Kontinuierlich messende Verfahren zur Aktivitätsbestimmung der α-Amylase im Serum Vergleich zu amyloklastischen und chromolytischen Methoden

Meier. Henkel und Dankert: Kontinuierüch messende Verfahren zur Aktivitätsbestimmung der «-Amylase 709 J. Clin. Chem. Clin. Biochem..

Vol. 17,1979, pp. 709-716

Kontinuierlich messende Verfahren zur Aktivitätsbestimmung der -Amylase im Serum Vergleich zu amyloklastischen und chromolytischen Methoden

Von H. Meier, E. Henkel und H. Danken

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Institut für Klinische Chemie, Abt. II, der Medizinischen Hochschule Hannover, Zentrallaboratorium am Kranken- haus Oststadt

(Eingegangen am 10. Juli/2. Oktober 1979)

Dem Gedenken an Professor Dr. Gabor Szasz gewidmet

Zusammenfassung: In 57 Patientenseren mit normalem bis stark erhöhtem -Amylasegehalt wurden vergleichende Be- stimmungen der Enzymaktivität mit vier enzymatisch-kinetischen Testkombinationen sowie fünf herkömmlichen kon- fektionierten Verfahren durchgeführt. Die Ergebnisse wurden durch Regressionsanalysen ausgewertet.

Die Spezifltät der Methoden wurde mit Humanpankreas-, Humanspeichel- und Schweinepankreasamylaseproben untersucht. Die Störanfälligkeit der kinetischen Verfahren ist gering. Die Problematik der Umrechnung von Aktivi- tätseinheiten und Normalbereichen wird diskutiert. Die UltraZyme- und die Monamyl neu-Methode wurden wegen guter Praktikabilität und Präzision und großen linearen Bereiches anderen Verfahren überlegen gefunden; ihre Spezifi- tät ist für die Pankreasdiagnostik etwas weniger günstig als die der herkömmlichen Verfahren.

Continuously measuring procedures for the determination ofa-amylase in serum. Comparison with amyloklastic and chromolytic methods

Summary: -amylase has been measured in 57 patients' sera with normal to highly elevated amylase activities. The results obtained with four enzymatic-kinetic test-kits have been compared with those from five conventional marketed procedures. The results are evaluated by regression analysis.

The specificity of the methods was analysed with amylase samples from human pancreas, human saliva and pig pancreas. The susceptibility of the kinetic procedures to interferences is smaller. The problems of conversion of activity units and reference ranges are discussed. The UltraZyme and the Monamyl neu-methods have been found superior to the other procedures because of their good practicability, precision and broad linear range; their specificity for diagnostic purposes in pancreatic diseases is less favourable compared with that of conventional procedures.

Einfuhrung fität, Störanfälligkeit, Richtigkeit und Präzision erst Die Methoden zur kontinuierlichen Messung der Aktivität wenige Ergebnisse vorliegen (1-4), wurden vier konfek- der -Amylase siad wegen ihrer einfachen Handhabung, tionierte kinetische Methoden und fünf ebenfalls im der Automatisierbarkeit und ihrer auf molaren Umsätzen Handel erhältliche Testkombinationen mit lod-Stärke- benihenden Definition der Enzymaktivität auf großes In- Reaktion, bzw. kovalent an Substrat gebundenen Farb- teresse bei den Anwendern gestoßen. Da über ihre Spezi- Stoffen vergleichend untersucht.

1) Auszugsweise vorgetragen auf der gemeinsamen Jahrestagung Material und Methoden der österreichischen Gesellschaft für Klinische Chemie und Material und Methoden der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie, 29.-31. März

1979, Salzburg (Meier, H., Henkel, E. & Dankert, H. (1979), Kobenrnaterul

diese Z., 7 7,180). Vergleichende Aktivitatsbestimmungen der -Amylase wurden an

2) Die Arbeit e'nthält Daten aus der Dissertation von H. Dankert 57 Serumproben von Patienten durchgeführt, die sich etwa an der Medizinischen Hochschule Hannover gleichmäßig über das 10-33-fache der jeweüs angegebenen

034(M)76X/79/0017-0709$2.00

©by Walter de Gruyter & Co. · Berlin · New York

710

Meier, Henkel und Dankert; Kontinuierlich niessende Verfahren zur Aktivitätsbestimmung der a-Amylase Tab. 1. Übersicht über die untersuchten Methoden.

Methode DyAmyl-L Harleco Merckotest Amy lo chrome

Einheit Ansatzvariante Probenvolumen (ml) Meßwellenlänge (nm) Berechnung

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Normalbereiche bei logarithmischem Aktivität§maßs.tab ver- teilen (s. Tab. 2). Zur Spezifitätsprüfung wurden affinitäts- chromatographisch gereinigte (5) Proben von HuroanpanJcreas-, Humanspeichel- und Schweinepankreasamylase eingesetzt, Methoden

Harleco UltraZyme Plus -Amyl (American Hospital Supply, Best.-Nr. 64982, 64967)

Monamyl (Biomed, Chargen-Nr. 7683) Monamyl neu (Biomed, Chargen-Nr. 9$43) Amylase-DS (Beckman, Best.-Nr. 682427) Phadebas (Pharmacia, Best.-Nr. 93-986-2-1393rp2) Amylochrome (Röche, Best.-Nr. 1002)

DyAmyl-L (Gödecke, Chargen-Nr. 0253027) Merckotest -Amylase (Merck, Best.-Nr. 3301)

Harleco -Amyl (American Hospital Supply, Best.-Nr. 81200A, 81200B)

Eine Übersicht über Charakteristika der Methoden und ggf. die in dieser Untersuchung benutzte Variante des Testansatzes gibt Tabelle l. Die Aktivitätsbestimmungen wurden mit den folgen?

den Abweichungen nach den Angaben der Hersteller durchge- führt:

Zum Phadebas-Test wurden die Proben ab 3600 U/l (anstelle von 5000 U/l) l: 3 vorverdünnt.

Die Amylase-PS-Methode wurde bei 25 °C (anstatt 30 °C) ver- wendet ,

Geräte

Photo meter Eppendorf M 1100 mit Kompensationsschreiber 6511 . . . . Eppendorf Mikrolitersystem

Darstellung der Reaktionsprinzipien

Beim UltraZyme-Verfahren werden von der aus dem al$ Substrat verwendeten Oligosaccharidgemisch (G4 bis (6)) durch ar Amylase abgespaltenen (Reaktion 1) d. Fprmelsehemas) Maltose (und Maltotriose) ausgehend, die Reaktionen 2) bis 4) zur Err zeugung von NADH durchlaufen.

Die nur geringfügig im pHrWert des Puffgrs un4 den HUfsenzym?

konzentrationen verschiedenen Testkombinationen Amylase-DS und Monamyl neu (7,8) setzen als Substrat Maitotetraqse (64) ein, die durch a-Amylase überwiegend symmetrisch nach (Sleichung 5) gespalten wird, wodurch sich die Reaktionen 6), 7) und 4) an?

schließen.

Da§ alte Monamyl-Verfahren benutzt Stärke als Substrat. Die ne, beyi vey sgftjedenen Oligosacchariden daraus abgespaltene Mafiose (Reakfign 8) wird wie bei den letztgenannten Methoden nagh 4§n @lei$iungen gj, 7) ußg 4), sowie zur Erhöhung der

nicht quantitativ ablaufenden Ais Einheit U der a-Amylaseaktivität ist für UltraZyme, Monamyl und Amylase-DS die Bildung von l , für Monamyl neu 2 Maltose (entspr. Spaltung von l G⁴) pro Minute definiert.

Pie Methoden Merckotest und Harleco beruhen auf der Abnahme der Farbreaktipn der polymeren Suhistrate (s. Tab. 1) mit (öd qach der Inkubation mit der Probe, gei dVjichromQly fischen Verfahren sind Farbstoffmoleküie kgyalent an unlpslicfye ^w. fällbare poly- mere Substrate gebun^eii^ §u§ i}ej)e|i ^urbji oi^jr^lsL^ iö$lipKe, ' farbstiaff tfagenide .QÜggsaccharide abgespalten werden.

Ergebnisse und Diskussion

Verteilungsmuster der Ergebnisse beiden einzelnen Ver- fahren

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Prüfung der Spezifität

Talbellie 3 gibt die Aktivitäten an, die mit den verschiede- nen Methoden in -Amylasepräparationen gefunden wer- den, ,die im Pha4efe3§TTg§t 10 U/l-eiKÖP»· W^end djg mit den Zweippnktmgthoden ermittelten Werte sich für Humanpankreas- urid Speichelamylase nicht signifilcant unterspheidßn, werden mit den kontinuierlich messenden Verfahren in der Speichelenzyrnprgfr? -tHfiH hphpre Al$:

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J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 17,1979 / No. 11

Meier, Henkel und Dankert: Kontinuierlich messende Verfahren zur Aktivitätsbestiramung der o-Amylase 711

Phadebas

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aus Standaidkurve Stärkederivat 70-300 16(12) 0,94

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Maltotetraose (G4) 20-110 (30 °C) 9

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Maltotetraose (G⁴) 6-34

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lieh erfaßt als Amylasen menschlichen Ursprungs. Be- sonders auffällig ist die hohe Aktivität des tierischen En- zyms im Stärke-Monamyl- und im UltraZyme-Test mit mittleren Oligosacchariden als Substrat und die vergleichs- weise niedrige gegenüber Maltotetraose.

gefunden werden wie für andere (z.B. Phadebas und Dy- Amyl-L). Eine eindeutige Einstufung als normal oder pathologisch ist allerdings, unter anderem bedingt durch das unterschiedliche Isoenzymmuster der Proben, auch mit umgerechneten Normalbereichen nicht möglich.

Zur Normalbereichsdefinition Regressionsanalyse der Meßergebnisse

Die angegebenen Entscheidungsgrenzen stimmen in ihrer Bei der Auswertung durch lineare Regressionsanalyse Aussage so wenig überein, daß sie nach proportionaler wurden zwischen den Meßergebnissen der verschiedenen oder auf Regressionsgleichungen basierender Umrechnung Methoden Korrelationskoeffizienten von 0,9234 (Dy- flir einige Verfahren (z.B. Merckotest) gut doppelt so hoch Amyl-L/Amylase-DS) bis 0,9954 (Amylase-DS/Monamyl

1. Oligosaccharid Gⁿ + H²O 2) Maltose + H²O

3) Glucose + ATP

e-Amylase EC 3.2.1.1 tt-Glucosidase EC 3.2.1.20 Hexokinase EC 2.7.1.l

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6) Maltose + PO⁴³' 7) ßrGlucose-1-phösphat 8) Stärke + H²0 9) 6-Phosphogluconat +

Formelschema: Reaktionsschritte der kinetischen Methoden Maltosephp sphorylase^

EC 2.4.1.8

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-Amylase ^ EC 3.2.1.1

6-Phosphoglucohat-dehydtogenase ^ EC 1.1.1.44

Maltose + Oligosaccharid Gⁿ_2 2 Glucose

Glucose-6-phosphat + ADP 6-Phosphogluconat + NADH + H⁺ 2 Maltose

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Maltose-+ Oligosaccharide

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712

Meier, Henkel und Dankert: Kontinuierlich messende Verfahren zur Aktivit tsbestimmung der o-Amylase

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Angegeben sind die jeweils 1000 U/l (Phadebas) entspre- chenden Aktivit ten (Doppelbestimmungen an Proben in Proteinmatrix), sowie die Relationen der Aktivit ten von Humanspeichel- und Schweinepankreasamylase gegen ber Humanpankreasamylase.

Human- Human- Schweine·?

Pankreas- Speichel· Pankreas- Amylase Amylase Amylase Amylochrome (U/l) 726 758f=1)04 578f=o,8o DyAmyl-L (SE/100ml)672 724f=1>08 798f=lfl8

Harleco(U/l) 662 635f=0j96 928f=1>40

Merckotest (U/l) 347 323f=0j93 619f=1|78

UitraZyme (U/l) 251 316f^=1>26 637f=²,54 Monamyl (U/l) 41,4 63.2f=i^fS3 194^ί=4|69 Monamyl neu (U/l) 68 W6f=i,S6 54f=o,79 Amylase-DS (U/l) 145 230f^=lt59 H9f=⁰,82 neu) gefunden (Tab. 4). Werden die Korrelationskoeffi- zienten jeweils im Vergleich zu allen brigen Methoden gemittelt, so weisen die Ergebnisse von Amylochrome

mit r = 0,9778, dicht gefolgt von UitraZyme (r = 0.9772), Monamyl (F = 0,9749) und dem Harleco-Iod-St rke- Test (T s 0,9724) die durchschnittlich besten Korrelatio- nen zu allen brigen Methoden auf, w hrend DyAmyl-L mit F = 0,9378 mit Abstand am schlechtesten abschnei- det. Ansonsten sind die Korrelationen zwischen den vier kinetischen Methoden mit r > 0,97 besser als im Gro - teil der brigen Methodenpaarungen, wobei die drei Test- kits, die das Maltosephosphorylase-j3-Phosphoglucomii- tase-Hilfsenzymsystem enthalten, mit Korrelatipnskoeffi- zienten durchweg ber 0,99 in ihren Ergebnissen beson- ders gut bereinstimmen.

Die schlechte Korrelation von DyAmyl-L mit den brigen Methoden ist in systematisch zu niedrigen Ergebnissen dieser Methode im hohen Aktivit tsbereich begr ndet, was durch ein typisches Regressionsdiagramm (Abb. 1) demonstriert werden soll. Dort ist, wie auch bei den

brigen ausgew hlten Diagrammen, neben der f r das gesamte Probenkollektiv errechneten eine zweite Re- gressionsgerade eingezeichnet, die f r ein Teilkollektiv ohne Ber cksichtigung der Proben mit sehr hohen Ak^

tivit ten (U/l Phadebas > 3000) gilt, und in ihrem Be- reich die Me werte sehr viel besser erfa t als die des Gesamtkollektivs. Diese weist einen unvertretbar gro en Achsenabschnitt auf, der den Norm lbereich f r Dy- Amyl-L weit berschreitet und mehr als ein Drittel des Kollektivmittelwertes ausmacht, und vermag die Be-

^ Ziehung der Me gr en zueinander nicht sinnvoll zu H beschreiben.

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g hnlich gro e Achsenabschnitte, die je nach Vorzeichen J! f r mangelnde Linearit t der als .unabh ngige oder ab-+j 2 h ngige Variable behandelten Methode sprechen, wer- Γ den f r DyAmyl-L bei allen Vergleichen mit anderen

J. Clin. Ghem. Clin. Biochem. / Vol. 17,1979 / No. 11

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Meier, Henkel und Dankert: Kontinuierlich messende Verfahren zur Aktivitätebestimmung der a-Amylase

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-Amylose (Ultra2yme)lU/lI

Abb. 1. Regressionsdiagramm UltraZyme gegen DyAmyWU Die Ziffern bezeichnen die Anzahl der am jeweiligen Ort zusammenfallenden Wertepaare.

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3,70 66,43 129,16 191jB9 254,52 31735 380,08 442,81 505,54 568,27 631,00 -Amylase (Mona my l neu) [U/ U

Abb.. 3· Regressionsdiagramm Monamyl neu gegen Monamyl.

IJie Ziffern bezeichnen die Anzahl der am jeweiligen Ort zusammenfallenden Wertepaare.

Methoden und in den meisten Fällen auch für die übrigen chromolytischen Verfahren und

gefunden, nicht aber beim Vergleich der kinetischen Methoden untereinander.

Große additive Glieder in den Regressionsgleichungen (Tab. 4) und sehr unterschiedliche Gleichungen für das Gesamt- und das Teilkollektiv (Abb. l, 2) unterstreichen besonders die Fragwürdigkeit sowohl einer proportio- nalen als auch einer aus der linearen Regression herge- leiteten Umrechnung von Ergebnissen einer Methode zu denen einer anderen.

Große additive Glieder in den Regressionsgleichungen des Gesamtkollektivs sind in denen des Teilkollektivi ganz erheblich reduziert und fallen auch bei Polynom*

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'3,70 66,43129,16 191,89 254,52 317,35 38008 442 1 505» HUT 0UH a-Amylose(Monomylneu)[U/l]

Abb. 2. Regressionsdiagramm Monamyl neu gegen Merekotest, Die Ziffern bezeichnen die Anzahl der am Jeweiligen Oft zusammenfallende Wertepaaro,

angleiehungen mit quadratischen oder quadratischen und kubischen Gliedern meist beträchtlich kleiner aus.

Während durch Ausschließen der hohen Werte aber nur bei den sich extrem unlinear darstellenden Methoden- paarungen mit dem Rückgang der additiven Glieder aueh eine V§fb§§§erung der Korrelationskoeffizienten verbundin ist, wird durch die Polynomangleichung grundsätzlich eine Verbesserung der Korrelation er- reicht. Diese ist allerdings in den Fällen unerheblich, die bereits gute lineare Korrelation zeigen (Tab. 4).

Die im V§Fgl§ieh mit 4en recht umständlichen Zweipunkt- methöden sehr gute Praktikabilität der kontinuierlich

Verfahren stellt die Bestimmung der a-Amy- in eine Reihe mit anderen in der Routinedia- gn@stÜ£ üfeliphen Enzymbestimmungen. Seirümvofver- dünnungen sind nur bei sehr hohen Aktivitäten erforderlich.

Ein in der Charge konstanter Reagenzienleerwert ist lediglich bei UltraZyme in Abzug zu bringen.

Vom Einsatz des älteren Monamyl- Verfahrens auf einem Zentrifugälanalysätor wurde von van Wersch et äl. (2) berichtet. Wegen seiner nie ganz linearen Kinetik liefert dieses Verfahren nur in einer mechanisierten Anwendung reproduzierbare Ergebnisse; Versuche, durch Zusatz von Glykogen zu einem linearen Absorptionsanstieg zu kQjnmen, wurden von Hanson et al. (8) mitgeteilt. Über die AdftptiQn der mtFa£yme-Methode an ejn&i Eppen-

dorMngyffliutomaten b§right§t/feKM(6): Di§ übrigen kin§ti§§h§n M§th§d§ft §ind

peignet,

Die Hütbifkeit der mit dem Aufto g§braugh§feFtigen Reagenzien etwa einem Tag wi*t §iQh bei §ehr Kleinen

Serien auf den ohnehin relativ hphen Pieis pro Analyse

(Tab. J) aus-

j. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 17,1979 / No. 11

Meier, Henkel und Danken: Kontinuierlich messende Verfahren zur Aktivit tsbest nmung der o-Amylase 715

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j. Clki. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 17,1979 / No. 11

716

Meier, Henkel und Dankert: Kontinuierlich messende Verfahren zur Aktivitätsbestimfnung der a-Amylase

Störanfälligkeit

Störende Einflüsse von Bestandteilen der Probe wurden nur bei den kinetischen Verfahren geprüft. Die Auswir- kungen von Störfaktoren auf den UltraZyme-Test, sowie die Ausschaltung des nur dort störenden Einflusses hoher Serum- und Uringlucosekonzentrationen, werden von Henkel (6) ausführlich diskutiert. Über den bei kineti-

schen -Amylase-Methoden zu niedrige Ergebnisse be- dingenden Einfluß hoher Pyruvatkonzentrationen in der Probe wurde von Hanson et al. (8) berichtet. Hämo- lyse stört allgemein erst ab einer Hb-Könzentration von etwa l g/l merklich durch falsch niedrige Resultate, wohl infolge eines NADH-Verbrauchs durch Glutathione- ductase. Diese Störeinflüsse wirken sich beim Monämyl- Verfahren wegen dessen geringer Empfindlichkeit relativ am stärksten aus. Lipämie stört nur bei sehr starker Trübung.

Bei Pankreatitis und bestimmten Nierenerkrankungen kommt es zum erhöhten Auftreten von a-Glucosidase in Serum und Urin. Einige unserer Befunde deuten darauf hin, daß bei Monamyl, Monamyl neu und Amylase-DS

-Glucosidase aus der Probe mit der Maltosephosphory- lase um die Maltose konkurriert und so zu niedrige Er-

gebnisse bedingt. Die Interferenz der -Glucosidäse bei diesen Tests ist Gegenstand weiterer Untersuchungen in unserem Arbeitskreis.

Störungen duf ch sonstige in menschlichem Serum vor- kommende Substanzen konnten nicht beobachtet werden.

Bei Methoden mit geringem Lineäritätsbereich, z.B.

Merckotest, stört die Adsorption der -Amylase aus stark verdünnten Proben an die Gefäßwand. Dies ent- fällt bei den kinetischen Verfahren.

Ein im neuen MonamyMleagenz nach Zusatz von NADH anstelle der Probe beobachteter Absorptionsabfall weist auf die Anwesenheit einer NADH verbrauchenden Enzym- verunreinigung hin, die um bis zu 4 U/l zu niedrige Er- gebnisse bedingt; sie dürfte mitverantwortlich dafür sein, daß die Ergebnisse bei Monamyl neu verglichen mit Amy- lase-DS, wo sie nicht nachzuweisen war, allgemein niedri- ger ausfallen, als aus der Berechnung zu erwarten wäre.

Danksagung

Für mathematische Beratung und fiir die statistische Auswertung der Meßwerte danken wir Frau Dr. C. Zschege und Herrn PD Dr.

U. Feldmann von der Abteilung für Biometrie der Medizinischen Hochschule Hannover.

Literatur

1. Bruckner, ., Schenkel, R. & Fritzsche, W. (1978), Ärztl. Lab.

24, 355-362.

2. Wersch, J. van, Quast, O. & Kleesiek, K. (1978), Fresenius Z. Anal. Chem. 290,173-174 (Vortrag auf der Tagung Bio- chemische Analytik 1978 und Analytika 1978, 18.-21. April 1978, München).

3. Wisser, H., Dettmer, K. & Knoll, E. (1978), Ärztl. Lab. 24, 392-398.

4. Hauch, D. & Gibitz, H. J. (1979), diese Z. 17,161 (Vortrag auf der Gemeinsamen Jahrestagung der Österreichischen Gesellschaft für Klinische Chemie und der Deutschen Gesell- schaft für Klinische Chemie, 29.-31. März 1979, Salzburg).

5. Meier, H. & Henkel, E. (1978), Fresenius Z. Anal. Chem.

290,187 (Vortrag auf der Tagung Biochemische Analytik 1978 und Analytika 1978,18.-21. April 1978, München).

6 a) Henkel, E. (1979), diese Z. 17,163 (Vörtrag auf der gemein- samen Jahrestagung der Österreichischen Gesellschaft für Klinische Chemie und der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie, 29.-31. März 1979, Salzburg),

b) Henkel, E. (1979), diese Z. 17, 705-708.

7. Pierre, K. J., Tung, K. K. & Nadj, H. (1976) Clin. Chem. 22, 1219.

8. Hanson, N.Q. & Yasmineh, W. G. (1978), Clin. Chem. 24, 762-768.

Dr. Helmut Meier

Institut für Klinische Chemie, Abt. II, Medizinische Hochschule Hannover, Zentrallabor am Krankenhaus Oststadt Podbielskistr. 380

D-3000 Hannover 51

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 17,1979 / No. 11