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Charakterisierung der pestiviralen Glykoproteine E1 und E2

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(1)

Glykoproteine E1 und E2

I NAUGURALDISSERTATION

zur

Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Universität Greifswald

vorgelegt von Christina Radtke geboren am 04.05.1986 in Bremerhaven Greifswald, 12.07.2019

(2)

1. Gutachter: PD Dr. Michael Knittler 2. Gutachter: Prof. Dr. Norbert Tautz Tag der Promotion: 25.11.2019

(3)

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis v

1 Einleitung 1

1.1 Die Taxonomie von Pestiviren . . . 1

1.2 Biotypen und Spezies von BVDV . . . 3

1.3 Infektion mit BVDV . . . 3

1.4 Die Genomstruktur und Morphologie von Pestiviren . . . 6

1.5 Das Strukturprotein E1 . . . 7

1.6 Das Strukturprotein E2 . . . 8

1.7 Weitere pestivirale Proteine . . . 9

1.8 Virale Replikation . . . 11

1.9 Sortierung von Proteinen in intrazellulären Membransystemen . . . 14

1.10 Fragestellung der Arbeit . . . 16

2 Material 17 2.1 Chemikalien . . . 17

2.2 Verwendete Kits . . . 19

2.3 Lösungen und Puffer . . . 20

2.4 Medien . . . 24

2.5 Enzyme, Proteine, Größenmarker . . . 25

2.6 Detektionsreagenzien . . . 26

2.7 Biologisches Material . . . 29

2.7.1 Zellen . . . 29

2.7.2 Bakterienstämme . . . 29

2.7.3 Viren . . . 30

2.8 Verwendete Oligonukleotide . . . 30

2.9 Verwendete Plasmide . . . 35

2.9.1 Im Labor vorhandene bzw. käuflich erworbene Plasmide . . . 35

(4)

2.9.2 Eigene Plasmide . . . 36

2.10 Geräte . . . 41

2.11 Verbrauchsmaterialien . . . 43

2.12 Verwendete Software . . . 44

3 Methoden 45 3.1 Molekularbiologische Methoden . . . 45

3.1.1 PCR gestützte Methoden . . . 45

3.1.2 Agarosegelelektrophorese . . . 48

3.1.3 Präparative Agarosegelelektrophorese . . . 48

3.1.4 Restriktionsenzymspaltung . . . 48

3.1.5 Ligation von DNA-Fragmenten . . . 49

3.1.6 Sequenzierung . . . 49

3.1.7 in vitro-Transkription . . . 50

3.1.8 Phenol-Chloroform-Extraktion . . . 51

3.1.9 Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) . . . 51

3.2 Mikrobiologische Methoden . . . 52

3.2.1 Herstellung kompetenterE.coli . . . 52

3.2.2 Hitzeschock-Transformation vonE.coli . . . 52

3.2.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien . . . 52

3.3 Zellbiologische Methoden . . . 53

3.3.1 Kultivierung von adhärenten Zellen . . . 53

3.3.2 Infektion von Zellen . . . 54

3.3.3 Transfektion von Zellen . . . 54

3.3.4 Elektroporation von Zellen mit RNA . . . 55

3.3.5 Titration von Viren . . . 55

3.3.6 Wachstumskinetik von Viren . . . 56

3.3.7 Extraktion viraler RNA aus Zellen . . . 56

3.4 Proteinanalytische Methoden . . . 57

3.4.1 Indirekte Immunfluoreszenz Analysen . . . 57

3.4.2 Durchflusszytometrische Analyse (FACS-Analyse) . . . 58

3.4.3 Biotinylierung von Proteinen . . . 59

3.4.4 Immunpräzipitation . . . 60

3.4.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) . . . 60

3.4.6 Transfer von Proteinen auf Nitrocellulose-Membranen . . . 61

(5)

3.4.7 Immundetektion der Proteine im Westernblot . . . 61

4 Ergebnisse 63

4.1 Bestimmung der intrazellulären Lokalisation von E1 und E2 . . . 63 4.1.1 Kolokalisationsexperimente mit transient exprimiertem E1 und E2 . . 64 4.1.2 Kolokalisationsexperimente mit viralem E2 . . . 68 4.2 Untersuchungen zur Lokalisation des Retentionssignals in E1 und E2 mittels

CD72-Fusionsproteinen . . . 73 4.2.1 Eingrenzung des Retentionssignals auf Ecto- oder Transmembrando-

mäne . . . 73 4.2.2 Auswirkung von Punktmutationen auf das Retentionsverhalten von

CD72-E1-Fusionsproteinen . . . 78 4.3 Auswirkung von Punktmutationen auf das Retentionsverhalten von E2 . . . . 82

4.3.1 Auswirkung von Substitution und Deletion des Arginins an Position 355 auf die Retention von E2 . . . 83 4.3.2 Auswirkung von Substitution und Deletion des Isoleucins an Position

366 auf die Retention von E2 . . . 84 4.3.3 Auswirkung von Substitution und Deletion der Glutaminsäure an Po-

sition 369 auf die Retention von E2 . . . 85 4.3.4 Auswirkung von Substitution und Deletion des Glutamins an Position

370 auf die Retention von E2 . . . 86 4.3.5 Analyse des Retentionsverhaltens ausgewählter E2-Mutanten mittels

Oberflächenbiotinylierung . . . 87 4.3.6 Analyse des Retentionsverhaltens ausgewählter Mutationen in E2 mit-

tels indirekter Immunfluoreszenz . . . 90 4.4 Auswirkung von Mutationen auf die zelluläre Lokalisation von E2 . . . 92 4.5 Auswirkung ausgewählter E2-Mutationen auf das Wachstum des BVDV-Stamms

CP7 . . . 97 4.5.1 Generierung von CP7-Virusmutanten mit ausgewählten E2 Mutationen 97 4.5.2 Charakterisierung der CP7-Virusmutanten . . . 99 4.6 Analyse der Topologie von E1 und E2 . . . 100

5 Diskussion 104

5.0.1 Subzelluläre Lokalisation der Glykoproteine E1 und E2 . . . 105 5.0.2 Retention des Glykoproteins E1 . . . 106 5.0.3 Retention des Glykoproteins E2 . . . 108

(6)

5.0.4 Topologie der Glykoproteine E1 und E2 . . . 111 5.0.5 Auswirkung ausgewählter E2-Mutationen auf das Wachstum des BVDV-

Stamms CP7 . . . 112 5.0.6 Resümee und Ausblick . . . 115

6 Zusammenfassung 117

7 Summary 118

Abbildungsverzeichnis 119

Tabellenverzeichnis 121

Literaturverzeichnis 123

Publikation 142

Danksagung 143

Anhang 144

(7)

Abkürzungsverzeichnis

A Ampere

A Adenin

Ac Acetat

Ala Alanin

Amp Ampicillin

AP Alkalische Phosphatase

APS Ammoniumpersulfat

Arg Arginin

AS Aminosäuren

Asn Asparagin

Asp Asparaginsäure

ATP Adenosintriphosphat

BHK „Baby Hamster Kidney“

bp Basenpaar

BP Blockpuffer

BSA Rinderserumalbumin

BVDV „bovine viral diarrhea virus“

bzw. beziehungsweise

C Cytosin

C Cystein

°C Grad Celsius

ca. circa

CHO Chinese Hamster Ovary

cm Zentimeter

(8)

cp zytopathogen

CPE zytopathogener Effekt

cpm Impulse („counts“) pro Minute CSFV „classical swine fever virus“

C-terminal Carboxyterminal C-Terminus Carboxyterminus

CTP Cytosintriphosphat

Cys Cystein

d Tag

D Asparaginsäure

d.h. das heißt

Da Dalton

DABCO 1,4 Diazabicyclo[2.2.2]octan

DAPI 4’,6-Diamidino-2-phenylindol-2HCl dATP Desoxyadenosintriphosphat

dCTP Desoxycytosintriphosphat

DEPC Diethylpyrocarbonat

dGTP Desoxyguanosintriphosphat

DMEM „Dulbecco’s Minimal Essential Medium“

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

DOC Desoxycholinsäure

ds doppelsträngig

dTTP Desoxythymidintriphosphat

E Glutaminsäure

EDTA Ethylendiamin-N,N,N’,N’-tetraessigsäure EMCV Encephalomyocarditis-Virus

Endo H Endoglycosidase H

ER Endoplasmatisches Retikulum

ERGIC ER Golgi Inermediäre Kompartiment

F Phenylalanin

(9)

FCS fötales Kälberserum FITC Fluoresceinisothiocyanat FLI Friedrich-Loeffler-Institut

g Gramm

g Erdbeschleunigung

G Guanin

G „gauge“ Mass für den Außendurchmesser von Kanülen

G Glycin

GAPDH Glucose-Aldehyd-Phosphat-Dehydrogenase GFP green fluorescent protein

Gln Glutamin

Glu Glutaminsäure

Gly Glycin

GTP Guanosintriphosphat

h Stunde

H Histidin

HCV Hepatitis C-Virus

HEPES N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N’-[2-ethansulfonsäure]

His Histidin

I Isoleucin

Ile Isoleucin

IRES „internal ribosome entry site“

k Kilo

K Lysin

kb Kilobasenpaare

kD Kilodalton

l Liter

L Leucin

LB Luria-Bertani

Leu Leucin

Lys Lysin

(10)

m milli

m Meter

M molar (mol/l)

M Methionin

µ mikro

m.o.i. „multiple of infection“

mAK monoklonaler Antikörper

MD „Mucosal Disease“

MDBK „Madin-Darby bovine kidney“

Met Methionin

min Minute

mio Million

MOPS 3-[N-morpholino]propansulfonsäure

MW Molekulargewicht

n nano

N Asparagin

ncp nicht zytopathogen

nt Nukleotid

N-terminal Aminoterminal N-Terminus Aminoterminus

NTP Ribonukleosidtriphosphat

NTR „non translated region“

OD optische Dichte

ORF „open reading frame“

P Prolin

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

pAK polyklonaler Antikörper

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR Polymerase-Ketten-Reaktion

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Konzentration

Phe Phenylalanin

(11)

PI Propidiumiodid

PO Meerrettich-Peroxidase

Pro Prolin

Q Glutamin

R Arginin

RNA Ribonukleinsäure

RNase Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse-Transkriptase-basierte PCR

s Sekunde

S Serin

SDS Natriumdodecylsulfat

Ser Serin

SBFP strongly enhanced blue fluorescent protein

ss einzelsträngig

T Thymin

T Threonin

TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TE Tris-EDTA-Puffer

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

TFB Transformationspuffer

Thr Threonin

TDM Trnasmembrandomäne

Tricin N-Tris(hydroxymethyl)-methylglycin Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan TRITC Tetramethylrhodaminisothiocyanat

Trp Tryptophan

Tyr Tyrosin

U Aktivitätseinheit (bei Enzymen)

(12)

u.a. und andere

UTP Uridintriphosphat

UV Ultraviolett

V Volt

V Valin

v/v Volumen pro Volumen

Val Valin

vgl. vergleiche

Vol. Volumenanteil

vs. versus

W Tryptophan

w/v Gewicht pro Volumen

Y Tyrosin

(13)

1 Einleitung

Für ihre Replikation sind Viren, die keinen eigenen Stoffwechsel besitzen, auf das zelluläre System ihres Wirts angewiesen. Die Vielfältigkeit der zellulären Organismen spiegelt sich in der großen Anzahl verschiedener Virustypen mit ihren ganz individuellen Vermehrungsstra- tegien, angepasst an den jeweiligen Wirt oder Wirte, wider. Der Grundaufbau von Virionen besteht im Wesentlichen aus viralen Strukturproteinen und Nukleinsäuren mit der Information zu ihrer Replikation und Reproduktion. Als Virion wird ein einzelnes Viruspartikel bezeich- net, welches sich außerhalb einer Zelle befindet. Schaut man sich Viren etwas genauer an, gibt es große Unterschiede im Aufbau der Virionen. Manche Viren sind zusätzlich mit einer Virus- hülle, bestehend aus viralen Membranproteinen in einer Lipiddoppelschicht, umgeben. Hier spricht man von „behüllten“ Viren. Auch in ihrer Größe (15 nm bis 440 nm) und Form (z.B.

ikosaederförmig, isometrisch, geschossförmig, pleiomorph) unterscheiden sich Viren erheb- lich. Vielseitig sind Viren auch in Bezug auf die Art ihres Genoms. Dieses besteht entweder aus RNA oder DNA, welche einzel- oder doppelsträngig, zirkulär oder linear, fragmentiert oder monopartit sein kann.

1.1 Die Taxonomie von Pestiviren

Das Genus (Gattung) Pestivirus gehört gemeinsam mit den Genera Flavivirus, Hepacivirus und Pegivirus zur Familie der Flaviviridae. Diese Klassifizierung der Flaviviridae erfolg- te auf Grund der evolutionären Verwandtschaft der Viren, welche durch Sequenzvergleiche der RNA-abhängigen RNA-Polymerase bestimmt wurde [161]. Zum Genus Flavivirus zäh- len neben dem Gelbfiebervirus, welches als Namensgeber fungiert, z.B. das „West-Nile“ Vi- rus. Das GenusHepacivirusenthält als Hauptvertreter das humane Hepatitis-C-Virus (HCV).

Das Genus Pegivirus ist das neueste Genus in der Familie Flaviviridae. Es enthält bis zum jetzigen Zeitpunkt elf Spezies, darunter das bei immunsupprimierten Menschen gefundene GB-C-Virus. Im Gegensatz zu den anderen Genera der Familie Flaviviridaefasst das Genus

(14)

Pestivirus nur tierpathogene Viren zusammen. Zu diesen auch wirtschaftlich sehr bedeuten- den Viren zählen das Virus der klassischen Schweinepest (classical swine fever virus, CSFV), das „border disease“ Virus (BDV) des Schafes und das Virus der bovinen viralen Diarrhoe 1 und 2 (BVDV-1, BVDV-2), welches Grundlage der vorliegenden Arbeit ist. Neben diesen vier klassischen Vertretern der Pestiviren werden noch weitere, neu entdeckte Viren als Pestiviren angesehen. Hierzu gehören das Virus Giraffe-1 [68], PG-2-Virus [8], atypical Pestivirus (auch HoBi-like Pestivirus) [154] und das Bungowannah Virus[86].

Abb. 1.1: Phylogenetischer Baum derFlaviviridaenach Romero-Brey and Bartenschlager [144].

(15)

1.2 Biotypen und Spezies von BVDV

BVDV wird auf Grund von Sequenz- und Antigenunterschieden in unterschiedliche Spezies eingeteilt: BVDV Typ 1 und BVDV Typ 2. BVDV Typ 1 wird dabei noch weiter in Genotyp 1a und 1b differenziert [16]. Die Sequenzhomologie zwischen CSFV und den zwei BVDV Spezies liegt zwischen 60-70 %. Zwischen den Isolaten in jeder BVDV Spezies besteht eine Homologie zwischen 80-96 %. Eine Besonderheit von Pestiviren ist zudem ihr Vorkommen in zwei Biotypen, dem zytopathogen (cp) und dem nicht-zytophathogen (ncp). Der nicht- zytopathogene Biotyp zeigt bei Infektion in Zellkultursystemen keine makro- oder mikro- skopisch sichtbaren Veränderungen in der Zellkultur [6]. Eine Infektion mit dem zytopatho- genen Biotyp dagegen führt innerhalb weniger Tage zur Vakuolisierung des Zytoplasmas, zur Kernpyknose, zur Abkugelung und letztendlich zum Absterben der Zellen durch Apoptose [98, 72, 85]. Auf Protein-Level konnte, noch bevor Sequenzdaten vorlagen, ein Marker für die zwei Biotypen etabliert werden. Während zu diesem Zeitpunkt sowohl in ncp- als auch in cp- Viren das NS2-NS3-Vorläuferprotein gefunden werden konnte, wurden NS3 nur in cp-Viren detektiert [44, 136]. Bei ncp-Viren ist die Spaltung streng geregelt und findet dadurch nur in den ersten 8h nach Infektion statt. Der für die Spaltung benötigte zelluläre Kofaktor JIV liegt in der Zelle nur in sehr geringen Mengen vor. Ist dieser aufgebraucht, wird kein, für die RNA- Replikation erforderliches, NS3 mehr nachgeliefert und die Replikation wird heruntergeregelt.

Durch diesen limitierenden Faktor pegelt sich eine Basisreplikationsrate ein, die es dem Virus erlaubt, sich in der Zelle zu vermehren, ohne dem Wirt zu schaden. Cp-Viren hingegen haben Wege gefunden NS3 unabhängig von diesem Faktor zu bilden, wodurch es zu einer unge- steuerten Replikation des Virus in den Zellen kommt. Die ungesteuerte Replikation geht mit einer großen Menge viraler RNA in den Zellen einher, was die Kapazität der immunsuppri- mierenden Maßnahmen des Virus übersteigt und letztendlich zur Zerstörung der Zelle führt.

Um vom zellulären Faktor JIV unabhängig zu werden, haben cp-Viren unterschiedliche Stra- tegien entwickelt. Einige Erreger haben den für die Interaktion wichtigen Bereich des JIVs in ihr eigenes Genom integriert, während andere Viren auf die Insertion einer Ubiquitin-Sequenz setzen. [36, 116, 117].

1.3 Infektion mit BVDV

Eine Infektion mit BVDV äußert sich in unterschiedlichen klinischen Bildern mit unterschied- lichen Schweregraden. Ausschlaggebend ist hierbei der Impfstatus des Tieres sowie der Infek-

(16)

tionszeitpunkt. Postnatale Infektionen von immunkompetenten Tieren verlaufen in 70-90 % der Fälle asymptomatisch. In seltenen Fällen kommt es zu einer Erhöhung der Temperatur, Diarrhoe und/oder Nasenausfluss [6, 17]. Nur in Extremfällen zeigt die Erkrankung von adul- ten Tieren einen schweren Verlauf. Ein Tier mit überstandener Infektion entwickelt eine le- benslange Immunität gegen Neuinfektionen. Untersuchungen haben gezeigt, dass ca. 60 % der Rinder Antikörper gegen Proteine des BVDVs aufweisen [147, 74].

In der BVDV-Infektion des adulten, immunkompetenten Rinds liegt allerdings nicht das Pro- blem, sondern bei der Infektion von trächtigen Tieren und der vertikalen Übertragung des Virus auf den Fetus. Ist das Muttertier immun oder die Trächtigkeit besteht schon länger als 120 Tage, ist auch der Fetus immunkompetent und bildet neutralisierende Antikörper zur Eli- mination des Virus [103]. Bei Infektion von seronegativen Muttertieren vor dem 120. Tag der Trächtigkeit reichen die Folgen der Infektion von Fruchttod mit Resorption, Mumifikati- on oder Abort, bis hin zur Geburt von Kälbchen mit kongenitalen Missbildungen [27, 103].

Bei der Infektion sollte zwischen cp-Viren und ncp-Viren unterschieden werden. Während die Infektion mit einem cp-Virus zu der Elimination des Virus oder einem Abort führt, kommt es bei der Infektion mit einem ncp-Virus innerhalb des ersten Trimesters der Trächtigkeit zu persistent infizierten Feten [103, 55]. Das Immunsystem des Fetus ist zu diesem Zeitpunkt noch nicht ausgereift und es kommt zu einer spezifischen Immuntoleranz gegenüber des infi- zierenden BVDV-Stamms. Die Folge ist, dass die persistent infizierten Tiere (PI-Tiere) weder Antikörper noch zytotoxische T-Zellen gegen das Virus bilden und somit einen hohen Virus- titer im Blut aufweisen. PI-Tiere scheiden Zeit ihres Lebens große Mengen Virus aus und können so andere Tiere infizieren. Die Hälfte der PI-Tiere bleiben nach der Geburt in ihrer Entwicklung zurück, die andere Hälfte erscheint jedoch zunächst gesund und lebt bis zu 24 Monate (im Einzelfall länger) vollkommen symptomfrei. Die Kälber von PI-Tieren sind wie- derum persistent infiziert. In der Population machen pi geborene Kälber 0,5-2 % aus, was zu einer ständigen Virusquelle führt, die den Bestand immer wieder aufs Neue infiziert [147, 74].

PI-Tiere erkranken meist innerhalb der ersten zwei Lebensjahre an der „Mucosal Disease“

(MD). Diese Erkrankung geht mit hochgradigen Erosionen und Ulzerationen der Schleimhäu- te des Verdauungstraktes einher und führt innerhalb von ein bis zwei Wochen nach auftreten erster Symptome zum Tode [5, 138]. Während in PI-Tieren nur der ncp-Biotyp nachgewie- sen werden kann, finden sich in MD erkrankten Tieren beide Biotypen. Beide Viren, die aus einem an MD erkrankten Tier isoliert wurden, weisen häufig eine große serologische Ähn- lichkeit auf und bilden ein sogenanntes Virus-Paar [136, 23]. Dabei kann das cp-Virus durch Mutationen aus dem im Tier vorhandenen ncp-Virus resultieren oder in seltenen Fällen durch eine Infektion von außen ins Tier gelangt sein.

(17)

Abb. 1.2: Schematische Darstellung der Übertragung von BVDV auf den Fetus.Quelle der Grafik: Universität Bern, Institut für Virologie und Immunologie, PDF:

Standortbestimmung/Bestandesabklärung BVD

(18)

1.4 Die Genomstruktur und Morphologie von Pestiviren

Alle Mitglieder derFlaviviridaeverfügen über sehr ähnliche Eigenschaften, wie die Bildung von umhüllten Viruspartikeln mit einem einzelsträngigen RNA-Genom positiver Polarität und der Genexpression mittels Translation eines einzigen langen Polyproteins [105]. Pestiviren zeigen mit den Hepaciviren eine größere Übereinstimmung in ihrer Genomstruktur und in ihrem Translationsinitiationsmechanismus als mit den Flaviviren, somit wurden sie lange Zeit auch als Modellsystem für HCV verwendet, da dieses bis 2005 nicht in Zellkultur untersucht werden konnte [24].

Die Pestiviruspartikel sind membranumhüllt, haben einen Durchmesser von 40-60 nm [115]

und bestehen aus dem Kapsidprotein sowie den drei Glykoproteinen Erns, E1 und E2. Da- bei sitzen die Glykoproteine auf bzw. in der Hüllmembran, die die Partikel umschließt. Das Kapsidprotein hingegen ist im Partikel zu finden. Das virale Genom hat eine Länge von ca.

12.300 Nucleotiden und enthält nur einen einzigen offenen Leserahmen (OLR; engl. Open Reading Frame, ORF),welcher von nicht-translatierten Regionen (NTR) am 5´- und 3´-Ende flankiert wird. Die virale RNA kann durch ihre positive Polarität direkt als mRNA fungieren.

Die Translation des aus ca. 3900 Aminosäuren bestehenden Polyproteins wird über eine IRES (interne ribosomale Eintrittsstelle) in der 5´-NTR gestartet [142]. Die Prozessierung erfolgt co- und posttranslational durch virale und wirtseigene Proteasen in die vier Strukturproteine Kapsidprotein, Erns, E1 und E2 und die Nichtstrukturproteine p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (vgl. Abb. 1.3). Innerhalb des Polyproteins sind die Strukturproteine N-terminal und die Nichtstrukturproteine C-terminal. Eine Ausnahme unter den Nichtstrukturproteinen bildet hier jedoch die Autoprotease Npro, welche direkt am Anfang des Polyproteins zu finden ist [163].

(19)

Abb. 1.3: Genomorganisation von Pestiviren:Die grafische Darstellung erfolgt vom 5´- zum 3´-Ende. Die Strukturproteine sind blau markiert, die Nichtstrukturproteine grau. Die Spaltstellen der viralen und zellulären Proteasen sind durch Pfeile markiert und farblich differenziert.

1.5 Das Strukturprotein E1

Das Glykoprotein E1 ist eines der drei Hüllproteine. E1 ist das einzige Protein bei Pestivieren für welches weder die Struktur noch die Funktion bekannt ist. Infizierte Tiere bilden keine Antikörper gegen E1 und auch die Gewinnung von Antiseren stellt in der Praxis eine große Herausforderung dar. Dieser Umstand macht die Untersuchung von E1 sehr schwierig und führte dazu, dass E1 meistens nur im Kontext mit Erns oder E2 betrachtet wird. E1 hat eine Länge von 162 Aminosäuren und wird durch die zelluläre Signalpeptidase sowohl N-terminal von Erns als auch C-terminal von E2 abgespalten (s. Abb. 1.3) [12]. Die Abspaltung Erns/E1 verläuft interessanterweise wesentlich langsamer als die Spaltung zwischen E1 und E2, was zur Folge hat, dass eine signifikante Menge an Erns-E1-Vorläuferprotein detektiert werden kann [149]. E1 verfügt über einige hoch konservierte Cysteine in seiner Sequenz, die neben intramolekularen Disulfidbrücken zur Stabilisierung des Proteins auch intermolekulare Disul- fidbrücken mit E2 ausbilden. Die E1-E2-Heterodimere sind auf der Hülle des Viruspartikels nachweisbar [50]. Die Ausbildung von E1-E2-Heterodimeren verläuft sehr langsam [149], was vermutlich in der langsamen Faltung von E1 begründet ist [19, 20]. Die Faltung von E1 wird über das Chaperon Calnexin vermittelt, wobei die transiente Interaktion über 30 min an- dauert und von der Glykosylierung von E1 abhängig ist. Die Bildung der E1-E2-Heterodimere startet erst nach korrekter Faltung von E1 [19]. In der Arbeit von Ronecker et al. [145] zeigten sich die geladenen Aminosäuren K174 und R177 als essentiell für die Bildung von Heterodi- meren mit E2. Über die Funktion des Hüllproteins E1 ist nach wie vor kaum etwas bekannt, jedoch konnte mittels Pseudotypisierung gezeigt werden, dass E1 und E2 ausreichend für die

(20)

Fusion des pseudotypisierten Virus mit der Wirtszelle sind [145, 182]. Nachdem die Kristall- struktur von E2 kein offensichtliches Fusionspeptid aufwies, wurde angenommen, dass E1 dieses beinhaltet. Über die Struktur von E1 ist ebenfalls nicht viel bekannt. Ein Blick auf die Sequenz zeigt eine lange hydrophobe Region im C-Terminus des Proteins, welche für einen Transmembrananker spricht [179, 149]. Eine genaue Voraussage der Membrantopologie ist dennoch schwierig. Bei dem nah verwandten Hepatitis-C-Virus konnte, vor der Spaltung von E1-E2, für die E1 Transmembranregion eine Haarnadel-Struktur gezeigt werden, bei der so- wohl der N- als auch der C-Terminus in das ER Lumen orientiert ist. Nach der Spaltung erfolgt ein Umklappen der Transmembranregion hin zu einem einspännigen Membrananker (Abb. 1.4 (1), (2)) [35]. Ob sich das pestivirale E1 genauso verhält, war u.a. Gegenstand dieser Arbeit.

Abb. 1.4: Schematisches Modell der Topologie der HCV Proteine E1 und E2 vor und nach der Prozessierung des Polyproteins:(1) Sowohl der N- als auch der C-Terminus des Proteins HCV-E1 ist in das ER-Lumen gerichtet und nimmt somit eine Haarnadel-Struktur ein. (2) Nach der Spaltung orientiert sich der C-Terminus in das Cytosol um. (3) Auch der C-Terminus von HCV-E2 besitzt vor der Spaltung eine Haarnadel-Struktur, die nach der Spaltung in eine einspännige Membrantopologie umklappt (4). Quelle: Cocquerel et al. [35]

1.6 Das Strukturprotein E2

Das Glykoprotein E2 hat eine Länge von 373 Aminosäuren. Neben E1-E2-Heterodimeren bildet E2 auch Homodimere [173]. Das reife E2 enthält, abhängig von der Virusspezies, 15- 17 konservierte Cysteine, mittels derer intra- und intermolekulare Disulfidbrücken gebildet werden. Des Weiteren enthält E2 drei bis sechs N-Glykosylierungsstellen, die aber weitaus weniger konserviert sind [48, 101]. Die Spaltung zwischen E1-E2 und E2-p7 erfolgt durch die zelluläre Signalpeptidase (SPase) [49, 149]. Die Spaltung zwischen E2 und p7 verläuft aller- dings nicht immer vollständig, so dass das ungespaltene E2-p7-Vorläuferprotein in infizierten Zellen detektiert werden kann [67]. Auch E2 interagiert mit Calnexin, aber im Gegensatz zu E1 läuft hier die Faltung und Dissoziation schneller ab (ca. 2,5 min). Wird die Assoziation

(21)

von E2 und Calnexin durch Verwendung einesα-Glykosidase-Inhibitors unterdrückt, kann E2 nicht korrekt gefaltet werden und auch die Interaktion von E2 mit E1 wird behindert [19].

Der C-Terminus des Proteins verfügt über einen hydrophoben Abschnitt, welcher als Mem- brananker fungiert [65]. Aber auch bei E2 ist die Topologie noch nicht abschließend geklärt.

Untersuchungen mit E2 aus Hepatitis-C-Viren zeigten für HCV-E2 eine Haarnadel-Struktur vor Abspaltung des nachfolgenden Proteins p7. Sowohl das N- als auch das C-terminale Ende zeigen vor der Abspaltung in das ER Lumen. Nach der Spaltung kommt es bei HCV-E2 zu einem Umklappen des C-Terminus ins Cytosol und somit zur Ausbildung eines einspännigen Membranankers (Abb. 1.4 (3), (4)) [35]. In der Arbeit von Köhl et al. [87] konnte gezeigt werden, dass der Transmembrananker die Retention E2s in der Zelle vermittelt. Maßgeblich beteiligt an diesem Prozess ist das Arginin an Position 355 in E2, da eine Deletion dieser Aminosäure zur Expression des Proteins auf der Zelloberfläche führt [87]. Auch für die He- terodimerisierung mit E1 ist das Arginin 355 (E2) unerlässlich [145]. Das Glykoprotein E2 ist das Haupttarget für neutralisierende Antikörper im infizierten Tier [186, 134]. Im Repli- kationszyklus dient E2 als Rezeptor-bindendes Protein und sorgt somit für die Bindung des Virions an den zellulären Rezeptor. Der Eintritt von Pestiviren unterliegt wahrscheinlich einem Prozess mit mehreren Schritten. In der Arbeit von Schelp et al. [153] konnte, für BVDV, CD46 als Rezeptor identifiziert werden, jedoch gibt es Hinweise, dass CD46 nicht alleine für eine erfolgreiche Infektion ausreicht und noch weitere Rezeptoren beteiligt sein könnten [111].

1.7 Weitere pestivirale Proteine

Npro

Die Autoprotease Nproist 168 Aminosäuren lang. Nproist das einzige pestivirale Protein, wel- ches nicht essentiell für das Virus ist. Dennoch führt seine Deletion zu einem zwar infektiösen, aber attenuierten Virus [11, 175, 112, 120]. Npro spielt außerdem eine wichtige Rolle bei der Blockade des angeborenen Immunsystems des Wirts [148, 92, 70].

Kapsidprotein C

Das Kapsidprotein C (abgeleitet von dem engl. „core“) mit einer Länge von 99 Aminosäuren ist das erste der vier nun folgenden Strukturproteine. Am Ende des Kapsidproteins befindet sich eine Signalsequenz, welche die Translokation der nachfolgenden Abschnitte des Polypro- teins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) initiiert. Das reife Kapsidprotein umhüllt die virale RNA nicht wie bei anderen Viren, sondern ist lose mit dieser assoziiert, was

(22)

durch einen hohen Anteil an basischen Aminosäuren unterstützt wird [129, 81].

Erns

Das Glykoprotein Erns stellt das erste Hüllprotein im pestiviralen Polyprotein dar und besitzt eine Reihe ungewöhnlicher Eigenschaften. Erns ist exklusiv in Pestiviren zu finden [105, 162].

Erns hat eine Länge von 227 Aminosäuren und kommt in Homodimeren vor. Ungewöhnlich an Erns ist zum einen seine intrinsische RNase-Aktivität sowie die Tatsache, dass Erns zu et- wa 10 % sezerniert wird [149]. Aus diesen Eigenschaften ergibt sich auch der Namenszusatz

„rns“, welcher dem englischen „RiboNucleaseSecreted“ entstammt. Im Gegesatz zu den an- deren beiden Hüllproteinen E1 und E2 besitzt Erns keinen Transmembrananker, sondern ist über eine lange amphipathische Helix am C-Terminus an die Membran gebunden [51, 171].

Intrazelluläres Erns wird vornehmlich im ER zurückgehalten. Verantwortlich hierfür zeigten sich drei hydrophobe Aminosäuren (L138, I190, L208) im C-Terminus des Proteins [25]. Erns stellt außerdem neben E2 ein pestivirales Antigen dar. In infizierten Tieren konnten neutrali- sierende Antikörper gegen Erns nachgewiesen werden, deren neutralisierende Wirkung jedoch geringer als die der gegen E2 gerichteten Antikörper ist [187].

p7

Das Nichtstrukturprotein p7 schließt sich im Polyprotein an die Strukturproteine an und wird ebenfalls durch die zelluläre SPase freigesetzt [49]. Möglicherweise ist p7 an der Ausschleu- sung von Viruspartikeln aus der Zelle beteiligt, denn es wird angenommen, dass es sich bei p7 um ein Viroporin handelt, welches in der Membran oligomerisiert und dadurch Ionen- kanäle bildet [67, 59, 131, 97]. Betrachtet man alle veröffentlichten Arbeiten zu p7 aus HCV und Pestiviren gemeinsam, zeigt sich p7 als wichtiger Faktor, um den pH-Wert in intrazel- lulären Vesikeln zu erhöhen, was für den letzten Schritt im Virus-Assembly unerlässlich ist [84, 164, 192].

NS2 und NS3

N2 hat eine Länge von 457 Aminosäuren, während N3 683 Aminosäuren lang ist. NS2 spaltet sich autoproteolytisch vom NS2-NS3-Vorläuferprotein ab. Diese Abspaltung ist ausschlag- gebend für die virale RNA-Replikation sowie der Ausbildung des Biotypens (s. Abschnitt 1.2). Die NS3-Serinprotease mit dem Kofaktor NS4A ist verantwortlich für die Spaltung der nachfolgenden Nichtstrukturproteine (NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) [190]. Diese Spaltun- gen sind nicht immer vollständig, so dass verschiedene intermediäre Spaltprodukte detektiert werden können, wie ein NS4A-NS4B-, NS4B-NS5A- oder ein NS5A-NS5B-Vorläuferprotein

(23)

[95, 36]. Im C-terminalen Bereich des Proteins ist die Helikase sowie die NTPase lokalisiert [60]. Beide Funktionen stellen einen essentiellen Faktor in der Replikation viraler RNA dar [184, 183, 61].

NS4A

Neben der Funktion als Kofaktor für NS3 konnte durch Komplementationsexperimente auch eine essentielle Rolle in der Virion Morphogenese für NS4A festgestellt werden [2, 102, 127].

NS4B

NS4B ist ein essentieller Faktor in der pestiviralen RNA-Replikation, der bis jetzt aber wenig untersucht ist [62]. Es wird aber angenommen, dass NS4B ein integrales Membranprotein in intrazellulären Membranen ist [189].

NS5A

Bei Pestiviren ist NS5A Bestandteil des Replikationskomplex und ist für die Replikation vira- ler RNA essentiell [11]. Die Replikation wird vermutlich über eine Interaktion mit der 3´NTR des pestiviralen Genoms sowie einer Region in NS5B, welche eine RNA-abhängige RNA- Polymerase-Aktivität aufweist, reguliert [28, 62, 158, 159]. Dong and Tang [42] konnten dar- über hinaus zeigen, dass NS5A den NF-κB-Signalweg in porcinen aleveolaren Makrophagen inhibieren kann und somit die Konzentration von inflammatorischen Zytokinen beeinflusst.

NS5B

NS5B zeigt Sequenzcharakteristika einer RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) und be- sitzt auchin vitroPolymeraseaktivität [196]. NS5B ist essentiell für die virale RNA-Replikation [166, 11] und ist außerdem an der Morphogenese pestiviraler Virionen beteiligt [4]. Der in- hibitorische Effekt auf die virale Translation durch NS5A kann durch Bindung von NS5B an NS5A unterdrückt werden [158].

1.8 Virale Replikation

Die Bindung von BVDV (Attachment) an die Wirtszelle und das Eindringen (Penetration) er- folgen über rezeptorvermittelte, Clathrin-abhängige Endozytose. Bei diesem Schritt sind die viralen Glykoproteine Erns und E2 sowie unter anderem der zelluläre Rezeptor CD46 betei- ligt [80, 111]. Die anschließende Freisetzung der viralen RNA aus dem Kapsid ist ein pH- abhängiger Schritt [43]. Die nun folgende Translation der viralen RNA sowie die Spaltung

(24)

des Polyproteins wurden bereits in den vorherigen Abschnitten beschreiben. Die für die Re- plikation benötigten Proteine bilden nachfolgend den Replikationsapparat aus. Hier wird zu- nächst Minusstrang-RNA synthetisiert, die als Matrize für die Plusstrang-RNA dient [58]. Die Detektion von neusynthetisierter RNA ist frühestens sechs Stunden nach Infektion möglich, dabei wird angenommen, dass 10-15 mal mehr Plusstrang-RNA als Minusstrang-RNA gebil- det wird [11, 58, 125]. Über die nächsten Schritte der viralen Replikation ist bis lang nicht viel bekannt. Durch welches Signal die Verpackung der viralen RNA in das Kapsid gestartet wird, bleibt zu untersuchen. Die Entstehung der Virushülle (Knospung/Budding) sowie die Freiset- zung der Virionen stellen die letzten Schritte der Virusvermehrung dar. Die Aufgabe der Hüll- proteine bei der Entstehung neuer Virionen ist weitgehend unbekannt. Lokalisationsanalysen legen allerdings nahe, dass die pestiviralen Hüllproteine vorwiegend im ER zurückgehalten werden [149, 87, 139, 25]. Neuere Ultrastrukturuntersuchungen von Schmeiser et al. [155]

mit dem Pestivirusstamm Giraffe-1 zeigten, dass die Knospung an intrazellulären Membranen stattfindet. Zuvor vermuteten bereits Grummer et al. [65], dass sich die Hüllproteine für die Knospung in den Membranen des rauen ERs anreichern. Eine Knospung von Pestiviren an der Zellmembran gilt als unwahrscheinlich, da die Strukturproteine nicht an der Zellmembran nachgewiesen [188] werden konnten und Ohmann [133] zeigten, dass die Knospung häufig an intermediären Kompartimenten wie dem ER oder dem Golgi-Apparat stattfindet. Die Aus- schleusung der reifen Virionen geschieht exozytotisch über das zelluläre Transportsystem.

(25)

Abb. 1.5: Grafische Abbildung des Replikationszyklus von Pestiviren an Hand der Replikation von CSFV.Im ersten Schritt (a) kommt es zur Anheftung des Virus an die Zielzelle. Hierbei interagiert eines der Oberflächenproteine mit einem Oberflächenrezeptor der Wirtszelle.

Nach der Rezeptor-vermittelten Endozytose (b) wird die virale RNA freigesetzt (c). Diese RNA dient zum einen als mRNA für die Translation des Polyproteins (d) sowie als Ausgangsmaterial für die RNA Replikation (e). Nach erfolgreicher Spaltung des Polyproteins (d) lagern sich die, für das Virion benötigten, viralen Proteine sowie die neusynthetisierte virale RNA zusammen (Assambly, (f)). Die Reifung und der Transport des Virions aus der Wirtszelle geschieht anschließend entlang des zellulären Transportsystems (f, g). Quelle der Grafik: Ji et al. [83]

(26)

1.9 Sortierung von Proteinen in intrazellulären Membransystemen

In allen eukaryotischen Zellen gibt es Kompartimente, die durch Membranen unterteilt sind und spezifische Aufgaben ausüben. Für die reibungslose Funktion der Zelle ist es notwendig, dass bestimmte Proteine und Lipide gezielt an ihren Bestimmungsort transportiert werden.

Zytoplasmatische Proteine werden meist an freien Ribosomen des Zytoplasmas synthetisiert und können sich nachfolgend frei in diesem verteilen (Abb. 1.6 (2), (4)). Im Gegensatz dazu werden Proteine, die an den Ribosomen des rauen ERs synthetisiert werden cotranslational in das Lumen des ERs geleitet (Abb. 1.6 (1), (3)) . Sekretorische Proteine wie beispielswei- se lysosomale, vakuoläre und residente Proteine des Endomembransystems verbleiben jedoch nicht im ER, sondern werden je nach Funktion zu den entsprechenden Zielorganellen trans- portiert (Abb. 1.6 (5)) [151, 180, 77]. Der sekretorische Weg wird von vielen Proteinen in der Zelle verwendet. Nach Eintritt in das ER und auf dem Transport entlang des sekretorischen Wegs wird eine Modifikation und Sortierung der Proteine vorgenommen. Für die intrazellulä- re Sortierung der Proteine gibt es drei Möglichkeiten: (1) Proteine mit einem Retentionssignal verbleiben in dem für ihr Signal spezifischen Zellorganell. (2) Andere Proteine werden auf dem sekretorischen Weg zunächst Richtung Plasmamembran transportiert und anschließend über einen Rückhol-Mechanismus (retrieval) in das jeweilige Zielkompartiment zurückge- bracht [169, 57, 135]. Eine klare Abgrenzung zwischen Retention und Rückhol-Mechanismus ist allerdings nicht immer möglich, da die Übergänge oft fließend sind. (3) Die dritte Mög- lichkeit bietet die Diffusion des Proteins entsprechend seiner Umgebungskonzentration. Dies geschieht passiv in die Transportvesikel und sofern kein Sortierungssignal vorhanden ist, ge- langt das Protein so an die Zelloberfläche (Membranproteine) oder wird sekretiert [146]. Das Aussehen der spezifischen Sortierungs-, Retentions- und Rückholsignale ist vielfältig und ab- hängig vom Zielorganell. Bisher identifizierte Sortierungssignale sind meistens kurze Peptid- domänen von 4-25 Aminosäuren oder konformationsabhängige Strukturen. Des Weiteren ist es möglich, dass Proteine mehrere Sortierungssignale enthalten, die in ihrer Gesamtheit oder aufeinanderfolgend durch Prozessierung zur korrekten Lokalisation der Proteine beitragen [26, 78, 82]. Im ER lokalisierte Typ-I Transmembranproteine besitzen meist ein Dilysin-Motiv (-KKXX, -RKXX, -KXKXX, und -RXKXX) im cytosolischen C-Terminus [160], während luminale ER Proteine oftmals eine KDEL-Sequenz besitzen [128]. Beide Sequenzen sorgen hierbei durch Interaktionen mit spezifischen Rezeptoren für einen Rücktransport der Proteine aus dem Golgi-Apparat durch Coatomere [160, 99]. Des Weiteren wurde von Schutze et al.

(27)

[156] für Typ-II Transmembranproteine ein Diarginin-Motiv im cytosolischen N-Terminus als Rückholsignal identifiziert. Die Sortierung in post-Golgi-Kompartimente erfolgt oftmals durch ein Tyrosin-Signal (GYxxZ, Z= hydrophobe AS) [110]. Der Transport zu apikalen Zel- loberflächen wird durch C-terminale Glykophosphatidyl-Inositol-Anker (GPI-Anker) vermit- telt [52, 40].

Abb. 1.6: Schematische Darstellung der Sortierung von Proteinen innerhalb der Zelle:Die Translation der mRNA geschieht entweder an den Ribosomen des rER (1) oder den freien Ribosomen im Zytoplasma (2). Die ER-Signalsequenz vermittelt den Transport des Proteins in das ER (3), anschließend erfolgt, entlang des sekretorischen Wegs, eine Modifikation des Proteins sowie der Transport an den entsprechenden Zielort (z.B. ER, Golgi,

Plasmamembran) (5). Proteine, die an den freien Ribosomen synthetisiert wurden, verbleiben hingegen im Zytoplasma oder werden entsprechend ihrer Signalsequenzen in den Zellkern, die Mitochondrien oder in die Peroxisomen transportiert (4). Quelle der Grafik: Horn [73]

(28)

1.10 Fragestellung der Arbeit

Zum heutigen Zeitpunkt gibt es nur wenige Informationen über die späten Abschnitte des pes- tiviralen Replikationszyklus. Frühere Untersuchungen zeigten, dass Ernsund E2 nicht auf der Zelloberfläche zu finden sind. Daraus zog man den Schluss, dass die pestiviralen Glykoprotei- ne intrazellulär zurückgehalten werden und auch der Prozess der Knospung an intrazellulären Membranen stattfinden muss. Die Knospung (Budding) ist der Moment im Replikationszy- klus, in dem das Virion seine Hülle erhält. Da auf dem reifen Virus die Glykoproteine in der Hüllmembran verankert sind, ist davon auszugehen, dass diese zum Zeitpunkt der Knospung in der zellulären Membran (an der die Knospung stattfindet) angereichert sind. Ziel dieser Arbeit war die genauere Charakterisierung der Glykoproteine E1 und E2 hinsichtlich ihrer intrazel- lulären Lokalisation, ihres Retentionssignals und ihrer Topologie. Für E2 konnte bereits durch andere Arbeitsgruppen eine wahrscheinliche Lokalisation im ER gezeigt werden und auch die Retention konnte auf die C-terminalen Region des Proteins zurückgeführt werden. Von beson- derer Bedeutung ist hierbei das Arginin an Position 355 in E2. In dieser Arbeit wurde zunächst die Kolokalisation der viralen Proteine mit Kompartimentmarkerproteinen mittels indirekter Immunfluoreszenz ermittelt. In nachfolgenden Analysen wurden die an der Retention beteilig- ten Regionen eingegrenzt und einzelne Aminosäuren auf ihre Beteiligung an der Retention hin untersucht. Zur Analyse der Membrantopologie wurden Tag-markierte Proteinvarianten in der indirekten Immunfluoreszenz mit selektiver Permeabilisierung der Zellmembran verwendet.

(29)

2 Material

2.1 Chemikalien

Sämtliche in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien wurden in Analysenqualität bezogen.

Aceton Roth, Karlsruhe

Acridinorange Serva, Heidelberg

Acrylamid (40 %) (29:1) AppliChem, Darmstadt

Agarose Gibco, Schottland

Ampicillin Roth, Karlsruhe

APS Merck, Darmstadt

Bacto-Agar Becton Dickinson, USA

Bacto-Hefeextrakt Becton Dickinson, USA

Bacto-Trypton Becton Dickinson, USA

Bis-Tris Sigma, München

Borsäure Roth, Karlsruhe

Bromphenolblau GE Healthcare, Freiburg

BSA (Fraktion V) Roche, Mannheim

CaCl2 Roth, Karlsruhe

Complete Inhibitor Roche, Mannheim

Coomassie Brilliant Blue G250 Serva, Heidelberg

DABCO Roth, Karlsruhe

DAPI Serva, Heidelberg

DEPC Sigma, München

Digitonin Serva, Heidelberg

dNTPs New England BioLabs, Frankfurt

(30)

DOC Sigma, München

DTT Roche, Schweiz

EDTA Roth, Karlsruhe

Esel Serum abcam, England

Essigsäure Hoechst, Dortmund

Ethanol Rothe, Karlsruhe

FCS Biochrom, Berlin

GelRed Phenix Research, USA

Glukose Merk, Darmstadt

Glycin Roth, Karlsruhe

Glycerol (87 %) Roth, Karlsruhe

Harnstoff Roth, Karlsruhe

H3PO4 Roth, Karlsruhe

HCl Roth, Karlsruhe

HEPES Sigma, München

KAcetat Roth, Karlsruhe

KCl Roth, Karlsruhe

KH2PO4 Roth, Karlsruhe

Magermilchpulver Hobbybäcker Versand, Bellenberg

Methanol Roth, Karlsruhe

β-Mercaptoethanol MP Biomedicals, Heidelberg

MgCl2 Merck, Darmstadt

MgSO4 Roth, Karlsruhe

Mowiol 4-88 Roth, Karlsruhe

NaAcetat Roth, Karlsruhe

NaCl Roth, Karlsruhe

Na2CO3 Roth, Karlsruhe

Na2HPO4 Roth, Karlsruhe

NaOH Roth, Karlsruhe

Orange G Sigma, München

Paraformaldehyd Sigma, München

(31)

Phenol, Tris-gesättigt Roth, Karlsruhe

Propidiumiodid-Lösung Sigma, München

PMSF Böhringer, Mannheim

Saponin Roth, Karlsruhe

SDS Roth, Karlsruhe

Sucrose Roth, Karlsruhe

TEMED Serva, Heidelberg

Tris Invitrogen, USA

Tricin Roth, Karlsruhe

Triton-X100 Sigma, München

Tryptan blue stain Gibco, USA

Tween-20 Sigma, München

Tab. 2.1: Verwendete Chemikalien

2.2 Verwendete Kits

BigDye® Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Weiterstadt Quiagen® OneStep RT-PCR Kit Quiagen, Niederlande

RiboMAX Large Scale RNA Production System- T7 Promega, Mannheim Nucleo-Spin®-Gel and PCR clean- up Macherey-Nagel, Düren

Nucleobond® Xtra Midi Kit Macherey-Nagel, Düren

Trizol®Reagent ambion RNA, USA

Tab. 2.2: Verwendete Kits

(32)

2.3 Lösungen und Puffer

Die Lösungen wurden in demineralisiertem Millipore-Wasser angesetzt.

Blockpuffer (Biotinylierung) 0,6 % BSA in PBS

Blockpuffer (IF) 10 % Esel Serum

in PBS

Blockpuffer (Westernblot) 5 %(w/v) Magermilchpulver in PBS-T

Coomassie-Stock 50 % (v/v) Methanol

10 % (v/v) Essigsäure

0,25 % (w/v) Coomassie blue

Digitonin-Lösung 20 mM HEPES (pH 6,9)

0,3 M Sucrose

0,1 M KCl

2,5 mM MgCl2

1,0 mM EDTA

5 µl/ml Digitonin

DNA-Probenpuffer (5x) 0,125 % (w/v) Orange G

15 % (w/v) Ficoll 400

5x TAE

Entfärbelösung 20 % (v/v) Methanol

3 % Glycerol

Fixierlösung 30 % (v/v) Methanol

(33)

10 % (v/v) Essigsäure

Jagow-Anodenpuffer (10x) 2 M Tris (pH 8,9)

Jagow-Gelpuffer (3x) 3 M Tris (pH 8,45)

0,3 % (w/v) SDS

Jagow-Kathodenpuffer(10x) 1 M Tris

1 M Tricin

1 % (w/v) SDS

pH 8,25

Lämmli-Puffer 0,25 M Tris

1,925 M Glycin

pH 8,3

Minipräp-Lösung 1 50 mM Tris

10 mM EDTA

50 mM Glucose

pH 8,0

Minipräp-Lösung 2 0,2 M NaOH

1 % (v/v) Triton-X100

Minipräp-Lösung 3 3 M NaAcetat (pH 4,8)

Mowiol-DAPI 6 g Mowiol

6 ml Aqua bidest.

12 ml 0,2 M TRIS Puffer (pH 8)

0,1 % DABCO

0,2 % DAPI

(34)

PBS 0,5 mM MgCl2

0,9 mM CaCl2

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

7,4 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2PO4

PBS-A 137 mM NaCl

2,7 mM KCl

7,4 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2PO4

PBS-Tween 0,2 % (v/v) Tween-20

in PBS-A

4 % PFA 4 % (w/v) Paraformaldehyd

in PBS-A

SDS-Probenpuffer 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8)

2 % (w/v) SDS

10 % (v/v) Glycerol

6 M Harnstoff

5 % (v/v) β-Mercaptoethanol

0,01 % (w/v) Brpmphenolblau

0,01 % (w/v) Phenolrot

SDS-PAGE-Sammelgel 0,075 % (w/v) SDS

10 % (w/v) Acrylamid (29:1)

0,75 M Tris-HCl (pH 8,45)

0,08 % (w/v) APS

(35)

0,09 % (w/v) TEMED

SDS-PAGE-Trenngel 0,1 % (w/v) SDS

8 %, 10 % oder 16 % (w/v) Acrylamid (29:1)

1 M Tris-HCl (pH 8,45)

5,5 % Glycerol

0,08 % (w/v) APS

0,09 % (w/v) TEMED

TAE-Puffer 40 mM Tris

5 mM NaAcetat

1 mM EDTA

pH 7,8

TFB I 30 mM KAc (pH 5.8)

50 mM MnCl2

10 mM CaCl2

100 mM RbCl

15 % (v/v) Glycerol

TFB II 10 mM MOPS

75 mM CaCl2

10 mM RbCl

15 % (v/v) Glycerol

TGG 2 % BSA 9 % (w/v) Glucose

2 % BSA

in PBS

Transferpuffer (Westernblot) 18 % (v/v) Methanol in Lämmlipuffer

(36)

Zell-Lysis-Pffer 1 % (v/v) Triton-X100

2 mM EDTA

in PBS

Tab. 2.3: Puffer und Lösungen

2.4 Medien

Käuflich erworbene Medien

ZB5d Zellbank FLI Insel Riems

Bestandteil pro Liter

MEM Eagle (Hank’s Salze, Sigma M4642) 5,32 g MEM (Earles’ Salze, Gibco/Invitrogen 61100) 4,76 g

NaHCO3 (Roth 6885.1) 1,25 g

NEA (Biochrom K 0293, 100x) 10 ml

Na-Pyruvat (Merck 1.06619) 120 mg

ZB5 Zellbank FLI Insel Riems

Bestandteil pro Liter

MEM Eagle (Hank’s Salze, Sigma M4642) 5,32 g MEM (Earles’ Salze, Gibco/Invitrogen 61100) 4,76 g

NaHCO3 (Roth 6885.1) 1,25 g

NEA (Biochrom K 0293, 100x) 10 ml

Na-Pyruvat (Merck 1.06619) 120 mg

FCS 100 ml

(37)

OPTIMEM Gibco, USA

HBSS Gibco, USA

Tab. 2.4: Käuflich erworbene Medien

Selbst hergestellte Medien

LB-Agarplatten 1,5 % Agar

in LB-Amp-Medium

LB-Amp-Medium 100µg/ml Ampicillin

in LB-Medium

ΨB-Medium 10 mM KCl

20 mM MgSO4

in LB-Medium

LB-Medium 10 g Bacto-Trypton

5 g Bacto-Yeast-Extrakt

5 g NaCl

ad 1 l Aqua bidest.

Tab. 2.5: Selbst hergestellte Medien

2.5 Enzyme, Proteine, Größenmarker

Reagenz Firma

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs Inc., Frankfurt Phusion High Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs Inc., Frankfurt

(38)

T4 DNA Ligase New England BioLabs Inc., Frankfurt Restrictionsenzyme New England BioLabs Inc., Frankfurt

RNase Serva Electrophoresis, Heidelberg

Proteinase K New England BioLabs Inc., Frankfurt

Lipofectamin 2000 Invitrogen, USA

ExGen 500 Biomol, Hamburg

1 Kb plus DNA Ladder Invitrogen, USA

PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Scientific, USA

0,5- 10 Kb RNA Ladder Invitrogen, USA

SepharoseA GE Healthcare, Freiburg

Tab. 2.6: Enzyme, Proteine, Größenmarker

2.6 Detektionsreagenzien

Bezeichnung Antigen Wirt Verdünnung/

Menge

Herkunft

Primäre Antikörper BVDV-Mix

aus 4 mAk:

1a16, 1b8,1b31,D5

E2 Maus IF 1/10

IP 100µl FACS 1:10

Weiland

f48 E2 Maus IF 1:10 Weiland

WB214 E2 Maus WB 1:250 Weybridge,

England

WB210 Erns Maus IF 1:100 Weybridge,

England α-Code4 NS3 Maus IF 1:3 FLI-Tübingen α-CD72 [3F3] CD72 Maus IF 1:100

FACS 1:750 IP 0,25µl

Abcam, England

α-CD72 [H96] CD72 Kaninchen WB 1:500 Santa Cruz

Biotechnology Inc., USA

(39)

Bezeichnung Antigen Aus Verdünnung/

Menge

Herkunft

α-Flag Flag-Tag Kaninchen IF 1:100 WB 1:1000

Sigma-Aldrich, USA

α-Flag M2 Flag-Tag Maus IF 1:100 IP 0,25µl

Sigma, USA

α-V5 V5-Tag Kaninchen IF 1:100

WB 1:500

Invitrogen, USA

α-AU1 AU1-Tag Kaninchen IF 1:100 WB 1:1000

Abcam, England

α-Calnexin Calnexin Kaninchen IF 1:200 Sigma-Aldrich, USA α-Giantin Giantin Kaninchen IF 1:200 Abcam, England α-ERGIC ERGIC-53 Maus IF 1:100 Enzo Life Science,

Lörrach

α-GFP GFP Ziege IF 1:100 Sicgen Antibodies, Portugal

Sekundär Antikörper

α-Maus-FITC Maus-IgG Ziege IF 1:100 FACS 1:100

Dianova, Hamburg α-Maus-

Alexa-Fluor-448

Maus-IgG Esel IF 1:250 Thermo Scientific, USA

α-IgG1-Cy3 Maus-IgG1 Ziege IF 1:250 Dianova, Hamburg α-IgG2a-

Alexa-Fluor-488

Maus-IgG2a Esel IF 1:250 Thermo Scientific, USA

α-Kaninchen- Alexa-Fluor-555

Kaninchen- IgG

Esel IF 1:250 Thermo Scientific, USA

α-Ziege-

Alexa-Fluor-555

Ziegen-IgG Esel IF 1:250 Thermo Scientific, USA

α-Maus-PO Maus-IgG light chain

Ziege WB 1:10000 Dianova, Hamburg

(40)

Bezeichnung Antigen Aus Verdünnung/

Menge

Herkunft

α-Kaninchen-PO Kaninchen- IgG

light chain

Maus WB 1:10000 Dianova, Hamburg

Sonstiges EZ-Link

Sulfo-NHS-Biotin

Lysin 1:500 Thermo Scientific,

USA

Avidin-PO Biotin WB 1:5000 Invitrogen, USA

GelRed Nucleic Acid Stain

Nukleinsäuren 300µl/l Biotrend Chemikalien, Köln

SuperSignal West Pico

Chemiluminescent Substrate

HRP 1:1 Thermo Scientific,

USA

Tab. 2.7: Detektionsreagenzien

(41)

2.7 Biologisches Material

2.7.1 Zellen

Für die transiente Expression von Proteinen sowie für die Kultivierung von Viren wurden die folgenden eukaryotischen Zelllinien verwendet:

Bezeichnung Tierart Gewebe Herkunft

BHK21 Goldhamster

Mesocricetus auratus

Niere T. Rümenapf

CHO Zwerghamster

Cricetulus barabensis griseus

Ovar Zellkultursammlung FLI

MDBK-B2 Hausrind

Bos primigenus taurus

Niere Zellkultursammlung FLI

Tab. 2.8: Verwendete Zellen

2.7.2 Bakterienstämme

Für die Amplifikation der Plasmide wurden Bakterien der StämmeE.coliHB101 und Top10F’

verwendet.

HB101-Genotyp: supE44, ∆ (mcrC-mrr), recA13, ara-14, proA2, lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5,mtl-1,leuB6,thi-1

Top 10 F’-Genotyp: mcrA, ∆(mcrBC-hsdRMS-mrr), end A1, recA1, relA1, gyrA96, Φ 80lacZ ∆ M15, deoR, nupG, araD139, F(lacIq, Tn10(Tetr)), galU, ∆ lacX74, galK, ∆(ara- leu)7697

(42)

2.7.3 Viren

Stamm Herkunft

BVDV CP7 erhalten von Dr. EJ Dubovi

BVDV KE9 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

BVDV Oregon Virussammlung FLI Tübingen

BVDV NewYork´93 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

BVDV 296 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

Tab. 2.9: Verwendete Viren

2.8 Verwendete Oligonukleotide

Die verwendeten Oligonukleotide für PCR und Sequenzierungen wurden von Metabion (Mün- chen) bezogen und vom Hersteller frei von Schutzgruppen, voll entsalzt und lyophilisiert ge- liefert. Standardmäßig wurde eine Stammlösung der Oligonukleotide mit einer Konzentration von 0,1 nmol/µl hergestellt. Daraus wurden anschließend Gebrauchslösungen mit einer Kon- zentration von 10 pmol/µl angesetzt. Aufgeführt sind die Sequenzen der Oligonukleotide in 5’

-3’ Richtung.

Klonierungsprimer CR28 SS-Ernsforward

gctacagTCTAGAatgGAGAAAGCCCTATTGGCCTG CR29 SS-Ernsreverse Fusion E1

CTTCCGTTCTACCTCACAATAGGGAGAGGCTCCCATTGTGACTTGAAAGA CR30 E1 forward Fusion SS-Erns

GCCCTGGTTTTCTTTCAAGTCACAATGGGAGCCTCTCCCTATTGTGAGGT CR31 E1 reverse

gctcaggGCGGCCGCtcaCCCTTGCGCCCCTGTTATGAGC CR32 E1-V5 reverse

cgtgcgGCGGCCGCtcaggtgctatccaggcccagcagcgggttcggaatcggtttgccCCCTTGTCGC CCTGTTATGAGCATCAGCC

CR33 SS-E2 forward

(43)

ggctacgTCTAGAatgACCACTGCATTCTTGGTTTG CR34 E2 reverse

ggtcagGCGGCCGCtcaACCCGAGGCCATCTGTTCTG CR35 E2-Au1 reverse

ccgtaggGCGGCCGCtcagatgtatcggtacgtgtcACCCGACCTCATCTGTTCTGATAA GATCATG

CR36 E1-V5 reverse Fusion E2

CCCTTGCGCCCCggtgctatccaggcccagcagcgggttcggaatcggtttgccCCCTTGTCGCC CTGTTATGAGCATCAGCC

CR37 E2 forward Fusion V5-E1

CGACAAGGGggcaaaccgattccgaacccgctgctgggcctggatagcaccGGGGCGCAAGGGTA CCCAGACTGCAAACCCGG

CR50 CD72 forward XbaI

TCTAGAATGGCTGAGGCCATCACCTATG CR51 CD72 reverse KasI NotI

TCGAAGCGGCCGCgactcAggcgccATCTGGAAACCTGAAAGCTG CR52 E2 forward KasI

CCAGATggcgccTACCCAGACTGCAAACCCGG CR53 E2 Ectodomain reverse NotI

CGAAGCGGCCGCtcaCAACAGGGACTCAGCGAAGTAATC CR54 E2 TMD reverse NotI

CGAAGCGGCCGCtcaACCCGAGGCCATCTGTTCTG CR55 E2 TMD forward KasI

CCAGATggcgccGTGATAGTAGTTGCACTCCTG CR104 E1 forward KasI

CCAGATggcgccGCCTCTCCCTATTGTG CR105 E1 Ectodomain reverse NotI

CGAAGCGGCCGCtcaAGCAGCGGTCCAAATGCG CR106 E1 TMD forward KasI

CCAGATggcgccACCACTGCATTCTTGG CR116 E1 TMD180-195 reverse NotI

CGAAGCGGCCGCtcaTTGGCCTCTCACTACCTTCACC

(44)

CR117 E1 Ectodomain mit Überhang zu E1 TMD180-195 reverse

GAGCATCAGCCACAGTATACCTTGTAACACTGTAGCAGCGGTCCAAATGC CR118 E1 TMD180-195 mit Überhang zur E1 Ectodomain forward

GATCTGACGCGCATTTGGACCGCTGCTACAGTGTTACAAGGTATACTGTG CR120 E2 TMD361-374 reverse NotI

CGAAGCGGCCGCtcaCAGCCAAAGCACGTACCTGC CR121 E2 Ectodomain mit Überhang E2 TMD361-374

CTGTTCTGATAAGATCATGTATGTGACCAGCAACAGGGACTCAGCGAAGT CR122 E2 TMD361-374 mit Überhang E2 Ectodomain forward

CACCGAGATTACTTCGCTGAGTCCCTGTTGCTGGTCACATACATGATCTT CR172 pCite- SS-Erns forward NcoI

gctacagCCATGGATGGAGAAAGCCCTATTGGCCTG CR173 pCite E1-V5 reverse

gctacagCTCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGC TTACCCCCTTGTCGCCCTGTTATGAGCATCAGCC

CR174 pCite-SSE2 forward

gctacagCCATGGATGACCACTGCATTCTTGGTTTGTCTG CR175 pCite-E2-V5 reverse

gctacagCTCGAGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGCT TACCACCCGACCTCATCTGTTCTGATAAGATCATG

CR177 E1 reverse XmaI

gctacagCCCGGGTCACCCTTGCGCCCCTGTTATGAGCAT CR179 SS-Ernsforward XhoI

gctacagCTCGAGATGGAGAAAGCCCTATTGGCCTGGGCA CR180 SS-Erns-Flag reverse (Fusionsprimer)

TTTATCATCATCATCCTTATAATCTCCCATTGTGACTTGAAAGA CR181 Flag-E1 forward (Fusionsprimer)

GATTATAAGGATGATGATGATAAAGCCTCTCCCTATTGTGAGGTAGAA CR182 E1-V5 reverse XmaI

gctacagCCCGGGTCACGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTAGGGATAGGC TTACCCCCTTGTCGCCCTGTTATGAGCATCAGCC

(45)

Quickchangeprimer TMD E2

CR59 E2 355A forward CTCCTGGGTGGCGCATACGTGCTTTGG

CR60 E2 355A reverse CCAAAGCACGTATGCGCCACCCAGGAG

CR61 E2 355K forward CTCCTGGGTGGCAAGTACGTGCTTTGG

CR62 E2 355K reverse CCAAAGCACGTACTTGCCACCCAGGAG

CR63 E2 355∆forward CTCCTGGGTGGCTACGTGCTTTGG

CR64 E2 355∆reverse CCAAAGCACGTAGCCACCCAGGAG

CR65 E2 370A forward ATCTTATCAGAAGCAATGGCCTCGGGT

CR66 E2 370A reverse ACCCGAGGCCATTGCTTCTGATAAGAT

CR67 E2 370N forward ATCTTATCAGAAAACATGGCCTCGGGT

CR68 E2 370N reverse ACCCGAGGCCATGTTTTCTGATAAGAT

CR69 E2 370E forward ATCTTATCAGAAGAGATGGCCTCGGGT

CR70 E2 370E reverse ACCCGAGGCCATCTCTTCTGATAAGAT

CR71 E2 370∆forward ATCTTATCAGAAATGGCCTCGGGT

CR72 E2 370∆reverse ACCCGAGGCCATTTCTGATAAGAT

CR144 E2 354R 355G forward GCACTCCTGGGTAGGGGCTACGTGCTT CR145 E2 354R 355G reverse AAGCACGTAGCCCCTACCCAGGAGTGC CR146 E2 355Y 356R forward CTGGGTGGCTACAGGGTGCTTTGGCTG CR147 E2 355Y 356R reverse CAGCCAAAGCACCCTGTAGCCACCCAG CR148 E2 355A Ins 354R forward CTCCTGGGTGGCAGGGCATACGTGCTT CR149 E2 355A Ins 354R reverse AAGCACGTATGCCCTGCCACCCAGGAG CR150 E2 355A Ins 356R forward CTGGGTGGCGCAAGGTACGTGCTTTGG CR151 E2 355A Ins 354R reverse CCAAAGCACGTACCTTGCGCCACCCAG

CR152 E2 355E forward CTCCTGGGTGGCGAATACGTGCTTTGG

CR153 E2 355E reverse CCAAAGCACGTATTCGCCACCCAGGAG

CR154 E2 369A forward ATGATCTTATCAGCACAGATGGCCTCG

CR155 E2 369A reverse CGAGGCCATCTGTGCTGATAAGATCAT

CR156 E2 369Q forward ATGATCTTATCACAGCAGATGGCCTCG

CR157 E2 369Q reverse CGAGGCCATCTGCTGTGATAAGATCAT

CR158 E2 369R forward ATGATCTTATCAAGGCAGATGGCCTCG

CR159 E2 369R reverse CGAGGCCATCTGCCTTGATAAGATCAT

(46)

CR160 E2 369∆forward ATGATCTTATCACAGATGGCCTCG

CR161 E2 369∆forward CGAGGCCATCTGTGATAAGATCAT

CR162 E2 366V forward GTCACATACATGGTCTTATCAGAACAG

CR163 E2 366V reverse CTGTTCTGATAAGACCATGTATGTGAC

CR164 E2 336A forward GTCACATACATGGCATTATCAGAACAG

CR165 E2 336A reverse CTGTTCTGATAATGCCATGTATGTGAC

CR166 E2 366N forward GTCACATACATGAACTTATCAGAACAG

CR167 E2 366N reverse CTGTTCTGATAAGTTCATGTATGTGAC

Quickchangeprimer TMD E1

CR74 E1 171A forward GCATTCTTGGTTGCACTGGTGAAGGTA

CR75 E1 171A reverse TACCTTCACCAGTGCAACCAAGAATGC

CR76 E1 174A forward GTTTGTCTGGTGGCAGTAGTGAGAGGC

CR77 E1 174A reverse GCCTCTCACTACTGCCACCAGACAAAC

CR78 E1 174E forward GTTTGTCTGGTGGAGGTAGTGAGAGGC

CR79 E1 174E reverse GCCTCTCACTACCTCCACCAGACAAAC

CR80 E1 174∆forward GTTTGTCTGGTGGTAGTGAGAGGC

CR81 E1 174∆reverse GCCTCTCACTACCACCAGACAAAC

CR82 E1 177A forward GTGAAGGTAGTGGCAGGCCAAGTGTTA

CR83 E1 177A reverse TAACACTTGGCCTGCCACTACCTTCAC

CR84 E1 177K forward GTGAAGGTAGTGAAGGGCCAAGTGTTA

CR85 E1 177K reverse TAACACTTGGCCCTTCACTACCTTCAC

CR86 E1 177∆forward GTGAAGGTAGTGGGCCAAGTGTTA

CR87 E1 177∆reverse TAACACTTGGCCCACTACCTTCAC

CR88 E1 179A forward GTAGTGAGAGGCGCAGTGTTACAAGGT

CR89 E1 179A reverse ACCTTGTAACACTGCGCCTCTCACTAC

CR90 E1 179N forard GTAGTGAGAGGCAACGTGTTACAAGGT

CR91 E1 179N reverse ACCTTGTAACACGTTGCCTCTCACTAC

CR92 E1 179E forward GTAGTGAGAGGCGAGGTGTTACAAGGT

CR93 E1 179E reverse ACCTTGTAACACCTCGCCTCTCACTAC

CR94 E1 179∆forward GTAGTGAGAGGCGTGTTACAAGGT

(47)

CR95 E1 179∆reverse ACCTTGTAACACGCCTCTCACTAC

CR96 E1 182A forward GGCCAAGTGTTAGCAGGTATACTGTGG

CR97 E1 182A reverse CCACAGTATACCTGCTAACACTTGGCC

CR98 E1 182N forward GGCCAAGTGTTAAACGGTATACTGTGG

CR99 E1 182N reverse CCACAGTATACCGTTTAACACTTGGCC

CR100 E1 182E forward GGCCAAGTGTTAGAGGGTATACTGTGG

CR101 E1 182E reverse CCACAGTATACCCTCTAACACTTGGCC

CR102 E1 182∆forward GGCCAAGTGTTAGGTATACTGTGG

CR103 E1 182∆reverse CCACAGTATACCTAACACTTGGCC

Sequenzierungsprimer

CR41 Erns forward AGGGATAGCCCCACACCATTAAC

CR42 E1 forward GCCTCTCCCTATTGTGAGGTAG

CR43 E1 reverse CCCTTGCGCCCCTGTTATGAGC

CR44 E2 forward TACCCAGACTGCAAACCCGG

CR45 E2 mitte reverse CTCACAAGACTCAACGGGCCC

CR46 E2 mitte forward GGCCCGTTGAGTCTTGTGAG

CR107 CD72 forward ACTCTGTCTTCCAAGCTGGC

BT317 pCI forward GTCCATTCGCCATTCAGG

BT311 pCI reverse ACATAGTAAGCCAGTATACACTC

Tab. 2.10: Verwendete Oligonukleotide

2.9 Verwendete Plasmide

2.9.1 Im Labor vorhandene bzw. käuflich erworbene Plasmide

pCI Expressionsplasmid Promega, Mannheim

pCITE 2a(+) Expressionsplasmid Novagen, Merck, Darmstadt pcDNA3 Expressionsplasmid Thermo Fischer Scientific, USA

(48)

CD72-WT- Sequenz

IRATp970E0144D

Template für PCR ImaGene, Berlin

p798 Infektiöser Klon BVDV CP7 Prof.Dr.Gregor Meyers

pB11 Erns-WT C-Term. V5 Dr. Birke Andrea Tews

pB153 ErnsLZ C-Term. V5 abspaltbar Dr. Birke Andrea Tews pB154 ErnsLZ C-Term. V5 nicht abspaltbarDr. Birke Andrea Tews

pB443 SBFP-KDEL Dr. Birke Andrea Tews

Tab. 2.11: Erworbene Plasmide

2.9.2 Eigene Plasmide

Zur Untersuchung der Glykoproteine E1 und E2 wurden eine Reihe von Expressionsplasmi- den, ausgehend von der Wildtyp- Sequenz des BVDV- Stammes CP7, hergestellt. Die einzel- nen Konstrukte wurden mit unterschiedlichen molekularbiologischen Techniken hergestellt, die unter 3.1.1 beschrieben sind.

pCI- und pcDNA3-Expressionsplasmide: Wildtyp und getaggte Proteine

pCR13 basierend auf p798, durch Fusions-PCR wurde die Signalsequenz von Erns mit der Sequenz für E1 fusioniert und das PCR-Produkt mittels XbaI und NotI Schnittstelle in den pCI Vektor kloniert.

pCR14 pCR13 mit zusätzlichen C-terminalem V5-Tag, die Mutation A193R ver- hindert die Abspaltung des Tags

pCR15 basierend auf p798, E2-Sequenz inkl. E2-Signalsequenz; das PCR-Produkt wurde mittels XbaI und NotI Schnittstelle in den pCI Vektor kloniert.

pCR16 pCR15 mit zusätzlichen C-terminalem Au1-Tag, die Mutation A372R ver- hindert die Abspaltung des Tags

pCR17 basierend auf p798, durch Fusions-PCR wurde die Signalsequenz von Erns mit der Sequenz für E1- E2 fusioniert und das PCR-Produkt mittels XbaI und NotI Schnittstelle in den pCI Vektor kloniert.

pCR127 basierend auf p798; durch Fusions-PCR wurde die Signalsequenz von Erns mit der Sequenz für E1 fusioniert sowie ein N-terminales FLAG-Tag einge- baut; das PCR-Produkt wurde mittels XhoI und XmaI Schnittstelle in den pCI Vektor kloniert.

(49)

pCR128 pCR127 mit zusätzlichen C-terminalem V5-Tag, die Mutation A193R ver- hindert die Abspaltung des Tags

pCR157 basierend auf p798, beinhaltet diese Sequenz die Signalsequenz von Erns, die Sequenz für E1- E2 sowie ein N-terminales FLAG-Tag; Das Insert wur- de durch AflI und XhoI aus pCR145 generiert und in den pcDNA3- Vektor kloniert.

Tab. 2.12: pCI- und pcDNA3-Plasmide

Abb. 2.1: Graphische Darstellung der Inserts von pCR13- 18.

pCI-Expressionsplasmide: CD72-Fusionskonstrukte

pCR25 CD72-Wildtypsequenz mit nachfolgender KasI Schnittstelle zur Klonie- rung von pCR26-28; das PCR-Produkt wurde mittels XbaI und NotI Schnittstelle in den pCI Vektor kloniert.

pCR26 basierend auf pCR25 wurde die komplette E2-Wildtypsequenz durch KasI und NotI Schnittstellen in den Vektor kloniert

pCR27 basierend auf pCR25 wurde die E2-Ectodomain (Aminosäure 1-345) durch KasI und NotI Schnittstellen in den Vektor kloniert

(50)

pCR28 basierend auf pCR25 wurde die E2-Transmembrandomain (Aminosäure 346- 374) durch KasI und NotI Schnittstellen in den Vektor kloniert pCR37 basierend auf pCR25 wurde die komplette E1-Wildtypsequenz durch KasI

und NotI Schnittstellen in den Vektor kloniert

pCR38 basierend auf pCR25 wurde die E1-Ectodomain (Aminosäure 1-164) durch KasI und NotI Schnittstellen in den Vektor kloniert

pCR39 basierend auf pCR25 wurde die E1-Transmembrandomain (Aminosäure 165- 195) durch KasI und NotI Schnittstellen in den Vektor kloniert pCR56 wie pCR37 mit einer Deletion der letzten 15 Aminosäuren (E1δ180-195) pCR57 wie pCR37 mit einer Deletion von 15 Aminosäuren (E1δ165-179)

pCR58 wie pCR26 mit einer Deletion der letzten 14 Aminosäuren (E2∆361-374) pCR59 wie pCR37 mit einer Deletion von 15 Aminosäuren (E2∆346-360) Tab. 2.13: CD72-Plasmide

Abb. 2.2: Schematische Darstellung der CD72-Fusionskonstrukte.

(51)

CD72-E1-Fusionskonstrukte mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen in E1-TMD pCR37 CD72-E1 WT ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR40 CD72-E1 C171A ...165TTAFLVALVKVVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR41 CD72-E1 K174A ...165TTAFLVCLVAVVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR42 CD72-E1 K174E ...165TTAFLVCLVEVVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR43 CD72-E1 K174∆ ...165TTAFLVCLV−VVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR44 CD72-E1 R177A ...165TTAFLVCLVKVVAGQVLQGILWLMLITGAQG pCR45 CD72-E1 R177K ...165TTAFLVCLVKVVKGQVLQGILWLMLITGAQG pCR46 CD72-E1 R177∆ ...165TTAFLVCLVKVV−GQVLQGILWLMLITGAQG pCR47 CD72-E1 Q179A ...165TTAFLVCLVKVVRGAVLQGILWLMLITGAQG pCR48 CD72-E1 Q179N ...165TTAFLVCLVKVVRGNVLQGILWLMLITGAQG pCR49 CD72-E1 Q179E ...165TTAFLVCLVKVVRGEVLQGILWLMLITGAQG pCR50 CD72-E1 Q179∆ ...165TTAFLVCLVKVVRG−VLQGILWLMLITGAQG pCR51 CD72-E1 Q182A ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLAGILWLMLITGAQG pCR52 CD72-E1 Q182N ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLNGILWLMLITGAQG pCR53 CD72-E1 Q182E ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLEGILWLMLITGAQG pCR54 CD72-E1 Q182∆ ...165TTAFLVCLVKVVRGQVL−GILWLMLITGAQG pCR60 CD72-E1 R177E ...165TTAFLVCLVKVVEGQVLQGILWLMLITGAQG pCR61 CD72-E1 Q182K ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLKGILWLMLITGAQG pCR62 CD72-E1 K174E, Q182K...165TTAFLVCLVEVVRGQVLKGILWLMLITGAQG pCR63 CD72-E1 K174∆, Q182∆...165TTAFLVCLV−VVRGQVL−GILWLMLITGAQG

CD72-E2 Fusionskonstrukte mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen in E2-TMD pCR26 CD72-E2 WT ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSEQMASG pCR29 CD72-E2 R355A ...346VIVVALLGGAYVLWLLVTYMILSEQMASG pCR30 CD72-E2 R355K ...346VIVVALLGGKYVLWLLVTYMILSEQMASG pCR31 CD72-E2 R355∆ ...346VIVVALLGG−YVLWLLVTYMILSEQMASG pCR32 CD72-E2 Q370A ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSEAMASG pCR33 CD72-E2 Q370N ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSENMASG pCR34 CD72-E2 Q370E ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSEEMASG pCR35 CD72-E2 Q370∆ ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSE−MASG

(52)

Tab. 2.14: Plasmide: CD72-E1/E2-Mutenten

FLAG-E1-Konstrukte mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen

pCR129 FLAG-E1 K174A ...165TTAFLVCLVAVVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR130 FLAG-E1 K174E ...165TTAFLVCLVEVVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR131 FLAG-E1 K174∆ ...165TTAFLVCLV−VVRGQVLQGILWLMLITGAQG pCR132 FLAG-E1 R177A ...165TTAFLVCLVKVVAGQVLQGILWLMLITGAQG pCR133 FLAG-E1 R177K ...165TTAFLVCLVKVVKGQVLQGILWLMLITGAQG pCR134 FLAG-E1 R177E ...165TTAFLVCLVKVVEGQVLQGILWLMLITGAQG pCR135 FLAG-E1 R177∆ ...165TTAFLVCLVKVV−GQVLQGILWLMLITGAQG pCR136 FLAG-E1 Q179A ...165TTAFLVCLVKVVRGAVLQGILWLMLITGAQG pCR137 FLAG-E1 Q179N ...165TTAFLVCLVKVVRGNVLQGILWLMLITGAQG pCR138 FLAG-E1 Q179∆ ...165TTAFLVCLVKVVRG−VLQGILWLMLITGAQG pCR139 FLAG-E1 Q182A ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLAGILWLMLITGAQG pCR140 FLAG-E1 Q182N ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLNGILWLMLITGAQG pCR141 FLAG-E1 Q182E ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLEGILWLMLITGAQG pCR142 FLAG-E1 Q182K ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLKGILWLMLITGAQG pCR143 FLAG-E1 Q182∆ ...165TTAFLVCLVKVVRGQVL−GILWLMLITGAQG pCR144 FLAG-E1 Q182F ...165TTAFLVCLVKVVRGQVLFGILWLMLITGAQG

E2-Konstrukte mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen

pCR15 E2 WT ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSEQMASG

pCR77 E2∆346-374 Transmembrandomain AS 346-374deletiert

pCR71 E2∆346-360 ...346 LVTYMILSEQMASG

pCR84 E2∆361-374 ...346VIVVALLGGRYVLWL

pCR72 E2 R355A ...346VIVVALLGGAYVLWLLVTYMILSEQMASG

pCR78 E2 R355K ...346VIVVALLGGKYVLWLLVTYMILSEQMASG

pCR79 E2 R355∆ ...346VIVVALLGG−YVLWLLVTYMILSEQMASG

pCR80 E2 Q370A ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSEAMASG

pCR81 E2 Q370N ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSENMASG

pCR82 E2 Q370E ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSEEMASG

(53)

pCR83 E2 Q370∆ ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSE−MASG pCR107 E2 G354R,R355G ...346VIVVALLGRGYVLWLLVTYMILSEQMASG pCR108 E2 R355Y,Y356R ...346VIVVALLGGYRVLWLLVTYMILSEQMASG pCR109 E2 R355A,Ins.354R ...346VIVVALLGGRAYVLWLLVTYMILSEQMASG pCR110 E2 R355A,Ins.356R ...346VIVVALLGGARYVLWLLVTYMILSEQMASG

pCR111 E2 R355E ...346VIVVALLGGEYVLWLLVTYMILSEQMASG

pCR112 E2 E369A ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSAQMASG

pCR113 E2 E369Q ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSQQMASG

pCR114 E2 E369R ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILSRQMASG

pCR115 E2 E369∆ ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMILS−QMASG

pCR116 E2 I366V ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMVLSEQMASG

pCR117 E2 I366A ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMALSEQMASG

pCR118 E2 I366N ...346VIVVALLGGRYVLWLLVTYMNLSEQMASG

Tab. 2.15: Plasmide: Flag-E1- und E2-Mutanten

Gesamtklone mit Aminosäuresubstitutionen, -deletionen in E2-TMD

798-CR1 Gesamtklon auf Basis von p798 mit R355A Substitution in der E2- TMD

798-CR2 Gesamtklon auf Basis von p798 mit R355K Substitution in der E2- TMD

798-CR3 Gesamtklon auf Basis von p798 mit R355 Deletion in der E2- TMD

798-CR4 Gesamtklon auf Basis von p798 mit Q370E Substitution in der E2- TMD

Tab. 2.16: Gesamtklone mit E2-Mutationen

2.10 Geräte

AB Hitachi 3130 Genetic Analyzer Applied Biosystems, Weiterstadt Analysenwaage Satorius A200S Satorius, Göttingen

Abbildung

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