spaltung) andererseits der Gewinnung von DNA für die Klonierung (präparative Spaltung). Die Trennung erfolgt durch Agarosegelelektropho- rese (siehe 2.2.4.1), wobei eine Längenabschätzung der gewonnenen Fragmente anhand eines Standards vorgenommen wird.
Analytische Spaltung: 1-2µg Plasmid-DNA werden mit 10U einer Restriktion- sendonuklease für eine Stunde bei der für das Enzym optimalen Temperatur inkubiert.
Präparative Spaltung: 8-10µg Plasmid-DNA werden mit 20U einer Restrikti- onsendonuklease für mehrere Stunden oder auch über Nacht bei optimaler Temperatur inkubiert.
2.2.3 Ligation
Zur Verknüpfung von DNA-Fragmenten wurde in dieser Arbeit T4-DNA-Ligase ver- wendet. Das Enzym ist in der Lage, alle Brüche zu reparieren, die in einer doppel- strängigen DNA vorkommen können.
Die Ligation erfolgt bei einzelsträngigen Überhängen (sticky ends) bei 37°C, da die DNA-Fragmente schon durch Basenpaarung der Überhänge in Ver- bindung treten können. Eine Verknüpfung von glatten DNA-Fragmenten (blunt ends) wird bei niedrigerer Temperatur durchgeführt (etwa 16°C).
Für den Ansatz setzt man äquimolare Mengen der DNA-Fragmente ein.
Weiterhin gibt man den vom Hersteller empfohlenen Puffer und ATP dazu (um das durch die Knüpfung von Phosphodiesterbindungen verbrauchte ATP zu ersetzen). Nach Zugabe von 1,5U T4-DNA-Ligase wird der Reaktionsan- satz eine halbe Stunde inkubiert.
Nachfolgend muß die Ligase durch 10minütige Erhitzung des Ansatzes auf 65°C inaktiviert werden. Nun können mit dem Ligationsprodukt Zellen trans- formiert werden (siehe 2.1.4).
2.2.4 Elektrophoretische Trennung von DNA
2.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese
Agarose, ein Polysaccharid aus roten Meeresalgen, ist ein lineares Polymer aus al- ternierend 1,3-verknüpften ß-D-Galactopyranose- und 1,4-verknüpften 3,6-Anhydro-
α-L-Galactopyranose-Resten. Es löst sich beim Erhitzen in Wasser. Beim Abkühlen bildet sich ein Netzwerk, welches die Wanderung der zu trennenden DNA- Fragmente herabsetzt. Zum Beispiel ist ein 1%iges Gel durch Poren mit einem mittleren Durchmesser von 150nm gekennzeichnet. Die herzustellende Konzentra- tion richtet sich nach der Anzahl der Basenpaare der zu trennenden DNA-Fragmen- te: je kleiner das Fragment, desto höher die Gelkonzentration. Agarosegele werden in einer die Dimension des Gels festlegenden Wanne gegossen.
Für ein 1%iges Gel löst man 1g Agarose in 100ml TPE-Laufpuffer unter Er- hitzen auf. Anschließend gießt man die Lösung in die vorbereitete Gelkas- sette. Nach Erstarren der Masse wird diese mit Laufpuffer überschichtet. Nun können die mit Agaroseauftragspuffer versetzten Proben aufgetragen wer- den. Die Elektrophorese läuft etwa zwei Stunden bei 60V und 100mA.
Zur Dokumentation wird das Gel mit Ethidiumbromid (etwa 10µl auf 100ml warmes Wasser) gefärbt. Die Banden werden auf einem UV-Leuchttisch (312nm, UV-Transilluminator Chema 4) sichtbar gemacht. Die Dokumenta- tion erfolgt mit E.A.S.Y RH-3 (Enhanced Analysis System, Herolab), die Bil- der werden über einen Drucker (Mitsubishi Video copy processor) erhalten.
TPE-Puffer: 900mM Tris
(10fach) 20mM EDTA, pH8,8
Agaroseauftragspuffer: 0,25M EDTA
(5fach) 1,2% SDS
25% Saccharose 0,1% Bromphenolblau 0,1% Xylen Cyanol FF
2.2.4.2 Polyacrylamidgel-Elektrophorese
Diese Form der Elektrophorese dient der Trennung doppelsträngiger DNA-Frag- mente in einem Bereich von 5-1000Bp, wie man sie beispielsweise aus Restriktions- spaltungen oder PCR erhält. Als Gel- und Laufpuffer benutzt man TTE. Stammlö- sung ist eine 30%ige Acrylamid/Bisacrylamidlösung der Firma AGS.
Man gießt die vorbereitete Gellösung zwischen zwei Glasplatten und wartet die durch TEMED und APS eingeleitete Polymerisation ab. Anschließend kann das Gel in die Elektrophoresekammer eingespannt und die Proben auf- getragen werden. Die Elektrophorese läuft bei 30mA. Angefärbt wird das Gel auf einer Glasplatte haftend in Ethidiumbromidlösung. Die Dokumentation der Banden wird wie beim Agarosegel beschrieben durchgeführt (siehe 2.2.4.1).
TTE: 1,8M Tris (nicht eingestellt)
(20fach) 575mM Taurin
2,7mM EDTA
PAA-Auftragspuffer: 10mM Tris/HCl, pH8,8
(5fach) 1mM EDTA
50% (v/v) Glyzerin 0,2% (w/v) Azorubin
0,2% (w/v) Bromphenolblau 0,2% (w/v) Xylen Cyanol FF
2.2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase chain reaction, PCR) beruht auf der zy- klischen Amplifikation von DNA-Sequenzen durch eine thermostabile Polymerase.
Dazu sind mehrere Faktoren wichtig. Man benötigt zwei synthetisch hergestellte Oli- godesoxynucleotid-Primer mit einer Länge von 15-30 Nukleotiden. Die Sequenzen der Primer müssen komplementär zu den Anfangs- und Endsequenzen der beiden Stränge der zu amplifizierenden DNA sein. Weiterhin wird ein Gemisch von Desoxy- nukleotidtriphosphaten und eine hitzestabile DNA-Polymerase, zum Beispiel aus Thermus aquaticus [Mullis & Falcona, 1987], benötigt.
Die PCR-Reaktion läuft in drei sich wiederholenden Reaktionsschritten ab. Zunächst erfolgt eine Denaturierung der Doppelstrang-DNA (Template) der gewünschten Se- quenz durch Erhitzen auf 95°C. Dieses bewirkt eine Auftrennung in Einzelstränge. In der nun folgenden Abkühlphase hybridisieren die Primer auf die Einzelstrang-DNA (Annealing). Durch die thermostabile DNA-Polymerase werden die neuen Stränge
bei einer Temperatur von 72°C synthetisiert (Extension). Es sind nun zwei Moleküle doppelsträngiger DNA entstanden. Diese werden wieder denaturiert, es entstehen erneut Einzelstränge, die nach dem Abkühlen mit den Primern hybridisieren und dann wieder von der Polymerase verlängert werden.
Da bei jedem Einzelschritt eine Verdopplung der DNA-Menge erreicht werden sollte, tritt nach 20 Zyklen theoretisch ein Vermehrungsfaktor von etwa 106 auf.
2.2.6 Mutagenesestrategien
Für die zielgerichtete Herstellung der EcoRI-Mutanten wurden die Gapped duplex- Methode [Kramer et al.,1984] und die PCR-Mutagenese [Barettino et al. 1994] ver- wendet.
2.2.6.1 Gapped duplex-Mutagenese
Die Gapped duplex-Methode ist eine gezielte Mutagenesestrategie.
Um die gewünschte Mutation einführen zu können, wird zunächst ein Oligonukleotid (Primer) synthetisiert, welches neben der Aminosäuremutation eine stille Mutation enthält. Diese beinhaltet die Basensequenz zur Erzeugung oder Zerstörung einer Restriktionsspaltstelle, verändert jedoch nicht die Aminosäuresequenzen der Posi- tion. Die stille Mutation dient später der Überprüfung des Mutageneseerfolges und wird als Screeningsite bezeichnet. Abbildung 2.1 zeigt eine schematisierte Darstel- lung der Mutagenese.
Abb. 2.1: Schematische Darstellung der Gapped duplex-Mutagenese
Aus einer mit f1-Phagen superinfizierten Bakterienkultur, welche das zu mu- tierende Plasmid mit f1-Replikon (pRIF309+(CH6)) enthält, wird einzelsträn- gige Plasmid-DNA aufgereinigt [Vennekohl,1996]. Dann erfolgt auf dieser Matrize die Hybridisierung des Mutageneseprimers sowie eines Mutagenese- rahmens, welcher die Bereiche, die in der Auffüllreaktion (Fill in) neusyntheti- siert werden müssen, möglichst klein hält. Diesen Rahmen erhält man durch Spaltung aus dem zu mutierenden doppelsträngigem pRIF309+(CH6) mit zwei Restriktionsendonukleasen. Der Mutageneseprimer enthält nach der Synthese kein endständiges Phosphat, so daß eine Phosphorylierung erfor- derlich wird (siehe unten).
Zur Hybridisierung folgt eine Inkubation von 5min bei 95°C mit anschließen- der langsamer Abkühlungsphase des Hybridisierungsansatzes auf Raum- temperatur. Einzelsträngige Bereiche werden mit Hilfe von T7-DNA-Polyme- rase aufgefüllt und dann durch T4DNA-Ligase geschlossen (siehe unten). Mit dem entstandenen Mismatch-Plasmid werden Zellen des reparaturdefi- zienten Stammes WK6mutS(λ) transformiert (siehe 2.1.4). Nach der in vivo-
+
+
ss-pRIF309+
Rahmen: SpeI/HindIII
Mutagenese- Oligonukleotid
mismatch-Plasmid
Transformation von WK6mutS
mutiertes Plasmid wt-Plasmid
linearisiertes wt-Plasmid mutiertes Plasmid
Transformation in LK111
Screening:
Schneiden mit BglII
Amplifikation besitzen höchstens 50% der Tochterplasmide die gewünschte Mutation, da nur ein Strang des Plasmids die durch den Mutageneseprimer eingeführte Mutation trägt.
Über die stille Mutation ist dann eine Selektion der positiven Klone möglich, indem bei Einführung einer Restriktionsspaltstelle die isolierte DNA mit dem entsprechenden Enzym gespalten wird (siehe 2.2.2). Nach Religation (siehe 2.2.3) erfolgt die Transformation von LK111(λ)-Zellen. Wurde eine Restrik- tionsspaltstelle vernichtet, können nach der Spaltung durch das Screening- Enzym direkt LK111(λ) transformiert werden.
Anschließend werden einzelne Klone erneut mit dem Screening-Enzym ge- spalten. Die daraus hervorgehenden positiven Klone müssen in ihrer Basen- sequenz verifiziert werden (siehe 2.2.7).
Phosphorylierungsansatz: 2µl 10x EcoRI-Puffer (Standardbedingungen) 2µl 0,1M DTT
1µl 10mM rATP 1µl (20pmol) Primer 13µl ddH20
1µl PNK (1U/µl)
Hybridisierungsansatz: 4µl Hybridisierungspuffer (10fach)
10µl (10pmol) phosphoryliertes Oligonukleotid 3µl (1pmol) einzelsträngige pRif309+(His6)-
Matrize
10µl (0,5pmol) verkürzter Doppelstrang (Rah- men)
ad 40ml ddH2O
Auffüllreaktion (Fill in): 40µl Hybridisierungsansatz und Ligation 7,5U T7-DNA-Polymerase
7,5U T4-Ligase
8µl Fill in-Puffer (10fach) ad 80µl ddH2O
Hybridisierungspuffer: 10mM Tris/HCl, pH7,5 150mM KCl
Fill in-Puffer: 27,5mM Tris/HCl, pH7,5 67,5mM KCl
15mM MgCl2
2mM DTE
50µM ATP
je 25µM dATP, dGTP, dTTP, dCTP
2.2.6.2 PCR-Mutagenese
Die in vitro-Amplifikationsmethode der Polymerase chain reaction (PCR) [Mullis &
Falcona, 1989] ermöglicht die gezielte Veränderung eines Gens, in das durch die Verlängerung der eingesetzten mutagenen Primer gleichzeitig eine Mutation auf bei- den Strängen des Gens eingebracht wird [Barettino et al., 1993].
Dazu sind zwei Teilschritte notwendig, welche auf der Abbildung 2.2 deutlich ge- macht werden.
Abb. 2.2: Schematische Darstellung der PCR-Mutagenese
In diesem Fall erfolgt im ersten Schritt die Amplifikation eines verkürzten Fragments des ecoRI-Gens. Der Reaktionsansatz beinhaltet den Mutageneseprimer M, der so- wohl die gewünschte als auch eine stille Mutation enthält sowie den Primer A, der auf dem Hexahistidintag des ecoRI-Gens und angrenzenden Bereichen hybridisiert. Als Template wird hier pRIF309+(CH6) eingesetzt (Ansatz siehe unten). Das Produkt dieser 1. PCR-Reaktion dient in der anschließenden 2. PCR-Reaktion als Mega- primer. Dort werden gleichzeitig die Primer A und B sowie pRIF309+(ohne Hexahisti- dintag) als Template eingesetzt (Ansatz siehe unten).
Der PCR-Ansatz wird nach folgenden Angaben zusammengestellt (siehe unten) und einer PCR unterzogen. Tabelle 2.2 gibt das Standardprogramm für die PCR-Mutagenese wider.
Erste PCR: 5µl 10xHigh-Fidelity-Puffer
5µl 2mM dNTPs
1µl 50µM Primer A
1µl 50µM Mutageneseprimer
1µl pRIF309+(His6) (100ng/µl, lin. XmnI) 1µl High Fidelity-DNA-Polymerase (nativ,
2,5U/µl, Firma Boehringer Mannheim) 35µl ddH2O
Tab. 2.2: Standardprogramm für die PCR-Mutagenese
Wiederholungen Denaturierung Annealing Extension
1x 91°C
300s
30x 91°C
60s
45°C 90s
72°C 60s
1x 91°C
60s
45°C 90s
72°C 300s