Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
dem Institut für Ernährungsphysiologie
der Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel Karlsruhe
Wirkung von Apfelsaft auf die Kolonkarzinogenese und deren Modulation durch
Wachstumsfaktoren im Tierexperiment.
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Christine Fähndrich
aus Ludwigshafen
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. B. Schröder; Dr. S. Barth
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. B. Schröder 2. Gutachter: Prof. Dr. I. Nolte
Tag der mündlichen Prüfung: 23.11.2005
Für Herrn Bill Tür
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 Einleitung 13
2 Literaturübersicht 15
2.1 Kolonkarzinogenese 15
2.1.1 Kolonkarzinogenese und Ernährung 15
2.1.2 Das Mehrstufenmodell der Kolonkarzinogenese 19
2.1.3 „Biomarker“ der Kolonkarzinogenese 23
2.1.3.1 Aberrante Krypt Foci (ACF) 24
2.1.3.2 Proliferation 28
2.1.3.3 Genexpression 30
2.1.4 Tiermodelle für die Kolonkarzinogenese 32 2.1.4.1 Die chemisch induzierte Kolonkarzinogenese im Tiermodell 33 2.1.4.2 Die genetisch induzierte Kolonkarzinogenese im Tiermodell 36
2.1.5 Einfluss von Insulin als Wachstumsfaktor auf die
Kolonkarzinogenese 37
2.2 Sekundäre Pflanzenstoffe 40
2.2.1 Polyphenole 41
2.2.1.1 Phenolcarbonsäuren 41
2.2.1.2 Flavonoide 42
2.3.1 Einfluss von Ballaststoffen auf die Kolonkarzinogenese 47
2.4 Apfelsaft 49
2.4.1 Polyphenole im Apfel und im Apfelsaft 49
2.4.2 Einflüsse auf die Polyphenole bei der
Herstellung des Apfelsaftes 50
2.5 Trubstoffe im Apfelsaft 52
3 Zielsetzung 53
4 Eigene Untersuchungen 55
4.1 Material 55
4.1.1 Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffe 55
4.1.1.1 Herstellung der Säfte 55
4.1.1.2 Herstellung des Polyphenol-Extrakts 56
4.1.1.3 Gewinnung der Trubstoff-Fraktion 56
4.1.1.4 Zusammensetzung der Apfelsäfte 57
4.1.1.5 Polyphenolzusammensetzungen in den Säften
und im Polyphenol-Extrakt 58
4.1.1.6 Zusammensetzung der Trubstoffe 59
4.1.2 Tiere 60
4.1.2.1 Versuchstiere und Haltung 60
4.1.3 Versuchsaufbau 62
4.1.3.1 Vorversuch 62
4.1.3.2 Intervention mit Apfelsaft 62
4.1.3.3 Intervention mit Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen 63
4.1.3.4 Insulin-Studie 64
4.1.4 Chemikalien, Pufferlösungen und Verbrauchsmaterialien 66
4.1.5 Geräte 68
4.2 Methoden 69
4.2.1 ACF-Assay 69
4.2.1.1 Gewebeaufbereitung 69
4.2.1.2 Färbung 69
4.2.1.3 Auswertung 70
4.2.2 BrdU-Assay 71
4.2.2.1 Gewebeaufbereitung 71
4.2.2.2 Präparation der Objektträger 72
4.2.2.3 Schneiden der Gewebe 72
4.2.2.4 Entparaffinisieren 73
4.2.2.5 Nachweis des inkoporierten BrdUs 73
4.2.2.6 Differentialfärbung 76
4.2.2.7 Auswertung 77
4.2.2.8 Kontrollen 77
4.2.3 RT-PCR 78
4.2.3.1 Gewebeaufbereitung 78
4.2.3.2 RNA-Präparation 78
4.2.3.3 Konzentrationsbestimmung von RNA 80
4.2.3.7 Auswertung 84
4.2.4 ELISA zum Nachweis von humanem Insulin im Serum 85
4.2.5 Statistische Auswertung 86
5 Ergebnisse 87
5.1 Physiologische Daten 87
5.1.1 Vorversuch 87
5.1.2 Intervention mit Apfelsaft 88
5.1.2.1 Energiebilanz der Apfelsaftintervention (berechnet) 91 5.1.2.2 Aufnahme von Polyphenolen und Pektin in der
Apfelsaftintervention (berechnet) 92
5.1.3 Intervention mit Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen 93 5.1.3.1 Energiebilanz in der Intervention mit
Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen (berechnet) 95 5.1.3.2 Aufnahme von Polyphenolen und Pektin in der Intervention mit
Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen (berechnet) 96
5.1.4 Insulin-Studie 97
5.2 ACF-Assay 98
5.2.1 Vorversuch 98
5.2.2 Intervention mit Apfelsaft 103 5.2.3 Intervention mit Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen 106
5.2.4 Insulin-Studie 109
5.3 Proliferations-Assay 111
5.3.1 Vorversuch 111
5.3.2 Intervention mit Apfelsaft 113
5.3.3 Intervention mit Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen 115
5.3.4 Insulin-Studie 116
5.4 RT-PCR 117
5.4.1 Vorversuch 117
5.4.2 Intervention mit Apfelsaft 118
5.4.3 Intervention mit Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen 121
5.5 Serum-Insulin-Spiegel 122
6 Diskussion 123
6.1 Multi-Stage Kolonkarzinogenese 125
6.2 Intervention mit klarem und trübem Apfelsaft 129
6.2.1 Physiologische Parameter 129
6.2.2 Biomarker der Kolonkarzinogenese 129
6.3 Intervention mit Apfelsaft, Polyphenol-Extrakt und Trubstoffen 135
6.4 Insulin-Studie 145
6.4.1 Physiologische Parameter 145
6.4.2 Biomarker der Kolonkarzinogenese 146
7 Zusammenfassung 149
8 Summary 150
9 Literaturverzeichnis 151
10 Publikationsliste 184
ADH Alkoholdehydrogenase
AICR American Institute for Cancer Research
AOM Azoxymethan
APC Adenomatöse Polyposis Coli
BrdU 5-Bromo-2`deoxyuridin
cDNA Komplementäre DNA
CYP Cytochromperoxidase
DAB 3, 3`-Diaminobenzidin
DgE Deutsche Gesellschaft für Ernährung
DMH 1, 2-Dimethylhydrazin
DNA Desoxyribonukleinsäure
EGF Epidermaler-Wachstumsfaktor
EU Europäische Union
FGF Fibroblasten-Wachstumsfaktor
GSH Glutathion-Sulfhydryl
ß-GCS Gamma-Glutamylcysteinsynthetase
GST Glutathion-S-Transferase
GST Guanidiniumthiocyanat
HNE 4-Hydroxynonenal
I.E. Internationale Einheiten
IGF Insulinähnlicher-Wachstumsfaktor
IARC International Agency for Research on
Cancer
KA Klarer Apfelsaft
kDa KiloDalton
KGW Körpergewicht
kJ Kilojoule
KRK Kolorektales Karzinom
M Molar
MAM Methylazoxymethanol
MAPK Mitogen aktivierende Protein Kinase
MDA Malondialdehyd
MGMT 6-O-Methylguanin-Methyltransferase
mM Millimolar
mRNA messenger RNA
NaCl Natriumchlorid
OD Optische Dichte
O6-MEG 6-O-Methylguanin
PDGF Plättchen-Wachstumsfaktor
PP Polyphenole
RNA Ribonukleinsäure
RT-PCR Reverse-Transkriptase-Polymerase-
TNF Tumornekrosefaktor
TrS Trubstoffe
VdF Verband der deutschen Fruchtsaftindustrie
VERA Verbundsstudie Ernährungserhebung und
Risikofaktorenanalytik
v/v Volume per volume
W Wasser
WCRF World Cancer Research Fund
1 Einleitung
Im Rahmen der weltweiten Krebsstatistik wird für das Jahr 2000 die Zahl der Neuerkrankungen an Krebs auf 940.000 Menschen und die Zahl der Todesfälle auf 500.000 Menschen geschätzt (STEWARD 2003). Innerhalb dieser Statistik wird das kolorektale Karzinom (KRK) an 3. Stelle nach dem Bronchial- und Mammakarzinom genannt.
Im Vergleich zu anderen EU-Ländern steht die Inzidenz für das KRK in Deutschland an erster Stelle (ARBEITSGEMEINSCHAFT BEVÖLKERUNGSBEZOGENER KREBSREGISTER IN DEUTSCHLAND 2004). Basierend auf epidemiologischen Studien ist bekannt, dass neben selteneren erblich bedingten Dispositionen vor allem die Ernährung und der Lebensstil zu den vermeidbaren Risikofaktoren im Bezug auf die Entstehung des KRK gehören (HOLLMAN und ARTS 2000).
Bereits 1997 analysierten der World Cancer Research Fund (WCRF) und das American Institute for Cancer Research (AICR) eine Vielzahl von Studien, die den Zusammenhang einer Ernährung mit einem hohen Anteil an Obst und Gemüse und Krebs untersucht hatten.
Damaliges Ergebnis: Wer viel Obst und Gemüse verzehrt, verringert für viele Krebsarten das Erkrankungsrisiko im Vergleich zu Personen mit einem geringen Obst- und Gemüsekonsum.
Diese erste Evaluation berücksichtigte vor allem Fall-Kontroll-Studien, deren Ergebnisse durch aktuellere prospektive Kohorten-Studien bestätigt wurden (RESEARCH 1997). Den aktuellen Forschungsstand hat inzwischen eine von der International Agency for Research on Cancer (IARC) ins Leben gerufene Forschergruppe zusammengetragen. Anfang 2003 wurde eine Evaluation der bisher vorliegenden Studien abgeschlossen, in die auch die aktuellen Ergebnisse aus prospektiven Kohorten-Studien eingeflossen sind.
Die Evaluation des IARC konnte differenzierte Aussagen über die gesundheitlichen Wirkungen eines hohen Obst- und Gemüseverzehrs treffen. Während einige Krebsformen von den Ernährungsgewohnheiten unabhängig zu sein scheinen, spielen Obst und Gemüse bei anderen durchaus eine Rolle in der Primärprävention von Krebserkrankungen. Im Einzelnen kamen die Forscher der IARC-Arbeitsgruppe zu folgenden Ergebnissen: Nach derzeitigem Forschungsstand reduziert ein höherer Verzehr von Obst mit großer Wahrscheinlichkeit das
Risiko von Speiseröhren-, Magen- und Lungenkrebs. Ein höherer Verzehr von Gemüse hingegen reduziert gleichfalls das Risiko von Speiseröhren- und außerdem das von Dickdarm- und Mastdarmkrebs. Die Arbeitsgruppe schätzt, dass etwa einer von zehn Krebsfällen in der westlichen Welt auf den zu geringen Verzehr von Obst und Gemüse zurückzuführen ist (BINGHAM und RIBOLI 2004).
Für die positiven Effekte eines hohen Obst- und Gemüseverzehrs werden vor allem die in Obst und Gemüse enthaltenen sekundären Pflanzenstoffe verantwortlich gemacht. Sekundäre Pflanzenstoffe sind so genannte nicht-nutritive-Pflanzeninhaltsstoffe, die unter anderem für die Farbe und das Aroma von Pflanzen verantwortlich sind und zu unterschiedlichen chemischen Gruppen gehören.
Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung (DGE) empfiehlt deshalb zwei Drittel der täglichen Nahrungsenergie aus pflanzlichen Lebensmitteln aufzunehmen. Das National Cancer Institute in den USA rät, täglich vier bis fünf Portionen Obst und Gemüse entsprechend etwa 400 bis 500 g zu verzehren. Entgegen dieser Empfehlungen hat die VERA-Studie (Verbundstudie Ernährungserhebung und Risikofaktorenanalytik (HESEKER et al. 1995) ergeben, dass der durchschnittliche Verzehr von Obst und Gemüse in Deutschland nur etwa 200 g pro Tag beträgt.
Relativ hoch liegt dagegen der Fruchtsaftkonsum in Deutschland, wobei Apfelsaft mit einem Pro-Kopf-Verbrauch von 12,8 l (VDF 2004) an der Spitze steht. Im Apfelsaft enthalten sind sekundäre Pflanzenstoffe der Gruppe der Polyphenole (SPANOS et al. 1990).
Apfelsaft stellt somit ein Lebensmittel dar, das zum einen eine viel versprechende Quelle für sekundäre Pflanzenstoffe darstellt und zum anderen eine breite Akzeptanz innerhalb der Bevölkerung findet.
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von trübem und klarem Apfelsaft auf die Kolonkarzinogenese in einem Tiermodell getestet werden.
Hierfür wurde Labornagern beginnend vor der Induktion der Kolonkarzinogenese mittels eines chemischen Karzinogens trüber und klarer Apfelsaft als Tränke verabreicht.
Anhand verschiedener, ausgewählter Parameter sollte untersucht werden, ob die Apfelsäfte einen Einfluss auf die Induktion der Kolonkarzinogenese haben und auf welchen molekularbiologischen Mechanismen diese beruhen.
2 Literaturübersicht
2.1 Kolonkarzinogenese
Mit einer für das Jahr 2000 geschätzten Inzidenz von 940.000 Neuerkrankungen und 500.000 Todesfällen rangiert das kolorektale Karzinom (KRK) nach dem Bronchial- und Mammakarzinom an 3. Stelle der weltweiten Krebsstatistik (STEWARD 2003). In Deutschland erkranken jährlich ca. 33.000 Männer und 34.000 Frauen. Das durchschnittliche Erkrankungsalter liegt bei den sporadischen KRK (ca. 50–60% aller KRK) mit unauffälliger Familienanamnese bei ca. 65 Jahren, bei den autosomal-dominant monogenetisch bedingten hereditären Krebsprädispositionssyndromen (<10% aller KRK) in der Regel vor dem 45.
Lebensjahr.
Zu den Risikofaktoren gehören neben der genetischen Prädisposition vor allem Faktoren des individuellen Lebensstils. So wurde 1981 erstmals von (DOLL und PETO 1981) gezeigt, dass Lebensstil und Ernährung für etwa 50±30 % aller Krebserkrankungen verantwortlich sind.
Inzwischen geht der World Cancer Research Fund (WCRF) davon aus, dass bei Dickdarmtumoren 66-75 % der Todesfälle durch Ernährungsumstellung vermieden werden könnten (RESEARCH 1997).
2.1.1 Kolonkarzinogenese und Ernährung
Bei der Entstehung von sporadisch auftretenden Kolonkarzinomen handelt es sich generell um einen multifaktoriellen Prozess, viele epidemiologische Studien legen einen kausalen Zusammenhang mit Lebensstil und Ernährungsgewohnheiten nahe (WILLETT 2000). So scheinen z.B. die steigenden Darmkrebsraten bei den jüngeren Generationen in Süd- und vor allem Osteuropa im Zusammenhang mit einer „Verwestlichung“ der Ernährungsgewohnheiten in Verbindung zu stehen. Umgekehrt wird dagegen der Rückgang der Darmkrebssterblichkeit in West- und Nordeuropa mit einer Verschiebung der Ernährungsgewohnheiten zugunsten von mehr Obst und Gemüse bei geringerem Verzehr von
Fleisch und gesättigten Fettsäuren in Verbindung gebracht (LA VECCHIA et al. 1998). Dass die Ernährung die Krebshäufigkeit beeinflusst, legen auch Untersuchungen bei sog.
Migrationspopulationen nahe. In Japan tritt Magenkrebs viel häufiger auf als in den USA. Bei Japaner die nach Kalifornien ausgewandert sind, nimmt die Magenkrebshäufigkeit schon in der ersten Generation ab. In der zweiten Generation hat sich die Rate derjenigen der übrigen Kalifornier angeglichen (TSUGANE 2005).
Es wird angenommen, dass ca. 80% der Darmkrebserkrankungen durch ernährungsbedingte Risikofaktoren oder die Minderaufnahme protektiv wirksamer Nahrungsstoffe ausgelöst oder begünstigt werden (HOLLMAN und ARTS 2000).
Im Einzelnen sind das:
- Hohe Energie- (Kalorien-) -aufnahme und Übergewicht:
Bedingt durch Übergewicht und Überernährung kommt es im Körper zur vermehrten Insulin-Sezernierung (TUOMILEHTO et al. 1992). Dies stimuliert u.a. in der Leber die Produktion des Insulinähnlichen-Wachstumsfaktors-1 (IGF-1) (UNDERWOOD et al. 1994). Eine Folge chronisch erhöhter IGF-1 Spiegel ist ein Anstieg der epithelialen Proliferation im Kolon (CATS et al. 1996). In vitro konnte IGF-1 über Interaktion mit seinem zellulären Rezeptor eine Apoptose-Hemmung und eine Proliferationsinduktion auslösen (KOENUMA et al. 1989; GUO et al. 1992). Die Signaltransduktion von IGF- 1 und Insulin wirkt über eine Aktivierung des p21ras-Proteins, das eine Erhöhung der Zellproliferation vermittelt (BURGERING et al. 1991; JHUN et al. 1994; BOS 1988).
Interessanterweise besitzen Kolonkarzinomzelllinien sowohl Insulin- als auch IGF-1 Rezeptoren (KOENUMA et al. 1989; GUO et al. 1992; MACDONALD et al. 1993).
Im Tierexperiment konnte bereits eine Insulin vermittelte Steigerung der Anzahl und Größe von Kolontumoren beobachtet werden (TRAN et al. 1996).
- Gesättigte Fettsäuren:
Die Ernährung in den westlich geprägten Ländern zeichnet sich durch einen hohen Anteil an tierischem Fett aus, was vorwiegend aus gesättigten Fettsäuren zusammengesetzt ist (SLATTERY 2000). Viele epidemiologische Studien geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen einer hohen Aufnahme von tierischem Fett und einem erhöhten Kolonkrebsrisiko (GIOVANNUCCI und WILLETT 1994;
HURSTING et al. 1990). Zum einen verursacht eine fettreiche Ernährung eine erhöhte Sekretion von sekundären Gallensäuren, die ein bekannter Promotor der Kolonkarzinogenese sind und eine Induktion der Zellproliferation im Kolonepithel induzieren (BULL et al. 1993). Zum anderen können speziell die gesättigten Fettsäuren (aus tierischen Fetten z.B. Palmitinsäure, Stearinsäure) durch ihren Gehalt an Wasserstoffperoxiden mittels Peroxidation die Membranlipide von Zellen schädigen. Metabolite dieser Lipidperoxidation, wie 4-Hydroxynonenal (HNE) oder Malondialdehyd (MDA), steigern die Zellproliferation und können zur DNA- Schädigung führen (LEURATTI et al. 2002; MARNETT 2000; BARRERA et al.
1996).
Bei ungesättigten Fettsäuren wie z.B. den Omega-3-Fettsäuren aus Fischöl dagegen deuten epidemiologische, klinische und experimentelle Daten auf einen protektiven Effekt gegen Kolonkrebs hin (COLLETT et al. 2001; ANTI et al. 1994; CHANG et al.
1998).
- Alkoholkonsum:
Neben anderen schädlichen Einflüssen übermäßigen Alkoholkonsums (Leberzirrhose u.a.) hat sich im Bezug auf Kolonkrebs ein im menschlichen Körper entstehendes Abbauprodukt des Alkohols, das Acetaldehyd, im Tierexperiment als kanzerogen erwiesen. Darüber hinaus ergaben Studien, dass Acetaldehyd auch in der Kolonkrebsentstehung beim Menschen eine wichtige Rolle spielt (YOKOYAMA et al.
1998).
- Niedrige Aufnahme von Ballaststoffen und sekundären Pflanzenstoffen:
Ballaststoffe sind Bestandteile pflanzlicher Nahrungsmittel, die der menschliche Körper nicht direkt verwerten kann, d.h. sie können durch die Verdauungsenzyme im Dünndarm nur marginal abgebaut und aufgenommen werden und gelangen zu fast 100
% in den Dickdarm. Dort können sie mehr oder weniger vollständig durch die Bakterien der Dickdarmflora fermentiert werden. Gut fermentiert werden z.B.
Ballaststoffe aus Haferflocken, Guarkernmehl oder Pektin. Weniger gut fermentiert werden dagegen Ballaststoffe aus Weizenkleie oder Zellulose (CUMMINGS 1984;
MCBURNEY und THOMPSON 1990). Ballaststoffe können zum einen über einen Volumenreiz die Darmmotilität steigern und somit die Transitzeit der Faeces im Darm und damit auch die Expositionszeit der Darmoberfläche gegenüber evtl. vorhandenen Noxen im Faecesstrom reduzieren (GAZZANIGA 1987). Zum anderen werden Ballaststoffe zum Teil durch die mikrobielle Dickdarmflora zu kurzkettigen Fettsäuren (SCFA), wie z.B. Butyrat abgebaut. Im Bezug auf die Kolonkarzinogese wird postuliert, dass diese SCFA die Expression proapoptotischer Gene, wie z.B. BAX, erhöhen und die Expression antiapoptotischer Gene, wie z.B. Bcl-xl, vermindern können (HAGUE et al. 1995; HAGUE et al. 1997; MENZEL et al. 2002).
Dass eine ballaststoffreiche Ernährung das Risiko an Kolonkrebs zu erkranken um bis zu 40 % vermindern kann, zeigten erste Ergebnisse einer umfangreichen Studie in Europa (BINGHAM et al. 2003).
Die Wirkungen von sekundären Pflanzenstoffen auf die Kolonkarzinogese werden detailliert in Kapitel 2.2 beschrieben.
- Eine weitere Rolle spielen Schadstoffe, die während der Erzeugung oder Verarbeitung in die Lebensmittel gelangen. Dazu gehören etwa Lebensmittelzusatzstoffe wie Nitritpökelsalz, Verbrennungsrückstände beim Räuchern und Grillen (Benzpyrene und andere krebserregende Kohlenwasserstoffe), sowie Schadstoffe, die durch starkes Erhitzen entstehen, wie z.B. Peroxide im Öl (UDILOVA et al. 2003; NIJINSKY 1999;
JAKSZYN et al. 2004).
2.1.2 Das Mehrstufenmodell der Kolonkarzinogenese
Das Mehrstufenmodell der Kolonkarzinogenese beschreibt den Prozess der Krebsentstehung als eine Abfolge verschiedener Stadien, die als Initiations-, Promotions- und Progressionsphase bezeichnet werden. Diese Prozesse, die auch als "Adenom-Karzinom- Sequenz" bezeichnet werden, sind mit mehreren, in einer hierarchischen Sequenz aufeinander folgenden genetischen Mutationen oder dem Funktionsverlust bestimmter Gene assoziiert.
Diese Veränderungen bilden die Grundlage dafür, dass sich aus normalem Kolonepithel ein invasiv wachsendes und metastasierendes Karzinom entwickeln kann (FEARON und VOGELSTEIN 1990).
Die Initiation wird ausgelöst durch eine für die Epithelzelle nicht letale Mutation der DNA unter dem Einfluss eines einwirkenden Karzinogens. Wird anschließend eine Mitose vollständig vollzogen, ohne dass der Schaden durch Reparaturmechanismen behoben wurde oder die geschädigte Zelle der Apoptose (= programmierter, physiologischer Zelltod) anheim fiel, kommt es zu einer Weitergabe der Mutation an die Tochterzelle. Stammzellen sind noch nicht ausdifferenzierte Körperzellen, die sich lebenslang teilen können. Bei jeder Teilung entstehen Tochterzellen, die während der Differenzierung ihre volle Funktionsfähigkeit erlangen und dabei ihre Teilungsfähigkeit verlieren. Diese Zellproliferation wird gesteuert von verschiedenen Regulationsmechanismen (POTTEN und LOEFFLER 1990).
Erlangt eine Stammzelle durch die Mutation die Fähigkeit sich den Regulationsmechanismen von Zellproliferation und Apoptose zu entziehen, kann sie diese Fähigkeit in Form der Mutation an die Tochterzelle weitergeben. Die Folge ist ein autonomes Wachstum des betroffenen Gewebes (KLAUNIG et al. 1998).
Zu den drei Hauptgentypen, die in der Tumorgenese eine wichtige Rolle spielen, gehören die Protoonkogene, Tumor-Supressor-Gene und DNA-Reparaturenzym-Gene (FEARON und VOGELSTEIN 1990). Sogenannte Wachstumsfaktoren regulieren die physiologische Zellteilung, dabei wird der Übergang einer Zelle aus der G0-Phase (keine Teilungsaktivität) in die G1-Phase des Zellzyklus (Vorbereitung der Teilung) von Kompetenzfaktoren reguliert.
Kompetenzfaktoren sind z.B. der Epidermale-Wachstumsfaktor (EGF), der Transformierende-Wachstumsfaktor-α (TGF-α), der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und der Plättchen-Wachstumsfaktor (PDGF). Zum Ende der G1-Phase wird der Übergang in
die S-Phase des Zellzyklus (Verdopplung des Genoms) zusätzlich zu den Kompetenzfaktoren von so genannten Progressionsfaktoren vermittelt. Wichtige Vertreter dieser Progressionsfaktoren sind der Insulinähnliche-Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) oder Insulin in hohen Konzentrationen. Gehemmt werden kann dieser Übergang durch die Anwesenheit bestimmter Zytokine, wie den transformierenden-Wachstumsfaktor-β (TGF-β) oder den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). In Abbildung 1 sind diese Vorgänge schematisch dargestellt.
G0
Voranschreiten des Zellzyklus durch Kompetenzfaktoren wie z.B. EGF, PDGF,
Voranschreiten des Zellzyklus durch Progressionsfaktoren wie z.B. Insulin, IGF1
Hemmung des Übergangs in die S-Phase des Zellzyklus z.B.
durch TGFβ, TNFα _
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Beeinflussung des Zellzyklus durch Kompetenz- und Progressionsfaktoren. G1-Phase: Vorbereitung der Zelle auf die DNA- Reduplikation und Auflösung der Kernmembran, S-Phase: Reduplikation des genetischen Materials (tetraploider Chromosomensatz), G2-Phase: Kontrollmechanismen und Vorbereitung auf die Zellteilung, M-Phase: Mitose, Aufteilung der Chromosomen, Reorganisation des Zellkerns, G0-Phase: Keine Zellteilungsaktivität.
+ Konstitutive Aktivierung durch Onkogene
Protoonkogene kodieren Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren und andere am Fortschreiten der Zellteilung beteiligten Genprodukte, wie z.B. G-Proteine und Transkriptionsfaktoren (ANTONIADES und OWEN 1982; AARONSON 1991; DATTO et al. 1995).
Werden Protoonkogene durch Mutationen zu Onkogenen aktiviert, kann es zur konstitutiven Anschaltung eines Signaltransduktionsweges kommen, der zur Zellteilung führt, obwohl kein exogenes Wachstumssignal vorliegt. Die Zelle unterliegt somit keiner externen Regulation der Zellteilung mehr. Ein wichtiges Protoonkogen ist das KRAS2-Gen, dessen Mutation zu den frühen genetischen Veränderungen bei der Entstehung von Kolontumoren zählt (KRONTIRIS 1995; BOUGHDADY et al. 1992). Die Ras-Familie besteht aus HRAS (Harvey murine sarcoma), KRAS1 und 2 (Kirsten murine sarcoma) und NRAS (neuroblastoma) (FABRY 1995). Die kleinen G-Proteine der Ras-Familie stellen molekulare Schalter für eine Signaltransduktionskaskade dar (KATZ und MCCORMICK 1997). Die Aktivierung der RAS–Proteine erfolgt durch die Bindung von Wachstumsfaktoren, wie z.B. EGF an ihre Rezeptoren die zur Tyrosinkinase-Familie gehören. Dadurch wird eine Phosphorylierung von GDP zu GTP am RAS-Protein bewirkt, die dazu führt, dass zytosolisches Raf-1 gebunden wird. Im nächsten Schritt phosphoryliert und aktiviert Raf-1 MEK1/2 (mitogen-extracellular- signal-regulated kinase kinase), welche wiederum ERK1/2 (extracellular-regulated-protein kinase) aktiviert. Aktivierte ERK kann ihrerseits eine Vielzahl von Zielproteinen sowohl im Kern als auch im Zytoplasma aktivieren, was zur Mitose der Zelle und somit zur Zellproliferation führt. Zu den Substraten von ERK zählen unter anderem Transkriptionsfaktoren (z.B. c-Jun, Elk1), strukturelle Proteine und weitere Kinasen. Im Normalfall wird die ras-Protein Aktivität begrenzt durch die Hydrolyse des RAS-GTPs zum inaktiven RAS-GDP mittels eines GTPase aktivierenden Proteins (GAP). Liegt ein durch Genmutation verändertes RAS-Protein vor kommt es zur Störung der Inaktivierung und zu einer von äußeren Stimuli unabhängigen Übertragung von Wachstumssignalen an den Zellkern (CHANG et al. 2003; CHONG et al. 2003). Hinsichtlich der Isoform der Mutierten RAS-Gene gibt es Unterschiede zwischen den Tumorformen. Beim Menschen werden KRAS Mutationen vorwiegend bei Pankreas- und und Kolonkrebs gefunden, eine Mutation des HRAS-Gens ist assoziiert mit Blasenkrebs und eine NRAS Mutation mit Erkrankungen an myeloischer Leukämie (KWANGHEE et al. 2002).
Zu den frühen genetischen Veränderungen im Rahmen der Kolonkarzinogenese zählt auch die Mutation im APC-Gen (Adenomatoese-Poliposis-Coli-Gen), einem bekannten Tumorsuppressorgen, das bei etwa 90 % der humanen Darmkrebsfälle mutiert ist. Die wichtigste Aufgabe des APC-Genproduktes ist es, die Konzentration von β-Catenin in der Zelle zu reduzieren. β-Catenin fungiert einmal als Bindemolekül in Zell-Zell-Verbindungen, kann aber unter bestimmten Voraussetzungen zum Genregulator werden. Durch eine Inaktivierung des APC-Gens kommt es zu einer Akkumulation von großen Mengen β- Catenins in der Zelle. Dadurch kann es zu einer direkten Aktivierung des Cyclin-D1-Gens mit Anstieg der Produktion des Cyclin-D1-Proteins kommen, das an der Freisetzung von Transkriptionsfaktoren beteiligt ist, die für den Übergang der Zelle in die S-Phase benötigt werden. Ist durch Inaktivierung des APC-Gens keine Regulation mehr möglich, kommt es zur unkontrollierten Zellteilung (FODDE 2002; TAKAHASHI et al. 2000; MORIN et al. 1997).
Schäden an der DNA, die sich in Basenveränderungen äußern, werden als Änderungen der Raumstruktur von spezifischen Proteinen erkannt, die dann mit DNA-Glykosylasen aktive Komplexe bilden und geschädigte Basen eliminieren. Zum Einsetzen der richtigen Base wird zunächst von Apyrimidin-Endonukleasen und Phosphodiesterasen das Desoxyribosephosphat entfernt und die entstandene Lücke anschließend von DNA-Polymerasen und DNA-Ligasen wieder aufgefüllt und geschlossen. Bei größeren Schäden schneidet ein Multienzymkomplex ein aus ca. 10-20 Nukleotiden bestehendes Oligonucleotid aus dem geschädigten Einzelstrang, der danach durch DNA-Polymerasen und DNA-Ligasen wieder aufgefüllt wird (DE LAAT et al. 1999; HOEIJMAKERS 2001).
Es wurde festgestellt, dass allein durch oxidative Schädigung täglich ca. 10.000 „Angriffe“
auf die zelluläre DNA stattfinden (AMES et al. 1993). Sind nun die den Reparaturmechanismen zu Grunde liegenden Gene selbst durch Mutation geschädigt, kann es zum Ausfall der Reparaturmechanismen kommen. Dies bedingt eine hohe Disposition für weitere Mutationen. Betreffen diese Mutationen die oben beschrieben Gene, die in die Regulation der Zellproliferation und Apoptose involviert sind, kann dies zu einer
„Entgleisung“ des Zellzyklus führen (AMES et al. 1993).
Erste im Kolonepithel mikroskopisch sichtbare Anzeichen sind Veränderungen im Bereich der Krypten. Diese veränderten Krypten sind durch ein dilatiertes Lumen und eine verbreiterte
perikryptale Zone gekennzeichnet. Sie werden als aberrante Krypten, fokale Ansammlungen dieser veränderten Krypten als Aberrante Krypt Foci (ACF) bezeichnet (BIRD 1987).
Veränderungen der Expression oder Mutationen in den genannten Gengruppen führen zum selektiven Wachstumsvorteil einer Zelle. Dieses selektive, klonale Wachstum einer initiierten Zelle wird als Tumorpromotion bezeichnet und stellt einen langsamen Prozess dar, der sich an die Initiation anschließt und Wochen bis Jahre dauern kann. Findet in dieser Phase keine durch körpereigene Schutzmechanismen gesteuerte Regression dieses Prozesses statt, führt die Entgleisung des Zellzyklus durch die Störung des Gleichgewichtes zwischen Zellteilung und Apoptose zur Akkumulation weiterer DNA-Mutationen und damit zum autonomen Wachstum des Gewebes (Progressionsphase) (CALVERT und FRUCHT 2002) (siehe Abbildung 2).
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Multistage-Kolonkarzinom-Modells (modifiziert nach FEARON und VOGELSTEIN 1990).
Hyperproliferation (Bildung von aberranten Krypt Foci)
Initiation Promotion Progression
DNA Schädigung z.B. durch
Karzinogene Selektiertes klonales Wachstum der initiierten Zellen
Akkumulation weiterer DNA Mutationen durch gesteigerte Proliferation normales Epithel
Karzinom Adenom
2.1.3 „Biomarker“ der Kolonkarzinogenese
Die Entwicklung eines Kolonkarzinoms findet über einen sehr langen Zeitraum (10-30 Jahre Latenzzeit) statt und ist in frühen Stadien relativ schwer diagnostizierbar, denn klinisch apparente eher unspezifische Symptome zeigen Kolonkarzinome erst zu einem späten Zeitpunkt des Krankheitsgeschehens. Da der Therapieerfolg und die Prognose entscheidend vom Erkrankungsstadium abhängen, kann vor allem eine rechtzeitig Früherkennung zur Senkung der Mortalitätsrate beitragen. Doch eine endoskopische Diagnose ist erst bei der makroskopisch sichtbaren Manifestierung eines Tumors und hauptsächlich in distalen Bereichen des Kolons möglich. Aus diesem Grund spielen im Hinblick auf die Senkung der Inzidenz- und Mortalitätrate des Kolonkarzinoms krebspräventive Maßnahmen und die Entwicklung von Modellen (in vitro, in vivo) zur Identifizierung und Charakterisierung von tumorassoziierten „Biomarkern“ in Frühstadien der Karzinogenese eine sehr wichtige Rolle.
Als Biomarker werden zelluläre und mikrobiologische Veränderungen betrachtet, die im Zusammenhang mit der Kolonkarzinogenese stehen (JEHLE et al. 2003; SMOLA et al.
1995).
Auch ist es in diesem Zusammenhang erstrebenswert, möglichst solche tumorassoziierte
„Biomarker“ zu identifizieren und zu charakterisieren, die möglichst früh vor der klinischen Manifestation eines Tumors erscheinen. Aus den oben genannten Gründen ist die Identifizierung solcher Biomarker in Krebspatienten nur schwer möglich. Daher wurden verschiedene Tiermodelle entwickelt, in denen die verschiedenen Stadien der Kolonkarzinogenese in wesentlich kürzeren Zeiträumen verlaufen.
Da für das Kolonkarzinom bereits seit fast drei Jahrzehnten (BIRD 1987) ein gut etabliertes Tiermodell existiert (siehe auch Kapitel 2.1.4), sind aussagekräftige, tumorassoziierte Biomarker identifiziert worden, die als morphologische, biochemische und molekulare Veränderungen so auch im Verlauf der humanen Karzinogenese nachweisbar sind. Im Folgenden soll auf diese Biomarker detaillierter eingegangen werden.
2.1.3.1 Aberrante Krypt Foci (ACF)
Erstmals beschrieb BIRD (1987) im Kolon von Mäusen, die mit dem Prokarzinogen Azoxymethan behandelt wurden, veränderte Krypten. Diese zeichneten sich bei der mikroskopischen Untersuchung Methylenblau gefärbter Darmpräparate durch stark dilatierte Lumen und intensivere Färbung aus und erschienen größer und dunkler. Diese Krypten wurden als aberrante Krypten, fokale Ansammlungen dieser veränderten Krypten als Aberrante Krypt Foci (ACF) bezeichnet.
Auch elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigten, dass die luminalen Öffnungen aberranter Krypten im Vergleich zu normalen Krypten größer und uneinheitlicher geformt sind und die perikryptale Zone verbreitert ist. Des Weiteren sind ACF leicht über die Mukosaoberfläche erhaben und zeigen im Vergleich zu normalen Krypten eine intensivere Vitalfärbung (PAULSEN et al. 1994; DI GREGORIO et al. 1997).
Eine Vielzahl von Studien, die die Charakteristika der ACF untersuchten legen nahe, dass es sich bei den ACF um frühe präneoplastische Läsionen handelt (BIRD et al. 1989).
Für die Tatsache, dass es sich bei ACF um frühe präneoplastische Läsionenhandelt,sprechen folgende Aspekte:
ACF lassen sich durch spezifische Kolonkarzinogene (z.B. 1,2-Dimethylhydrazin, 4- Aminobiphenyl, N-nitroso-N-methylurea und 3-Methylcholanthrene) im Tiermodell dosisabhängig induzieren, während keine ACF in unbehandelten Tieren vorhanden sind (MCLELLAN und BIRD 1988b).
ACF können bereits zwei Wochen nach der Karzinogen-Behandlung im Kolon der Tiere gefunden werden, und sie persistieren auch nach Beendigung der Karzinogen-Behandlung (MCLELLAN und BIRD 1988a). Darüber hinaus zeigen die Epithelzellen in den ACF, in Abhängigkeit von der Zeit fortschreitende, histologische Veränderungen. Diese beginnen mit leichten morphologischen Veränderungen und reichen bis zu hochgradigen Dysplasien.
Gleichzeitig weisen sie biochemische und genetische Alterationen auf, die auch in Tumoren gefunden werden können (TUDEK et al. 1989; MCLELLAN und BIRD 1988a, b; CADERNI et al. 1995).
Ähnlichkeiten zwischen ACF und Tumoren (Karzinomen) bestehen bei tumorassoziierten genetischen Veränderungen, die zur Aktivierung von Protoonkogen (KRAS2) oder zur Inaktivierung von Tumorsupressorgenen (p53) führen. Eine Aktivierung des KRAS2-Gens und eine Inaktivierung des p53-Gens können in Kolontumoren und in ACF sowohl beim Mensch als auch im Tiermodell beobachtet werden (VOGELSTEIN et al. 1988; LOSI et al.
1996; SHIVAPURKAR et al. 1997).
Mutationen des Tumorsupressorgens APC konnten im Tiermodell zwar nicht in ACF, aber in den später entstandenen Adenomen festgestellt werden (DE FILIPPO et al. 1998). Dies zeigt, dass die APC-Gen Mutation im Wesentlichen die Entwicklung vom ACF zum Adenom, jedoch nicht die der geschädigten Mukosa zum ACF beeinflusst. Diese Beobachtung konnte auch von anderen Arbeitsgruppen gemacht werden (TAKAYAMA et al. 2001). Trotz der fehlenden Mutation des APC-Gens wurden in ACF im Tiermodell erhöhte β-Catenin Spiegel festgestellt. Diese Beobachtung lässt auf eine im Tiermodell alternative, APC-Gen unabhängige Erhöhung des β-Catenin-Spiegels schließen (HAO et al. 2001; FURIHATA et al. 2002). Auf Grund des promovierenden Einflusses von β-Catenin auf die Zellproliferation werden Kolonkrypten mit erhöhter β-Catenin-Expression neben den ACF als Biomarker der Kolonkarzinogenese im Tiermodell postuliert (HIROSE et al. 2003). Bei humanen Patienten mit KRK konnte eine Mutation des APC-Gens und eine Erhöhung des β-Catenin-Spiegels nicht in ACF, aber in Adenomen festgestellt werden (TAKAYAMA et al. 2001).
Als weiteres Charakteristikum von Kolontumoren (Adenome, Karzinome) gilt eine im Vergleich zur unveränderten Mukosa gesteigerte Proliferation der Epithelzellen. Auch dieses Merkmal zeichnet sowohl humane ACF (RONCUCCI et al. 1993) als auch ACF in Tiermodellen aus (DASHWOOD et al. 2001).
Für eine Korrelation zwischen ACF- und Tumorentwicklung spricht, dass die Verbreitung, Anzahl und Größe von ACF von gesunden Probanden über Adenom-Patienten bis zu Karzinom-Patienten zunimmt. Einige Autoren berichten von einer Korrelation zwischen der Größe der ACF und der späteren Ausbildung von Tumoren, wobei vor allem den so genannten „großen ACF“ das Potential zugeschrieben wird, zu Tumoren zu transformieren (SHIRTLIFF und BIRD 1996; DAVIES et al. 1999; CADERNI et al. 1995). Problematisch ist
dabei die uneinheitliche Definition von „großen ACF“, da bis heute kein einheitliches System der Grösseneinteilung von ACF existiert.
Veröffentlichungen von SHIRTLIFF und BIRD (1996) und DAVIES et al. (1999) zeigen, dass die Anzahl von ACF mit mehr als vier aberranten Krypten enger mit der Anzahl an Adenomen korreliert als die Gesamtzahl aller ACF. Die Arbeitsgruppe von CADERNI et al.
(1995) konnte diesen Zusammenhang für große ACF mit mehr als 14 aberrante Krypten bestätigen.
Zusätzlich zu der Anzahl und Größe der ACF identifizierten CADERNI et al. (1995) weitere morphologische Veränderungen in aberranten Krypten und teilten diese in Abhängigkeit zur Stärke der Veränderungen in drei Gruppen: milde, moderate und schwere morphologische Veränderungen. Dabei bezieht sich diese Graduierung auf Veränderungen des Kryptlumens, der Größe der Zellkerne der Epithelzellen und der Anzahl der Becherzellen pro Krypte. Im Rahmen dieser Untersuchung konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Größe der ACF in Abhängigkeit von der Zeit nach der AOM-Applikation sondern auch der Grad der oben beschriebenen morphologischen Dysplasien zunimmt.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei der Untersuchung der ACF-Bildung im Hinblick auf mögliche chemopräventive Effekte von Testsubstanzen eine möglich Abnahme der Anzahl großer ACF eine bessere Aussagekraft hinsichtlich einer prospektiven Tumorreduktion hat, als eine Abnahme der Gesamtzahl aller ACF. WIJNANDS et al. (2004) fanden dagegen keinen Zusammenhang zwischen ACF-Anzahl/-Größe und der Bildung von Tumoren (es wurde keine histopathologische Klassifizierung der Tumore vorgenommen) im Tiermodell.
Hierfür wurde bei Fischer-Ratten die Kolonkarzinogenese durch das chemische Karzinogen Azoxymethan (AOM)-induziert. Die Tiere wurden in drei Gruppen mit unterschiedlichen Versuchsdiäten unterteilt. Nach 7, 15 und 26 Wochen wurde die Anzahl und Größe der ACF bestimmt, nach 26 Wochen und 8 Monaten die Anzahl und Größe der Tumore. Lediglich in einer der drei untersuchten Tiergruppen bestand eine Korrelation zwischen der ACF-Anzahl und -Größe und der Tumor-Anzahl und -Größe.
Zusammenfassend weisen zwar viele Studien darauf hin, dass der ACF als präneoplastische Läsion einen guten Biomarker für die spätere Adenom/Karzinom Entwicklung repräsentiert, die Aussagekraft des ACF-Assays wird jedoch durch die spontane ACF-Rückbildung oder nur partielle Entwicklung zu einem Adenom eingeschränkt (BIRD 1995).
Um eine sichere Aussage über das chemopräventive Potential einer Testsubstanz auf die chemisch induzierte Kolonkarzinogenese im Tiermodell treffen zu können, ist die alleinige Verwendung des ACF-Assays nicht ausreichend, sondern er sollte mit weiteren Biomarkern kombiniert werden.
2.1.3.2 Proliferation
Die Karzinogenese im Kolon muss im Zusammenhang mit der normalen Topographie der Krypten, welche aus dem Epithelgewebe der Schleimhaut gebildet werden, gesehen werden.
Der normale Zellzyklus der Kryptepithelzellen wird durch ein Gleichgewicht aus Proliferation, Differenzierung, Apoptose und Abschilfern bestimmt. Bei den Krypten handelt es sich um „Einstülpungen“ der Mukosa, die mit einer einzigen Schicht aus Epithelzellen bedeckt sind (Abbildung 3).
Aus proliferativen Prozessen der undifferenzierten Stammzellen am Grund der Krypte entstehen die Epithelzellen der Kolonschleimhaut. Diese besitzen selbst nicht die Fähigkeit zu
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Topographie von Kolonkrypten. Am Grund der Krypte (Kryptbasis) befindet sich die Proliferationszone der Stammzellen. Auf ihrem Weg entlang der Kryptachse in Richtung Darmlumen erlangen die Zellen durch Differenzierung ihre funktionellen Eigenschaften. Nach 3-5 Tagen werden die Kolonepithelzellen ins Darmlumen abgeschilfert (POTTEN und LOEFFLER 1990).
Körnerzelle Stammzellen Differenzierung der Zellen
Differenzierte Zellen Abschilferung der Zellen an der Kryptöffnung
luminaler Ausrichtung durch Differenzierung ihre funktionelle Kompetenz: Die terminale Differenzierung ist nämlich nicht nur mit einem irreversiblen Ausstieg aus dem Zellzyklus, sondern auch mit der Expression gewebespezifischer Enzyme, wie Bürstensaum-Hydrolasen, Disaccharidasen und Alkalischer Phosphatasen verbunden (DING et al. 2000).
Mit dem programmierten Zelltod an der Kryptenöffnung und der Abschilferung ins Darmlumen endet die Lebensspanne der Kolonepithelzellen.
Die vollständige Regeneration der intestinalen Epithelzellpopulation erfolgt innerhalb von 3 bis 5 Tagen (GAVRIELI et al. 1992; STRATER et al. 1995).
Es wird deutlich, dass die physiologische Gewebshomöostase durch ein Gleichgewicht zwischen Proliferation in der Kryptbasis und Apoptose am Kryptlumen aufrecht erhalten wird. Doch in der Kanzerogenese spielen Fehlregulationen des Zellzyklus eine essentielle Rolle. Alle Neoplasien entstehen letztlich aufgrund von Veränderungen, die die normale Zellzyklusregulation außer Kraft setzen und diese Balance stören, beispielsweise zu Gunsten einer erhöhten Proliferation, einer verminderten Apoptose oder der Entwicklung eines weniger differenzierten Zelltypus (CASPARY und STEIN 1999).
Als Proliferation wird der durch veränderte Genexpression hervorgerufene Prozess bezeichnet, der eine Stammzelle im basalen Kryptdrittel veranlasst, den gesamten Zellzyklus zu durchlaufen und sich zu teilen. Zusätzlich moduliert wird die Proliferationsrate durch externe Wachstumsstimuli (siehe auch Kapitel 2.1.2). Drei bis fünf Tage nach ihrer Entstehung in der Kryptbasis wird eine Kryptepithelzelle apoptotisch und an der Kryptspitze ins Darmlumen abgeschilfert. Durch diese begrenzte Lebensspanne kann eine genetische Veränderung in differenzierten Kolonepithelzellen keinen bleibenden Schaden anrichten. Die Stammzellen hingegen persistieren in der Kryptbasis. Sind diese Zellen von einer genetischen Schädigung betroffen, kann es zu einer Manifestierung dieser Schädigung kommen (POTTEN und LOEFFLER 1990). Entstehen in einer Stammzelle beispielsweise durch die Einwirkung eines Karzinogens Mutationen im Bereich Zellzyklus regulierender Gene, kann sie die daraus entstehende Fähigkeit, sich den Regulationsmechanismen von Zellproliferation und Apoptose zu entziehen, an die Tochterzelle weitergeben. Eine klonale Expansion dieser Zellen wäre die Folge (KLAUNIG et al. 1998).
Es konnte wiederholt gezeigt werden, dass ein Anstieg der proliferativen Aktivität im Kolonepithel ein beständiges Merkmal von Patienten mit KRK ist (RONCUCCI et al. 1993).
Dieser Anstieg, verbunden mit einer Ausdehnung der proliferativen Zone in den Kolonkrypten, ist ein charakteristisches Symptom in allen Stufen der Kolonkarzinogenese (SHPITZ et al. 1997). Auch im Tiermodell konnte nach Injektion des chemischen (Kolon-) Karzinogens 1,2-Dimethylhydrazin eine Zunahme der Proliferation von Kolonepithelzellen und eine weitere Ausdehnung der Proliferationszone nach luminal beobachtet werden (MA et al. 2002).
Wie bereits im Rahmen der ACF als Biomarker erläutert, kann alleinig von einer erhöhten Zellproliferation per se nicht kausal auf ein erhöhtes Tumorrisiko geschlossen werden. Die fehlregulierte Zellteilung ist nur ein Teil im komplexen Prozess der Kolonkanzerogenese und muss als krebsassoziierter Biomarkers immer im Kontext mit anderen untersuchten Biomarkern der Kolonkanzerogenese (z.B. ACF-Bildung, tumorassoziierte Genexpression) betrachtet werden (WEINSTEIN 1991).
2.1.3.3 Genexpression
Wie bereits beschrieben, ist ein gestörtes Gleichgewicht von Zellproliferation und Apoptose für jede Neoplasie charakteristisch, d.h. letzten Endes ist eine Neoplasie die Folge einer Aktivierung und/oder Unterdrückung von Genen, welche die Zellproliferation und/oder Apoptose, „Entgiftung“ oder DNA-Reparatur regulieren.
Die Apoptose unterliegt einer streng kontrollierten und komplexen Signaltransduktion. Im Zentrum der Apoptoseexekution steht das proteolytische System der Caspasen, die sog.
Caspase-Kaskade. Bei den Caspasen handelt es sich um cysteinhaltige Proteasen, die in einer Kaskade aktiviert werden und schließlich über die Aktivierung der DNAsen zur Degradierung der chromosomalen DNA und somit zur Apoptose führen.
Zu Beginn der Apoptose werden so genannte Initiatorcaspasen aktiviert (wie Caspase–8 und – 9), die nachfolgend Effektorcaspasen (wie Caspase-3, -6 und –7) in ihre aktive Form überführen (AFFORD und RANDHAWA 2000; LOS et al. 2001).
Die Induktion der Apoptose wird gesteuert durch die Expression pro- oder antiapoptotischer Gene.
Eine Schlüsselrolle hierbei spielt die Bcl-2 Familie, deren Mitglieder in eine proapoptotische Gruppe (z.B. BAX, Bcl-xs) und eine antiapoptotische Gruppe (z.B. Bcl-xl und Bcl-2) eingeteilt werden (LANAVE et al. 2004).
Einen zentralen Mechanismus für die Aktivierung der Caspase-Kaskade vermittelt Cytochrom-C, das bei Schädigung der Zelle aus den Mitochondrien freigesetzt werden kann (LIU et al. 1996). Die Cytochrom-C-Freisetzung aus den Mitochondrien wird durch Proteine der Bcl-2-Subfamilie kontrolliert. Cytochrom-C ist zwischen innerer und äußerer Mitochondrienmembran lokalisiert. Bei entsprechenden Stimuli wird es durch die Membranporen freigesetzt und aktiviert dann über die Caspase-Kaskade die Apoptose.
Das Bcl-2-Protein ist in der Lage, die Mitochondrien-Membran abzudichten, in Folge dessen das Cytochrom-C daran zu hindern die Mitochondrien zu verlassen und wirkt auf diese Weise antiapoptotisch. Hingegen trägt BAX zur Öffnung dieser Membranporen bei und wirkt somit proapoptotisch (YANG et al. 1997; KLUCK et al. 1997; GROSS et al. 1999).
Ein weiteres Merkmal für humane Kolonkarzinome ist im Vergleich zur normalen Kolonschleimhaut die Überexpression der Cyclooxygenase-2 (COX-2).
Cyclooxygenasen sind Enzyme, die die Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostaglandinen und Eikosanoiden katalysieren. Bislang sind zwei Isoenzyme entdeckt worden (COX-1 und COX-2). COX-2 als induzierbare Isoform wird durch eine Vielzahl von Stimuli hochreguliert, wie z.B. Zytokine, Wachstumsfaktoren, sowie mikrobiologische, mechanische und chemische Einflüsse und ist in die Prostaglandinsynthese im Rahmen von Entzündungsprozessen involviert. Dagegen wird die Isoform COX-1 in vielen Geweben konstitutiv exprimiert und ist dort in physiologische Prozesse eingebunden. So bewirkt Prostaglandinsynthese durch die COX-1 eine Förderung der Schleimbildung im Magen und wirkt dadurch zytoprotektiv (SMITH et al. 2000; TURINI und DUBOIS 2002).
Eine Überexpression von COX-2 ist im Tumorgewebe im Vergleich zu unverändertem Gewebe nachgewiesen worden und unterstützt die Tumorprogression durch die massiv erhöhte PGE2-Synthese. Durch diese erhöhte PGE2-Konzentration wird die Angiogenese stimuliert, die Adhäsion der Zellen an die extrazelluläre Matrix verstärkt und eine Apoptose- Resistenz ausgeprägt (TSUJI et al. 2001; TURINI und DUBOIS 2002).
Die Überexpression von COX-2 ist auch in chemisch induzierten Kolonkarzinomen im Tiermodell nachgewiesen (DUBOIS et al. 1996).
Zur Entwicklung und Persistenz von Tumoren kann auch eine gesteigerte Aktivität so genannter Entgiftungsenzyme beitragen. Die Entgiftung von körpereigenen und xenobiotischen Substanzen wird katalysiert durch die Glutathion-S-Transferasen (GST).
Diese Enzyme zeichnen sich durch einen breiten Bereich an Substratspezifität aus und existieren in vielen verschiedenen Isoenzymen (z.B. GST-P und GST-M). Die Entgiftung der meist hydrophoben Substanzen geschieht durch die kovalente Verknüpfung an Glutathion und die Umwandlung in ein weniger reaktives, hydrophiles Glutathion-Konjugat, das weiter metabolisiert und ausgeschieden werden kann.
Glutathion-Sulfhydryl (GSH) ist ein Tripeptid, das aus den Aminosäuren Glycin, Glutaminsäure und Cystein gebildet wird und vorwiegend innerhalb von Zellen vorkommt.
Der geschwindigkeitslimitierende Schritt im GSH-Stoffwechsel bildet die γ-Glutamylcystein- Synthetase (γ-GCS) (MEISTER 1988). Das GSH hat zahlreiche biologische Funktionen, unter anderem die Beteiligung bei der Abwehr von freien Radikalen und die Bildung von Konjugaten zur Ausscheidung von toxischen Fremdstoffen (ARRICK und NATHAN 1984).
Ein unerwünschter Effekt der GSH-abhängigen Reaktionen betrifft die Inaktivierung von Medikamenten, die in der Krebstherapie eingesetzt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die meisten humanen Tumore große Mengen an GST exprimieren (PETERS et al. 1989).
Aber auch im Tiermodell konnte eine Überexpression der GST-Isoformen GST-P und GST-M in chemisch induzierten Kolontumoren nachgewiesen werden (CADERNI et al. 2000).
Darüber hinaus besteht ein Zusammenhang zwischen Tumoren mit einer hohen Expression von GST (v.a. die Isoform GST-P) und der Unwirksamkeit von Chemotherapeutika und schlechten Überlebenszeiten dieser Patienten (SUTOH et al. 2000).
Zur Tumorentstehung beitragen kann auch die Überexpression der γ-GCS, die entscheidend zur verstärkten Bildung von Glutathion und damit zur gesteigerten Entgiftung von Chemotherapeutika durch GST führt (MEISTER 1988).
2.1.4 Tiermodelle für die Kolonkarzinogenese
Zur Erforschung der Kolonkarzinogenese des Menschen wurden in den vergangenen Jahrzehnten verschiedene Tiermodelle entwickelt, um die Vorgänge während der Krebsentstehung besser nachvollziehen, sowie die Wirkung möglicher chemopräventiver Substanzen auf die Kolonkarzinogenese in einem Modellsystem in vivo untersuchen zu können.
Zwei verschiedene Modellsysteme der Kolonkarzinogenese haben sich etabliert:
- Tiermodelle mit chemisch induzierter Kolonkarzinogenese,
- Tiermodelle mit genetisch induzierter Kolonkarzinogenese.
2.1.4.1 Die chemisch induzierte Kolonkarzinogenese im Tiermodell
Das in tierexperimentellen Studien vorwiegend zur Induktion der Karzinogenese im Kolon genutzte Karzinogen ist 1,2-Dimethylhydrazin (DMH) oder dessen Metabolit Azoxymethan (AOM) (CORPET und TACHE 2002). Es ist eines der wenigen chemischen Karzinogene, das beim Labornager spezifisch im Kolon krebsinduzierend wirkt und vergleichbare Läsionen hervorruft, wie sie in der sporadischen Form der Kolonkarzinogenese beim Mensch gefunden werden (DRUCKREY 1970). Dabei ähneln sich sowohl die Lokalisation der Läsionen (vorwiegend distales Kolon), als auch die Abfolge der pathologischen Ereignisse von der Bildung der präneoplastischen aberranten Krypt Foci (ACF), die sich weiter zu Adenomen und Karzinomen entwickeln (WEISBURGER und FIALA 1983).
Darüber hinaus finden sich in DMH-induzierten Tumoren im Tiermodell genetische Veränderungen, die auch in humanen Tumoren gefundenen werden, wie z.B. Mutationen im KRAS2-Gen (SHIVAPURKAR et al. 1997). Untersuchungen an Krebspatienten ergaben eine
Häufigkeitsverteilung bei Mutationen im KRAS2-Gen von 14,3 % (5/35) in Karzinomen, 13,3
% (2/15) in Adenomen und 17,6 % (6/34) in ACF (YUAN et al. 2001).
In AOM-induzierten ACF im Tiermodell konnte eine Mutation des KRAS2-Gens in 33 % der ACF festgestellt werden (STOPERA et al. 1992). In DMH-induzierten Kolonkarzinomen lag eine K-ras-Mutation in 66 % der Karzinome vor (JACOBY et al. 1991).
Unterschiede zeigten sich in der Mutation des APC-Gens, die beim Mensch häufig schon in ACF, in diesem Tiermodell erst später in Adenomen vorliegt und in nur bei 15 % aller ACF gefunden werden (DE FILIPPO et al. 1998).
DMH ist ein so genanntes Prokarzinogen, d.h. es ist eine Vorstufe die erst durch endogene Metabolisierung bioaktiviert werden muss (WEISBURGER und FIALA 1983). Entsprechend des von Weisburger postulierten Mechanismus der Bioaktivierung wird DMH zunächst in der Leber oxidiert und über die Zwischenstufe des Azoxymethans (AOM) zu Methylazoxymethanol (MAM) umgewandelt. Dieses wird mit Glucuronsäure konjugiert und gelangt über die Gallenflüssigkeit in den Darm, wo es durch bakterielle β-Glucuronidase zu MAM hydrolysiert wird. In-vitro-Studien zeigten den spontanen Zerfall von MAM und die Bildung eines Alkyl-Radikals bei einer Halbwertszeit von 12 Stunden bei 37˚C und neutralem pH (NAGASAWA et al. 1972) (siehe auch Abbildung 4). Dieses Alkyl-Radikal ist stark elektrophil und in der Lage nukleäre DNA zu alkylieren (HERRON und SHANK 1982).
Für die Annahme, dass das Karzinogen (MAM) die Kolonmukosa auch über den Blutweg erreicht und dass auch die Zellen der Kolonmukosa in die Bioaktivierung mit einbezogen sind, spricht eine Studie von MATSUBARA et al. (1978). Diese zeigte, dass es bei einer Applikation von DMH auch in einem chirurgisch vom Faecesstrom isolierten Kolon zur Ausbildung von Tumoren kommt. Darüber hinaus spricht die Organspezifität des Karzinogens DMHfüreine Involvierung der Kolonepithelzellen bei der Metabolisierung von DMH zum aktiven Karzinogen. So konnte festgestellt werden, dass an der Transformation von DMH zum aktiven Karzinogen spezifische, in Kolonepithelzellen vorhandene Enzyme beteiligt sind.
Folgenden Enzymen bzw. Isoformen wird eine Beteiligung an der Aktivierung von DMH zugeschrieben:
- Alkohol-Dehydrogenase (ADH) (SCHOENTAL 1973) - Prostaglandin-Synthetase (TAN et al. 1981)
- Lipoxygenase (CRAVEN et al. 1985)
- Cytochrom P-450 (CYP 450), davon v.a. die Isoform CYP2E1 (NEWAZ et al. 1983;
SOHN et al. 2001)
Neben den Kolonepithelzellen konnte LAQUEUR et al. (1981) die Beteiligung der Darmflora an der Aktivierung von DMH feststellen. Der Versuch zeigte, dass das β-Glucuronid von MAM mutagen nach Hydrolyse mit β-Glucuronidase ist und in Ratten mit physiologischer Darmflora nach oraler Applikation als Karzinogen wirkt, nicht aber in Tieren ohne physiologische Darmflora.
DMH in seiner aktivierten Form als Alkyl-Radikal ist stark elektrophil und in der Lage nukleäre DNA zu alkylieren (HERRON und SHANK 1982).
Diese DNA-Alkylierung führt zur Bildung von 6-O-Methylguanin (O6-MeG). Dieses wird normalerweise von der 6-O-Methylguanin-DNA-Methyltransferase (MGMT) eliminiert (PEGG und BYERS 1992). Wird diese Schädigung hingegen nicht repariert, findet bei DNA- Replikation auf Grund der Strukturänderung eine Fehlbindung des 6-O-Methylguanins mit Thymin statt und es kommt daher zu einer GC → AT Transition (siehe auch Abbildung 4).
Es konnte gezeigt werden, dass diese GC → AT Transition im KRAS2-Gen auch bei ca. 50%
der humanen Kolontumore gefunden werden konnte (CALVERT und FRUCHT 2002).
Weitere karzinogene Mechanismen alkylierender Substanzen sind Mutationen in den DNA- Reparatursystemen und in den Tumorsupressorgenen p53 und APC (MALTZMAN et al.
1997). Zusammenfassend sind in den Prozess der Induktion der Karzinogenese durch alkylierende Karzinogene folgende Ereignisse involviert:
CH3-[O]NH-NH-CH2OH
Alkyl-Radikal
[CH3](+) N-NO
H3C
H Aktivierung von Dimethylhydrazin
Azoxymethan
CH3NHNHCH3
CH3-[O]N=N-CH3
CH3
6-O-Methylguanin
||| G
C ||| G
C Replikation 6-O-CH3
T 6-O-CH3
A
||| G T
Replikation T ||
||
G 6-O-CH3
||| G C [CH3](+)
Methylierung des Guanins
Fehlpaarung des 6-O-Methylguanins mit Thymin während der DNA Replikation
Guanin
Methylazoxymethanol Dimethylhydrazin
CYP 2E1
und andere CYP 2E1, ADH und andere
CYP 2E1, ADH und andere
spontaner Zerfall
[CH3](+)
Abbildung 4: Bildung einer Punktmutation in genomischer DNA. Diese Mutation kann durch eine Basenfehlpaarung nach der Methylierung von Guaninbasen durch ein Alkyl- Radikal entstehen. Diese Alkyl-Radikale werden bei der Aktivierung des Prokarzinogens DMH gebildet.
- Exposition, Metabolismus/Bioaktivierung des Prokarzinogens,
- die Bildung von DNA-Addukten in genomischer DNA von Zielzellen, - eine verminderte Reparatur dieser Veränderungen durch Reparatur-Systeme, - Apoptose-Resistenz,
- Replikation der abnormen Zelle, die zur Persistenz der DNA-Schäden führt (Initiation),
- Entstehung eines präkanzerösen Herdes (Promotion), - Wachstum des Tumors (Progression).
2.1.4.2 Die genetisch induzierte Kolonkarzinogenese im Tiermodell
Ein verwendetes Tiermodell zur Untersuchung von vererbbaren und sporadisch auftretenden Darmtumoren stellt das Modell der Min (= multiple intestinal neoplasia)-Maus dar.
Min Mäuse besitzen ähnlich wie humane FAP (Familiäre Adenomatöse Polyposis)-Patienten eine Keimbahnmutation im APC-Gen, das auch bei der Entstehung von sporadischen Darmtumoren oft in sehr frühen Stadien verändert vorliegt (SU et al. 1992).
APC reduziert die cytoplasmatische β-Catenin-Konzentration. β-Catenin ist nach seiner Translokation in den Zellkern in der Lage, die Expression bestimmter Gene zu induzieren, die ihrerseits für die Zellteilung und Proliferation zuständig sind. Bei einer Mutation des APC- Gens ist der Abbau des β-Catenins gestört, wodurch die Zellproliferation und somit das Tumorwachstum stimuliert wird (MORIN 1999).
Eine wesentliche Einschränkung dieses Tiermodells für die Verwendung als Modell für die Kolonkarzinogenese ist allerdings die vorwiegende Lokalisation der Neoplasien im Dünndarm und nicht im Kolon (CORPET und PIERRE 2003).
Für die Untersuchung möglicher chemopräventiver Eigenschaften von Nahrungsinhaltsstoffen auf die Krebsentstehung speziell im Kolon, ist dieses Tiermodell daher im Vergleich zum DMH/AOM-Modell weniger geeignet.
2.1.5 Einfuss von Insulin als Wachstumsfaktor auf die Kolonkarzinogenese
Insulin und Insulinähnliche-Wachstumsfaktoren (IGF) spielen als endokrine Substanzen eine wichtige Rolle in Regelkreisen der Energiehomöostase und bei Wachstumsprozessen des Körpers.
Physiologisch wird Insulin im Verlauf der Nahrungsaufnahme, bei steigendem Blutzuckerspiegel, aus den ß-Zellen der Langerhansschen Inseln des Pankreas freigesetzt und vermittelt die Glukoseaufnahme in die Körperzellen, va. Fettgewebe und Skelettmuskulatur.
Die IGF (1 und 2) werden von den meisten Geweben produziert und dienen als Proliferations- und Wachstumsfaktoren (BUTLER und LEROITH 2001; COHICK und CLEMMONS 1993;
STEWARD 1996).
Zwischen Insulin und IGF bestehen neben einer großen strukturellen Ähnlichkeit auch funktionelle Gemeinsamkeiten (HILL 1999). So können auch IGF die Glukoseaufnahme in Fett- und Muskelzellen stimulieren. Umgekehrt kann Insulin, wenn auch mit geringerer Affinität, an IGF-Rezeptoren binden, über die die anabolen und mitogenen Effekte der IGF vermittelt werden (SOARES et al. 1985; VAN KLEFFENS et al. 1998; CASELLA et al.
1986; BUTT et al. 1999).
Hinweise auf den Zusammenhang zwischen Kolonkrebs und Insulin zeigten In-vitro-Studien, die in verschieden Kolonkarzinomzellinien eine Expression von IGF- als auch Insulinrezeptoren feststellten (KOENUMA et al. 1989; GUO et al. 1992; MACDONALD et al. 1993).
Auch zahlreiche epidemiologische Studien legen nahe, dass ein chronisch erhöhter Insulinspiegel zu einem erhöhten Erkrankungsrisiko für Dickdarmkrebs führt (SUEHIRO et al. 2005; PALMQVIST et al. 2003).
In Tiermodellen der chemisch induzierten Kolonkarzinogenese bewirkte die chronische Applikation von Insulin eine gesteigerte Bildung von ACF und eine Zunahme der Tumorzahl und -größe (CORPET et al. 1997; TRAN et al. 1996). Als möglicher Mechanismus dafür wird die, durch einen hohen Insulinspiegel verstärkte, Wirkung der IGF diskutiert. Ein hoher Insulinspiegel führt zur vermehrten Bildung von IGF-1 (UNDERWOOD et al. 1994) und hemmt die Bildung von IGF-1-Bindungsproteinen in der Leber. Bei niedrigen
Konzentrationen an zirkulierenden IGF-Bindungsproteinen liegt mehr freies zirkulierendes IGF-1 vor, das an seinen Rezeptor binden kann. Somit ist die wachstumsfördernde Wirkung des IGF-1 stärker ausgeprägt (OOI et al. 1992; POWELL et al. 1991; LEE et al. 1993).
Als Folge eines chronisch erhöhten IGF-1-Spiegels, wie er z.B. bei Akromegalie Patienten vorliegt, konnte ein Anstieg der epithelialen Proliferation im Kolon festgestellt werden (CATS et al. 1996). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Probanden mit hohem IGF-1 und niedrigem IGF-Bindungsprotein-Spiegel einem höheren Risiko ausgesetzt sind, an Dickdarmkrebs zu erkranken (MA et al. 1999).
In vitro kann IGF-1 über Interaktion mit seinem zellulären Rezeptor eine Apoptose- Hemmung und eine Proliferations-Induktion auslösen (KOENUMA et al. 1989; GUO et al.
1992). Die Signaltransduktion von IGF-1 und Insulin wirkt über eine Aktivierung des p21ras- Proteins, das eine Erhöhung der Zellproliferation vermittelt (BURGERING et al. 1991; JHUN et al. 1994).
Eine vermehrte Insulinsekretion im Körper ist meist mit Adipositas, einer hohen Energieaufnahme und häufig mit zu wenig Bewegung assoziiert (TUOMILEHTO et al.
1992).
Bekannt ist auch, dass das viscerale Fettgewebe endokrin aktiv ist und bei adipösen Personen zu einer Steigerung des Insulin-Spiegels beiträgt (SHIMOKATA et al. 1989; BJORNTORP 1991). Vor allem die Sezernierung von Adiponectin scheint dabei eine wichtige Rolle zu spielen. Ein eigentlich paradoxer und bisher nicht näher geklärter Umstand ist, dass der Serum-Adiponectinspiegel mit zunehmender Körpergesamtfettmasse sinkt, obwohl Adiponectin ausschließlich von Adipozyten produziert wird (ARITA et al. 1999). Diese Verringerung verschlechtert die Insulinsensivität in der Leber und den Skelettmuskeln und erhöht somit das Risiko, an Typ II Diabetes zu erkranken (YAMAUCHI et al. 2001).
In den Rahmen dieses Problemkomplexes des so genannten metabolischen Syndroms gehört auch die Insulinresistenz.
Die Insulinresistenz wird definiert als die beeinträchtigte biologische Reaktion der Zellen auf Insulin und ist charakterisiert durch eine kompensatorische Hyperinsulinämie und einem erhöhten Risiko an Typ II Diabetes zu erkranken (ASSOCIATION 1998).
Meist geht die Insulinresistenz mit weiteren Symptomen, wie Adipositas, Bluthochdruck, Hyperglykämie und Dyslipidämie einher, die insgesamt zum Krankheitskomplex des metabolischen Syndroms zusammengefasst werden (GAVIN und KAGAN 2000).
Eine Hyperinsulinämie bei vorliegender Insulinresistenz besteht meist symptomlos und nicht als solche diagnostiziert über Jahre. Somit wirken sowohl erhöhte Insulin-, als auch erhöhte IGF-1-Spiegel über einen langen Zeitraum stimulierend auf das Wachstum der Zellen des Kolonepithels ein und vergrößern das Risiko, an Darmkrebs zu erkranken (BRUCE et al.
2000).
Wichtig bei der Reduktion dieses durch hohe Insulin-Spiegel vermittelten zusätzlichen Erkrankungsrisikos für das Kolonkarzinom erscheint vor allem eine Restriktion der Energieaufnahme und eine Reduktion des Körperfettes zu sein.
So zeigte eine Energierestriktion von 30 % über 45 Wochen im Tiermodell der AOM induzierten Kolonkarzinogenese in einer Studie von REDDY et al. (1987) deutlich reduzierende Effekte auf die Anzahl und Größe von Tumoren im Kolon. Dabei konnte in einer Untersuchung von (RAJU und BIRD 2003) ein direkter Zusammenhang zwischen der Futterrestriktion, der Tumorinzidenz und verringerten Plasma-IGF-Spiegeln festgestellt werden.
Einen ganz neuen Ansatzpunkt beschreibt die Arbeitsgruppe von TSUDA et al. (2003).
In einer tierexperimentellen Studie an Mäusen konnten sie zeigen, dass die Applikation von Anthocyanen der Entstehung von Adipositas unter einer fettreichen Versuchsdiät hemmte.
Dabei kam es durch die Intervention mit Anthocyanen zu einer Normalisierung der hypertrophierten Fettzellen und einer Reduktion der Hyperglykämie.
Der Mechanismus dieser Effekte ist derzeit noch weitgehend unbekannt, aber diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass bei der Vorbeugung des metabolischen Syndroms der Konsum von sekundären Pflanzenstoffen ein präventives Potential aufweist.
2.2 Sekundäre Pflanzenstoffe
In zahlreichen epidemiologischen Studien wurde ermittelt, dass ein hoher Verzehr von Obst und Gemüse das Risiko an Krebs zu erkranken senken kann (BLOCK et al. 1992; COLLINS und FERGUSON 2004; WILLETT 2000). Verantwortlich für diese positiven Effekte werden die in Obst und Gemüse enthaltenen sekundären Pflanzenstoffe gemacht (DRAGSTED et al.
1993).
Zur Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe zählen mehr als 30.000 verschiedene Substanzen, die ausschließlich von Pflanzen gebildet werden. Sie werden im Gegensatz zu Nährstoffen wie Kohlenhydraten, Proteinen und Fetten, die im primären Stoffwechsel der Pflanze gebildet werden, im Zuge des sekundären Stoffwechsels hergestellt. Die Bezeichnung sekundärer Stoffwechsel rührt daher, dass die hierbei gebildeten Substanzen für das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen entbehrlich sind. Die Pflanzen bilden diese Stoffe z.B. als Schutz- oder Abwehrstoffe gegen Schädlinge, als Farb-, Duft- oder Lockstoffe und als pflanzeneigene Hormone (HELDT 1996). Früher nahm man an, dass sekundäre Pflanzenstoffe für die menschliche Ernährung unbedeutend sind. Erst in jüngerer Zeit erkannte man die Bedeutung dieser Stoffe. Sekundäre Pflanzenstoffe können im menschlichen Körper eine Vielzahl von Schutzfunktionen ausüben.
So können sekundäre Pflanzenstoffe bei ausreichender Zufuhr entzündungshemmend, immunstimulierend, antimikrobiell, antioxidativ oder krebsprotektiv wirken (ANTONY et al.
1999; BASILE et al. 1999; BEATTY et al. 2000; KELLOFF et al. 2000).
Aus diesem Grund empfiehlt das National Cancer Institute der USA und die Deutsche Gesellschaft für Ernährung e.V. (DGE) mindestens fünf Portionen Obst und Gemüse täglich aufzunehmen (KLOOS 1999; BRITSCH 1996).
2.2.1 Polyphenole
Eine Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe, der schon in den 30er Jahren eine vitamin- ähnliche Wirkung zugesprochen wurde, sind die Polyphenole. Sie wurden auch als Vitamin P bezeichnet (BENTHSATH 1937).
Polyphenole kommen überall im Pflanzenreich vor und ihre Grundstruktur lässt sich vom klassischen Phenol, dem Monohydroxybenzol, ableiten.
Die wichtigsten Polyphenole lassen sich in drei Gruppen einteilen:
- Phenolcarbonsäuren und deren Derivate („Nichtflavonoide“), - Flavonoide,
- Niedermolekulare Polyphenole.
2.2.1.1 Phenolcarbonsäuren
Die Gruppe der Phenolcarbonsäuren lässt sich in zwei Untergruppen einteilen, die Hydroxyzimtsäure und die Hydroxybenzoesäure.
Reich an Hydroxyzimtsäuren sind Gemüse wie Spinat, Kartoffeln und Kopfsalat, Weizen- und Roggenvollkorn, Äpfel, Heidelbeeren und Kaffee (WATZL 2001). Die am häufigsten vorkommenden Hydroxyzimtsäuren sind p-Coumarsäure, Kaffeesäure, Ferulasäure und Sinapingsäure. Quellen für Hydroxybenzoesäuren in der menschlichen Ernährung sind Walnüsse, Pekannüsse, Himbeeren, Brombeeren, Rot- und Weißwein (WATZL 2001).
Die Phenolcarbonsäuren kommen in Pflanzen hauptsächlich in gebundener Form vor, d.h. sie sind meist mit organischen Säuren oder mit Zuckern verestert.
Die in Früchten am weitesten verbreitete Hydroxyzimtsäure-Verbindung ist z.B. die Chlorogensäure, ein Ester aus Kaffeesäure und L-Chinasäure.
Freie Phenolcarbonsäuren können sowohl im Dünn-, als auch im Dickdarm des Menschen absorbiert werden. Die Ester-Verbindungen dagegen können im Dünndarm nicht absorbiert werden, da der Mensch keine Esterasen besitzt, die diese Ester-Verbindungen spalten. Erst im Dickdarm können sie durch Enzyme der Mikroflora hydrolysiert und schließlich absorbiert werden(WATZL 2001).
Eine Studie von (OLTHOF et al. 2003) zeigte bei Ileostomie-Patienten, dass die Hälfte oral aufgenommener Chlorogensäure im Kolon durch die mikrobielle Flora zu Hippursäure umgewandelt und zu 33 % absorbiert wird, wovon nur Spuren im Urin ausgeschieden werden.
2.2.1.2 Flavonoide
Unter den Polyphenolen in Pflanzen nehmen die Flavonoide die größte Gruppe ein.
Diese große Anzahl und die mitunter erheblichen Strukturunterschiede der Flavonoide machte eine weitere Unterteilung notwendig:
- Flavonole (Zwiebeln, Endivien):
Kaempferol, Quercetin,
- Flavanole (Rotwein, Äpfel, grüner Tee):
Catechin, Epicatechin, Procyanidine, - Flavanone (Grapefruit, Orange):
Naringenin, Hesperidin, - Flavone (Sellerie, Paprika):
Apigenin, Luteolin,
- Anthocyane (blaue Trauben, Kirschen):
Malvidin, Cyanidin, - Chalkone (Äpfel):
Phloridzin, Phloretin (WATZL und RECHKEMMER 2001).
Die häufig in der Nahrung vorkommenden Flavonoide liegen meist nicht in freier Form (Aglykon), sondern als Flavonoidglykoside vor. Ähnlich wie bei den Phenolcarbonsäuren können die freien Formen im Dünndarm absorbiert werden, und bei den Glykosid- verbindungen ging man lange Zeit davon aus, dass auch sie durch mikrobielle Enzyme im Dickdarm hydrolysiert und anschließend passiv aufgenommen werden (GRIFFITHS und BARROW 1972). Neuere Studien an Ileostomie-Patienten zeigten, dass es auch ohne mikrobielle Dickdarmflora zur Aufnahme von Flavonoiden kam und ließen vermuten, dass bestimmte Flavonolglykoside über einen aktiven Transport im Dünndarm aufgenommen werden können (HOLLMAN et al. 1995). Andere Studien an CaCo-2 Zellen, einem gut etablierten In-vitro-Modell zur Untersuchung intestinaler Absorptionsmechanismen, zeigten jedoch eine sehr schlechte Resorption der Glykosidformen (WALGREN et al. 2000b;
WALGREN et al. 2000a). Deswegen geht man in jetzt davon aus, dass eine Spaltung der