Die Expression der Tyrosin-Kinase-Rezeptoren in zerebralen und spinalen Chordomen in Korrelation mit klinischen Daten - eine retrospektive Studie bei 71 Patienten
Dissertation zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Roya Akhavan Sigari aus Teheran/ Iran
Hannover 2010
Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann Betreuer: Prof. Dr. med. M. R. Gaab
Referent: PD Dr. med. Makoto Nakamura
Korreferent: Prof. Dr. med. Alexandru Constantin Stan Tag der mündlichen Prüfung: 20.10.2010
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. med. Hermann Müller-Vahl Prof. Dr. med. Marc Ziegenbein Prof. Dr. med. Frank Schuppert
Kap. Seite
1. Einleitung ... 1
2. Literaturübersicht ... 2
2.1 Historie ... 2
2.2 Ursprung und Häufigkeit... 2
2.3 Lokalisation, Wachstum und Metastasierung ... 3
2.4 Klinische Symptome ... 4
2.5 Pathologie... 4
2.6 Immunhistochemie ... 6
2.6.1 iNOS... 8
2.6.2 Ki-M1P... 8
2.6.3 VEGFR-2... 8
2.6.4 EGFR... 11
2.6.5 PDGFR-α... 12
2.6.6 c-Met ... 12
2.6.7 CD-34 ... 13
2.7 Prognose ... 13
2.8 Therapie... 14
2.9 Fragestellung ... 16
3. Material und Methode ... 17
3.1 Patientenkollektiv... 17
3.2 Methode... 17
3.2.1 Gewebematerialien... 17
3.2.2 Multi-Tissue Block... 17
3.2.3 Immunhistochemie Färbung... 19
3.2.4 Statistische Auswertung ... 22
4. Ergebnisse ... 23
4.1 Immunhistochemische Ergebnisse ... 23
4.2 Zusammenhänge... 35
4.3 Alter und Geschlecht ... 37
4.4 Symptomatik ... 38
4.5 Tumorlokalisation und Ausdehnung ... 40
4.6 Tumorrezidive ... 41
4.7 Mortalität ... 41
5. Diskussion ... 42
5.1 Zweck der Studie... 42
5.2 Immunhistochemische Ergebnisse ... 43
5.3 Zusammenhänge... 48
5.3.1 Korrelation der Marker untereinander... 48
5.3.2 Alter und Geschlecht ... 48
5.3.3 Tumorlokalisation ... 49
5.3.4 Tumorrezidiv und Prognose ... 49
5.3.5 Klinische Symptome ... 50
5.4 Alter und Geschlecht ... 50
5.5 Tumorrezidive und Mortalität ... 51
5.6 Schlussfolgerungen ... 51
6. Zusammenfassung ... 52
7. Literaturverzeichnis... 54
8. Danksagung... 67
9. Lebenslauf ... 68
Abb. Seite Abb. 1: Altersverteilung in Abhängigkeit von der Lokalisation der Chordome
(McMaster et al. 2001) ...3
Abb. 2: Chordom mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung unter 100facher Vergrößerung ...5
Abb. 3: Rolle von VEGFR in endothelialen Zellen (Ferrara et al. 2003) ...9
Abb. 4: Parakrine and autokrine Stimulation der Angiogenese (McMahon 2000)...10
Abb. 5: Vereinfachtes Schema des EGFR-Systems, die zellulären Prozesse Proliferation, Differenzierung und Überleben werden durch multiple Mechanismen reguliert (Harari und Huang 2000, Huang und Harari 1999)...11
Abb. 6: Darstellung von mehreren Multitissue Blöcken mit unterschiedlicher Anzahl von Proben. In unserer Studie wurden 3 Multitissue Blöcke mit 96, 60 und 13 Proben erstellt...18
Abb. 7: Immunhistochemische Ergebnisse, dargestellt sind alle n=71 Patienten mit kraniellem Chordom (bei mehreren Messungen pro Patient Darstellung der mittleren Bewertung)...24
Abb. 8: Immunhistochemische Ergebnisse, dargestellt sind n=8 Patienten mit spinalen Chordomen als Kontrollgruppe ...25
Abb. 9: Intrakranielles Chordom: iNOS-Expression, Intensitätsgrad 2, 4fache Vergrößerung...27
Abb. 10: Intrakranielles Chordom: iNOS-Expression, Intensitätsgrad 3, 25fache Vergrößerung...28
Abb. 11: Spinales Chordom: iNOS-Expression, Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung .28 Abb. 12: Intrakranielles Chordom: VEGFR-2-Expression, Intensitätsgrad 1, 4fache Vergrößerung...29
Abb. 13: Spinales Chordom: VEGFR-2-Expression, Intensitätsgrad 3, 25fache Vergrößerung...30
Abb. 14: Intrakranielles Chordom: KiM-1P-Expression, Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung...30
Vergrößerung...31
Abb. 16: Spinales Chordom: EGFR-Expression, Intensitätsgrad 3, 25fache Vergrößerung...31
Abb. 17: Intrakranielles Chordom: PDGFR-α-Expression, Intensitätsgrad 3, 4fache Vergrößerung...32
Abb. 18: Spinales Chordom: PDGFR-α-Expression, Intensitätsgrad 3, 4fache Vergrößerung...32
Abb. 19: Intrakranielles Chordom: c-Met-Expression, Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung...33
Abb. 20: Spinales Chordom: c-Met-Expression: Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung.33 Abb. 21: Intrakranielles Chordom: CD-34-Expression:, Intensitätsgrad 2, 4fache Vergrößerung...34
Abb. 22: Intrakranielles Chordom: CD-34-Expression, Intensitätsgrad 2, 10fache Vergrößerung...34
Abb. 23: Altersverteilung von n=31 Patienten...38
Abb. 24: Symptomatik (n=58)...39
Abb. 25: Anzahl der Tumorrezidive (n=58)...41
Tab. Seite Tab. 1: Immunhistochemische Differentialdiagnose des typischen kraniellen und
zervikalen Chordoms (Seifert und Donath 1998)...7
Tab. 2: Verdünnung der eingesetzten Antikörper in 0,5% iger PBSA...21
Tab. 3: Korrelationen (Spearman-Rang) zwischen den immunhistochemischen Ergebnissen (n=72), angegeben sind die Korrelationskoeffizienten und die p- Werte (Fettdruck für p<0,1) ...35
Tab. 4: Zusammenhänge zwischen Alter, Geschlecht, Tumorrezidiv, Tumorlokalisation und Ausdehnung mit den immunhistochemischen Ergebnissen (n=58), angegeben sind die p-Werte (Fettdruck für p<0,1) (U-Test) ...36
Tab. 5: Zusammenhang zwischen den Symptomen und den immunhistochemischen Ergebnissen, berechnet für jeden Patienten (n=58), angegeben sind die p-Werte (Fettdruck für p<0,1) (U-Test) ...37
Tab. 6: Tumorlokalisation und Ausdehnung (n=58) ...40
Tab. 7: EGFR-Expression bei Chordomen in verschiedenen Studien...45
Tab. 8: PDGFR-α-(β)-Expression bei Chordomen in verschiedenen Studien ...46
Tab. 9: c-Met-Expression bei Chordomen in verschiedenen Studien ...47
Tab. 10: Alter und Geschlecht von Patienten mit intrakraniellem Chordom ...50
ACT Antichymotrypsin bFGF basic fibroblast growth factor
CD-34 cluster of differentiation („Reifungsgruppe“) Nr. 34
CEA carcino-embryonales Antigen
CEP circulating endothelial progenitorcell CK Zytokeratin
c-Met = HGFR Met: mesenchymal-epithelial transition factor EGFR epidermal-growth-factor-receptor
EMA epitheliales Membranantigen
EPC endothelial progenitor cell FGF fibroblast growth factor Flk-1 = VEGFR-2 fetal liver kinase 1
GFAP saures Gliafaserprotein
HGFR = c-Met hepatocyte growth factor receptor
HSG Hintere Schädelgrube
iNOS induzierbare NO-Synthase
Ki-M1P pan-monocytic/macrophage marker
NSE neuron specific enolase
PBSA phosphatgepufferte Kochsalzlösung (mit boviner Albuminfraktion) PDGF platelet-derived growth factor
PDGFR-α platelet-derived growth factor receptor α PlGF placenta growth factor
RTK receptor tyrosine kinase S-100 S-100-Protein TGF-α transforming growth factor α
tNOS totale NO-Synthase
VEGF vascular endothelial growth factor
VEGFR-2 = Flk-1 vascular endothelial growth factor receptor 2 VIM Vimentin
1. Einleitung
Die chirurgische Behandlung von Läsionen im Bereich der Schädelbasis stellt infolge der komplexen anatomischen Verhältnisse mit wichtigen neurovaskulären Strukturen, die auf engstem Raum anzutreffen sind, eine besondere Herausforderung dar. Die meisten Tumore im Bereich der Schädelbasis weisen zwar gutartige biologische Ver- haltensmuster auf, aufgrund ihres infiltrativen Charakters im Schädelknochen unterhalb und innerhalb der duralen Hüllen des Gehirns muss man ihr klinisches Verhalten jedoch leider häufig als maligne bezeichnen. Da die Gehirnfunktion erst spät durch erhebliche raumfordernde Wirkung beeinträchtigt wird, sind diese Tumore zum Zeitpunkt der Diagnosestellung häufig bereits sehr groß.
Chordome und Chondrosarkome werden, obgleich histopathologisch unterschiedlich, wegen ihrer Lokalisation und Seltenheit oft gemeinsam betrachtet. Klinisch sind sie oft die bioptisch zu klärende Differentialdiagnose. Sie gehen beide vom geometrischen Zentrum der Schädelbasis aus und können sich in alle Richtungen ausdehnen.
Insbesondere Chordome neigen immer wieder zu Rezidiven und stellen somit eine außergewöhnliche Schwierigkeit für die behandelnden Ärzte dar. Die Seltenheit dieser Tumore führt dazu, dass in der Regel die individuellen und institutionellen Erfahrungen mit diesen Pathologien limitiert und daher die bisher publizierten operativen Studien zu diesen Erkrankungen selten sind und größtenteils geringe Fallzahlen aufweisen. Es gibt bis heute keine einheitliche, auf wissenschaftliche Grundlagen gestützte Behandlungsstrategie für diese Krankheitsbilder, vielmehr beruht die Therapie auf der Erfahrung weniger Institutionen. Vor diesem Hintergrund untersucht diese Studie an einem, gemessen an der Literatur, sehr großen Patientengut Chordome der Schädelbasis und Wirbelsäule, welche im Zeitraum von 1979 bis 2008 im Nordstadtkrankenhaus des Klinikums Hannover behandelt wurden.
2. Literaturübersicht
2.1 Historie
Rudolf Virchow stellte diesen Tumor erstmalig im Februar 1856 vor der „Würzburger physikalisch-medizinischen Gesellschaft“ vor. 1857 beschrieb er „physaliforme Zellen“, die bis heute als charakteristisch für das Chordom anzusehen sind (Virchow 1857). In der Annahme, die Matrix entstamme dem Knorpelgewebe der Schädelbasis, benannte er ihn als „Ecchondrosis physaliformis“. Müller (1858) untersuchte Embryonen und postulierte eine Entstehung aus embryonalem Notochord. Ribbert (1894) verwendete erstmals den Begriff Chordom. Coenen (1925) veröffentlichte die erste zusammenfassende Beschreibung von 68 Chordomen, davon 20 der Schädelbasis.
2.2 Ursprung und Häufigkeit
Chordome gehören wie auch die Ameloblastome, Kraniopharyngeome sowie meso- dermalen Mischtumoren zur Gruppe der embryonalen Restgewebstumoren. Sie ent- stehen aus Resten der nicht zurückgebildeten Chorda dorsalis. Diese entwickelt sich in der 3. embryonalen Woche aus dem Processus notochordalis, das heißt aus dem Meso- derm. Sie ist das zentrale Achsenorgan der Chordata (Wacker et al. 2002).
In den USA beträgt die Inzidenz des Chordoms 0,08 Patienten pro 100.000, 0,10 bei Männern und 0,06 bei Frauen (McMaster et al. 2001). Mit einem Anteil von etwa 0,1- 0,2 % ist es ein sehr seltener intrakranieller Tumor. Trotz seiner Seltenheit unter den primären Knochentumoren stellt das Chordom zusammen mit den Chondrosarkomen einen Großteil der primären Knochentumoren der Schädelbasis dar (Rosenberg et al.
1999). Chordome werden eingeteilt in konventionelle (typische) Chordome, chondroide Chordome und dedifferenzierte Chordome (Barnes und Kapadia 1994, Seifert und Donath 1998).
Chordome entstehen, unabhängig von der Lokalisation, am häufigsten in der Alters- gruppe der etwa 50-70jährigen. Von kraniellen Chordomen sind relativ häufig auch
jüngere Patienten betroffen aber kaum ältere Patienten. Umgekehrt sind von sakralen oder spinalen Chordomen wenige jüngere Patienten aber viele ältere Patienten betroffen (McMaster et al. 2001) (Abb. 1).
18
44
52
11 14
30
60
30
2
18
59
38
2 5 7 10
0 10 20 30 40 50 60 70
3-25. 26-48 49-71 72-95
Alter [Jahre]
Anzahl der Patienten
kranial spinal sakral andere
Abb. 1: Altersverteilung in Abhängigkeit von der Lokalisation der Chordome (McMaster et al. 2001)
2.3 Lokalisation, Wachstum und Metastasierung
Die Chordome sind zu 32 % kraniell, 29 % sakral, 33 % spinal und 6 % extra-axial lokalisiert. Es fanden sich auch Chordome in der Nasenhöhle, Nasopharynx und in den Nasennebenhöhlen. In den meisten Fällen liegt intraossärer Wachstum vor, es sind aber auch Fälle von extraossärem Wachstum beschrieben worden (McMaster et al. 2001).
Das Chordom zeichnet sich durch ein meist langsames, aber lokal destruierendes Wachstum aus, welches mit einer Kompression und Invasion benachbarten Gewebes verbunden ist (Mendenhall et al. 2005). Dies führt gerade bei Chordomen der Schädelbasis zu einer großen Bandbreite von Symptomen (siehe Kap. 2.5).
In 10-30 % der Fälle kommt es zu einer Metastasierung welche bevorzugt auf hämato- genem Wege geschieht (Chambers und Schwinn 1979, Dahlin und Unni 1986). Wie aus Autopsien hervorgeht, scheint die tatsächliche Metastasenfrequenz jedoch höher zu sein (Dahlin und Unni 1986).
2.4 Klinische Symptome
Kraniozervikale Chordome werden wegen ihrem langsamen Wachstum oft erst in einem fortgeschrittenen Stadium durch unspezifische Symptome wie z. B. Kopfschmerzen klinisch manifest (Heffelfinger et al. 1973, Stammberger 1983). Dann liegt bereits eine ausgedehnte Infiltration kaudaler Hirnnerven oder eine Verdrängung zerebraler oder spinaler Strukturen vor (Maier et al. 2006). Die Symptome treten im Mittel 14 Monate vor der Diagnosestellung auf (Bjornsson et al. 1993). Bis zur Diagnosestellung können aber auch Jahre vergehen (Seifert und Donath 1998). Die ersten Symptome sind meist Hirnnervendefizite (am häufigsten den dritten und sechsten Hirnnerven), Hydrozephalus und sensomotorische Defizite (Noël et al. 2003). Sehr häufig sind okuläre Symptomen wie Diplopie und/oder Sehbehinderung. Die Diplopie ist anfangs oft intermittierend (Volpe et al. 1993).
2.5 Pathologie
Das Chordom besteht aus großblasigen, pflanzenähnlichen (physaliformen), isomorphen Zellen, die in einer gallertigen Grundsubstanz liegen. Die Zellkerne sind rund, Mehr- kernigkeit und Kernpolymorphie kommen vor. Die physaliformen Zellen besitzen kleinere Kerne und enthalten Glykogengranula. Besonders kennzeichnend sind zahl-
reiche Zytoplasmavakuolen, die das Zellinnere vollständig ausfüllen. Mitunter sind die Zellkerne randständig verlagert, so dass der Zelltypus einer Siegelringzelle ähnelt.
Charakteristisch ist auch ein ausgeprägter zellularer Pleomorphismus. Im vakuolär umgewandelten Zytoplasma der physaliformen Zellen befinden sich Schleimtropfen.
Die pflanzenzellähnlichen Zellen sind für Chordome pathognomonisch (Seifert und Donath 1998, Wacker et al. 2002) (Abb. 2).
Eine weitere Zellform sind die epitheloiden Übergangszellen mit schwach azidophilem Zytoplasma in solider strangförmiger Anordnung. Sie sind durch ein deutlich erweitertes endoplasmatisches Retikulum und abgeschnürte kleine Zytoplasmavakuolen gekennzeichnet. Inmitten ausgedehnter Schleimseen liegen sowohl strangförmig angeordnete anastomosierende Zellen als auch kleinere, mehr spindelförmige Zellen (Seifert und Donath 1998).
Abb. 2: Chordom mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung unter 100facher Vergröße- rung
Weiterhin kommen auch kleine, sternförmige Zellen, mehrkernige Tumorriesenzellen und nekrotische Tumorzellen vor. Die mehr indifferenten fibroblastenartigen stern- förmig verzweigten Zellen besitzen große Kerne, enthalten ein reichliches raues endo- plasmatisches Retikulum und sind zur starken Proliferation befähigt. Die vorgenannten Zelltypen lösen sich in der schleimigen Grundsubstanz auf. Diese enthält reichlich PAS- und Astrablau-positives mukoides Material (Seifert und Donath 1998).
Das beschriebene histologische Bild ist insbesondere für differenzierte Chordome gültig, dedifferenzierte Chordome enthalten einen größeren sarkomatösen Anteil (Wacker et al. 2002).
2.6 Immunhistochemie
Für die exakte Diagnose eines Chordoms sind immunhistochemische Methoden unver- zichtbar (Ishida und Dorfman 1994, Krech et al. 1987, Mitchell et al. 1993, Persson et al. 1991, Seifert und Donath 1998, Walker et al. 1991). Aus den vorgenannten Studien geht übereinstimmend hervor, dass die typischen Chordome sowohl eine Expression von Zytokeratinen (insbesondere von CK 8 und CK 19) als auch von Vimentin auf- weisen, außerdem fast immer eine Expression von EMA. Die Expression von S-100- Protein korreliert mit dem Vorkommen von Chondroitinsulfat im Glykosaminglykan- haltigen Stroma, die Expression von NSE mit der metabolischen Aktivität (Karabela- Bouropoulou et al. 1988). Die identische Doppelexpression von Zytokeratin und Vimentin sowohl in den Zellen des Nucleus pulposus (Stosiek et al. 1988) als auch in Zellen der fetalen Chorda dorsalis (Krech et al. 1987, Naka et al. 1997a) bestätigt den Ursprung der Chordome aus Zellen der embryonalen Chorda dorsalis.
Besonders wichtig ist die Immunhistochemie zur Unterscheidung der Chordome von Knorpeltumoren, pleomorphen Adenomen, muzinösen Adenokarzinomen und Mukoepi- dermoidkarzinomen. Charakteristisch für das Chordom ist die Expression von Zytokera- tin, Vimentin und EMA. Dieses Markerspektrum ist in vollem Umfang nur beim typischen Chordom ausgeprägt. Beim chondroiden Chordom ist nur die Vimentin- expression konstant nachweisbar, während die Expression von Zytokeratin und EMA
vollständig fehlt oder nur schwach vorhanden ist. In Chondrosarkomen sind im Gegen- satz zu den typischen Chordomen weder Zytokeratin noch EMA nachweisbar, dagegen Vimentin, S-100-Protein und auch Lysozym (Gmür und von Hochstetter 1988). Trotz der morphologischen Ähnlichkeit von Chondrosarkom und chondroidem Chordom ist so eine Differentialdiagnose möglich. Die Bestimmung des Ki67 Labellingindex scheint von prognostischer Bedeutung zu sein, da der Labellingindex über 6 % mit einem schnelleren Tumorwachstum verbunden ist (Holton et al. 2000). Ein Pleomorphismus der Zellkerne, welcher über einen erhöhten MIB-1 Labelling index einhergeht, ist für die Prognose der Schädelbasischordome ebenfalls wichtig (Naka et al. 2003).
Tab. 1: Immunhistochemische Differentialdiagnose des typischen kraniellen und zervikalen Chordoms (Seifert und Donath 1998)
Chordomtyp CK EMA VIM CEA S-100 Lysozym GFAP ACT
Typisches Chordom ++ ++ ++ (+) + – – +
Chondroides
Chordom +/– +/– ++ – ++ – – +
Chondrosarkom – – ++ – ++ ++ –
Pleomorphes Adenom ++ + + + ++ + ++
Muzinöses
Adenokarzinom ++ + – + (+) – –
Mukoepidermoid-
karzinom ++ + – + (+) – –
CK Zytokeratin, EMA: epitheliales Membranantigen, VIM: Vimentin, CEA: carcino-embry- onales Antigen, S-100: S-100-Protein, GFAP: saures Gliafaserprotein, ACT: Antichymotrypsin
In der eigenen Studie wurde die Expression der NOS-Isoform II, des VEGFR-2 (Flk-1), des Pan-Makrophagen-Markers Ki-M1P sowie der Tyrosinkinaserezeptoren EGFR, PDGFR-α, c-Met sowie CD-34 untersucht. Deshalb werden diese näher erläutert.
2.6.1 iNOS
Die iNOS wird gewöhnlich nicht konstitutiv exprimiert, sondern in Makrophagen und vielen anderen Zellen durch bakterielle Endotoxine wie z. B. Lipopolysaccharid (LPS) oder Zytokine induziert (Hevel et al. 1991, Stuehr et al. 1991).
Am Beispiel von Kopf/Hals-Tumoren wurde festgestellt, dass die tNOS- und iNOS- Aktivität erhöht ist und zwar umso mehr, je höher der Tumorgrad ist. Außerdem besteht eine Korrelation mit der Vaskularisation (Gallo et al. 1998). So konnte festgestellt werden, dass eine erhöhte iNOS-Expression der Tumor-assoziierten Makrophagen die Neovaskularisation fördert und den Blutfluss erhöht (Bingle et al. 2002). Auf der anderen Seite scheint NO maßgeblich an der tumoriziden Aktivität der Makrophagen beteiligt zu sein (Hung et al. 1998). Die Wirkung von NO auf Tumoren ist dosisabhängig und begünstigt in niedrigen Konzentrationen die Angiogenese und somit das Tumorwachstum, bei hohen Konzentrationen hingegen übt es eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung auf Tumorzellen aus (Fitzpatrick et al. 2008, Lechner und Rieder 2005). Durch den NOS-Inhibitor L-NAME kann die Angiogenese verhindert werden (Gallo et al. 1998).
2.6.2 Ki-M1P
Ki-M1P ist ein selektiver monoklonaler Antikörper, der mit den physiologischen Funktionsformen (Makrophagen des lymphatischen und nichtlymphatischen Gewebes), pathologischen Reaktionsformen (Epitheloidzellen und Fremdkörperriesenzellen) und neoplastischen Varianten (Gewebeinfiltrate von Monozytenleukämie) des Monozyten- /Makrophagensystems reagiert. Der monoklonale Antikörper Ki-M1P ist somit ein Pan- Makrophagen-Antikörper, der solche Zellen dieses Zellsystems erkennt, die zur Phago- zytose fähig sind (Radzun et al. 1991).
2.6.3 VEGFR-2
Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF-A) ist einer der wichtigsten und meist untersuchten Regulatoren des vaskulären Systems (Ferrara et al. 2003, Ferrara 2002, 2004). Neben anderen Funktionen ist es bei der Bildung und Organisation der
Blutgefäße und Bildung der hämatoplastischen Inseln beteiligt (Ayala et al. 2000). Zur Familie der VEGF-Moleküle gehören neben dem VEGF-A noch VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E und der plazentare Wachstumsfaktor (PIGF). Die Wirkung der VEGF-Proteine wird durch membranständige Rezeptoren der Tyrosinkinasefamilie VEGFR-1, VEGFR-2 und VEGFR-3 vermittelt. Dabei binden die verschiedenen Proteine mit unterschiedlicher Affinität an die VEGF-Rezeptoren. VEGF-A bindet sowohl VEGFR-1 als auch VEGFR-2. Dagegen interagieren PLGF und VEGF-B nur mit VEGFR-1. VEGF-C und VEGF-D binden VEGFR-2 und VEGFR-3. Während VEGFR-1 und VEGFR-2 im Wesentlichen die Vaskulogenese, Angiogenese, Rekrutie- rung hematopoetischer Vorläuferzellen und Monozyten regulieren, steuert VEGFR-3 Prozesse der Lymphangiogenese (Ferrara 2004, Hunzelmann et al. 2007, Neufeld et al.
1999) (Abb. 3).
Abb. 3: Rolle von VEGFR in endothelialen Zellen (Ferrara et al. 2003)
Die Angiogenese stellt einen fundamentalen Bestandteil der neoplastischen Trans- formation sowie der Regelung des Tumorwachstums dar (Dvorak et al. 1995). VEGF ist an der Angiogenese zahlreicher solider Tumoren beteiligt (McMahon 2000). Dies konnte auch bei Knorpeltumoren, 5 Enchondromas und 21 Chondrosarkome, festgestellt werden (Ayala et al. 2000). An der parakrinen und autokrinen Stimulation der Angio- genese sind neben dem VEGF noch weitere angiogene Faktoren wie FGF (fibroblast growth factor) und PDGF (platelet-derived growth factor) beteiligt (McMahon 2000) (Abb. 4).
Abb. 4: Parakrine and autokrine Stimulation der Angiogenese (McMahon 2000)
Die Neovaskularisation ist nur eines von mehreren Elementen, die an der neoplastischen Transformation und Progredienz von Knorpeltumoren zu höheren histologischen Graden beteiligt sind. Tatsächlich ist die VEGF-Expression bei Knorpeltumoren höheren Grades vermehrt. Da die Angiogenesehemmung sehr wichtig für die Erhaltung eines intakten Knorpels ist, wird vermutet, dass sie auch eine wichtige Rolle bei Knorpeltumoren spielt (Ayala et al. 2000).
2.6.4 EGFR
EGFR (epidermal growth factor receptor) spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung von Zellwachstum, Differenzierung und Überleben. Es ist an der Angiogenese durch Stimulierung der Produktion von VEGF beteiligt. Auch fördert EGFR das Überleben der Zelle durch Verhinderung der Apoptose (Hof et al. 2006). Zusätzlich zu diesen normalen Zellfunktionen spielt EGFR auch bei der Entwicklung einer Malignität eine Rolle, so ist EGFR an der Motilität der Tumorzellen und an der Metastasierung beteiligt (Herbst und Shin 2002) (Abb. 5).
Abb. 5: Vereinfachtes Schema des EGFR-Systems, die zellulären Prozesse Proliferation, Differenzierung und Überleben werden durch multiple Mechanismen reguliert (Harari und Huang 2000, Huang und Harari 1999)
2.6.5 PDGFR-α
Der Platelet-derived growth factor (PDGF) ist einer der vielfältigsten Wachstums- faktoren, der Zellproliferation und Zellteilung reguliert. Er spielt insbesondere bei der Angiogenese eine Rolle. PDGF ist ein dimeres Protein, das aus jeweils 2 der 4 bekann- ten homologen Ketten (A, B, C und D) besteht, die durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind und sowohl Homodimere (PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF- DD) als auch Heterodimere (PDGF-AB) bilden (Board und Jayson 2005, Rosenkranz und Kazlauskas 1999).
Die Ligandenbindung der PDGF-Isoformen führt zur Dimerisierung von zwei Rezeptoruntereinheiten mit konsekutiver Erhöhung der intrinsischen Tyrosinkinase- aktivität und Autophosphorylierung des Rezeptors. Die Bindung spezifischer Signal- transduktionsmoleküle an phosphorylierte Tyrosine führt zur Aktivierung von Signal- transduktionskaskaden, welche selektiv PDGF-induzierte zelluläre Reaktionen ver- mitteln (Hunzelmann et al. 2007).
PDGF vermittelt seine biologische Aktivität durch die Aktivierung von zwei spezi- fischen, transmembranären Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK), α-PDGFR und β-PDGFR (Rosenkranz und Kazlauskas 1999). Die verschiedenen PDGF-Isoformen binden an die beiden Rezeptorsubtypen mit unterschiedlicher Affinität. Während die PDGF-B-Kette mit beiden Subtypen assoziiert, bindet die PDGF-A-Kette exklusiv an den α-PDGFR.
Somit induziert PDGF-AA ausschließlich αα-Homodimere, während PDGF-AB zur Bildung von αα- sowie αβ-Dimeren und PDGF-BB zur Bildung aller möglichen Rezeptordimere führt. PDGF-C bindet bevorzugt an den α-Rezeptor und PDGF-D vor- wiegend an den β-Rezeptor (Hunzelmann et al. 2007).
2.6.6 c-Met
Der Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF), der von mesenchymalen Zellen erzeugt wird (Gherardi et al. 1993), wurde als wichtigster Mediator der Leberregeneration identi- fiziert (Michalopoulos 1990). Der Rezeptor für HGF c-Met wird hauptsächlich in epithelialen Zellen exprimiert (Prat et al. 1991). c-Met, ein transmembraner Tyrosin- kinaserezeptor, wird vom c-met Protoonkogen kodiert (Park et al. 1986). Das parakrine
oder autokrine HGF/c-Met Signalsystem trägt zur Tumorentstehung und -progression bei und korreliert mit der Invasivität und schlechten Prognose bei vielen menschlichen Karzinomen und Sarkomen. Bei verschiedenen menschlichen Tumoren besteht eine negative Korrelation zwischen der c-Met Expression mit der Aggressivität des Tumors (Naka et al. 2008), Der chromosomale Standort vom c-met Protoonkogen wurde auf 7q31 lokalisiert (Glukhova et al. 2000). Steigerungen von 7q finden sich unter den häufigsten Chromosomenveränderungen, 69 % der Chordome zeigen eine 7q Steigerung (Scheil et al. 2001). Daraus wurde geschlossen, dass c-Met im Frühstadien der Tumorentstehung eine Rolle spielt (Naka et al. 2008, Weinberger et al. 2005). Eine Expression von c-Met konnte bei gut differenzierten Tumoren festgestellt werden, aber nicht bei verschiedenen schlecht differenzierten Tumoren. Schließlich korreliert eine c-Met Expression auch mit einer besseren Prognose (Aishima et al. 2002, Furukawa et al. 1995, Nakopoulou et al. 2000, Terada et al. 1998).
2.6.7 CD-34
Der Begriff Cluster of Differentiation bezeichnet Gruppen immunphänotypischer Ober- flächenmerkmale von Zellen, die sich nach biochemischen oder funktionellen Kriterien ordnen lassen. Bei den CD-Molekülen handelt es sich um membrangebundene Glyko- proteine, die teilweise zellspezifisch exprimiert werden. Bisher sind einige hundert Moleküle charakterisiert worden.
CD-34 ist ein Antigen, das unter anderem von epithelialen Progenitorzellen (EPC) und zirkulierenden endothelialen Progenitorzellen (CEP) exprimiert wird (Werner und Nickenig 2004, Rabelink et al. 2004).
2.7 Prognose
Chordome wachsen primär lokal destruktiv und weisen wegen ihrer hohen Rezidivrate eine schlechte Prognose auf (Erdem et al. 2003). Unbehandelt liegt das mittlere Über- leben nur bei 6 bis 24 Monaten (Eriksson 1981). Noch 1993 lag die 5-Jahres-Über- lebensrate bei 58 % (Bjornsson et al. 1993) bzw. 51 % Forsyth et al. (1993). Vor
wenigen Jahren überlebte kaum ein Patient 10 Jahre (Barnes und Kapadia 1994). Nach den neuesten Studien kam es in den letzten Jahren zu einer deutlichen Verbesserung der Prognose. Innerhalb eines Zeitraums von 5 Jahren überlebten alle 10 Chordompatienten (Maier et al. 2006). Die 5-Jahres-Überlebensrate lag bei 82,5 % (Yoneoka et al. 2008) und die 10-Jahres-Überlebensrate bei 59 %, 74 % für Neufälle und 48 % für Patienten mit Rezidiven (Almefty et al. 2007).
Dabei wird die Prognose durch die Lokalrezidive bestimmt. Bei Fernmetastasen handelt es sich meist um pulmonale oder ossäre Filiae, seltener um Metastasen der Weichteile, des ZNS oder der Leber. Dedifferenzierte Chordome metastasieren häufiger als kon- ventionelle (Sundersan 1986). Nach zwei Multivarianzanalyse waren außerdem folgende Faktoren prognostisch ungünstig: Weibliches Geschlecht, Tumornekrosen sowie ein Tumorvolumen von über 70 ml (Forsyth et al. 1993, O’Connel et al. 1994).
Ein Alter über 40 Jahre war nur nach der einen Studie ungünstig (Forsyth et al. 1993).
Nach weiteren Studien war insbesondere das weibliche Geschlecht mit einer signifikant schlechteren Prognose verbunden (Gay et al. 1995, Terahara et al. 1999). Dagegen war die Prognose nach einer neueren Studie unabhängig von Alter und Geschlecht (Almefty et al. 2007). Prognostisch ungünstig sind eine vorhergehende Bestrahlung oder Operation (Gay et al. 1995).
Eine Heilung kann nur nach einer radikalen operativen Entfernung im Gesunden erreicht werden (Klekamp und Samii 1996). Wegen der diffusen Infiltration und Destruktion insbesondere des Knochens ist die vollständige Resektion jedoch schwierig oder sogar unmöglich (Wang et al. 2004). Mit dem Einsatz moderner chirurgischer und radiotherapeutischer Verfahren kann eine mittlere Lebenserwartung von 5,7 Jahren erreicht werden (Wacker et al. 2002).
2.8 Therapie
Patienten mit Chordomen der Schädelbasis werden meist durch eine Operation mit nachfolgender Bestrahlungstherapie behandelt (Ammirati und Bernardo 1999, Chugh et al. 2007, St. Martin und Levine 2003).
Obgleich Chordome der Schädelbasis auf chirurgischen Weg allein nicht heilbar sind, ist die operative Behandlung dieser Tumoren die Therapie der ersten Wahl (Chugh et al.
2007, Erdem et al. 2003). Ziel der Operation ist in erster Linie die Dekompression neurovaskulärer Strukturen, hierbei insbesondere des Hirnstammes. Somit wird gleich- zeitig auch eine verbesserte Ausgangssituation für die adjuvante Strahlentherapie geschaffen.
Bei den mannigfaltigen, seit Anfang des 20. Jahrhunderts beschriebenen, operativen Zugängen zum Clivus haben insbesondere die Einführung des Operationsmikroskopes Ende der 60er Jahre, die CCT und MRT Diagnostik, das intraoperative neurophysio- logische Monitoring, sowie die Neuronavigation maßgeblich zu einer Reduzierung der Morbidität und Mortalität beigetragen. Längere Überlebensraten sind mit einer mehr extensiven Tumorentfernung verbunden. Diese gelingt in fast 90 % der Fälle (Al-Mefty und Borba 1997).
Chordome zählen zu den radioresistenten Tumoren, was Dosen von über 60 Gy not- wendig macht, um einen Effekt zu erzielten (Noël et al. 2003). Gegenüber der kon- ventionellen Bestrahlung wird durch die Anwendung von geladenen Teilchen wie Protonen die Sensitivität des Tumors erhöht bei gleichzeitiger Verminderung der Nebenwirkungen (Maier et al. 2006). Diese Therapieform ist gerade auch für kleine Chondrome geeignet (Igaki et al. 2004). Die physikalischen und ballistischen Eigen- schaften erlauben zudem einen höheren Dosisgradienten zwischen dem Zielgebiet und den umgebenden Strukturen (Casali et al. 2007). Es liegen auch bereits Erfahrungen mit Helium- und Kohlenstoffionen vor (Chugh et al. 2007). Schwerionen zeichnen sich gegenüber Protonen durch eine noch höhere biologische Effektivität aus (Schulz-Ertner et al. 2002, 2004, Wacker et al. 2002).
Auf eine zytotoxische Chemotherapie sprechen Chordome, wie viele andere niedrig- gradige Malignitäten, nur schlecht an (Chugh et al. 2007). Sie spielt daher in der Praxis keine Rolle (Casali et al. 2007, St. Martin und Levine 2003). Einen neuen viel ver- sprechenden Therapieansatz stellt die Hemmung der RTKs (receptor tyrosine kinases) dar (Weinberger et al. 2005), z. B. durch monoklonale Antikörper (Herbst und Shin 2002), was unter anderem in unserer Studie weiteruntersucht werden soll.
2.9 Fragestellung
Tyrosin-Kinase-Rezeptoren wie VEGFR2 (McMahon 2000), PDGFR-α (Board und Jayson 2005), EGFR (Hof et al. 2006, Nicholson et al. 2001), c-Met (Naka et al. 2008) und iNOS (Fitzpatrick et al. 2008, Lechner und Rieder 2005) spielen bei der Tumor- Progression und wahrscheinlich der Rezidivrate eine pathophysiologisch bedeutsame Rolle, wie Untersuchungen an zahlreichen humanen Tumoren gezeigt haben.
In zerebralen Chordomen wurde bereits teilweise die Expression von EGFR (Fasig et al.
2008, Weinberger et al. 2005), PDGFR-α (Tamborini et al. 2006) sowie c-Met (Naka et al. 1997b, 2008, Weinberger et al. 2005) an kleineren Patientenkollektiven untersucht.
Die anderen pathophysiologisch ebenfalls relevanten Proteine iNOS, Ki-M1P, VEGFR-2, die an der Neoangiogenese der Chordome beteiligt sein könnten, sind bisher noch nicht untersucht worden.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war, anhand einer, im Vergleich zur der Literatur, sehr großen Tumorbank das immunhistochemische Verhalten der vorgenannten Proteine in zerebralen und spinalen Chordomen zu analysieren. Neben einer semiquantitativen Auswertung der Expressionsstärke in Paraffinschnitten bioptischen Tumorgewebes wurde auch deren Koexpression bzw. Korrelation untereinander untersucht. Durch die hohe Anzahl der untersuchten Tumoren sollte hierbei die statistische Aussagekraft bezüglich der Expressionsstärke und Korrelation verstärkt werden.
Chordome können mit sehr unterschiedlichen Rezidivraten verbunden sein. Der Zusammenhang zwischen der Expressionsstärke der iNOS, VEGFR 2, Ki-M1P, PDGFR-α, c Met, EGFR und CD-34 mit dem Auftreten von Rezidiven sollte ebenfalls untersucht werden.
3. Material und Methode
3.1 Patientenkollektiv
Es wurde eine retrospektive Untersuchung von 71 Patienten mit histologisch gesicherten Chordomen der Schädelbasis durchgeführt, welche im Zeitraum von 1979 bis 2008 in der Neurochirurgischen Klinik des Nordstadtkrankenhauses in Hannover operiert worden sind. Von diesen Patienten waren 40 Männer und 31 Frauen. Als Vergleichsgruppe dienten acht weitere Patienten, fünf Männer und drei Frauen, mit spinalen Chordomen.
3.2 Methode
3.2.1 Gewebematerialien
Grundlage der vorliegenden Studie waren 169 Paraffinblöcken, die als Multi-Tissue Block aufgearbeitet worden waren.
3.2.2 Multi-Tissue Block
Als junges Unternehmen hat die Multiblock GmbH mit Sitz in Hannover ein neues Ver- fahren zur Herstellung von Paraffinblöcken mit multiplen Gewebeproben (= Multi- block) zum Patent angemeldet. Die simultane Untersuchung vieler verschiedener Gewebeproben in einem Multiblock spart sowohl Reagenzien als auch Zeit. Als weiterer wesentlicher Vorteil werden dabei alle Gewebe unter völlig identischen Bedingungen gefärbt. Bei der Untersuchung großer Fallkollektive werden somit Tagesschwankungen im Labor weitgehend ausgeschlossen. Darüber hinaus kann zur Qualitätssicherung in jeden Multiblock eine entsprechende Positiv- und Negativkontrolle von vornherein mit eingebracht werden. Auch die anschließende Auswertung der Reaktionsergebnisse wird durch den Multiblock erheblich beschleunigt (Abb. 6).
Abb. 6: Darstellung von mehreren Multitissue Blöcken mit unterschiedlicher Anzahl von Proben. In unserer Studie wurden 3 Multitissue Blöcke mit 96, 60 und 13 Proben erstellt
Arbeitsschritte zur Erstellung des Multi-Tissue Blocks:
Schritt 1 - Auswählen und Markieren
Für die Multiblockerstellung wird nur ein kleiner Teil des Archivmaterials benötigt.
Hierzu wird das gewünschte Areal auf einem aktuellen (d. h. für den vorhandenen Paraffinblock repräsentativen) HE-Schnitt mit einem dünnen wasserfesten Markerstift (z. B. Edding‚ o. ä.) markiert.
Schritt 2 - Gewebestanzen herstellen
Mit einer von der Firma gelieferten Handstanze wird nun unter sanftem Druck senkrecht in die farbig markierten Areale des Paraffinblocks, ca. 5 mm tief oder bis zum Anschlag bei Kunststoffkassetten gestochen. Wie bei einem Kugelschreiber kann durch das Drücken auf das Stempelende Gewebe oder Paraffin aus der Hohlnadel nach vorne ausgeworfen werden.
Durch das Drehen der Handstanze mehrfach leicht hin und her wird der Gewebestanzzylinder in der Nadel vom Boden des Blockes abgelöst. Danach wird die Nadel senkrecht wieder herausgezogen.
Durch Druck auf den Stempel wird die gewonnene Gewebestanze herausgeschoben und kann in ein Transportröhrchen vorsichtig abgestreift werden
Schritt 3 - Zuordnen und Archivieren und Versenden
Dies ist einer der wichtigsten Schritte. Da die Gewebestanzen fast gleich aussehen, ist die Verwechslungsgefahr groß und eine nachträgliche Zuordnung unmöglich. Um Ver- wechslungen zu vermeiden sollte immer nur ein Röhrchen geöffnet, dann gestanzt und dieses sofort nach Befüllen verschraubt werden.
Mit dem fertigen Multiblock wird eine Schablone, aus der die genaue Position der Gewebestanzen ersichtlich wird, geliefert. Anhand der entsprechenden Gewebetabelle (gleiche MB-Nr.) kann dann jede einzelne Gewebestanze im Multiblock identifiziert werden.
3.2.3 Immunhistochemie Färbung
Die Substrat-Chromogenreaktion, die benutzt wurde, um die Peroxidase sichtbar zu machen, lässt keine Unterscheidung zu, ob es sich bei dem nachgewiesenen Enzym um das Enzym handelt, das durch die Immunreaktion das zelluläre Antigen lokalisiert oder ob es sich um enzymatische Aktivität handelt, die im Präparat schon vor Beginn der Anfärbung vorhanden war.
Vorrangig findet sich die endogene Peroxidaseaktivität in roten und weißen Blutkörper- chen. Sofern diese Aktivität nicht vor Zugabe des markierenden Enzyms blockiert wird, ist eine positive Anfärbung nicht nur auf das spezifische Antigen, sondern auch auf die im Gewebe bereits vorhandene Peroxidaseaktivität zurückzuführen.
Die endogene Peroxidase wurde blockiert, indem die Schnitte 10 Minuten in einer 3 %igen H2O2/PBS-Lösung aufbewahrt und anschließend mit PBS gespült wurden.
Dann wurden die Primärantikörper aufgetragen, in einer Feuchtkammer (Schott, DE) bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubiert und danach die überschüssigen Antikörper
gespült. Dazu wurden die Objektträger aus dem Bad genommen und die Flüssigkeit vor- sichtig um den Schnitt herum abgetupft.
Der nächste Schritt im Färbevorgang war die Applikation der Sekundärantikörper auf die Schnittproben. Diese Brückenantikörper, die von Mäusen bzw. Kaninchen stammen (amouse/a-rabbit; Vector, Barlingame, USA), wurden 30 Minuten mit den Proben inkubiert. Nach der nochmaligen Spülung wurde 30 μl peroxidasekonjugiertes Avidin- Biotin-Komplex (Vector, Barlingame, USA) aufgetragen und 45 Minuten inkubiert.
Während des nächsten Waschvorgangs wurde die Chromogene Substrat-Lösung (Sigma, Deisenhofen, DE) unter Lichtausschluss angesetzt. Das Substrat wurde für 10 Minuten auf die Schnitte gegeben und anschließend zweimal mit Acetatpuffer gespült.
Danach wurden die Objektträger in einer Küvette einminütig mit Gill’s Hämatoxylin (Sigma, Deisenhofen, DE) gegengefärbt. Die Intensität der Gegenfärbung kann durch die Länge der Färbezeit in Hämatoxylin reguliert werden. Eine zu intensive Gegen- färbung kann die positive Anfärbung durch Peroxidase maskieren. Im Anschluss wurden die Schnitte in Leitungswasser 5 Minuten gebläut und in Mowiol (Sakara Finetek, California, USA) eingedeckt.
Als Kontrollen wurden die Präparate ohne den Primärantikörper gefärbt.
Die optimale Verdünnung bzw. Konzentration der Antikörper in 0,5%iger PBSA (Phosphat Buffered Saline mit boviner Albuminfraktion; Serva, Heidelberg, DE) wurde in Vorversuchen ermittelt (Tab. 2).
Tab. 2: Verdünnung der eingesetzten Antikörper in 0,5% iger PBSA Antikörper Art Herkunft Ver-
dün- nung
Hersteller
1) iNOS Polyklonal Kaninchen 1:50 Dunn Labortechnik GmbH, Asbach, Germany
2) Ki-M1P Polyklonal Kaninchen 1:1000 Institut für
Hämatopathologie, Kiel, Germany
3) VEGFR-2 Polyklonal Kaninchen 1:20 Dunn Labortechnik GmbH, Asbach, Germany
4) EGFR Polyklonal Kaninchen 1:20 Dunn Labortechnik GmbH, Asbach, Germany
5) PDGFR-α polyklonal Kaninchen 1:100 Lab Vision, Suffolk, UK 6) C-Met Polyklonal Kaninchen 1:500 Santa Cruz Biotechnology,
Heidelberg, Germany 7) CD-34 Monoklonal Maus 1:30 Abcam Plc, Cambridge, UK
Die immunhistochemische Auswertung der Proben wurde getrennt durch zwei unab- hängige Beobachter durchgeführt. Für die Auszählung der positiven Zellen waren nicht nur die Felder mit der größten Gewebedichte relevant, sondern der gesamte Schnitt wurde beurteilt. Als Negativkontrolle dienten die ohne primären Antikörper gefärbten Schnittproben. Der Ausprägungsgrad der immunhistochemisch gefärbten Präparate wurde nach dem Schema von Iwata et al. (1999) festgestellt:
• Grad 0: keine Reaktion erkennbar
• Grad 1: geringe Immunreaktivität
• Grad 2: mäßige Immunreaktivität
• Grad 3: intensive Immunreaktivität
3.2.4 Statistische Auswertung
Die Erfassung der Daten erfolgte mit dem Programm Excel 2000 (Microsoft). Die statistische Auswertung wurde mit WinStat 3.1 (Kalmia Company, USA) vorgenom- men.
Zunächst erfolgte eine deskriptive Auswertung der Variablen mit der Ermittlung von Häufigkeit (n) und Anteil (%).
Bei den beiden durchgeführten statistischen Testverfahren (U-Test und Spearman-Test) wurde die Irrtumswahrscheinlichkeit in zwei Signifikanzniveaus angegeben (p < 0,05 signifikant und p < 0,01 hochsignifikant).
Durch den U-Test (Mann, Whitney und Wilcoxon) werden zwei unverbundene Stich- proben derselben Variablen auf Unterschiedlichkeit getestet. Es wird keine bestimmte Verteilungsform vorausgesetzt. Zudem muss die Variable nur ordinalskaliert sein, da nicht die Messwerte selbst, sondern ihre Rangplätze verwendet werden. Ordinalskaliert bedeutet, dass die Daten Wertungen darstellen, wobei die Linearität der Skala nicht gesichert ist.
Durch die Spearman-Rangkorrelation werden zwei Variablen auf Korrelation getestet.
Voraussetzungen über die Verteilungsform bestehen nicht, die Variablen brauchen nur ordinalskaliert zu sein.
4. Ergebnisse
4.1 Immunhistochemische Ergebnisse
Die Expression der untersuchten Antikörper wurde lichtmikroskopisch nach Lokalisation und Intensität der Expression ausgewertet.
Die höchsten immunhistochemischen Nachweise für kranielle Chordome fanden sich für c-Met und PDGFR-α. In allen Fällen lagen die Expression im hohen oder mittleren Bereich. Es folgen Ki-M1P mit 89 % und EGFR mit 85 % der Fälle mit mittlerer bzw.
höherer Expressionsstärke. Deutlich niedriger waren die Anteile bei CD-34 (63 %) und iNOS (54 %). Schließlich lag die Expressionsstärke für VEGFR-2 nur in einem Fall im hohen Konzentrationsbereich (Abb. 7).
Bei spinalen Chordomen waren die immunhistochemischen Nachweise für PDGFR-α und VEGFR-2 am höchsten. Auch bei iNOS und Ki-M1P lag die Expression in allen Fällen im hohen oder mittleren Bereich. Es folgen EGFR und c-Met mit jeweils 88 % der Fälle mit mittlerer bzw. höherer Expressionsstärke. Deutlich niedriger waren die Anteile bei CD-34 (50 %) (Abb. 8).
Die Expression von iNOS und VEGFR-2 war bei den spinalen Chordomen hochsigni- fikant höher als bei den kraniellen Chordomen (p<0,001, U-Test). Hinsichtlich PDGFR-α bestand eine Tendenz (p=0,0668, U-Test). Die anderen Proteine unterschie- den sich nicht signifikant zwischen kraniellem oder spinalem Chordom.
11 1
52 5
22 7
18 6
26
22 19
16 17
13
34
16 44
44 54 58
11
1
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
iNOS Ki-M1P VEGFR-2 EGFR PDGFR-alpha c-Met CD-34
Anteil keine wenig mittel hoch
Abb. 7: Immunhistochemische Ergebnisse, dargestellt sind alle n=71 Patien- ten mit kraniellem Chordom (bei mehreren Messungen pro Patient Darstellung der mittleren Bewertung).
1 1
4
3 4 1
1 2
3
5 4 6
8
5
1
7
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
iNOS Ki-M1P VEGFR-2 EGFR PDGFR-alpha c-Met CD-34
Anteil keine wenig mittel hoch
Abb. 8: Immunhistochemische Ergebnisse, dargestellt sind n=8 Patienten mit spinalen Chordomen als Kontrollgruppe
Charakteristische lichtmikroskopische Aufnahmen der verschiedenen Anfärbungen sind in den nachfolgenden Seiten (Abb. 9 bis Abb. 22) aufgeführt.
iNOS: Es zeigte sich, dass teilweise sowohl die Endothelzellen als auch das Zytoplasma bzw. der Zellausläufer der Tumorzellen angefärbt waren. Eine starke Farbreaktion trat nur in 16 Fällen bei Clivuschordomen auf.
VEGFR-2: Das Zytoplasma der Tumorzellen färbte sich bei Clivuschordomen geringfügig aber homogen. Eine membranständige Expression der Zellausläufer wurde nur vereinzelt festgestellt. In 52 von 71 untersuchten Patienten mit Clivuschordom war keine Expression nachweisbar. Nur in einem Fall wurde eine starke Expression festgestellt.
Ki-M1P: Es konnte hierbei eine starke Expression sowohl perikapillär als auch im Bereich des Zytoplasmas der Tumoren festgestellt werden. Der Zellkern war vereinzelt ebenfalls positiv. Insgesamt war die Expression sowohl bei Clivus- als auch bei spinalen Chordomen stark positiv.
EGFR: Die stärkste Anfärbung war im Bereich der Zellmembran bzw. der Zellausläufer zu verzeichnen. Das Zytoplasma war in den meisten Fällen homogen aber schwach angefärbt. Der Zellkern jedoch war von der Anfärbung ausgespart.
PDGFR-α: Eine sehr starke positive Anfärbung fand sich hier im Bereich des Zellkerns und des Zytoplasmas. Der Zellausläufer war hier ebenfalls stark positiv angefärbt.
c-Met: Die wesentliche Anfärbung fand sich hier im Bereich des Zytoplasmas und der Zellausläufer. Der Zellkern blieb wesentlich von der Anfärbung ausgespart.
CD-34: Die stärkste CD-34 Expression war im Bereich der Endothelzellen zu finden.
Das Zytoplasma bzw. der Zellkern der Tumoren waren nicht angefärbt.
Abb. 9: Intrakranielles Chordom: iNOS-Expression, Intensitätsgrad 2, 4fache Vergrößerung
Die iNOS Expression war bei den spinalen Chordomen (Abb. 11) deutlich stärker positiv als bei den kraniellen Chordomen (Abb. 10).
Abb. 10: Intrakranielles Chordom: iNOS-Expression, Intensitätsgrad 3, 25fache Vergrößerung
Abb. 11: Spinales Chordom: iNOS-Expression, Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung
Auch VEGFR-2 war bei den spinalen Chordomen (Abb. 12) deutlicher positiv als bei den intrakraniellen Chordomen (Abb. 13).
Abb. 12: Intrakranielles Chordom: VEGFR-2-Expression, Intensitätsgrad 1, 4fache Vergrößerung
Abb. 13: Spinales Chordom: VEGFR-2-Expression, Intensitätsgrad 3, 25fache Vergrößerung
Abb. 14: Intrakranielles Chordom: KiM-1P-Expression, Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung
Abb. 15: Intrakranielles Chordom: EGFR-Expression, Intensitätsgrad 3, 4fache Vergrößerung
Abb. 16: Spinales Chordom: EGFR-Expression, Intensitätsgrad 3, 25fache Vergrößerung
Abb. 17: Intrakranielles Chordom: PDGFR-α-Expression, Intensitätsgrad 3, 4fache Vergrößerung
Abb. 18: Spinales Chordom: PDGFR-α-Expression, Intensitätsgrad 3, 4fache Vergrößerung
Abb. 19: Intrakranielles Chordom: c-Met-Expression, Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung
Abb. 20: Spinales Chordom: c-Met-Expression: Intensitätsgrad 3, 10fache Vergrößerung
Abb. 21: Intrakranielles Chordom: CD-34-Expression:, Intensitätsgrad 2, 4fache Vergrößerung
Abb. 22: Intrakranielles Chordom: CD-34-Expression, Intensitätsgrad 2, 10fache Vergrößerung
4.2 Zusammenhänge
Die Marker iNOS, Ki-M1P und CD-34 korrelierten signifikant mit allen Tumormarkern außer mit c-Met. Eine weitere Korrelation bestand zwischen PDGFR-α und EGFR. Nur c-Met korrelierte mit keinem anderen Tumormarker (Tab. 3).
Tab. 3: Korrelationen (Spearman-Rang) zwischen den immunhistochemi- schen Ergebnissen (n=72), angegeben sind die Korrelationskoeffi- zienten und die p-Werte (Fettdruck für p<0,1)
Ki-M1P VEGFR-2 EGFR PDGFR-α c-Met CD-34
k 0,5303 0,3300 0,2774 0,4207 0,1489 0,9137 iNOS (II)
p 0,0000 0,0023 0,0092 0,0001 0,1059 0,0000
k 0,4181 0,2742 0,3851 0,0118 0,4014
Ki-M1P
p 0,0001 0,0099 0,0004 0,4610 0,0002
k -0,0356 0,0905 0,0029 0,3506
VEGFR-2
p 0,3833 0,2249 0,4905 0,0013
k 0,2030 0,1810 0,2456
EGFR
p 0,0436 0,0640 0,0188
k 0,0721 0,3693
PDGFR-α
p 0,2735 0,0007
k 0,1702
c-Met
p 0,0765
Alter und Geschlecht korrelierten mit keinem der Tumormarker. Das Vorkommen eines Tumorrezidivs korrelierte mit dem Tumormarker VEGFR-2. VEGFR-2 korrelierte außerdem mit Hirnstamm, suprasellär und Sinus cavernosus. Schließlich bestand ein Zusammenhang zwischen PDGFR-α und Sinus cevernosus (Tab. 4).
Tab. 4: Zusammenhänge zwischen Alter, Geschlecht, Tumorrezidiv, Tumor- lokalisation und Ausdehnung mit den immunhistochemischen Ergeb- nissen (n=58), angegeben sind die p-Werte (Fettdruck für p<0,1) (U-Test)
iNOS Ki-M1P VEGFR-2 EGFR PDGFR-α c-Met CD-34
Alter 0,157 0,288 0,210 0,203 0,458 0,326 0,311
Geschlecht 0,768 0,762 0,836 0,528 0,576 0,597 0,656 Tumorrezidiv 0,442 0,174 0,0503 0,132 0,653 0,199 0,303 Clivus ausschließlich Lokalisation im Clivus
HSG 0,774 0,974 0,213 0,935 0,636 0,128 0,897 Hirnstamm 0,662 0,113 0,0129 0,807 0,453 0,233 0,735 4. Ventrikel 0,949 0,439 0,543 0,200 0,488 0,128 0,685 suprasellär 0,523 0,297 0,0645 0,173 0,971 0,261 0,401 3. Ventrikel 0,581 0,129 0,247 0528 0,927 0,290 0,575 Sinus
cevernosus 0,827 0,686 0,0290 0,247 0,0809 0,246 0,687 HSG = Hintere Schädelgrube
Es fanden sich einige signifikante Zusammenhänge zwischen den Symptomen und den Tumormarkern. So war VEGFR-2 bei den Patienten mit einer Sehstörung signifikant erhöht und bei denen mit einer Ataxie oder Hydrocephalus signifikant erniedrigt. EGFR war signifikant erhöht bei Patienten mit einer Apraxie und erniedrigt bei denen mit Hirnnervenausfällen. Bei den Patienten mit einem Hirn-Organischen Psychosyndrom waren sowohl PDGFR-α als auch CD-34 erhöht (Tab. 5).
Tab. 5: Zusammenhang zwischen den Symptomen und den immunhisto- chemischen Ergebnissen, berechnet für jeden Patienten (n=58), angegeben sind die p-Werte (Fettdruck für p<0,1) (U-Test)
Symptom
iNOS (II) Ki-M1P VEGFR-2 EGFR PDGFR-α c-Met CD-34
Hemiparese 0,933 0,522 0,389 0,408 0,897 0,757 0,721 Apraxie 0,318 0,510 0,429 0,0306 0,175 0,124 0,379 Aphasie 0,701 0,243 0,898 0,933 0,189 0,124 0,636 Sehstörung 0,237 0,102 0,0852 0,477 0,118 0,945 0,285 Kopfschmerzen 0,254 0,335 0,225 0,159 0,387 0,843 0,418 Epileptische Anfälle 0,405 0,854 0,452 0,212 0,843 0,635 0,855 Ataxie 0,609 0,398 0,0370 0,529 0,993 0,523 0,753 Kaudale Hirnnerven-
störung 0,603 0,607 0,407 0,315 0,910 0,729 0,496 Hirnnervenausfälle 0,501 0,561 0,287 0,066 0,197 0,264 0629 Hydrocephalus 0,873 0,351 0,0425 0,713 0,449 0,514 0,605 Hirn-Organisches
Psychosyndrom 0,156 0,381 0,593 0,674 0,00389 0,563 0,0699 Fehlhaltung 0,987 0,255 0,443 0,442 0,979 0,481 0,826 Paraparese zu geringe Fallzahl (n=1)
Tetraparese zu geringe Fallzahl (n=3)
4.3 Alter und Geschlecht
71 Patienten fanden Eingang in die Studie. Es handelte sich um 40 Männer und 31 Frauen. Das Alter war von 70 Patienten bekannt. Dieses betrug im Mittel 43,9 Jahre, der älteste Patientin war 94 Jahre alt, der jüngste Patient 17 Jahre alt. Es ließ sich kein ein- deutiger Altersgipfel ausmachen (Abb. 23).
7
12 11
8
18
11
2
0 1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
10-19. 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79 80-89 90- 100 Alter [Jahre]
Anzahl der Patienten
Abb. 23: Altersverteilung von n=31 Patienten
4.4 Symptomatik
Die Symptomatik war bei 58 Patienten dokumentiert. Demnach waren die häufigsten Symptome Kopfscherzen (86 %), Sehstörungen (81 %) und Hirnnervenausfälle (71 %).
Eine größere Rolle spielten auch kaudale Hirnnervenstörung (47 %), Fehlhaltung (40 %), Apraxie (36 %), Aphasie (36 %), Hemiparese (33 %), Ataxie (33 %) und Hirn- Organisches Psychosyndrom (31 %). Die Symptome Hydrocephalus (22 %) und Epi- leptische Anfälle (19 %) hatten eine geringere Bedeutung. Selten kam es zu Tetraparese oder Paraparese (Abb. 24).
19 21 21
47 50 11
19 27
41 13
18 23 1
3
39 37 37
11 8 47
39 31
17 45
40 35 57
55
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%
Hemiparese Apraxie Aphasie Sehstörung Kopfschmerzen Epileptische
Anfälle Ataxie Kaudale Hirnnervenstörung Hirnnervenausfälle Hydrocephalus Hirn-Organisches Psychosyndrom
Fehlhaltung Paraparese Tetraparese
Anteil vorhanden nicht vorhanden
Abb. 24: Symptomatik (n=58)
4.5 Tumorlokalisation und Ausdehnung
Angaben zur Tumorlokalisation und Ausdehnung fanden sich bei 58 Patienten.
Bei allen Patienten lag eine Lokalisation im Clivus vor. Weitere Lokalisationen in abnehmender Reihenfolge waren hintere Schädelgrube, Hirnstamm, 4. Ventrikel, Sinus Cavernosus, suprasellär und 3. Ventrikel (Tab. 6).
Tab. 6: Tumorlokalisation und Ausdehnung (n=58)
vorhanden nicht vorhanden
Clivus 58 (100 %) 0 (0 %)
Hintere Schädelgrube (HSG) 34 (59 %) 24 (41 %)
Hirnstamm 33 (57 %) 25 (43 %)
4. Ventrikel 24 (41 %) 34 (59 %)
suprasellär 21 (36 %) 37 (64 %)
3. Ventrikel 10 (17 %) 48 (83 %)
Sinus cavernosus 22 (38 %) 36 (62 %)
4.6 Tumorrezidive
Bei 35 von 58 Patienten (64 %) wurde mindestens ein Tumorrezidiv festgestellt. In den meisten Fällen (43 %) lagen gleich zwei Rezidive vor (Abb. 25).
1 Rezidiv 19%
2 Rezidive 43%
kein Rezidiv 36%
3 Rezidive 2%
Abb. 25: Anzahl der Tumorrezidive (n=58)
4.7 Mortalität
Drei Patienten sind verstorben, ein Mann ein Jahr nach Erstmanifestation, eine Frau vier Jahre nach Erstmanifestation und ein Mann 11 Jahre nach Erstmanifestation.
5. Diskussion
5.1 Zweck der Studie
Chordome gehören zu den sehr seltenen Tumoren (McMaster et al. 2001). Aus diesem Grund sind die individuellen und institutionellen Erfahrungen sehr begrenzt. Ferner ist der Tumor, im Vergleich zu den anderen Tumoren mit höherer Anzahl an Veröffent- lichungen, relativ wenig wissenschaftlich erforscht. Zudem weisen die meisten Studien nur eine geringe Fallzahl auf. Insbesondere gibt es bis heute keine einheitliche, auf wissenschaftliche Grundlagen gestützte Behandlungsstrategie, vielmehr beruht die Therapie auf der Erfahrung weniger Institutionen. Die Wirksamkeit der bei vielen Tumoren angewandten Chemo- und konventionellen Strahlentherapie erwies sich bei Chordomen als sehr begrenzt (Chugh et al. 2007,Noël et al. 2003).
Bei zahlreichen humanen Tumoren konnte gezeigt werden, dass Tyrosin-Kinase- Rezeptoren wie VEGFR2 (McMahon 2000), PDGFR-α (Board und Jayson 2005), EGFR (Hof et al. 2006, Nicholson et al. 2001), c-Met (Naka et al. 2008) und iNOS (Fitzpatrick et al. 2008, Lechner et al. 2005) bei der Tumor-Progression und wahr- scheinlich der Rezidivrate eine pathophysiologisch wichtige Rolle spielen. Die Hemmung der RTKs (Weinberger et al. 2005), z. B. durch monoklonale Antikörper (Herbst und Shin 2002) würde somit einen neuen vielversprechenden Therapieansatz darstellen.
Bei zerebralen Chordomen wurde bereits die Expression von EGFR (Fasig et al. 2008, Weinberger et al. 2005), PDGFR-α (Tamborini et al. 2006) sowie c-Met (Naka et al.
1997b, 2008, Weinberger et al. 2005) teilweise untersucht. Die genannten Studien mit Ausnahme der Studie von Naka et al. (2008), die an der Erstellung dieser Arbeit auch mitgewirkt hat, wiesen allerdings nur eine kleine Fallzahl auf, so dass die statistische Aussagekraft diesbezüglich eingeschränkt ist. Die anderen pathophysiologisch ebenfalls relevanten Proteine iNOS, Ki-M1P, VEGFR-2 sind bisher noch nicht an Chordomen untersucht worden.
Daher sollte in der vorliegenden Arbeit bei einer größeren Anzahl von Patienten semi- quantitativ die Expressionsstärke der vorgenannten Proteine in zerebralen und spinalen
Chordomen ermittelt werden. Dies könnte die wissenschaftliche Grundlage für mögliche zukünftige Therapieoptionen bilden:
• Die Hemmung der RTKs (Weinberger et al. 2005), z. B. durch monoklonale Antikörper (Herbst und Shin 2002), könnte einen zukünftigen Therapieansatz darstellen. Durch die Untersuchung der Expression ließe sich ableiten, welche der RTKs für einen Eingriff möglicherweise besonders empfänglich wären.
Durch die Ermittlung der Koexpression bzw. Korrelation der Proteine unter- einander könnte gefolgert werden, ob eine Kombinationstherapie sinnvoll wäre.
• Durch die Analyse der Zusammenhänge zwischen der Expressionsstärke und dem Auftreten von Rezidiven ließen sich Aussagen zur Prognose ableiten. Der Zusammenhang zwischen der Expressionsstärke und der klinischen Sympto- matik gäbe möglicherweise Hinweise über die Schwere und Verlauf der Erkrankung.
5.2 Immunhistochemische Ergebnisse
iNOS:
Bei den intrakraniellen Chordomen lag die iNOS-Expression in 54 % und bei den spinalen Chordomen in allen Fällen im mittleren oder hohen Bereich. Die signifikant geringere Expression bei Patienten mit intrakraniellen Chordomen kann nach der Ein- sicht der Patientenakte darauf zurückgeführt werden, dass diese Patienten perioperativ mit Dexamethason behandelt worden sind. Denn die Induktion der iNOS durch Hemmung der mRNA-Translokation und gesteigerte Degradation von iNOS-Proteinen kann durch Dexamethason gehemmt werden (Kunz et al. 1996).
Aus der Literatur sind keine Vergleichszahlen für Chordome bekannt, allerdings wurde festgestellt, dass die iNOS-Aktivität bei Kopf/Hals-Tumoren ebenfalls erhöht ist (Gallo et al. 1998). Durch den NOS-Inhibitor L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) konnte beim Kaninchen die Angiogenese verhindert werden (Gallo et al. 1998). Es wäre daher eine mögliche Therapieoption, dass Chordome durch einen Eingriff in den iNOS- Regelkreis behandelt werden.
Ki-M1P:
Die Ki-M1P-Expression lag bei kraniellen Chordomen in 89 % der Fälle und bei den spinalen Chordomen in allen Fällen im mittleren oder hohen Bereich. Dieser Unter- schied war nicht signifikant. Eine hohe Ki-M1P Expression der Chordome könnte in unserer Studie durch die Infiltration des Tumorgewebes mit Monozyten/Makrophagen (potenzielle iNOS-Quelle) erklärt werden. Auch zu Ki-M1P sind aus der Literatur keine Vergleichszahlen bekannt. Zu anderen Tumoren liegen bislang ebenfalls noch keine Untersuchungen vor.
VEGFR-2:
Bei den kraniellen Chordomen war die VEGFR-2-Expression nur in einem Fall stark positiv, während sie bei den spinalen Chordomen in allen Fällen positiv war. Die stark verminderte Expression von VEGFR-2 kann hier ebenfalls durch die perioperative Behandlung der Patienten mit Dexamethason erklärt werden. (Kunz et al. 1996). Zur VEGFR-2-Expression bei Chordomen existieren in der Literatur ebenfalls noch keine Studien.
VEGF ist an der Angiogenese zahlreicher solider Tumoren beteiligt (McMahon 2000).
In einer Studie wurde dies auch bei Knorpeltumoren, 5 Enchondromas und 21 Chondro- sarkome, bestätigt. Die Chondrosarkome teilen sich auf in neun mal Grad 1, sechs mal Grad 2, vier mal Grad 4 und jeweils ein mesenchymales und myxoides Chondrosarkom.
Die VEGF-Expression war bei den Chondrosarkomen Grad 1 in 3/9 Fällen schwach und fokal, Grad 2 in 2/6 Fällen stark und ausgedehnt und Grad 3 in 2/4 Fällen stark und aus- gedehnt. Außerdem wurde eine enge Korrelation zwischen der VEGF-Expression und dem Nachweis von intraknorpeligen Gefäßen festgestellt. Daraus wurde die Vermutung abgeleitet, dass die VEGF-Expression für die Bildung von intraknorpeligen Gefäßen notwendig sei. Da VEGF an der Neoangiogenese eine entscheidende Rolle spielt, ist die VEGF-Expression für die Erhaltung eines intakten Knorpels sowie für die Tumor- progression unentbehrlich (Ayala et al. 2000). Hieraus könnte sich auch ein therapeutischer Ansatz für Patienten mit Chordomen ableiten.
EGFR:
Die EGFR-Expression lag bei den intrakraniellen Chordomen in 85 % und spinalen Chordomen in 88 % der Fälle im mittleren oder hohen Bereich. Die Werte sind mit der Studie von Weinberger et al. (2005) vergleichbar, hier lag der Anteil bei 80 %. Fasig et al. (2008) fanden mit 52 % einen deutlich geringeren Anteil (Tab. 7).
Tab. 7: EGFR-Expression bei Chordomen in verschiedenen Studien
Autor Fälle keine
(0)
schwach (+)
moderat (++)
stark (+++)
Weinberger et al. (2005) 10 0 2 3 5
Fasig et al. (2008) 21 7 4 7 3
eigene Studie (kraniell) 71 5 6 16 45
eigene Studie (spinal) 8 0 1 1 6
Neben den Chordomen exprimieren noch zahlreiche weitere menschliche Tumore EGFR auf der Zelloberfläche. Dabei korreliert die Expression von EGFR mit schlechter Prognose und hoher Tumoraggressivität (Hof et al. 2006). Der Eingriff in die Regulation des EGFR’s ist daher ein vielversprechender Ansatz zur Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung von Karzinomen (Huang und Harari 1999). Die Effektivität einer EGFR-Blockade konnte bereits in vivo und in vitro an verschiedenen Tumortypen demonstriert werden (Herbst und Shin 2002). Durch das Blockieren des EGFR’s ist die Aktivität der Tyrosinkinase verringert, was die nachgelagerte Signaltransduktion hemmt. Dies führt zu einer verringerten Zellproliferation und Zelldifferenzierung. Die Förderung von Apoptose, Antiangiogenese und die Ausübung einer antikörper- abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität kann hierbei ebenfalls erzeugt werden.
(Herbst und Shin 2002).
In einer neuen Studie wurde ein Patient mit sakralem Chordom mit Cetuximab in Kombination mit Gefitinib behandelt. Cetuximab blockiert die Bindung von EGF an den EGFR und Gefitinib hemmt die Tyrosinkinaseaktivität, die normalerweise von EGFR aktiviert wird. Innerhalb eines Nachbeobachtungszeitraums von 9 Monaten
zeigten sowohl das Lokalrezidiv als auch die Lungenmetastasen eine partielle Remission. Die Hemmung des EGF-Signalwegs scheint daher eine wirksame Maß- nahme in der Therapie der Chordome zu sein (Hof et al. 2006).
PDGFR-α:
Während PDGFR-α in Tumorzellen vorkommt, wird PDGFR-β im stromalen Raum des Tumors stark exprimiert. Die autokrine Aktivierung von PDGFR-α fördert am Beispiel der Gliomzellen die Proliferation und PDGFR-β stimuliert die Angiogenese und damit die Vaskularisation (Rosenkranz und Kazlauskas 1999). Die PDGFR-α-Expression lag bei den kraniellen und spinalen Chordomen jeweils in allen Fällen im mittleren oder hohen Bereich. Tamborini et al. (2006) fand dagegen in allen Fällen eine schwache Expression. In der Literatur finden sich Angaben zur PDGFR-β-Expression, nach Tamborini et al. (2006) lag diese in 28 % der Fälle im moderaten Bereich und nach Fasig et al. (2008) in 95 % der Fälle im mittleren oder hohen Bereich (Tab. 8).
Tab. 8: PDGFR-α-(β)-Expression bei Chordomen in verschiedenen Studien
Autor Typ Fälle keine
(0)
schwach (+)
moderat (++)
stark (+++)
α 12 0 12 0 0
Tamborini et al. (2006)
β 18 0 13 5 0
Fasig et al. (2008) β 21 0 1 9 11
eigene Studie (kraniell) α 71 0 0 17 55
eigene Studie (spinal) α 8 0 0 0 8
PDGFR zählt neben dem EGFR und c-Met zu den Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) Protoonkogenen. Die RTK sind an einem wichtigen Zellsignalpfad der Karzinompro- gression beteiligt. Diese Moleküle dienen als membrangebundene Zytokinrezeptoren und initiieren eine intrazelluläre Signalkaskade auf Ligandenbindung. Alle diese RTKs besitzen mitogene, und möglicherweise transformierende Qualitäten auf die Aktivie- rungs- und Signaltransduktion via Tyrosinkinasephosphorylierung. In Übereinstimmung mit der Studie von Weinberger, wäre die Hemmung der RTKs, wie bereits bei anderen
soliden Tumoren angewandt wird, eine mögliche Therapieoption für Patienten mit Chordomen (Weinberger et al. 2005). Die Behandlung mit Imatinibmesylate, ein Inhibitor einiger Tyrosinkinaserezeptoren wie PDGFR-A und PDGFR-B führte bei Patienten mit Chordomen zu einer Stabilisierung der Erkrankung, klinischen Ver- besserung und Erhöhung der Lebensqualität (Casali et al. 2004, Stacchiotti et al. 2007).
Es wurde die Vermutung abgeleitet, dass PDGFR-A durch das parakrine oder autokrine Signalsystem aktiviert wird. Chordome zeigen eine deregulierte Expression von PDGFR-A und PDGFR-B, welche möglicherweise durch Imatinibmesylate inhibiert wird (Tamborini et al. 2006)
c-Met:
Bei den intrakraniellen Chordomen lag die c-Met-Expression in allen Fällen und bei den spinalen Chordomen in 88 % der Fälle im mittleren oder hohen Bereich. Dieser Unter- schied erreichte jedoch aufgrund der kleinen Fallzahl für spinale Chordome nicht das Signifikanzniveau. In Übereinstimmung mit unserer Studie wurde von Naka et al.
(1997b) und Weinberger et al. (2005) in fast allen Fällen eine c-Met Expression ermittelt. Dagegen lag nach der neueren Studie von Naka et al. (2008) nur in 70 % der Fälle eine hohe oder mittlere Expression von c-Met vor (Tab. 9).
Tab. 9: c-Met-Expression bei Chordomen in verschiedenen Studien
Autor Fälle keine
(0)
schwach (+)
moderat (++)
stark (+++)
Naka et al. (1997b) 18 1 17
Weinberger et al. (2005) 10 0 1 2 7
Naka et al. (2008) 46 14 3 4 25
eigene Studie (kraniell) 71 0 0 14 58
eigene Studie (spinal) 8 0 1 2 5
CD-34:
Bei den intrakraniellen Chordomen lag die CD-34-Expression in 63 % und bei den spinalen Chordomen in 50 % der Fälle im mittleren oder hohen Bereich. Die insgesamt relativ niedrige CD-34 Expression, als Endothelzellmarker, korrespondiert mit einer geringen Vaskularisation der Chordome. Bei den Chondromen wurde nur sehr selten eine abnorme Tumorvaskularisation beschrieben (Erdem et al. 2003).
5.3 Zusammenhänge
5.3.1 Korrelation der Marker untereinander
Nach den Ergebnissen dieser Studie korrelierten die Marker iNOS, Ki-M1P und CD-34 signifikant mit allen anderen Tumormarkern außer mit c-Met. Eine weitere Korrelation bestand zwischen PDGFR-α und EGFR. Nur c-Met korrelierte mit keinem anderen Tumormarker. Auch Naka et al. (2008) ermittelten keine Korrelation zwischen der c-Met-Expression und Vimentin oder S-100 Protein. Im Gegensatz zu unserer Studie fanden Weinberger et al. (2005) eine signifikante Korrelation zwischen c-Met und EGFR.
Da alle Patienten unserer Studie eine stets höhere c-Met-Expression aufwiesen, konnte dementsprechend statistisch keine Korrelation zwischen c-Met und den übrigen Tumormarkern ermittelt werden.
5.3.2 Alter und Geschlecht
Alter und Geschlecht korrelierten nach unserer Studie nicht signifikant mit den Tumor- markern. Nach Naka et al. (2008) waren die Patienten mit einer höheren (moderat oder stark) c-Met-Expression mit 38,4 Jahren signifikant jünger als die mit einer niedrigeren (keine oder schwach) c-Met-Expression mit 48 Jahren. Da in unserer Studie alle Patienten eine höhere c-Met-Expression aufwiesen, konnte dieser Zusammenhang nicht verifiziert werden. Naka et al. (2008) fanden ebenfalls keinen Zusammenhang zwischen der c-Met-Expression und dem Geschlecht.
