N - A c e t y l t r a n s f e r a s e 2
( P h ä n o t y p i s i e r u n g : C o f f e i n - T e s t )
Anwendbarkeit Analyt. Messprinzip
Bestimmung in Urin
Hochleistungsflüssigchromatographie/
UV Detektion
Zusammenfassung
Das hier beschriebene Verfahren dient zur Phänotypisierung der N-Acetyltranfera- se 2 (NAT 2) über den so genannten Coffein-Test [1]. Dabei wird nach Gabe von Coffein (in der Regel in Form von Bohnenkaffee) das Verhältnis der Coffein-Meta- boliten 5-Acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil (AFMU) und 1-Methylxan- thin (1-MX) undzueinander bestimmt (AFMU/1-MX). Anhand dieses Verhältnis- ses kann zwischen sogenannten langsamen und schnellen Acetylierern unterschie- den werden [2�14].
Dazu wird Urin mit einem Gemisch aus Chloroform und Isopropanol extrahiert.
Nach Entfernen des Lösungsmittels im Stickstoffstrom wird der Rückstand in Me- thanol/Ameisensäure aufgenommen. Die quantitative Bestimmung der beiden Cof- fein-Metaboliten erfolgt nach hochleistungsflüssigchromatographischer Auftren- nung mittels UV-Detektion. Dabei wird das Standardadditionsverfahren eingesetzt.
1-Methylxanthin (1-MX)
Präzision in der Serie: Standardabweichung (rel)
Streubereich sw = 14% bzw. 6,4%
u = 32,2% bzw. 15,0%
bei einer Konzentration von 60 bzw. 96 nmol 1-MX pro Milliliter Urin und n = 10 bzw. 8 Bestimmungen
Analytische Methoden Band 2
Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft � Arbeitsgruppe ,,Analytische Chemie"
Präzision von Tag zu Tag:
sw = 16,7% bzw. 9,1%
Richtigkeit:
Nachweisgrenze:
Standardabweichung (rel)
Streubereich u = 41,7% bzw. 21,4%
bei einer Konzentration von 37,5 bzw. 58,5 nmol 1-MX pro Milliliter Urin und jeweils n = 6 bzw. 8 Bestimmun- gen
Wiederfindungsrate r = 83 � 98% bei 37,5�200 nmol/mL 5 ng 1-MX pro Milliliter Urin (0,03 nmol/mL) 5-Acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil (AFMU)
Präzision in der Serie:
Präzision von Tag zu Tag:
Richtigkeit:
Nachweisgrenze:
Standardabweichung (rel) Streubereich
sw = 27,4% bzw. 21,3%
u = 61,1% bzw. 50,0%
bei einer Konzentration von 6,6 bzw. 135 nmol AFMU pro Milliliter Urin und n = 10 bzw. 8 Bestimmungen Standardabweichung (rel)
Streubereich sw = 25,3% bzw. 29,1%
u = 63,2% bzw. 68,4%
bei einer Konzentration von 7,8 bzw. 125 nmol AFMU pro Milliliter Urin und jeweils n = 6 bzw. 8 Bestimmun- gen
Wiederfindungsrate r = 72 � 79% bei 6,6�135 nmol/mL 5 ng AFMU pro Milliliter Urin (0,022 nmol/mL) NAT 2
Allgemeine Grundlagen zur N-Acetyltransferase 2 wurden bereits ausführlich be- schrieben im Rahmen der Methodenvorschrift zur Genotypisierung der N-Acetyl- transferase 2 in diesem Band. Es wird ausdrücklich auf den entsprechenden Ab- schnitt verwiesen.
Autor: M. Blaszkewicz Prüfer: E. Richter, J. Lewalter
1 Grundlage des Verfahrens
Urin wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Isopropanol extrahiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Stickstoffstrom wird der Rückstand in Methanol/
Ameisensäure aufgenommen. Die quantitativen Bestimmung der beiden Coffein- Metaboliten 1-Methylxanthin (1-MX) und 5-Acetylamino-6-formylamino-3-me- thyluracil (AFMU) erfolgt nach hochleistungsflüssigkeitschromatographischer Auftrennung mittels UV-Detektion. Dabei wird das Standardadditionsverfahren eingesetzt.
2 Geräte, Chemikalien und Lösungen 2.1 Geräte
HPLC-System bestehend aus Systemcontroller mit zwei Gradientenpumpen, einer Vorrichtung zum Entgasen der Eluenten, einem Säulenthermostat, einem Injekti- onsventil, einem automatischen Probengeber, einem UV-Detektor sowie einem In- tegrator bzw. einem PC-System zur Datenauswertung.
Hochleistungsflüssigkeitschromatographische Säule:
RP18 endcapped, Länge: 250 mm; innerer Durchmesser: 4,6 mm; Teilchendurch- messer: 4 µm (z.B. Superspher 100 RP-18EC von Merck)
10-mL-Polyethylenröhrchen
Eppendorf-Reaktionsgefäße, 1,5 mL mit �safe lock" Verschlussdeckel Eppendorf-Reaktionsgefäße, 2 mL mit �safe lock" Verschlussdeckel Laborzentrifuge (z.B. Hettich)
Messkolben, 10, 100 und 1000 mL Microvials für HPLC-Autosampler
1-mL-Vollpipette
pH-Meter (z. B. Metrohm)
Vibrationsmischer (Vortex-Mixer) (z. B. Heidolph) Rüttelmischer für Reaktionsgefäße (z. B. Eppendorf)
Standzylinder, 100 mL
Stickstoffabblasstation mit beheizbarem Probenblock passend für die verwendeten Reaktionsgefäße
Variabel einstellbare Pipette, 10�100 µL (z.B. Eppendorf) Variabel einstellbare Pipette, 100�1000 µL (z.B. Eppendorf) Variabel einstellbare Pipette, 1000�5000 µL (z.B. Eppendorf) verschließbare Kunststoff-Flaschen zur Probenlagerung
2.2 Chemikalien
Ameisensäure, 98�100% p. A. (z. B. Fa. Merck) Ammoniumsulfat p. A. (z. B. Fa. Merck) Chloroform p. A. (z.B. Fa. Merck) Isopropanol p. A. (z. B. Fa. Merck) Methanol p. A. (z. B. Fa. Baker) Stickstoff, 99,996%
Salzsäure, 37% p. A. (z.B. Fa. Riedel-de Haen) Ammoniak, 25% p. A. (z. B. Fa. Merck)
1-Methylxanthin(1-MX)(z.B.Fa. Sigma, MG = 166,14 g/mol)
5-Acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil (AFMU) ! lichtgeschützt lagern (z. B. Biochemisches Institut für Umweltcarcinogene, Lurup 4, 22927 Großhans- dorf, Deutschland, siehe auch Addendum)
2.3 Lösungen
Mobile Phase A (6% Methanol in 0,01 M Ameisensäure):
In einem 1-L-Messkolben werden ca. 600 mL Wasser vorgelegt. Es werden 377 µL Ameisensäure (100%) und 60 mL Methanol hinzupipettiert. Anschließend wird der Kolben unter zwischenzeitlichem Umschwenken mit Wasser bis zur Marke auf- gefüllt. Die mobile Phase ist zu entgasen.
Mobile Phase B:
100% Methanol. Die mobile Phase ist zu entgasen.
Extraktionslösung (Chloroform/Isopropanol 97:3 v/v):
In einem Becherglas werden 97 Volumenteile Chloroform mit 3 Volumenteilen Iso-
propanol gemischt. Die anzusetzende Menge richtet sich nach dem Probenaufkom- men. Für jede zu analysierende Probe werden insgesamt 6 mL Extraktionslösung benötigt (jeweils Doppelbestimmung von Null- und Zusatzprobe). Die Extraktions- lösung ist fest verschlossen mehrere Wochen haltbar.
0,01 M Ameisensäure:
In einen 100-mL-Messkolben werden 37,7 µL Ameisensäure (entspricht 46 mg) pipettiert. Anschließend wird der Kolben mit dest. Wasser bis zur Marke aufgefüllt.
Salzsäure zum Ansäuern der Urinproben (ca. 6 N):
In eine 250-mL-Vorratsflasche mit Stopfen werden mittels Standzylinder 60 mL 32%ige Salzsäure sowie 40 mL destilliertes Wasser gegeben. Das Vorratsgefäß wird verschlossen und zur Durchmischung umgeschwenkt.
2.4 Vergleichsstandards Stammlösung AFMU:
Ca. 2 mg AFMU werden genau in einen 10-mL-Messkolben eingewogen (200 µg/
mL = 0,88 µmol/mL). Der Kolben wird anschließend mit mobiler Phase A bis zur Marke aufgefüllt. Der Lösungsvorgang wird unterstützt durch eine 5-minütige Ul- traschallbehandlung (Überhitzung vermeiden!). Das Volumen wird in 500-µL-Por- tionen in Kunststoffgefäße aliquotiert und tiefgefroren bei ca. �20°C gelagert. Tief- gefroren ist die Stammlösung mehrere Monate haltbar.
Eine 500-µL-Portion ist ausreichend für die Bestimmung von 39 Proben. Für den Gebrauch muss diese Stammlösung nach dem Auftauen wiederum ca. 5 Minuten im Ultraschallbad behandelt werden. Für jeden Messtag wird eine neu aufgetaute 500-µL-Portion verwendet.
Stammlösung 1-MX:
Ca. 2 mg 1-MX werden genau in einen 10-mL-Messkolben eingewogen (200 µg/
mL = 1,2 µmol/mL). Man fügt unter gelegentlichem Umschwenken etwa 8 mL 0,01 M Ameisensäure hinzu. Es werden 25 µL 25%iger Ammoniaklösung hinzupi- pettiert. Der Kolben wird anschließend mit 0,01 M Ameisensäure bis zur Marke aufgefüllt. Der Lösungsvorgang muss unterstützt werden durch eine Ultraschallbe- handlung (mind. 15 min). Das Volumen wird in 500-µL-Portionen in Kunststoff- gefäße aliquotiert und tiefgefroren bei ca. �20°C gelagert. Tiefgefroren ist die Stammlösung mehrere Monate haltbar.
Eine 500-µL-Portion ist ausreichend für die Bestimmung von 39 Proben. Für den Gebrauch muss diese Stammlösung nach dem Auftauen wiederum ca. 15 Minuten im Ultraschallbad behandelt werden. Nach dem Auftauen ist die Lösung mehrere Wochen im Kühlschrank bei ca. 4�6°C haltbar.
3 Probenahme und Probenvorbereitung 3.1 Probenahme
Die zu untersuchende Person erhält � möglichst nach erfolgter Blasenentleerung � 2 Tassen Coffein-haltigen Bohnenkaffee. Wenn in Ausnahmefällen der Bohnenkaf- fee abgelehnt wird, kann alternativ eine entsprechende Menge schwarzen Tees oder eines Cola-Getränkes bzw. eine Coffeintablette (z.B. Coffeinum N 0,2 g Tabletten von Merck) verabreicht werden. Nach 4 Stunden wird der Proband gebeten, eine Urinprobe abzugeben. Der Urin wird sofort mit 6 N HCl auf pH 3,5 eingestellt (Kontrolle des pH-Werts mittels pH-Elektrode) und kann dann in verschließbaren Kunststoff-Flaschen bei �20°C tiefgefroren aufbewahrt werden. Die angesäuerten, eingefrorenen Urinproben sind mehrere Wochen haltbar.
Coffein-Konzentrationen in den genannten Getränken:
� Kaffee: 75�215 mg pro 150 mL Tasse,
� schwarzer Tee: 40�55 mg pro 150 mL Tasse,
(unter der Annahme 1 Teebeutel mit 1,8�2,2 g Tee pro 200 mL Wasser),
� Cola-Getränke: 10�40 mg pro 150 mL.
3.2 Probenaufbereitung
Vor der Analyse werden die Proben ggf. aufgetaut und gut durchmischt.
In einem 1,5-mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß werden 500 µL der Urinprobe mit 500 µL Wasser verdünnt (Schritt 1, Tabelle 1). In ein weiteres 1,5-mL-Eppendorf- Reaktionsgefäß pipettiert man 450 µL der so verdünnten Probe und 50 µL mobile Phase A (Nullprobe). In ein zweites 1,5-mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß werden nacheinander 25 µL AFMU-Stammlösung, 450 µL der verdünnten Urinprobe und 25 µL 1-MX Stammlösung gegeben (Zusatzprobe) (Schritt 2, Tabelle 1). Aus Null- probe und Zusatzprobe werden jeweils Doppelbestimmungen angesetzt.
In 2-mL-Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit �safe lock" Deckel werden dazu für je zwei Null- und zwei Zusatzproben eine Spatelspitze Ammoniumsulfat (~ 70 mg) vorgelegt. Anschließend pipettiert man jeweils 100 µL der Proben aus Schritt 2 und 1,5 mL Chloroform/Isopropanol (97:3; v/v) hinzu. Jedes Gefäß muss direkt nach Zugabe des Extraktionsmittels dicht verschlossen werden (Schritt 3, Tabelle 1).
Tab. 1. Aufarbeitungsschema.
Die Probengefäße werden zunächst auf einem Vibrationsmischer kurz durchmischt und anschließend 3 Minuten auf einem Rüttelmischer geschüttelt. Sollte sich dabei das Ammoniumsulfat vollständig aufgelöst haben, muss erneut Ammoniumsulfat hinzu gegeben und geschüttelt werden. Anschließend wird 2 Minuten bei 4000 U/
min zentrifugiert.
1 mL der unteren (!) organischen Phase wird mit einer Vollpipette in ein unbe- nutztes 1,5-mL-Eppendorf-Gefäß transferiert. Dabei ist darauf zu achten, dass nichts von dem am Gefäßboden befindlichen Ammoniumsulfat mit aufgenommen wird. Die organische Phase wird bei 45°C unter Stickstoff verdampft. Der Rück- stand wird in 500 µL mobiler Phase A aufgenommen und anschließend 2 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert. Sollen die Proben nicht am gleichen Tag vermessen werden, können diese direkt nach Abzug des Lösungsmittels bei �18 bis �20°C ein- gefroren werden.
Ca. 250 µL der aufbereiteten Probe werden schließlich in ein HPLC-Autosampler- Gläschen pipettiert zur nachfolgenden flüssigchromatographischen Trennung und UV-Detektion.
4 Instrumentelle Arbeitsbedingungen
4.1 Hochleistungsflüssigchromatographische Arbeitsbedingungen Trennsäule:
Trennprinzip:
Temperatur:
Detektion:
Mobile Phase:
Gradient:
Flussrate:
Injektionsvolumen:
Retentionszeit:
Material:
Länge:
innerer Durchmesser:
Säulenfüllung:
Stahl 250 mm 4,6 mm Superspher 100 RP-18EC, 4 µm Reversed phase
25°C
UV-Detektor (270 nm)
Mobile Phase A: 6% Methanol in 0,01 M Ameisensäure Mobile Phase B: 100% Methanol
(Die Eluenten sind vor ihrem Einsatz zu entgasen!) 0�18 min 100% A, 0% B
18,0�18,5 min 0% A, 100% B (Gradient) 18,5�19,0 min 0% A, 100% B
19,0�19,5 min 100% A, 0% B (Gradient) 19,5�37 min 100% A, 0% B
1,0 mL/min 50 µL AFMU:
1-MX:
5,6 min 16,7 min
(AAMU: 3,9 min; DAMU: 8,5 min, siehe Addendum) Alle anderen Parameter sind nach Herstellerangaben zu optimieren.
Unter den beschriebenen chromatographischen Bedingungen ergaben sich die oben angegebenen Retentionszeiten. Diese Angaben können nur als Anhaltspunkt die- nen. Der Anwender hat sich selbst von der Trennleistung der HPLC-Säule und des daraus resultierenden Retentionsverhaltens der Substanzen zu überzeugen.
Abbildung 1 am Ende der Methode zeigt beispielhaft HPLC-Chromatogramme, die mit dem hier beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
5 Analytische Bestimmung
Von den nach Abschnitt 3 aufgearbeiteten Urinproben werden jeweils 50 µ L in das HPLC-Gerät injiziert. Je zwei der nach Abschnitt 3, Tabelle 1 (Aufarbeitungssche-
ma) vorbereiteten Analysenlösungen werden unter Zugrundelegung der vorstehen- den Geräteparameter (vgl. Abschnitt 4) analysiert (Doppelbestimmung). Die Peak- flächen werden registriert. Man erhält so jeweils zwei Chromatogramme für die Nullprobe sowie zwei Chromatogramme für die dotierte Zusatzprobe zur Ermitt- lung des Analysenergebnisses.
Bei jeder Analysenserie wird eine Qualitätskontrollprobe mitanalysiert.
6 Kalibrierung und Berechnung der Analysenergebnisse
Der AFMU- und 1-MX-Gehalt in den zu untersuchenden Urinproben wird gra- phisch mit Hilfe des Standardadditionsverfahrens ermittelt. Dazu werden die vom Integrator ermittelten mittleren Peakflächen der undotierten (Nullproben) sowie der dotierten Proben (Zusatzprobe) gegen die jeweils dotierten AFMU- und 1-MX- Konzentration aufgetragen (im Falle der Nullprobe ist die dotierte Konzentration = 0). Es resultiert je eine Gerade, deren Schnittpunkt mit der negativen Konzentra- tionsachse den Betrag des AFMU- bzw. 1-MX-Gehalts in nmol pro Milliliter 1:2 verdünntem Urin angibt.
Die nachfolgende Gleichung, in der der Faktor 2 zur Berücksichtigung der 1:2 Ver- dünnung des Urins eingefügt ist, fasst dieses Vorgehen beispielhaft für AFMU ma- thematisch zusammen:
Die AFMU- und 1-MX-Konzentration wird in Doppelbestimmungen ermittelt (Null- und Zusatzprobe werden doppelt analysiert). Aus den jeweils ermittelten Konzentrationen wird der Mittelwert berechnet.
Ermittlung des Acetyliererstatus:
Die Ermittlung des Acetyliererstatus erfolgt über das molare Verhältnis von AFMU zu 1-MX in den Urinproben. Zur Bildung des Quotienten wird die molare AFMU- Konzentration durch die molare 1-MX-Konzentration dividiert. Ist der Quotient (AFMU / 1-MX) kleiner als 1, erfolgt die Zuordnung zu den langsamen Acetylie- rern; ist er größer oder gleich 1 zu den schnellen Acetylierern.
7 Standardisierung der Messergebnisse und Qualitätssicherung Zur Sicherung der Qualität der Analysenergebnisse wird gemäß den Richtlinien der Bundesärztekammer [15, 16] und den speziellen Vorbemerkungen dieses Werkes verfahren. Zur Präzisionskontrolle wird eine Urinkontrollprobe mit untersucht, die
eine konstante Konzentration an Analyten aufweist. Da käufliches Material nicht zur Verfügung steht, muss das Kontrollmaterial selbst hergestellt werden. Dazu empfiehlt es sich, angesäuerten (!) Urin bzw. Mischurin zu verwenden und mit 1-MX sowie AFMU im entscheidungsrelevanten Konzentrationsbereich zu dotie- ren. Dieser Urin sollte von Personen gewonnen werden, die innerhalb der letzten 24 Stunden keine Coffein-haltigen Getränke zu sich genommen hatten. Alternativ dazu kann auch angesäuerter Urin bzw. Mischurin von Personen verwendet werden, die 2 bis 4 Stunden vor der Urinspende eine entsprechende Coffein-Menge zu sich genommen haben. Eine zusätzliche Dotierung ist hier nicht mehr notwendig.
Von diesem Kontrollmaterial wird ein Halbjahresbedarf in verschließbare 2-mL Reaktionsgefäße aliquotiert und tiefgefroren aufbewahrt. Der Sollwert und die To- leranzbereiche des Qualitätskontrollmaterials werden im Rahmen einer Vorperiode (an 20 Tagen je eine Analyse des Kontrollmaterials) ermittelt [17�19].
8 Beurteilung des Verfahrens 8.1 Präzision
Zur Ermittlung der Präzision in der Serie wurden native Urinproben von Personen verwandt, denen 4 Stunden vor der Urinspende 2 Tassen Bohnenkaffee zum Trin- ken gegeben wurden. Diese Urinproben wurden gemäß den vorhergehenden Ab- schnitten analysiert. Bei der 10- bzw. 8-fachen Bestimmung dieser Urinproben er- gaben sich die in Tabelle 2 dokumentierten Präzisionen in der Serie.
Tab. 2. Präzisionen in der Serie (MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung, VK = Variations- koeffizient, WR = Wiederfindung; Probe 1 = langsamer Acetylierer; Probe 2 = schneller Acety- lierer).
Probe
1
2
statistische Daten MW SD VK MW SD VK
AFMU nmol/mL 6,6 1,8 27,3%
28,7 135 21,2%
WR 75%
78%
1-MX nmol/mL 60 8,4 14,0%
96,6 6,15 6,4%
WR 83%
84%
mol. Verhält.
AFMU 1-MX 0,11 0,02 18,7%
1,39 0,24 17,3%
Anzahl der Messungen
n = 10
n = 8
Darüber hinaus wurde die Präzision von Tag zu Tag bestimmt. Hierzu wurde eben- falls natives Material von Probanden eingesetzt, denen vor der Urinspende Coffein
verabreicht wurde. Diese Urine wurden an 6�8 verschiedenen Tagen aufgearbeitet und analysiert. Die so ermittelten Präzisionen sind Tabelle 3 zu entnehmen.
Tab. 3. Präzisionen von Tag zu Tag (MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung, VK = Varia- tionskoeffizient, WR = Wiederfindung; Probe 1 und 2 = langsame Acetylierer; Probe 3 und 4 = schnelle Acetylierer).
Probe
1
2
3
4
statistische Daten MW SD VK MW SD VK MW SD VK MW SD VK
AFMU nmol/mL 7,8 1,95 25,30%
37,1 9,75 26,40%
125 13,8 11,10%
71,4 20,9 29,10%
WR 72%
79%
72%
72%
1-MX nmol/mL 59,1 5,4 9,10%
46,2 199 23,20%
80,6 20,9 26,00%
37,5 6,3 16,70%
WR 88%
98%
97%
90%
mol. Verhält.
AFMU 1-MX 0,13 0,04 28,80%
0,19 0,03 16,30%
1,67 0,6 35,80%
1,87 0,3 15,80%
Anzahl der Messungen
n=8
n=7
n=6
n=6
8.2 Richtigkeit
Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate (WR, Tabellen 2 und 3) des Zusatzes wurden die zur Ermittlung der Präzisionen eingesetzten Proben verwendet.
Aus der Flächendifferenz von Zusatzprobe und Nullprobe, der Konzentration eines Standards mit dem zugehörigen Flächenwert und einer Konstanten in ng/50 µL kann die Wiederfindung ermittelt werden. In der nachfolgend angegebenen Formel muss die Konzentration des Standards in ng/50 µL HPLC-Injektionsvolumen ein- gesetzt werden. Die Konstante 66,7 ng/50 µL lässt sich aus den Probenaufarbei- tungsschritten unter der Annahme einer 100%igen Überführung des Zusatzes be- rechnen.
In der Analyse sollten die Wiederfindungsraten für beide Analyten zwischen 65 und 100% liegen. Unabhängig vom Acetylierertyp erhält man mittlere Wiederfin- dungsraten von 75% für das AFMU und 90% für das 1-Methylxanthin.
8.3 Nachweisgrenzen
Die Nachweisgrenzen liegen für AFMU und 1-MX bei jeweils ca. 5 ng/mL. Aller- dings haben sie beim vorgegebenen Procedere der Coffein-Einnahme keine ent- scheidende Bedeutung. Bei allen bisher vom Autor untersuchten Proben wurden Gehalte über den Nachweisgrenzen gemessen. Die gefundenen Konzentrationen liegen nach Erfahrungen des Autors für das AFMU im Bereich von 0,5�60 µg/mL (2,2�360 nmol/mL) und für das 1-Methylxanthin zwischen 1�80 µg/mL (6�480 nmol/mL). Die hier angegebenen Konzentrationen gelten für unverdünnte Urinpro- ben.
8.4 Störeinflüsse
Trotz der aufwändigen Probenaufarbeitung können Störungen bei der chromatogra- phischen Trennung auftreten. In den Zeitfenstern der Elution der Hauptanalyten AFMU und 1-MX können Signale erscheinen, die aufgrund nicht genügender Tren- nung oder einer Koelution die Integration der Analytsignale verfälschen. In der Regel sind jedoch die mit der verwendeten chromatographischen Säule erreichten Auflösungen für eine Quantifizierung hinreichend.
Die Stabilität [22] von AFMU ist abhängig vom pH-Wert, der Temperatur und La- gerungszeit. Durch Deformylierung kann AFMU zu 5-Acetylamino-6-amino-3- methyluracil (AAMU) abgebaut werden. Diese Verbindung erscheint im Chroma- togramm vor dem AFMU. Bei der Auswertung sollte die Anwesenheit von AAMU geprüft werden. Bei Vorhandensein eines entsprechenden Peaks ist die AFMU- Stammlösung neu anzusetzen oder wie im Addendum beschrieben die AAMU- Konzentration abzuziehen.
Die Differenzierungsgrenze von 1,0 für den molaren Quotienten aus AFMU und 1-MX ist mitbestimmt durch die Korrelation von Phäno- zu Genotypisierung. Bei der Genotypisierung führt das Vorhandensein nur eines schnellen Allels zur Eintei- lung zu den schnellen Acetylierern. Die Phänotypisierung kann in solchen Fällen mit molaren Quotienten von 0,8 bis 1,0 einen langsamen Acetylierertyp ausweisen.
Diese Ergebnisse machen jedoch nur einen geringen Prozentsatz der Untersuchten aus. In der Literatur sind Studien zur intraindividuellen Variabilität der Typisierung, zu in-vivo/in-vitro-Vergleichen oder zu Phänotyp/Genotyp-Vergleichen vorhanden [23�28].
9 Diskussion der Methode
Problematisch für die Methode ist die etwas eingeschränkte Verfügbarkeit des AFMU-Analyten, der zum Zeitpunkt der Drucklegung nur von einem kommerziel- len Vertreiber angeboten wird. Die Synthese ist mehrstufig und kann nach Röhrka- sten et al. [20] durchgeführt werden (siehe Addendum).
Da die Extraktionsausbeuten der Analyten sehr stark von der Beschaffenheit der zu untersuchenden Urine abhängen, wurde die Methode der Standardaddition für die Quantifizierung gewählt. Die Wiederfindungsraten liegen für beide Analyten zwi- schen 70 und 100%. Bei niedrigeren Wiederfindungsraten sollte zur Aufklärung von Fehlern eine Wiederholungsmessung durchgeführt werden.
Die zweite Urinprobe (Doppelbestimmung) wird herangezogen, um bei den relativ hohen Präzisionen für das AFMU (� 20%) die individuelle Reproduzierbarkeit des Phänotypisierungsergebnisses sicherzustellen. Beide Bestimmungen sollten im Er- gebnis der Phänotypisierung nicht von einander abweichen. Unterschiedliche Er- gebnisse können nach Erfahrung von Autor und Prüfern bei etwa 1�2% der Typisie- rungen auftreten. Die Konstanz in der Bestimmung des Phänotyps wurde über die Zeit von 5 Wochen mit einer Bestimmung pro Woche für 1 schnellen und 3 lang- same Acetylierer untersucht. In keinem Fall wurden abweichende Typisierungen er- mittelt. Eine Prüfung an drei Folgetage bei zwei schnellen Acetylierern ergab eben- falls eine vollständige Konstanz.
Der Einfluss des Probenahmezeitpunkts ist von relativ untergeordneter Bedeutung.
Vergleicht man die Typisierungen bei Bestimmungen in Proben, die 2, 4 und 6 Stunden nach Coffein-Gabe genommen wurden, so liegen die Standardabweichun- gen der gemittelten 3 Quotienten zwischen 5 und 14% bei 5 Personen. Eine Abwei- chung in der Typisierung wurde hierbei nicht beobachtet. Da jedoch in der Literatur vereinzelt darauf hingewiesen wurde, dass der Zeitpunkt der Probenahme einen Einfluss auf das Phänotypisierungsergebnis haben kann (siehe Kapitel 1), sollte die Probenahme frühestens 4 Stunden nach Coffein-Gabe erfolgen.
Der Einfluss einer vollen oder leeren Blase vor der Coffein-Gabe wurde bei 7 Per- sonen geprüft. Abweichende Typisierungen wurden dabei nicht beobachtet.
Nach Einführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ergab sich die Möglich- keit, auch den Genotyp hinsichtlich der N-Acetyltransferase 2 zu bestimmen (siehe auch Methode NAT2 Genotypisierung in dieser Lieferung). Bislang fanden sich 19 Allele, die für einen �langsamen" Acetylierer kodieren. Das �schnelle" Allel ist über ein �langsames" Allel dominant. Die Korrelation zwischen Acetylierer-Phä- notyp (Coffein-Test) und Acetylierer-Genotyp (PCR) liegt zwischen 85 und 95%.
Die Validität dieser Zahlen wird durch eine Studie von Cascorbi et al. [23] gestützt, der bei 563 nicht verwandten Personen eine Genotypisierung (PCR) und Phänotypi- sierung (Coffein-Test) durchführte. Die Übereinstimmung in den Typisierungen lag bei über 93%.
Verwendete Messgeräte:
HPLC: Systemcontroller SCL 6B mit zwei Gradientenpumpen LC 6A, UV-Detek- tor SPD 6A und Probengeber Sil 6B von Shimadzu, Integrator HP-3394 A von Hewlett-Packard.
10 Literatur
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Autor: M. Blaszkewicz Prüfer: E. Richter, J. Lewalter
Addendum
Synthese der acetylierten Coffein-Metaboliten
Die Coffein-Metaboliten AAMU und AFMU können nach einer von Röhrkasten et al. [20] modifizierten Methode von Fink et al. [21] synthetisiert werden (vgl. Ab- bildungen 2 und 3). Das AAMU ist die Vorstufe (6. Stufe) in der Synthese zum AFMU und wird mit einer Reinheit von über 99% erhalten. Das AFMU enthält je- weils 5�10% AAMU und 5,6-Diacetylamino-3-methyluracil (DAMU). Das DAMU kann mittels HPLC unter Verwendung einer semipräparativen Säule aus ei- nem AFMU-Synthese-Produkt (7. Stufe) abgetrennt werden. AFMU ist über die Zeit nicht stabil. Durch Deformylierung entsteht AAMU, so dass eine wiederholte Reinheitskontrolle des Standards empfohlen wird. In den Abbildungen 2 und 3 ist der Syntheseweg schematisch dargestellt.
Syntheseweg für AFMU
Thioharnstoff (1) + Cyanessigsäureethylester (2): Kondensation mit Na-Ethano- lat zum
6-Amino-2-thiouracil (4): Methylierung mit Dimethylsulfat zum
6-Amino-2-methyl-3-methylthiouracil (6): Verseifung mit Natronlauge zum 6-Amino-3-methyluracil (8): Nitrosierung in Acetat-Puffer zum
6-Amino-3-methyl-5-nitrosouracil (9): Reduktion an Pd-Katalysator zum 5,6-Diamino-3-methyluracil (7): Acetylierung in Natriumacetat / Essigsäurean- hydrid zum
5-Acetylamino-6-amino-3-methyluracil (AAMU) (5): Formylierung in Ameisen- säure / Ameisensäure-Essigsäureanhydrid (gemischtes Anhydrid) zum
5-Acetylamino-6-formylamino-3-methyluracil (AFMU) (3)
Abb. 2. Schema der Synthese-Schritte zur Herstellung von AAMU und AFMU (die Zahlen in Klammern beziehen sich auf Abbildung 3).
Abb. 3. Synthese von AAMU und AFMU.
Bestimmung der AFMU-Konzentration aus selbst synthetisierten Ansätzen Das nachfolgend beschrieben Vorgehen dient zur Bestimmung der AFMU-Konzen- tration in der entsprechenden Stammlösung. Dies ist notwendig, da aus der Synthe- se erhaltenes AFMU in der Regel mit AAMU und DAMU verunreinigt ist. Darüber hinaus kann sich das AFMU in Lösung zersetzen zu AAMU. Es werden daher ana- lysentäglich aus den Stammlösungen Arbeitslösungen hergestellt. Mit diesen Ar- beitslösungen, die direkt in die HPLC-Anlage injiziert werden, wird der Gehalt an
AFMU in der AFMU-Stammlösung ermittelt. Die AFMU-Stammlösung kann für das Standardadditionsverfahren eingesetzt werden.
Stammlösung AFMU (aus 7-stufiger Synthese):
Ca. 2 mg AFMU werden genau in einen 10-mL-Messkolben eingewogen. Der Kol- ben wird anschließend mit mobiler Phase A bis zur Marke aufgefüllt. Der Lösungs- vorgang wird unterstützt durch eine 5-minütige Ultraschallbehandlung (Überhit- zung vermeiden!). Das Volumen wird in 500-µL-Portionen in Kunststoffgefäße ali- quotiert und tiefgefroren bei ca. �20 °C gelagert. (200 mg/L; 0,884 mmol/L) Stammlösung AAMU (aus Stufe 6 zur Synthese des AFMU):
Ca. 2 mg AAMU werden genau in einen 10-mL-Messkolben eingewogen. Der Kol- ben wird anschließend mit mobiler Phase A bis zur Marke aufgefüllt. Der Lösungs- vorgang wird unterstützt durch eine 15-minütige Ultraschallbehandlung. Das Volu- men wird in 500-µL-Portionen in Kunststoffgefäße aliquotiert und tiefgefroren bei ca. �20 °C gelagert. (200 mg/L)
Stammlösung DAMU (DAMU entsteht neben AFMU im letzten Schritt der Synthe- se und kann mittels semipräparativer HPLC abgetrennt werden):
Ca. 3 mg DAMU werden genau in einen 10-mL-Messkolben eingewogen. Der Kol- ben wird anschließend mit mobiler Phase A bis zur Marke aufgefüllt. Der Lösungs- vorgang wird unterstützt durch eine 15-minütige Ultraschallbehandlung. Das Volu- men wird in 500-µL-Portionen in Kunststoffgefäße aliquotiert und tiefgefroren bei ca. �20 °C gelagert. (300 mg/L)
Arbeitslösung AFMU:
100 µL der Stammlösung von AFMU wird in einen 10-mL-Messkolben pipettiert.
Der Kolben wird anschließend mit mobiler Phase A bis zur Marke aufgefüllt.
(2 mg/L; AFMU ist nicht stabil. Sein Gehalt in dieser Lösung ist zu bestimmen) Arbeitslösung AAMU:
50 µL der Stammlösung von AAMU werden in einen 10-mL-Messkolben pipet- tiert. Der Kolben wird anschließend mit mobiler Phase A bis zur Marke aufgefüllt.
(1 mg/L)
Arbeitslösung DAMU:
10 µL der Stammlösung von DAMU werden in einen 10-mL-Messkolben pipet- tiert. Der Kolben wird anschließend mit mobiler Phase A bis zur Marke aufgefüllt.
(0,3 mg/L)
Berechnung des AFMU-Gehalts in der Arbeitslösung AFMU
Es werden nacheinander jeweils 50 µL der Arbeitslösungen �AAMU", �DAMU"
und �AFMU" in die HPLC-Anlage injiziert und gemäß Abschnitt 4 vermessen. Die erhaltenen Peaks für die Analyten AAMU und DAMU werden integriert. Aus den so erhaltenen Peakflächen wird der Gehalt an AAMU und DAMU in der Arbeitslö- sung AFMU wie nachfolgend beschrieben ermittelt:
Bezogen auf die molaren Massen enthält eine aus der Synthese frisch angesetzte Arbeitslösung �AFMU" erfahrungsgemäß etwa 80% AFMU und jeweils ca. 10%
AAMU und DAMU. Fällt der Gehalt an AFMU unter 70%, so ist aus dem durch die Synthese erhaltenen Feststoff eine neue AFMU-Stammlösung anzusetzen. Der Ge- halt dieser Lösung an AFMU ist erneut wie hier beschrieben zu ermitteln.
An jedem Messtag sollte der aktuelle Gehalt des AFMU-Standards erneut bestimmt werden. Die Konzentrationen der Begleitstoffe AAMU und DAMU werden wie be- schrieben über die zugehörigen Standards berechnet und in Abzug gebracht. Über den so ermittelten prozentualen Gehalt des AFMU-Standards wird auch die Kon- zentration der AFMU-Dotierung in der Zusatzprobe des Standardadditions-Verfah- rens neu berechnet.
