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Zusammenhänge zwischen computergestützt ermittelten spermatologischen Merkmalen und der Fertilität von Bullen

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-Klinik für kleine Klauentiere-

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Zusammenhänge zwischen computergestützt ermittelten spermatologischen Merkmalen und der Fertilität von Bullen

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines

DOKTORS der VETERINÄRMEDIZIN durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Jens Baltissen

aus Nettetal

Hannover 2007

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. D. Waberski

1. Gutachterin: Prof. Dr. med. vet. D. Waberski 2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. H. Bollwein

Tag der mündlichen Prüfung: 25.05.2007

(3)

Meinen Eltern

gewidmet.

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(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 9

2 Literatur 10

2.1 Methoden zur Spermabeurteilung 10

2.1.2.1 Parameter der CASA 12

2.1.2.2 Entwicklung der CASA-Geräte 14

2.1.2.3 Computergestützte Morphometrie 16

2.1.2.4 Plasmamembranintegrität (SYBR 14 und PI) 17

2.2 Überprüfung der Befruchtungskompetenz 25

2.2.1 Maßzahlen für die Fruchtbarkeit 25

2.2.1.1 Non-Return-Rate (NRR) 24

2.2.1.2 Heterospermer (kompetetiver) Index 26

2.2.1.3 Embryonen und akzessorische Spermien 27

2.2.2 Einflußfaktoren auf die Fruchtbarkeit 28

2.1.1 Resistenztests 10

2.1.2 Computergestützte Methoden 11

2.1.3 Zusammenhänge zwischen den spermatologischen Parametern

………und der Fruchtbarkeit 19

(6)

3 Eigene Untersuchungen 34

3.1 Material und Methoden 34

3.2 Ergebnisse 41

3.1.1 Versuchsaufbau 34

3.1.2 Tiere 34

3.1.3 Samenproduktion 34

3.1.4 SpermVision® Gerät 35

3.1.5 Untersuchungsablauf 36

3.1.6 Vergleichsstudie der Messsysteme 39

3.1.7 Künstliche Besamung 39

3.1.8 Ermittlung der NRR (60) 39

3.1.9 Statistische Methoden 40

3.2.1 Ergebnisse der Vergleichsstudie der Messsysteme 41 3.2.2 Ergebnisse der spermatologischen Untersuchungen (CASA und

………Morphologie) 41 3.2.3 Zusammenhänge zwischen den spermatologischen Parametern45

3.2.4 Besamungsergebnisse (NRR) 48

3.2.5 Zusammenhänge zwischen der NRR und den spermatologischen

………Parametern 48

3.2.6 Vorhersage der Befruchtungskompetenz an Hand

………spermatologischer Parameter mittels Regressionsanalyse 50 3.2.7 Zusammenhänge zwischen der NRR und den Ergebnissen des

………Thermoresistenztests 55 3.2.8 Zusammenhänge zwischen der NRR und den Ergebnissen des

………Lagerungstests 57

3.2.9 Merkmalsvergleich subfertiler Bullen 60

(7)

4 Diskussion 63

4.1 Bedeutung der Parameter - Beurteilung der

………Korrelationsergebnisse 64 4.2 Prädiktion der Befruchtungskompetenz 67

4.3 Identifikation subfertiler Bullen 72

4.4 Vergleich Objektträger/ Leja-Kammer 73

4.5 Praxistauglichkeit des CASA-Gerätes SpermVision® 74

4.6 Diskussion der Forschungsstrategie 75

5 Zusammenfassung 78

6 Summary 80

7 Literaturverzeichnis 82

8 Anhang 95

8.1 Vergleich Gesamtbesamungen – Erstbesamungen 95 8.2 SpermVision® (Version 3.0) Settings 96

(8)

Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung

ALH Amplitude of lateral head displacement (µm) BCF Beat cross frequency (s-1)

bzw. beziehungsweise

ca. circa

CASA Computer assisted sperm analysis d.h. das heißt

DAP Distance avarage path (µm) DCL Distance curve line (µm)

df degrees of freedom (Freiheitsgrade) DM Doppel- und Mehrfachmissbildungen DSL Distance straight line (µm)

etc. et cetera

gMOT Motilität, gesamt (%) H Halsveränderungen

HE Veränderungen an Haupt- und Endstück K Kopfveränderungen

KK Kopfkappenveränderungen LIN Linearity: VSL / VCL

MAS Morphologisch abweichende Spermien Mio. Millionen

Mrd. Milliarden

MW arithmetischer Mittelwert n.s. nicht signifikant

NRR Non-Return-Rate (%) o.a. oben angeführt

p probability (Wahrscheinlichkeit) PI Propidiumiodid

pMOT Motilität, progressiv (%)

(9)

SD Standardabweichung STR Straightness: VSL / VAP

V Verbindungsstückveränderungen VAP Velocity avarage path (µm / sec) VCL Velocity curve line (µm / sec) vgl. vergleiche

VIA Viability (Zellmembranintegrität) (% lebende Spermien) VK Variationskoeffizient

VSL Velocity straight line (µm / sec) K Kopfveränderungen

KK Kopfkappenveränderungen V Verbindungsstückveränderungen H Halsveränderungen

MAS Morphologisch abweichende Spermien HE Haupt- und Endstückveränderungen WOB Wobble: VAP / VCL

(10)
(11)

1 Einleitung

Die computergestützte Spermabeurteilung, „Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)“, ermöglicht eine objektive und standardisierbare Erfassung von Bewegungsparametern und Konzentrationen von Spermien. Der technische Fortschritt qualifiziert diese Systeme auch für den Einsatz auf den Besamungsstationen, wo sie zur Qualitätssicherung und Steigerung der Produktionseffizienz beitragen. Die CASA-Systeme ermöglichen eine Einzel-Zell- Analyse einer Fülle von Motilitäts- und Geschwindigkeitsparametern, deren fertilitätsdiagnostisches Potential weitgehend unbekannt ist.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, den Zusammenhang zwischen den mit dem CASA- System SpermVision® erhobenen Parametern sowie standard-spermatologischen Merkmalen und der Fertilität von Besamungsbullen bei Einsatz von Tiefgefriersperma herzustellen. Die vorliegende Studie zeichnet sich durch folgende Charakteristika aus: (1) die hohe Anzahl der Tiere und der untersuchten Ejakulate, (2) den direkten Zusammenhang zwischen dem untersuchten Sperma und der im Besamungsversuch ermittelten Fertilität, (3) der Verwendung eines technisch weiter entwickelten CASA- Systems mit dem es auch möglich ist, die Plasmamembranintegrität zu bestimmen und (4) die kombinierte Analyse von Motilitäts- und Morphologieparametern zur Fertilitätsprognose in einem linearen Regressionsmodell. Es wird erwartet, dass durch die Kombination aller oben genannten Faktoren die Prognose der Befruchtungskompetenz von Besamungsbullen und die Effizienz der Produktion von Tiefgefriersperma erhöht werden kann. Dabei wird im Speziellen die mögliche Identifikation subfertiler Bullen anhand spermatologischer Merkmale geprüft. Die frühzeitige, d.h. auf Laborebene stattfindende Erkennung dieser Bullen würde zu einer deutlichen Effizienzsteigerung in der Selektion und der Produktivität der Tiere und damit zu einer höheren Rentabilität führen.

(12)

2 Literatur

2.1 Methoden zur Spermabeurteilung

Generell werden verschiedene Methoden zur Spermabeurteilung von Besamungsbullen unterschieden (WEITZE, 2001). Zu diesen zählen neben der grobsinnlichen Untersuchung die klassische Motilitäts- und Morphologiebestimmung.

Die Entwicklung computergestützter Analyseverfahren ermöglicht eine objektive Bestimmung von Motilität und Morphologie und die Messung zusätzlicher, die Kinetik einzelner Spermien beschreibende Parameter (BOYERS et al., 1989). Ergänzt werden diese durch funktionelle Tests einzelner spermatologischer Eigenschaften, zu denen unterschiedliche Resistenztestverfahren und neuartige fluoreszenzmikroskopische Färbetechniken zählen (WABERSKI et al., 1999).

2.1.1 Resistenztests

Ziel eines Resistenztests ist, die Reaktion der Spermien unter bestimmten Belastungen zu erfassen und somit Rückschlüsse auf die Qualität des Ejakulates zu schließen. Die Art der Belastung können Lagerung, Hitze und Kälte, pharmakologische Agenzien, osmotisch unterschiedliche Medien sowie oxidativer Stress sein (MULLER, 2000).

Beim Lagerungstest wird das Bullensperma mehrere Tage bei 5°C gelagert und im 24 h Rhythmus untersucht (WEITZE, 2001). Von ähnlichem Ablauf ist auch der Thermoresistenztest. Das aufgetaute Sperma wird bei Körpertemperatur für einige Stunden inkubiert und stündlich untersucht (WEITZE u. MÜLLER, 1991). SAACKE (1970) und SAACKE und WHITE (1970/1972) berichteten signifikante Beziehungen (r = 0,46; p < 0,05; zwei Stunden nach Auftauen und Lagerung bei 38°C) zwischen der Motilität im Thermoresistenztests und der Non-Return-Rate (NRR) von sechzehn Bullen (158 Ejakulate). Diesen Zusammenhang stellten auch KOZUMPLIK und

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SOSNOVA (1985) bei 17 Bullen mit 160 Ejakulaten und 10682 Erstbesamungen dar.

Bei den Ejakulaten, die nach zwei Stunden Inkubation bei 38°C noch 40%

progressive Motilität aufwiesen, konnte eine Abkalberate von 64,9% (1496 Besamungen) ermittelt werden. Bei 30% progressiver Motilität war diese mit 57,0%

(2403 Besamungen) signifikant geringer.

Ein häufig angewendeter Resistenztest, der eine Aussage über die Funktion und die chemisch-physikalischen Aktivität der Plasmamembran zulässt (ENGLAND u.

PLUMMER, 1993), ist der Hypoosmotische-Schwelltest (HOST) (NIE u. WENZEL, 2001; LECHNIAK et al., 2002). Dabei wird die Fähigkeit der Plasmamembran, unterschiedliche osmotische Gradienten auszugleichen, getestet. Die kombinierte Analyse im Regressionsmodell von Ergebnissen des (hyper-)osmotischen Resistenztests und mittels CASA bestimmter Motilitätsdaten beim Schwein brachte signifikante Korrelationen zur Konzeptionsrate (QUINTERO-MORENO et al., 2004).

BRITO et al. (2003) stellten den Hyperosmotischen-Schwelltest als das einzige Verfahren heraus, das eine signifikante Aussage über die Funktion der Plasmamembran von Bullenspermien im Bezug auf die in-vitro-Fertilisationsrate gibt.

Sie empfahlen den Test in die Routineuntersuchung einzubeziehen. Korrelationen konnten auch zwischen einem Hypoosmotischen-Schwelltest und der Membranintegrität von Bullensperma (r = 0,45, p < 0,05) sowie dem ATP Gehalt des Spermas (r = 0,61, p < 0,05) gezeigt werden (JANUSKAUSKAS et al., 1996). In einer kombinierten Analyse der Membran von Kopf und Schwanz des Kaninchenspermiums durch Anfärbung mittels Eosin und einem Hypoosmotischen- Schwelltest fanden DUCCI et al. (2002) eine positive Korrelation zur Motilität.

Insgesamt lassen diese Ergebnisse die Annahme zu, dass die Resistenzfähigkeit von Sperma einen Beitrag zur Vorhersage der Befruchtungskompetenz leisten kann.

2.1.2 Computergestützte Methoden

Die „Computer Assisted Sperm Analysis“ (CASA) hat sich in den letzten Jahren unter anderem durch die stetig steigende Rechenleistung der Personal Computer immer

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nach objektiven Beurteilungsmöglichkeiten bei der spermatologischen Untersuchung Rechnung getragen. Neben der Bestimmung der Vorwärtsbeweglichkeit können zusätzlich Geschwindigkeit und Art der Bewegung ermittelt werden. Durch die deutliche Beschleunigung der Untersuchungen und die Kostenreduzierung der Geräte werden diese nun mehr nicht nur in wissenschaftlichen Einrichtungen verwendet (BOYERS et al., 1989), sondern auch für den Routinebetrieb der Besamungsstationen interessant. Das Prinzip der Analyse hat sich nicht verändert:

Von dem zu untersuchenden Sperma wird mit einer Kamera, die auf einem Mikroskop angebracht ist, eine Videosequenz erstellt und mittels geeigneter Softwareprogramme analysiert. Das Programm gibt dabei Informationen für jedes einzelne in der Sequenz getroffene Spermium wieder und ist in der Lage, bei Benutzung einer Untersuchungskammer mit definiertem Volumen auch die Spermiendichte der Probe zu bestimmen. Durch die Ergänzung der Systeme um fluoreszenzmikroskopische Einheiten wurde es möglich, durch unterschiedliche Färbemethoden Aussagen über die Funktionalität der einzelnen Organellen des Spermiums, insbesondere der Plasmamembran- und der Akrosomintegrität zu treffen. Im Gegensatz zur subjektiven Beurteilung ergibt dies eine enorme Steigerung an Information und eine deutliche Minimierung der Untersuchungszeit (AGARWAL et al., 2003). Gleichzeitig lassen sich unterschiedliche Laboreinrichtungen besser qualitativ vergleichen (VERSTEGEN et al., 2001).

2.1.2.1 Parameter der CASA

Die üblicherweise von den CASA-Geräten gemessenen Parameter sind neben der lokalen, progressiven und nicht vorhandenen Motilität bestimmte Werte, die die Kinetik des einzelnen Spermiums detailliert beschreiben. Dazu gehören nach BOYERS et al. (1989) jeweils die Strecke und die Geschwindigkeit über den gesamten Weg, den das Spermium in der gemessenen Zeit zurückgelegt hat (DCL = distance curve line bzw. VCL = velocity curve line), die Strecke und die Geschwindigkeit über die direkte Verbindung zwischen Anfangs- und Endpunkt (DSL

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durchschnittlichen Weg (DAP = distance average path bzw. VAP = velocity average path). Die seitliche Kopfauslenkung (ALH = amplitude of lateral head displacement) beschreibt die Amplitude der Abweichung des Kopfes vom durchschnittlichen Weg.

Die beat-cross frequency (BCF) ist die gemittelte Frequenz, mit der die Bahn der gesamten vom Spermium zurückgelegten Strecke die durchschnittliche Strecke kreuzt. Aus diesen gemessenen Werten können weitere Parameter errechnet werden. Dazu zählt die Linearity (LIN), der Quotient aus VSL durch VCL, der die Linearität über die gesamte Strecke wiedergibt. Die Straightness (STR), VSL durch VAP, gibt die Geradlinigkeit des durchschnittlichen Weges wieder. Außerdem beschreibt der Wobble (WOB) den Grad des Ausschlags der gesamten Strecke von der gemittelten Strecke. Die hier genannten Parameter sind in Abbildung 1 zusammengefasst dargestellt. BOYERS et al. (1989) geben zu den aufgelisteten Parametern eine detaillierte Erläuterung.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der kinetischen Parameter eines Spermiums nachDAVISundSIEMERS(1995)

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2.1.2.2 Entwicklung der CASA-Geräte

Die Entwicklung der CASA-Geräte beinhaltete eine stetige technische Verbesserung der Messung und der Datenerfassung. Nach HOLT und VAN LOOK (2004) sind die Stör- und Fehlerquellen der ersten Untersuchungen bei der Benutzung der Systeme weitgehend überwunden. Ein Punkt, der in allen Studien als problematisch beschrieben wird, ist die Handhabung der Proben. DAVIS et al. (1995) geben als limitierende Faktoren für eine präzise Messung die Temperatur, die Messkammerbeschaffenheit, die Anzahl der untersuchten Bilder und den Zeitpunkt der Messung an. Gerade die Kammer spielt beim Messvorgang eine entscheidende Rolle. Unterschiedliche Beschickung oder geringe Volumenschwankungen, z. B.

durch Luftblasen oder uneinheitliche Produktionschargen seitens des Herstellers, führen zu abweichenden Ergebnissen. GINSBURG et al. (1990) fanden in ihren Untersuchungen über den Einfluss von Kammerdesign und –tiefe deutliche Unterschiede zwischen Makler-, Neubauer- und MicroCell- Kammern in der Präzision und Wiederholbarkeit der Ergebnisse, wobei Makler-Kammern die geringste Wiederholbarkeit aufwiesen. Neben den Schwankungen in der Konzentration wichen auch die Durchschnittsgeschwindigkeiten der Spermien zwischen den Messsystemen voneinander ab. Der Grund ist in der Kammertiefe zu suchen.

Während die Spermien sich im dreidimensionalen Raum bewegen, misst das CASA System nur zweidimensional. Eine geringe Kammertiefe ist also Vorraussetzung dafür, dass die Spermien sich in einer Ebene bewegen, da ansonsten die zurückgelegte Strecke zu gering eingeschätzt wird. Dies wird durch eine Studie von SCHRÖTER et al. (1996) belegt, die signifikante Unterschiede der VAP zwischen einer 10 µm und einer 15 µm tiefen Kammer fand. Die Geschwindigkeit war in der flachen Kammer höher als in der tieferen Modellausführung. Den Einfluss des Segre- Silberberg Effektes führt NICOLAE (2006) außerdem in seinen Untersuchungen an Ebersperma als mögliche Ursache einer uneinheitlichen Verteilung innerhalb einer Messkammer an. Er fand bei der Benutzung der Leja-Kammer und SpermVision® für die Messungen im Bereich zwischen 5 mm und 12 mm (Konzentration) und zwischen

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7 mm und 11 mm (Motilität) vom Rand entfernt die geringsten Variationskoeffizienten.

Neben den Einflüssen des Messsystems spielen auch andere Faktoren eine Rolle bei der Entstehung von uneinheitlichen Messergebnissen. KJÆSTAD et al. (1993) fanden bei ihren Untersuchungen zur subjektiv bestimmten Motilität, Geschwindigkeit und Akrosomenintegrität von tiefgefrorenem Bullensperma deutliche Unterschiede an verschiedenen Stellen innerhalb der Besamungspaillette, konnten aber dennoch signifikante Korrelationen zur Fertilität herstellen.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil, der durch die Entwicklung der Spermienanalyse mit CASA-Systemen entstanden ist, ist die Standardisierbarkeit der Messergebnisse. Die Reduzierung des individuellen Einflusses des Untersuchers auf ein Minimalmaß ist die Voraussetzung für ein einheitliches Arbeiten in unterschiedlichen Labors.

Geräteeinstellungen und Untersuchungsabläufe können somit festgelegt und kontrollierbar gemacht werden. Erst dadurch macht es Sinn, Mindestanforderungen an die Qualität von Sperma aufzustellen. Im Hinblick auf die Problematiken einer subjektiven Messung fordern WABERSKI und TÖPFER-PETERSEN (2004) eine Standardisierung der spermatologischen Analysemethoden in der Veterinärmedizin, wie sie bereits in der Humanmedizin von der WHO ausgegeben wurde. Sie schlagen die Einführung eines Qualitätsmanagements (QM) für spermatologische Untersuchungen vor, um die Genauigkeit und Einheitlichkeit der Arbeit in den unterschiedlichen Laboratorien gewährleisten zu können. Dieser Vorschlag sollte nach Ansicht der Autorinnen möglichst umgehend in den spermatologischen Laboratorien umgesetzt werden.

Der überwiegende Teil der Autoren, die in jüngerer Zeit Untersuchungen mit CASA- Geräten durchgeführt haben, kommt zu dem Ergebnis, dass das jeweilige von ihnen getestete System für den vorhergesehenen Gebrauch zu nutzen sei. VERSTEGEN et al. (2001) bescheinigen den unterschiedlichen Systemen eine hohe Präzision bei guter Wiederholbarkeit der Ergebnisse, allerdings ohne konkrete Zahlen über die Reliabilität (wiederholte Messung ein- und derselben Probe unter identischen

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Bedingungen) der verschiedenen Parameter vorzulegen. HOLT et al. (2004) halten die CASA Techniken ebenfalls für ausgereift, erwarten aber durch Veränderungen im Untersuchungsaufbau und in der Methodik klarere Aussagen im Bezug auf die Qualitätsbeurteilung von Sperma. Auch NICOLAE (2006) evaluierte die computergestützte Konzentrations- und Motilitätsmessung mittels SpermVision® als praxistauglich.

2.1.2.3 Computergestützte Morphometrie

Die Vorzüge der objektiven Spermabeurteilung durch Computer sollen auch für den Bereich der morphologischen Untersuchung genutzt werden. Die computergestützte Morphologiebestimmung bietet ein effizientes Werkzeug um objektiv die morphologischen Veränderungen am Spermienkopf unterschiedlicher Arten darzustellen (GARRETT u. BAKER, 1995; GRAVANCE et al., 1997, 1998;

BOERSMA u. BRAUN, 1999). Eine Vergleichsstudie von BOERSMA et al. (2000) zwischen subjektiver und computergestützter Morphometrie in unterschiedlichen Laboratorien zeigte, dass computergestützte morphologische Bestimmungen schwierig, prinzipiell aber möglich sind. PARASTIE (1998) hat an Hand der Richtlinien der WHO eine Definition über das normale Spermium des Menschen erstellt. Auch er weist explizit darauf hin, wie wichtig einheitliche Kriterien in der Einteilung der morphologischen Schäden sind. Diese müssten auf Grund der Artunterschiede in der Spermienmorphologie für jede Spezies definiert werden.

MENKVELD et al. (1995) zeigten durch ihre Untersuchungen, dass die Einteilung der morphologischen Veränderungen nach den von ihnen aufgestellten „Strict Tygerberg Criteria“ eine höhere Vorhersagbarkeit der Ergebnisse von funktionellen Spermatests und der Fruchtbarkeit in vitro bzw. in vivo bringen. BOYERS et al. (1989) fordern von einer CASA zur morphologischen Untersuchung drei wichtige Kriterien. Erstens muss das Gerät die Vielzahl von Kopfveränderungen von den „Nicht-Sperma- Bestandteilen“ abgrenzen können. Zweitens muss eine Reihe an Messungen für jeden Spermienkopf durchgeführt werden können. Drittens müssen die Kopfformen

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STOLLA (1984) wies auf die fehlende Standardisierung und damit verbunden die geringe Vergleichsmöglichkeit unterschiedlicher Studien hin.

Die Erkennung und Vermessung des Spermienkopfes ist technisch bereits möglich.

Variationskoeffizienten von 3,5% bis 8,5% und 97% korrekt analysierte Spermienköpfe in ihrer Studie am verdünnten Bullenejakulat ließen GRAVANCE et al. (1996) zu dieser Aussage kommen. HIDALGO et al. (2006) testeten das Analysegerät Sperm Class Analyzer® hinsichtlich der Messung von Spermienköpfen und empfahlen für Ziegensperma die Analyse von 100 Diff-Quik gefärbten Spermien, um eine sehr gute Wiederholbarkeit zu erreichen. Eine hohe Korrelation (r = 0,8, p <

0,05) konnten RIJSSELAERE et al. (2004) zwischen der computergestützten (Hamilton-Thorne HTR 12.1 Metrix) und der subjektiv bestimmten Morphometrie des Spermienkopfes beim Hund (n = 39) nachweisen. Sie erhielten die besten Ergebnisse bei einer Messung von 100 Spermien, verdünnt auf 50 x 106 Spermien pro ml und einer 60fachen Vergrößerung.

Die computergestützte Morphometrie bietet hinsichtlich der Beschreibung des Spermienkopfes eine gute Alternative zur subjektiven Betrachtung (BOERSMA et al., 2000). Dennoch bleiben einige Fragen im Bezug auf die Erkennung von Veränderungen am Spermienhals und Spermienschwanz sowie der Standardisierung ungeklärt (PARASTIE, 1998).

2.1.2.4 Plasmamembranintegrität (SYBR 14 und PI)

Die Plasmamembran ist eine Schlüsselorganelle in Bezug auf die Befruchtungskompetenz eines Spermiums (KHALIL et al., 2006). Die beiden Fluoreszenzfarbstoffe SYBR 14 und Propidium-Iodid (PI) können zur Beurteilung der Membranintegrität der Samenzelle sowohl beim Bullen (NAGY et al. 2003; GARNER et al. 1994) als auch bei anderen Säugetieren (HUO 2002; GRAVANCE et al. 2001;

GARNER u. JOHNSON 1995; GEISLER, 1990; BOLLWEIN et al. 2004) verwendet werden. Beide Substanzen binden an die DNA und fluoreszieren nach optischer

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Lage, eine intakte Zellmembran zu passieren, während PI (Exzitation/ Emission 488nm/ 617nm) nur durch eine geschädigte Membran permeieren kann. An der DNA hat PI die höhere Bindungsaffinität, so dass SYBR 14 verdrängt wird; die membrandefekte Zelle fluoresziert rot.

Die Auszählung der fluoreszierenden Zellen kann sowohl über die Fluoreszenzmikroskopie als auch über die Durchflusszytometrie erfolgen. Bei der Fluoreszenzmikroskopie werden durch UV-Licht angeregte, fluoreszierenden Spermien optisch erfasst und entweder subjektiv oder durch einen Computer über ein digitales Bildanalysesystem ausgewertet. Die Anzahl der zu analysierenden Zellen ist dabei deutlich geringer als bei der Durchflusszytometrie. Bei dieser Methode fließen die markierten Spermien einzeln an einem Laser vorbei, der sie fluoreszieren lässt. Die Wellenlänge, in der die Samenzellen leuchten, wird von einem Detektor erfasst und die Anzahl der in diesem Bereich fluoreszierenden Spermien per Computer ausgezählt. Innerhalb weniger Sekunden werden ca. 10,000 Spermien analysiert. Bei Hengstsperma unterscheiden sich die beiden Methoden bei Frischsperma nicht. Lediglich beim kryokonservierten Sperma scheint nach MERKIES et al. (2000) die Durchflusszytometrie weniger präzise zu sein. Diese Schlussfolgerung zogen sie auf Grund geringerer Korrelationen zwischen einem durch die Flowzytometrie bestimmten Lebend - Tot Verhältnisses und weiteren Untersuchungstechniken an Hengstspermaproben mit festgelegtem Lebend - Tot Verhältnis nach dem Auftauen im Vergleich zu den Korrelationen der Ergebnisse dieser Tests nach der Verdünnung. Da die Erfassung der Fluoreszenz objektiv, bei hoher Wiederholbarkeit der Messung erfolgt, ist die Durchflusszytometrie zur Erhebung der Plasmamembranintegrität geeignet (PEÑA u. LINDE-FORSBERG, 2000). Ein Vorteil der Durchflusszytometrie ist die Möglichkeit, unterschiedliche Tests durch die Kombination von Färbemethoden gleichzeitig auszuführen (NAGY et al., 2003).

In bisherigen Untersuchungen konnte nur ein geringer Zusammenhang der Plasmamembranintegrität zur Non-Return-Rate (BOLLWEIN et al. 2004, MORAVEC,

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2000) und zur IVF-Rate (BRITO et al., 2003) festgestellt werden. GARNER et al.

(1997) fanden eine hohe Korrelation von r = 0,97 zwischen der Motilitätsrate von TG- Sperma und der membranintakten Spermienfraktion. THOMAS et. al. (1997) kamen zu dem Ergebnis, dass über die Fluoreszenzfärbung eine Aussage über die Qualität von Bullensperma getroffen werden kann. Sie fanden hochsignifikante Zusammenhänge sowohl zwischen der Integrität des Akrosoms als auch der Motilität zur Integrität der Plasmamembran, die mittels SYBR14/ PI und SYTO-17/ PI angefärbt worden war. NUNEZ (2004) war in der Lage mit einem Flowzytometer die SYBR14 gefärbten Spermatozoen in eine normale und eine defekte Fraktion zu sortieren. Dies ermöglicht eine wesentlich schnellere Sortierung bei einem geringeren technischen Aufwand im Vergleich zu den bisherigen Methoden. Mit Hilfe der Fluoreszenzfärbung konnte die Annahme bestätigt werden, dass sich Mitochondrien, Akrosome und Plasmamembranen nicht tiefgefrorener Spermien in ihrer Reaktion auf die Zugabe von Glycerin unterscheiden (GARNER et al., 1999).

Dadurch wird deutlich, dass Glycerin neben seinen kryoprotektiven Eigenschaften in unterschiedlichem Maße die Spermien schädigen kann.

Die Genauigkeit der Messungen SYBR 14/ PI gefärbter Spermien von Schwein, Schaf, Ratte, Kaninchen, Mensch und Truthahn mit dem Flowzytometer konnten auch CHRISTENSEN et al. (2004) darlegen. Die Variationskoeffizienten ihrer Messungen waren mit 0,7% (Plasmamembranintegrität) und 3,3%

(Spermienkonzentration) sehr niedrig.

2.1.3 Zusammenhänge zwischen den spermatologischen Parametern und der Fruchtbarkeit

Das Ziel einer spermatologischen Untersuchung ist es, Rückschlüsse auf die Befruchtungsleistung herzustellen. HAFEZ (1993) erwartete durch Kombinationen von Untersuchungen und deren sorgfältige Bewertung eine tendenzielle Beurteilung des Fruchtbarkeitspotenzials. Für AMANN (1989) war eine hohe Korrelation zwischen untersuchtem Merkmal und Fruchtbarkeit entscheidend für eine Aussage

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genaue Fruchtbarkeitsdaten als Vorraussetzung der Bestimmung des Zusammenhangs. KRAUSE (1966) hielt die Korrelation zwischen Befruchtungsrate in Form der NRR und Laborwerten für nicht sinnvoll, da er den Einfluss der Kozeptionsbereitschaft des weiblichen Tieres für nicht zu unterschätzen hielt und empfahl die Laboruntersuchungen nur zur Bestimmung von Grenzwerten einzusetzen. WIJCHMAN et al. (2001) folgerten aus ihren Untersuchungen von sieben Samenparametern beim Menschen (n = 8), dass individuell unterschiedliche Muster der Motilitätsparameter vorhanden seien und es daher sinnvoll sei, die Zahl der Parameter und Probanden zukünftiger Studien zu erhöhen, um eine genauere Vorhersagbarkeit der Fertilität zu erzielen.

Die Untersuchungen, die bisher mit Hilfe von CASA-Geräten, aber auch auf konventionelle Weise durch subjektive Schätzung durchgeführt wurden, kamen hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen spermatologischen Parametern und Fruchtbarkeit zu unterschiedlichen Ergebnissen. In einem Teil der nachfolgend angeführten Studien konnten signifikante Zusammenhänge vorrangig zwischen Motilität und NRR gefunden werden, in den anderen Studien konnte dieser Zusammenhang nicht bestätigt werden. Auch in den Arbeiten, in denen von einem signifikanter Zusammenhang berichtet werden konnte, wurde stets das Fazit gezogen, dass die Prognoseleistung noch nicht zufriedenstellend sei. HOLT et al.

(2004) bilanzierten den Stand der Forschung dahin gehend, dass sich „schlechte“

Proben von anderen differenzieren lassen, allerdings ohne dass die gemessenen Parameter bislang eine zuverlässige Vorhersage der Fertilität zuließen. GRAHAM et al. (2005) führten an, dass keine der bisherigen Untersuchungen einen stabil hohen Zusammenhang zwischen spermatologischer Analyse und der Fertilität herstellen konnte.

ROMANOWSKI (1993) stellte Zusammenhänge zwischen der NRR und dem Median der Motilität von r = 0,12 sowie zum Median der progressiven Motilität von r = 0,20 her. Ähnlich geringe Korrelationen fand VOLZ (1990) in videomikrographischen Studien. Er konnte lediglich einen Zusammenhang zwischen der durchschnittlichen

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Spermiengeschwindigkeit 15 Minuten nach dem Auftauen und der NRR von 16 Jungbullen von r = 0,16 ermitteln. Insgesamt hatte er 254 Ejakulate von 26 Bullen aller Altersklassen zu vier verschiedenen Zeitpunkten untersucht. Diese Ergebnisse zum Zusammenhang zwischen spermatologischen Parametern und der Fruchtbarkeit entsprechen früheren, sowohl subjektiv (NEVILLE et al., 1971; CLARKE et al., 1973), als auch objektiv ermittelten (LATHROP et al., 1986) Resultaten (SAACKE et al., 1991; RODRIGUEZ-MARTINEZ et al., 1996).

Allerdings gibt es auch eine Reihe von Untersuchungen, in denen höhere Zusammenhänge zwischen einzelnen oder Kombinationen spermatologischer Parameter und der Fruchtbarkeit ermittelt werden konnten. WOOD et al. (1986) stellten einen Zusammenhang zwischen der subjektiv bestimmten Vorwärtsbeweglichkeit und der NRR von maximal r = 0,51 dar. Dazu hatten sie, neben weiteren Belastungstests, die einen geringeren Zusammenhang zur Fertilität zeigten, das tiefgefrorene Sperma vor der Analyse mit 0,85%iger NaCl-Lösung verdünnt. In videomikrographischen Untersuchungen konnte GSCHWEND (1986) eine Korrelation zwischen progressiver Motilität und der NRR von r = 0,32 bei verdünntem Sperma nachweisen.

BUDWORTH et al. (1988) arbeiteten mit dem CASA-Gerät CellSoft®. Sie fanden nach dem Auftauen des Spermas eine Korrelation zwischen Motilität und NRR von r

= 0,34, sowie zwischen progressiver Motilität und NRR von r = 0,39. Beide Werte waren allerdings wegen der geringen Anzahl von nur neun Bullen nicht signifikant.

Bei der Ermittlung des Zusammenhangs zwischen einem so genannten

„kompetetiven Fertilitätsindex“ (siehe auch Kapitel 2.2.1.2) mit den Parametern progressive Motilität, VAP (linear), VSL, Linearity, ALH und BCF erklärten die sechs Merkmale 88% der Varianz an dem Fertilitätsindex. Auch wenn dieser erklärte Varianzanteil sehr hoch ist, stellen die Autoren heraus, dass die Klärung der Frage, ob der „kompetetive Fertilitätsindex“ zur Vorhersage der Fruchtbarkeit geeignet ist, nachfolgenden Untersuchungen vorbehalten bleiben muss. Einen in der Höhe vergleichbaren Zusammenhang von r = 0,34 zwischen NRR und Motilität konnten

(24)

FARRELL et al. (1998) mit Hilfe des CASA-Gerätes IVOS® der Firma Hamilton- Thorne ermitteln. In einer schrittweisen Regressionsanalyse, in die – ähnlich wie bei BUDWORTH et al. (1988) - die Merkmale ALH, BCF, Linearity, VAP und VSL einbezogen wurden, kamen sie zu einem erklärten Varianzanteil an der NRR von 98%. Das Ergebnis ist durch eine Einschränkung der potenziellen Fehlervarianzquellen erklärbar, die die Autoren durch verschiedenste mathematischen Korrekturmaßnahmen vorgenommen haben. In ihrer Studie mit lediglich elf Bullen, die zwischen 6 und 11 Jahre alt waren, wurden insgesamt 44 Ejakulate gewonnen und untersucht. Die NRR wurde nicht über den Einsatz dieser Ejakulate im Feldversuch gebildet. Daher gab es keine direkte zeitliche Verbindung zwischen den spermatologischen Untersuchungen und der Fruchtbarkeitsleistung.

Die korrigierte NRR, die als Fruchtbarkeitsparameter gewählt wurde, bezog sich auf die bis zu dem Zeitpunkt der Untersuchung durchgeführten Besamungen jedes Bullen (6346 bis 59083 Erstbesamungen pro Bulle, insgesamt 211956 Besamungen für alle 11 Bullen). Schwankungen in der Spermaqualität, die auf saisonale oder außerordentliche Einflüsse zurückzuführen sind, werden bei dieser Art der Analyse außer Acht gelassen. Des Weiteren wurde eine Vorselektion der Bullen vorgenommen. Alle Tiere waren Zuchtwert geprüfte Vererber, die sich auf Grund bester züchterischer und damit auch fruchtbarkeitsrelevanter Merkmale auszeichneten. Dadurch variierte die NRR zwischen den Bullen nur von 70,3% bis 74,6%. Dieser Variationsbereich ist nicht repräsentativ, da letzterer typischerweise zwischen 50% und 80% liegt. Zusätzlich wurden in den Messreihen der CASA- Untersuchung Fehlerkorrekturen vorgenommen, indem Messwerte gestrichen wurden, um die Standardabweichung der Werte innerhalb eines Bullen zu minimieren. Mit Hilfe dieser Korrekturmaßnahmen und einer nicht weiter erläuterten Gewichtung der Prädiktoren war es offensichtlich möglich nahezu 100% der Varianz in der NRR durch die o.a. Prädiktoren zu erklären.

Einige der oben genannten spermatologischen Parameter konnten auch Spezies übergreifend als bedeutsam für den Befruchtungserfolg identifiziert werden. So führten AGARWAL et al. (2003) Untersuchungen an 250 infertilen Männern, 177

(25)

durch. Sie stellten einen „semen quality score“ und einen „relative semen quality score“ auf, den sie in Korrelation zu den Merkmalen Motilität, VSL, VAP, VCL, ALH und einer morphologischen Untersuchung nach den „Tygerberg strict criteria“

setzten. Sie konnten damit 80% der Variabilität der Werte aufklären. Allerdings ist die Repräsentativität der Aussage eingeschränkt, da die Daten von nur 25 fertilen Männern als Basis für die Bildung eines Durchschnitts herangezogen wurden, an dem die Werte der restlichen 427 Probanden gemessen wurden. Generell ist es in der Humanmedizin im Gegensatz zur Veterinärmedizin kaum möglich, spermatologische Daten in einen direkten Zusammenhang zur Befruchtungsleistung zu stellen, so dass man sich auf die Bildung von Qualitätskennzahlen begrenzen muss. Dennoch lassen sich Aussagen über die verwendeten spermatologischen Parameter auch in den veterinärmedizinischen Bereich übertragen.

Zusammenfassend konnte in den dargestellten Studien gezeigt werden, dass einzelne spermatologische Parameter unterschiedlich hoch mit der NRR korrelieren.

Die Motilität stellt dabei das am häufigsten untersuchte Merkmal dar. Seit der Einführung der CASA-Geräte wurden auch zunehmend weitere kinetische Parameter Bestandteil der Untersuchungen. Der Aufbau der einzelnen Arbeiten unterschied sich zum Teil sehr deutlich, besonders die Anzahl der Probengröße schwankte stark.

2.2 Überprüfung der Befruchtungskompetenz

2.2.1 Maßzahlen für die Fruchtbarkeit

Es gibt unterschiedliche Methoden, den Erfolg einer Besamung zu quantifizieren.

Dazu zählen die Ermittlung der Trächtigkeits- und auch der Abkalberate, die Non- Return-Rate (NRR) und modifizierte Arten der NRR. Die Non-Return-Rate wird immer wieder als Kriterium für die Erfassung der Befruchtungsleistung eines Bullen in der künstlichen Besamung herangezogen (WEITZE, 2001; REURINK et al., 1990;

SCHAEFFER, 1993). Diese Kennzahl wird in Abschnitt 2.2.1.1 detaillierter

(26)

beschrieben. Der schnellen Aussage über eine erfolgreiche Besamung steht allerdings die fehlende Genauigkeit dieses Wertes gegenüber. Die Trächtigkeits- oder auch die Abkalberate bieten eine recht genaue, wenn auch durch dieselben Störfaktoren wie die NRR beeinflusste Größe. Dabei ist der zeitliche und personelle Aufwand, diese beiden Maßzahlen zu erheben, wesentlich höher (MULLER, 2000), da jedes Tier zu einem bestimmten Zeitpunkt untersucht bzw., im Falle der Abkalberate, erst nach der Geburt eine Aussage über eine erfolgreiche Konzeption gemacht werden kann. STOLLA (1984) fand erhebliche Differenzen zwischen der NRR und den tatsächlich nachgewiesenen Trächtigkeiten.

Eine andere Art der Erfolgskontrolle der Befruchtung als der Besamungsversuch ist die im Labor durchgeführte in-vitro-Fertilisation. Bei dieser Methode dient die Anzahl der befruchteten Eizellen bzw. die Anzahl der ein bestimmtes Stadium erreichenden Embryonen als Messgröße (MARQUANT-LE GUIENNE et al., 1990; LINFORD et al., 1976). Die Aussagefähigkeit hinsichtlich einer später erfolgreichen Trächtigkeit ist allerdings gering (LONERGAN, 1994).

2.2.1.1 Non-Return-Rate (NRR)

Der gebräuchlichste Indikator für eine zahlenmäßige Aussage über den Befruchtungserfolg ist die Non-Return-Rate (NRR).

Dabei definiert sich eine erfolgreiche Besamung dadurch, dass ein mit einer Spermaportion belegtes Rind innerhalb einer bestimmten Zeit nicht wieder zur Besamung vorgestellt wird. Die Zuchtorganisationen erhalten Rückmeldung über jede Besamung, so dass die Gewinnung der Daten sehr einfach ist. Das ist eine wichtige Vorraussetzung, die als großer Vorteil in der Nutzung der NRR zu werten ist. Allerdings gilt eine Kuh, die innerhalb eines bestimmten Zeitraumes nicht erneut besamt wurde, als tragend. Diese Zeitspanne reicht bei den unterschiedlichen Autoren von 30 bis 90 Tagen. Tiere, die innerhalb der vorgegebenen Frist vom Deckbullen belegt, deren erneute Brunst nicht erkannt bzw. gar nicht vorhanden war

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oder die geschlachtet worden sind, gelten somit ebenfalls als tragend. Der Einfluss dieser Faktoren lässt sich, rein statistisch gesehen, nur über eine ausreichend hohe Anzahl an Besamungen verringern. NEHRING et al. (2004) fanden in ihren Untersuchungen über Spermaqualitätsmerkmale bei Schweizer Bullen höhere Korrelationen mit der NRR als bei den deutschen Tieren. Sie führten dies auf die in der Schweiz übliche Korrektur der NRR von exogenen Einflüssen zurück. REURINK et al. entwickelten 1990 ein System zur Korrektur der NRR um systematische Umwelteffekte, wie Herden-Saison, Jahreszeit der Besamung, Alter des besamten Tieres und Einfluss des Technikers. Dabei stellten sie die Bedeutung des Alters des besamten Tieres besonders heraus. Ein Bulle, der aufgrund seiner Vererbung komplikationsloser Geburten häufig für Besamungen der Erstkalbinnen eingesetzt wird, erreicht eine höhere NRR als ein anderer Bulle mit gleicher Befruchtungskompetenz, mit dem ältere Kühe besamt werden. OLTENACU et al.

(1976) gehen davon aus, dass die höhere Fruchtbarkeit der Färsen auf das Fehlen des Stresses durch die Milchproduktion zurückzuführen ist.

Trotz der genannten Einschränkungen befinden sowohl RIECK und ZEROBIN (1985) als auch KOOPS et al. (1995) die Beurteilung der Befruchtungsfähigkeit über die NRR als probates Mittel. FOOTE (1978) und OLTENACU et al. (1976) kamen im Vergleich verschiedener Methoden ebenfalls zu diesem Ergebnis. Die NRR wird daher, insbesondere bei der vorliegenden großen Stichprobenzahl, als Mittel für die Bestimmung des Befruchtungserfolgs herangezogen.

In Anlehnung an die NRR veröffentlichen KOOPS et al. (1995) ein anderes Modell zur Berechnung des reproduktiven Erfolges eines Bullen. Sie stellten eine Formel vor, mit deren Hilfe der zeitliche Vorteil der Bestimmung der Konzeptionsrate und die Genauigkeit einer Abkalberate in Zusammenhang mit der inseminierten Spermiengesamtzahl und der Zeit nach der Besamung verbunden wurde. Der dabei errechneten „estimated conception rate“ bescheinigten sie eine höhere Wiederholbarkeit zur Befruchtungskompetenz eines Bullen als der ursprünglichen NRR, gingen aber in ihrem Rechenmodell von einer perfekten Brunstbeobachtung

(28)

sowie einer vernachlässigbaren Rate des „frühen embryonalen Todes“ aus und führten ihre Untersuchungen lediglich an drei Bullen durch.

2.2.1.2 Heterospermer (kompetetiver) Index

Der Einsatz der heterospermen Besamung stellt eine Möglichkeit dar, exogene Einflüsse zu minimieren. Dabei wird ein Muttertier mit einer gepoolten Spermaprobe von zwei Vätern besamt. Das Sperma ist den gleichen Bedingungen ausgesetzt, der Vater mit der höheren Anzahl an Nachkommen hat eine so genannte „kompetetive Befruchtungskompetenz“. Durch den Vergleich vieler Vatertiere untereinander kann eine Rangliste (kompetetiver Index) erstellt werden, die die relative Befruchtungsleistung des Einzeltieres wiedergibt. Für Rinder (BEATTY, 1969;

STAHLBERG, 1998), Schweine und Hühner (MARTIN, 1977) ist dies bereits experimentell belegt. Der Aufwand der Datengewinnung ist allerdings wesentlich höher als bei der homospermen Besamung, da der Befruchtungserfolg entweder über Farbzeichnungen der Nachkommen oder aber über genetische Abstammungsuntersuchungen festgestellt werden muss. O´CONNOR et al. (1981) halten diese Relativwerte in ihrer Genauigkeit der Non-Return-Rate gegenüber für überlegen. KASIMANICKAM et al. (2006) konnten über eine multiple Regressionsanalyse 87% der Varianz eines kompetetiven Index, erstellt für vier Holstein- und vier Jerseybullen an Hand der gezeugten Kälber, über den DNA- Fragmentationsindex (DFI) und die Plasmamembranintegrität (PMI) der jeweiligen homospermen Proben aufklären. Die PMI (r = 0,87, p < 0,001) und die progressive Motilität (r = 0,74, p < 0,05) korrelierten positiv mit dem kompetetiven Index, während die DFI negativ (r = -0,87, p < 0,001) mit dem kompetetiven Index korrelierte. Beim Eber lag der in unterschiedlichen Spermafunktionstests ermittelte Korrelationskoeffizient der multiplen Regressionsanalyse und vier ausgewählten Parametern bei r = 0,94 (HAMMITT et al., 1989). Eine in vitro Form der heterospermen Besamung ist der Penetrationsstest an zona-freien Hamstereizellen.

Hierbei werden die Spermien der Bullen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und

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über die Auszählung der die Zona-freie Hamstereizelle penetrierenden Spermien kann ein kompetetiver Index erstellt werden. Die Anzahl der Spermien eines Bullen, die die Eizelle im heterospermen Test penetrieren, hatte einen Korrelationskoeffizienten von r = 0,86 zur Fruchtbarkeit (NRR59) von Bullen (DAVIS et al., 1987).

Die Darstellung von Unterschieden in der Befruchtungskompetenz in Zusammenhang mit dem spermatologischen Bild des Individuums, lassen wiederum Rückschlüsse auf die Bedeutung einzelner spermatologischer Merkmale zu und bilden gleichzeitig die Grundlage für die Entwicklung neuer Testsysteme.

2.2.1.3 Embryonen und akzessorische Spermien

Durch die Gewinnung von Embryonen nach einer künstlichen Besamung können Informationen über die Fertilisationsrate gewonnen werden (ARDON et al., 2005, DEJARNETTE et al., 1992). Dazu wird am Tag 3 bis 5 (Schwein) bzw. am Tag 6 (Rind) nach der künstlichen Besamung eine nichtinvasive Spülung des / der vorhandenen Embryonen durchgeführt und diese untersucht. Die Befruchtungsrate, das Teilungsstadiums des einzelnen Embryos, die Embryonenqualität und die Anzahl der akzessorischen Spermien (Spermien, die in die Zona pellucida eindringen, aber nicht mehr bis zur Eizelle gelangen) können dabei als Monitor für eine differenzierte und präzise Beurteilung der Faktoren, die männlicherseits das Reproduktionsgeschehen beeinflussen, fungieren (SAACKE et al., 1994a).

DEJARNETTE et al. (1992) stellten in ihren Untersuchungen beim Rind den positiven Zusammenhang zwischen der Anzahl der akzessorischen Spermien und der Fertilisationsrate sowie der Embryonenqualität dar. ARDON et al. (2003, 2005) konnten diese Zusammenhänge unter Verwendung des „Hannover gilt models“ für das Schwein bestätigen. Vorteil dieser Methodik liegt in der sehr gezielt für bestimmte Fragestellungen einsetzbaren Anwendung, die auch mit geringen Tierzahlen eine statistisch gesicherte Aussage ermöglicht und dabei gut zu

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standardisieren ist. Gleichzeitig bietet sie gerade bei den Spezies mit einem langem Reproduktionsintervall einen erheblichen zeitlichen Vorteil. Als Nachteil ist die sehr aufwendige Technik zu nennen. SAACKE et al. (1994b) unterschieden über die Auszählung der akzessorischen Spermien zwischen kompensierbarer, dass heißt durch Erhöhung der Spermienanzahl pro Paillette auszugleichende und nicht kompensierbarer Verminderung der Fruchtbarkeitsleistung von Bullen. Zu den kompensierbaren Einflüssen zählen Spermiendefekte, die die Spermien nicht bis an den Ort der Fertilisation kommen lassen. Im Gegensatz dazu stehen Veränderungen der Spermien, die eine Passage bis zur Eizelle und die Initiierung des Befruchtungsprozesses zulassen, jedoch zu einer Störung der frühembryonalen Entwicklung führen. Diese Mängel sind durch eine Erhöhung der Spermienzahl nicht kompensierbar. Eine unabhängige Betrachtung der Mängel ist unerlässlich und die Zuordnung der einzelnen Spermiendefekte in eine der beiden Kategorien ein wichtiger Schritt bei der Verbesserung der spermatologischen Analyse (SAACKE et al., 1994a). Neben den spermatologischen, paternalen Einflussfaktoren Spermaqualität und -quantität nennen SAACKE et al. (1994b) aber auch die Faktoren, die bei Kühen eine große Variabilität aufweisen. Die Passierbarkeit der Zona pellucida für die Spermien unterscheide sich von Tier zu Tier und könne durch Hormongabe oder in vitro Techniken verändert werden. Die Geschwindigkeit der Penetration und der Zona-Reaktion sei unterschiedlich und möglicherweise ebenfalls auf eine variable chemische Zusammensetzung der Zona zurückzuführen. Dies sind Faktoren, die die Aussagefähigkeit der Analyse akzessorischer Spermien schmälern (ARDON et al. 2005).

2.2.2 Einflußfaktoren auf die Fruchtbarkeit

Auf den Befruchtungserfolg hat neben vielen anderen Faktoren die Spermienanzahl pro Paillette einen großen Einfluss (PACE et al., 1981). SALISBURY et al. (1961) und DEN DAAS (1992) beschrieben in ihren Studien den Verlauf der Spermiendosis- Besamungserfolg-Kurve. Diese zeigt zunächst einen steilen Anstieg, der dann in ein

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für jeden Bullen spezifisches Plateau übergeht, also asymptotisch (vgl. Abbildung 2) verläuft.

60 65 70 75

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Besamungsdosis in Mio. Spermien

Besamungserfolg in % NRR

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Zusammenhangs zwischen Besamungserfolg und Besamungsdosis für einzelne Bullen nach DEN DAAS (1992)

Sowohl HÅÅRD et al. (1984), UWLAND (1984) und JANUSKAUSKAS (1995) als auch BRANDT (1999) kamen in ihren Arbeiten zu dem Ergebnis, dass sich mit einer Besamungsdosis von 15 Millionen Spermien pro Paillette zur künstlichen Besamung annähernd jeder Bulle im Bereich seines maximal möglichen Besamungserfolgs befindet. SCHENK (1987) dokumentierte, dass die NRR (75) bei einer Dosis von 11 Millionen Spermien signifikant geringer ist im Vergleich zu 15, 17 und 22 Millionen Spermien pro Dosis. Bei der Erstellung eines Versuchsaufbaus ist es demzufolge wichtig, die Besamungskonzentration in einem suboptimalen Bereich zu wählen, ein

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Unterschiede zwischen den Bullen verdeutlichen, da sehr hohe Konzentrationen Unterschiede zwischen den Bullen hinsichtlich der Befruchtungsleistung minimieren oder sogar eliminieren (FARRELL et al., 1998; AMANN u. HAMMERSTEDT, 2002;

WABERSKI, 2004).

Viele unterschiedliche Faktoren, die zum Teil unabhängig von den Spermaeigenschaften sind, beeinflussen den Befruchtungserfolg (Everett et al.

1986). Dabei haben nach EVERETT et al. (1982), JANSEN et al. (1987) und REURINK et al. (1990) auf der paternalen Seite der Bulle, das Ejakulat, der Umgang mit dem Sperma, die Lagerung, die Jahreszeit und der Techniker einen Einfluss.

Seitens der Mutter spielen nach REURINK et al. (1990) die Brunstsymptome, das Betriebsmanagement, die Laktationsanzahl und ebenfalls die Jahreszeit eine Rolle.

Innerhalb des Reproduktionstraktes der Kuh sind dann die Verhältnisse im Uterus und den Tuben, der Ovulationszeitpunkt, die Qualität der Oozyte, die Fähigkeit der Spermien zur Kapazitation, die Akrosomreaktion und die Penetration von beeinflussender Bedeutung (HAWK, 1987). Auch nach einer erfolgreichen Befruchtung sind es wiederum maternale sowie ebenfalls paternale Faktoren, die die Überlebensfähigkeit der Zygote bis hin zur feststellbaren Trächtigkeit bedingen (DEN DAAS, 1992). HAHN und KRAUSE (1964) messen der Konzeptionsbereitschaft des weiblichen Tieres einen so hohen Stellenwert bei, dass sie die alleinige Beziehung zwischen Spermieneigenschaften und NRR für nicht aussagefähig halten. HAHN (1993) schätzt den Anteil am Befruchtungserfolg der Fähigkeiten des Besamungstechnikers auf 20% und des gesamten Betriebsmanagements des Landwirtes auf 50%.

Auch durch die Wahl der Versuchsanordnung kann Einfluss auf die zu messenden Fruchtbarkeitsparameter und deren qualitative Aussage genommen werden. Eine Feldstudie stellt immer das praxisnaheste Testsystem dar. Bei einem Besamungsversuch im Feld üben sämtliche Faktoren, die bei der Befruchtung eine Rolle spielen, einen mehr oder weniger bekannten und quantifizierbaren Einfluss aus (REURINK et al., 1990). Ein Vorteil der Rinderbesamung liegt in dem großflächigen

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den bisherigen Untersuchungen verwendete relativ geringe Anzahl an Tieren und Besamungen wurde immer wieder kritisiert (PACE et al., 1981; DEN DAAS, 1992).

Daher ist es für den Aufbau einer aussagekräftigen Studie erforderlich, mit einer großen Anzahl an Tieren zu arbeiten (AMANN, 1989). Ein weiterer Vorteil der Besamung beim Rind besteht darin, dass die Datenverarbeitung der Zuchtorganisationen einen raschen und detaillierten Zugriff auf die Befruchtungsergebnisse der einzelnen Bullen ermöglicht. Dies vereinfacht die Datengewinnung und Auswertung erheblich. Feldstudien sind natürlich auf Grund der Vielzahl der potentiellen Einflussfaktoren unter klassisch experimentellen Gesichtspunkten hinsichtlich ihrer Aussagekraft eingeschränkt. So stellte WABERSKI (2004) exogene Einflüsse wie Jahreszeit, Besamungstechniker und Betriebsmanagement als Problemfaktoren eines Feldversuchs für die Aussagefähigkeit bezüglich neuer Spermauntersuchungsmethoden dar und präferiert daher den Einsatz von Tiermodellen zur Validierung neuer Untersuchungsmethoden.

MULLER (2000) fordert die Entwicklung einfacher und aussagekräftigerer Spermafunktionstests, die die unterschiedlichen Funktionen eines einzelnen Spermiums beschreiben. Dadurch erwartet er eine bessere Vorhersageleistung der Fertilität. Der Nachteil solcher, auf einzelne Funktionsbereiche fokussierter Untersuchungen in vitro ist das Fehlen der maternalen Einflussfaktoren. Eine exakte Aussage über Befruchtungsleistung eines Bullen wird sich nur dann erzielen lassen, wenn alle Faktoren, die diesen Prozess beeinflussen, im Modellversuch nachgestellt werden können. Das Zusammenspiel der einzelnen, zum Teil bereits erforschten Funktionsbereiche lässt sich nur schwer simulieren.

(34)

3 Eigene Untersuchungen

3.1 Material und Methoden 3.1.1 Versuchsaufbau

Die Untersuchung gliederte sich in zwei Abschnitte. Zum einen wurden spermatologische Parameter mit dem Gerät SpermVision® bzw. subjektiv per Mikroskopie bestimmt, zum anderen wurde das untersuchte Sperma im Feldversuch zur künstlichen Besamung eingesetzt und anschließend die Non-Return-Rate (NRR60) der einzelnen Bullen ermittelt.

3.1.2 Tiere

Das Sperma wurde von 34 Holstein-Friesian-Bullen (15 Rotbunte (Rbt.) und 19 Schwarzbunte (Sbt.)) in der Zeit vom 26.03.2004 bis zum 02.09.2004 auf der Besamungsstation der Rinder-Union West (RUW) in Borken (Westfalen) für ihren Einsatz als Testbullen gewonnen. Das Alter der Tiere zum Zeitpunkt der Samengewinnung lag zwischen 13,2 und 15,9 (durchschnittlich 14,4) Monaten. Die Bullen waren in Einzel- bzw. Dreierboxen auf Stroh aufgestallt. Der Gesundheitszustand war klinisch unauffällig. Von jedem Bullen wurden 850 (Rbt.) bzw. 1000 (Sbt.) Portionen gewonnen.

3.1.3 Samenproduktion

Dreimal in zwei Wochen wurde von den Bullen mit Hilfe einer künstlichen Vagina (Firma Minitüb) Sperma gewonnen. Als Sprungpartner diente ein Standbulle. Die Tiere absolvierten jeweils einen Doppelsprung in einem zeitlichen Abstand von ca.

zwei Stunden. Die Untersuchungen des Spermas im Labor begannen mit der Bestimmung des Gewichtes mit Hilfe einer digitalen Waage (Kern 440-47 N), der

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photometrischen Messung der Dichte (Minitüb SDM 5) und einer Vorverdünnung mit 5 ml Verdünner (Minitüb Andromed®). Ejakulate mit einer Dichte unter 0,6 Mrd./ml wurden verworfen. Das Sperma des ersten Sprunges wurde in einem Kugelbad bei 30°C bis zur Endverdünnung (Minitüb Andromed®) gelagert. Nachdem auch der zweite Sprung vorverdünnt war, wurden die zwei Ejakulate in einem Plastikkegel zusammengebracht und maschinell (Minitüb Diluter VC 360) und computergesteuert durch die Laborsoftware (Minitüb IDA Labor) auf 15 Millionen Spermien pro Dosis endverdünnt. Die Abfüllung in Minipailletten (IMV Mini) erfolgte durch die Abfüllmaschine (IMV MRS 3) bei Raumtemperatur. Nach einer Vorkühlung von drei Stunden bei 4°C wurden die Pailletten für neun Minuten bei -110°C im Stickstoffdampf eingefroren. Die weitere Lagerung einschließlich des Transportes fand im flüssigen Stickstoff bei -196°C statt. Ejakulate, die bei der Kontrolluntersuchung nach dem Auftauen eine Vorwärtsbeweglichkeit von weniger als 45% hatten, wurden vernichtet.

3.1.4 SpermVision® Gerät

Die weiteren Untersuchungen erfolgten mit Hilfe des Gerätes SpermVision® (Firma Minitüb) inklusive einer fluoreszenzmikroskopischen Einheit (Viability-Modul). Das Gerät bestand aus einem Mikroskop (Olympus BX 41) mit Phasenkontrast (Linse 40er Achromat) und einer 1:0 Vorlinse. Die Verbindung zum Rechner und damit zum zweiten Teil des Gerätes, der SpermVision® Software, stellte eine VGA Schwarz- Weiss Kamera dar. Die Fluoreszenzeinheit, die im Auflichtverfahren arbeitete, setzte sich aus einer 100 Watt HQL Lampe, einem Breitbandblaufilter (UF 31) und einer VGA Farbkamera mit Verbindung zum PC zusammen. Die Vorlinse hatte eine Größe von 0,35. Die Einstellungen innerhalb des SpermVision® Programms sind im Anhang aufgeführt.

Als Objektträger dienten zum einen handelsübliche Fabrikate, zum anderen Kammern der Firma Leja (20 Mikron SC20-01-Fa). Deren Befüllung erfolgte mit der Mikroman M10 Pipette (Firma Gilson). Als weitere Pippetierhilfe wurde die

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hatten eine Größe von 15 x 15 mm. Zum Auftauen von TG-Proben wurde ein Wasserbad mit 38°C, zum Aufbewahren und Anwärmen der Gebrauchsgegenstände ein Blockheizer (Rotilabo Heater H250) und ein Heiztisch (HAT 200) mit 38°C benutzt. Der Objektträgertisch des Mikroskops war ebenfalls auf 38°C geheizt.

3.1.5 Untersuchungsablauf

Nachdem das Sperma nach doppelter Ejakulatgewinnung endverdünnt war, wurde es mit Hilfe von SpermVision® weitergehend untersucht. Direkt nach der Endverdünnung wurden folgende Werte in der Leja-Kammer erhoben:

Gesamtmotilität (gMOT) Progressive Motilität (pMOT) Viabilität (VIA)

Distance curve line (DCL) Distance average path (DAP) Distance straight line (DSL) Velocity curve line (VCL) Velocity average path (VAP) Velocity straight line (VSL) Linearity (LIN) [VSL/VCL]

Straightness (STR) [VSL/VAP]

Wobble (WOB) [VAP/VCL]

Beat cross frequency (BCF)

Amplitude of lateral head displacement (ALH)

Die Untersuchung in der Leja-Kammer erfolgte nach den technischen Vorgaben der Firma Minitüb. Die Anzahl der zu beurteilenden Spermien betrug pro Untersuchung 400 Stück. Um diese Anzahl zu erreichen, war es nötig, fünf bis sieben Messfelder zentral innerhalb der Messkammer zu analysieren. Dabei wurden die Felder zufällig

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Für die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Plasmamembranintegrität wurde das Sperma mit SYBR14 und Propidium-Iodid (LIVE/DEAD® Sperm Viability Kit der Firma Molecular Probes; Katalog-Nr.: L-7011) nach den Vorgaben von Minitüb of America gemischt. Nach einer Inkubationszeit von fünf bis sieben Minuten wurde die Probe auf einem Objektträger mit Deckgläschen untersucht. Dazu wurden 20 Felder zufällig in den Fokus gebracht und die Anzahl der rot bzw. grün gefärbten Spermien durch SpermVision® analysiert. Der mittlere Prozentsatz der plasmamembranintakten Spermien wurde als „Viability“ wiedergegeben. Die Fluoreszenzmessung erfolgte zu allen 8 durchgeführten Messzeitpunkten (vgl. Abb.

3).

Des Weiteren wurden 20 µl jedes einzelnen Ejakulates mit 10 µl Natriumcitrat versetzt und 200 Spermien nach dem Untersuchungsschema der Tierärztlichen Hochschule Hannover auf morphologische Abweichungen hin untersucht. Diese Untersuchung erfolgte einmal am endverdünnten und einmal am aufgetauten Sperma. Die Ergebnisse wurden in sechs Gruppen unterteilt und der prozentuale Anteil in der Probe ermittelt:

morphologisch abweichende Spermien (MAS) Kopfkappenveränderungen (KK)

Kopfveränderungen (K) Halsveränderungen (H)

Verbindungsstückveränderungen (V)

Veränderungen an Haupt- oder Endstück (HE) Doppel- oder Mehrfachmissbildungen (DM)

Für die Untersuchungen des Tiefgefrierspermas wurden 5 Pailletten eines Ejakulates aufgetaut (38°C, 20 Sekunden), mit einem Zellstofftuch abgetrocknet, aufgeschnitten und das Sperma in einer 1,5 ml Küvette vermischt und nach gleichem Schema wie das frisch verdünnte Sperma untersucht. Ein Teil der gepoolten Probe blieb nach dem Auftauen in der Küvette im Blockheizer bei 38°C stehen und wurde nach 1 h, 2

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Zeitpunkt 1 nach der Verdünnung

Zeitpunkt 2 nach dem Auftauen

Zeitpunkt 3 nach 1 h bei 38°C

Zeitpunkt 6 nach 24 h bei 5°C

Zeitpunkt 4 nach 2 h bei 38°C

Zeitpunkt 7 nach 48 h bei 5°C

Zeitpunkt 8 nach 72 h bei 5°C Zeitpunkt 5

nach 3 h bei 38°C

5°C im Kühlschrank gelagert und jeweils 24 h, 48 h und 72 h nach dem Auftauen untersucht (Lagerungsresistenztest). Zu diesen sechs Zeiten der beiden Resistenztests wurden die 14 oben aufgelisteten Motilitätsparameter mittels SpermVision® bestimmt. Dabei wurde an Stelle der Leja-Kammer ein normaler Objektträger mit Deckglas verwendet. In Analogie zur subjektiven Motilitätsschätzung wurden die zu beurteilenden Felder nach Spermienanzahl und Motilität ausgewählt.

Auch hier wurden 400 Spermien ausgewertet.

Abbildung 3: Schematischer Ablauf der Untersuchungen

(39)

3.1.6 Vergleichsstudie der Messsysteme

Zur Prüfung des Unterschieds zwischen Leja-Kammer und Objektträger wurde im Vorfeld eine Vergleichsmessreihe angelegt. Dazu wurde sowohl endverdünntes Sperma (analog zum ersten Untersuchungszeitpunkt des Hauptversuchs) wie auch TG-Sperma (analog zum zweiten Untersuchungszeitpunkt des Hauptversuchs) verwendet. Die CASA-Analyse mittels SpermVision® erfolgte wie bereits in 3.1.5 erwähnt. Zuerst wurde in der Leja-Kammer, anschließend auf dem Objektträger mit Deckgläschen untersucht. Die Zeit zwischen den Untersuchungen betrug maximal eine Minute. Es wurden die gleichen Parameter wie im Hauptversuch bestimmt und miteinander verglichen. Insgesamt wurden innerhalb dieses Vorversuchs 352 unterschiedliche Proben von 112 verschiedenen Bullen untersucht.

3.1.7 Künstliche Besamung

Sobald ein Bulle die vorgegebene Anzahl von 850 bzw. 1000 Portionen produziert hatte und diese eine Mindestvorwärtsbeweglichkeit von 45% nach dem Auftauen hatten, wurden diese an die Besamungstechniker, Tierärzte und Eigenbestandsbesamer der Rinder-Union West ausgeliefert, die das Sperma innerhalb von drei Monaten zur künstlichen Besamung einsetzten. Die aus diesen Besamungen hervorgegangene 60-Tage-Non-Return-Rate ist aus organisatorischen Gründen nicht nach Samengewinnungstagen unterteilt, sondern bezieht sich auf alle zur künstlichen Besamung verwendeten Portionen des jeweiligen Bullen.

3.1.8 Ermittlung der NRR (60)

Die in dieser Arbeit verwendete Non-Return-Rate errechnet sich aus dem Quotienten von erfolgreichen Besamungen zu insgesamt durchgeführten Besamungen. Eine erfolgreiche Besamung definierte sich dadurch, dass das besamte Tier innerhalb von sechzig Tagen nicht erneut inseminiert wurde. Eine Belegung mit dem gleichen

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Bullen am selben Tag oder am darauf folgenden Tag wurde nicht als neue Besamung gezählt. Dabei spielte es für die Auswertung keine Rolle, zum wievielten Mal das jeweilige Tier besamt wurde. Die Besamungsdaten der einzelnen Bullen wurden aus der MAPPER®-Datenbank der Zuchtorganisation herausgelesen. Die Aufbereitung des Datenmaterials und die Berechnung der NRR wurden mit Hilfe des Programms Windows® Excel® durchgeführt. Die NRR, bezogen auf die Erstbesamungen, finden sich im Anhang.

3.1.9 Statistische Methoden

Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe der Statistikprogramme SAS® (SAS Institute Inc., Cary/North Carolina, 1998), SPSS® 14.0 (SPSS GmbH Software München/Deutschland) und Microsoft® Excel®. Es wurden deskriptive Statistiken (Mittelwerte, Mediane, Variationskoeffizienten, Standardabweichungen, Korrelationen) und schließende Statistiken (Regressions- sowie uni- und multivariate Varianzanalysen) berechnet. Das Signifikanzniveau lag bei allen Berechnungen bei p = 0,05. Zur Analyse der Vergleichsstudie zwischen Leja-Kammer und Objektträger wurde ein Mittelwertsvergleich (Student´s t-Test) für abhängige Stichproben durchgeführt. Für den Quartilsvergleich zwischen den 25% am besten mit den 25% am schlechtesten befruchtenden Bullen wurde eine multivariate Varianzanalyse gerechnet.

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3.2 Ergebnisse

3.2.1 Ergebnisse der Vergleichsstudie der Messsysteme

Zur Prüfung der Frage, ob die Verwendung einer Leja-Kammer oder eines Objektträgers bei der Analyse der mit dem CASA-Gerät gemessenen 13 Merkmale zu vergleichbaren Ergebnissen führt, wurden 352 Sperma-Proben mit beiden Methoden ausgewertet und mittels t-Test für abhängige Stichproben auf Unterschiede in der zentralen Tendenz geprüft. Die Mittelwerte und Standardabweichungen der 352 Proben sowie die Ergebnisse der t-Tests sind in Tabelle 1 für jedes Merkmal dargestellt.

Für alle Merkmale wurden hochsignifikante Unterschiede zwischen den beiden Methoden ermittelt, wobei die in der Leja-Kammer gemessenen Werte jeweils höher waren als die mit dem Objektträger erfassten Werte. Eine Ausnahme bildeten die Merkmale Linearity, Straightness und Wobble. Diese drei Merkmale stellen Quotienten aus den Geschwindigkeitsparametern VSL, VCL, VAP dar, und diese Quotientenbildung bedingte die höheren Mittelwerte unter dem Objektträger. Die Mittelwertsunterschiede waren insbesondere für die abgeleiteten Maße sehr gering.

Jedoch führte die hohe Anzahl der Proben in Verbindung mit der geringen Standardabweichung auch hier zu hochsignifikanten Mittelwertsunterschieden. Für den Thermoresistenz- und den Lagerungstest wurden die Analysen mit dem Objektträger durchgeführt. Die Ergebnisse machen demzufolge deutlich, dass die mit der Leja-Kammer ermittelten Werte der 13 Merkmale nach der Verdünnung und nach dem Auftauen nicht direkt vergleichbar sind mit den Werten, die im Thermoresistenz- und im Lagerungstest ermittelt wurden.

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Tabelle 1: Mittelwerte (MW) und Standardabweichungen (SD) für alle Merkmale gemessen mittels Leja-Kammer und Objektträger und die Signifikanzen der Unterschiedsprüfung mittels t-Tests für unabhängige Stichproben (n = 352 Ejakulate), Erläuterungen zu den Merkmalen siehe Kapitel 2.1.2.1, ***p < 0,001

Leja-Kammer Objektträger Merkmal

MW SD MW SD

p gesamt

Motilität 75,2 22,6 72,2 21,8 ***

prog.

Motilität 68,5 23,5 65,9 21,7 ***

DCL 61,6 9,7 54,6 10,6 ***

DAP 31,9 4,3 29,0 4,7 ***

DSL 24,5 3,5 22,6 3,7 ***

VCL 141,2 23,8 123,1 25,0 ***

VAP 73,3 10,8 65,6 11,4 ***

VSL 56,3 8,6 51,0 8,8 ***

Linearity 0,4 0,0 0,4 0,4 ***

Straight-

ness 0,8 0,1 0,8 0,1 ***

Wobble 0,5 0,0 0,5 0,3 ***

BCF 26,3 3,2 24,9 3,1 ***

ALH 5,0 0,9 4,5 0,9 ***

(43)

3.2.2 Ergebnisse der spermatologischen Untersuchungen (CASA und Morphologie)

In Tabelle 2 sind die Mittelwerte, die Standardabweichungen und die Variationskoeffizienten nach der Verdünnung und nach dem Auftauen für alle spermatologischen Merkmale, einschließlich der morphologischen Untersuchungsergebnisse dargestellt. Dabei wurden nur die Daten der Ejakulate berücksichtigt, die den Mindestanforderungen entsprachen und zur künstlichen Besamung verwendeten wurden. Die Ergebnisse des Student´s t-Tests für abhängige Stichproben beantworten die Frage nach der Signifikanz der Unterschiede zwischen den Werten zu den beiden Messzeitpunkten. Die Motilitäts- und Plasmamembranintegritätswerte lagen nach dem Einfrieren signifikant unter den Werten nach der Verdünnung. Dies galt auch für die Distanz- und Geschwindigkeitsparameter, wenngleich der Unterschied zwischen den Zeitpunkten geringer war. Kein signifikanter Unterschied ließ sich zum einen zwischen den Werten der mittleren Kopfauslenkung (ALH) und auch zwischen den Geschwindigkeitsquotienten (Linearity, Straightness, Wobble) feststellen. Die Variationskoeffizienten lagen, abgesehen von denen der morphologischen Parameter, bis auf wenige Ausnahmen unter 10%, d.h. die Streuung ausgedrückt in Einheiten des Mittelwerts war mit weniger als 10% des Mittelwerts sehr gering. Das galt nicht in gleichem Maße für die morphologischen Veränderungen. Hier schwankten die Variationskoeffizienten zwischen 46,6% (Halsveränderungen) und 99,9% (Haupt- und Endstückveränderungen). Lediglich die Koeffizienten für die Gesamtheit der morphologischen Veränderungen waren mit 22,9% nach dem Auftauen und 32,4% nach der Verdünnung in einem Bereich, in dem von einer stabilen Schätzung des Mittelwerts ausgegangen werden kann.

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