Inhalt
Remote ischemic preconditioning induziert eine durch extrazelluläre Vesikel vermittelte Reduktion Hypoxie-induzierter Apoptose von Kardiomyozyten nach Isofluran, nicht aber Propofol-Exposition
F. Abel · L. Yahsaly · F. Murke · C. Ochsenfarth · B. Giebel · J. Peters · U.H. Frey 347 Plexin C1 beeinflusst das Überleben während einer polymikrobiellen Sepsis
A. Bernard · A. Körner · C. Eggstein · V. Mirakaj · P. Rosenberger 348 Klinische und molekulare Signatur zur Differenzierung von Patienten nach Trauma versus komplexem regionalem Schmerzsyndrom (CRPS)
C. Dietz · M. Müller · A.K. Reinhold · L. Karch · B. Schwab · M.E. Brede · R. Jakubietz ·
N. Roewer · C. Sommer · V. Dimova · F. Birklein · H.L. Rittner 349 Differentielle Effekte regulatorischer Untereinheiten auf die Mechano sensitivität des
kardialen Natrium kanals Nav1.5
M. Maroni · B. Winner · A. Lampert · J. Schüttler · E. Eberhardt 350 Sphingosin-1-Phosphat vermittelt über AMPK-abhängige Mechanismen in humanen
mikrovaskulären Endothelzellen Barriere-stabilisierende Effekte
K.R. Finke · S. Dennhardt · A. Huwiler · S.M. Coldewey 351 Der Hitze-sensitive Ionenkanal TRPV2 wird über eine Oxidation intrazellulärer Methionine aktiviert
T. Fricke · C. Herzog · F. Echtermeyer · A. Leffler · M. Eberhardt 352 Neuartiger POC-Test detektiert die Wirkung direkter oraler Antikoagulantien (DOAK) und diskriminiert zwischen Dabigatran und Rivaroxaban in vitro und in vivo
P. Groene · T. Wiederkehr · T. Kammerer · A. Acevedo · V. Brummer · K. Feil · L.C. Hinske ·
S.T. Schäfer 353
Komplexbildung von MIF-2 und CCL20 – strukturelle Interaktion von atypischen und klassischen Chemokinen in vitro
A. Hoffmann · M. Brandhofer · P. Scheiermann · J. Bernhagen 354 All-trans-Retinsäure (ATRA) ist neuroprotektiv und vermindert reaktive Astrogliose in einem experimentellen Modell traumatischer Hirnschädigung
R. Hummel · S. Ulbrich · S. Zander · W. Bobkiewicz · C. Gölz · M.K.E. Schäfer 355 Modifikation des Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO)-Kriteriums Diurese nach idealem Körpergewicht verbessert die Prädiktion der Krankenhaus-Letalität bei kardiochirurgischen Patienten mit akuter Nierenschädigung
T.G. Kampmeier · M. Hessler · P.H. Arnemann · C. Schmidt · F. Lehmann · D. Görlich ·
A. Zarbock · C. Ertmer 356
Genetisch bedingtes PONV-Risiko
S. Klenke · G. de Vries · L. Schiefer · N. Seyffert · H. Bachmann · U.H. Frey · J. Peters 357 Semaphorin 7A induziert den proresolutionären Phänotyp von Monozyten/Makrophagen
und beeinflusst deren Metabolismus in einem murinen Zymosan A-Peritonitis-Modell
A. Körner · V. Mirakaj 358
Entwicklung einer antikörperbasierten Methode zur relativen Quantifizierung von Protein- Interaktionen
B. Koos · K. Koch · A. Klaesson · K.C. Schuermann · M. Adamzik · O. Söderberg ·
P.I.H. Bastiaens 359
Analyse von Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren bei Neuropathie in Ratten T.J. Lux · J.T.C. Chen · H. Hofmann · S. Dannhäuser · N. Roewer · R. Blum · R.J. Kittel ·
H.L. Rittner 360
MicroRNA-125a erhöht die endotheliale Permeabilität durch direktes Targeting von VE-Cadherin
M.B. Müller · M. Hübner · V. Ließke · S. Kreth 361
Thrombozyten beeinflussen die Auflösung der pulmonalen Entzündung in der Maus
A. Margraf · K. Thomas · M. Küllmar · J. Rossaint · A. Zarbock 362 PSMA – Möglicher Regulator von Nozizeptoren und Zielstruktur zur Schmerzvisualisierung M. Mohammadi · T. Hucho · H. Endepols · R. Lu · C. Kobe · J. Petersen · B.D. Zlatopolskiy · P. Krapf · A. Morgenroth · S. Stockter · J. Loeser · B.W. Böttiger · A. Drzezga · A. Schmidtko ·
B. Neumaier 363
Die spezifische CXCR4- und CXCR7-Blockade zeigt antiinflammatorische Effekte in der akuten Inflammation
K.-C. Ngamsri · C. Jans · R. Putri · J. Gamper-Tsigaras · D. Köhler · T. Granja · A. Straub ·
F. Konrad 364
Abstracts der
33. Wissenschaftlichen Arbeitstage der DGAI
15. – 16.02.2019, Würzburg
Die Vorträge, deren Abstracts nach- folgend publiziert werden, wurden in einem verblindeten Verfahren von sieben Gutachtern ausgewählt und auf den Wissenschaftlichen Arbeits- tagen der DGAI vom 15. – 16.02.2019 in Würzburg gehalten und diskutiert.
Nachfolgend wurde über die Publika- tionswürdigkeit der entsprechenden Abstracts im Plenum der Arbeitstage abgestimmt. Sie erfüllen damit die Kriterien einer begutachteten Publika- tion.
Die Ausschreibung für die Wissen- schaftlichen Arbeitstage 2020 der Fresenius-Stiftung und das DGAI- Forschungs stipendium der Fresenius- Stiftung finden Sie auf der Seite 346.
Ausschreibung des
DGAI-Forschungsstipendiums der Fresenius-Stiftung
Die 34. Wissenschaftlichen Arbeits- tage der Deutschen Gesellschaft für Anästhesiologie und Intensivmedizin (DGAI) werden vom 14. – 15.02.2020 in Würzburg, Festung Marienberg, Hofstuben, veranstaltet.
Nach Maßgabe der Statuten* der Wissenschaftlichen Arbeitstage wer- den hiermit Interessenten, die Mit- glieder der DGAI sind, eingeladen, ihre Teilnahme durch elektronische Einsendung eines Abstracts an die u. a. Anschrift anzumelden. Die an- genommenen Arbeiten nehmen an dem Auswahlverfahren für das DGAI- Forschungsstipendium der Fresenius- Stiftung teil.
Bewerbungen um das Forschungs- stipendium bitten wir entsprechend den Vorgaben auf der u.g. Internet- seite nach Annahme des Abstracts einzureichen.
2019 wird das DGAI-Forschungssti- pendium der Fresenius-Stiftung für eine hervorragende Forschungsarbeit mit 15.000 € dotiert. Grundlagenfor- schung und klinische Forschung sol- len gleichermaßen gefördert werden.
Einsendeschluss:
06.01.2020
Nähere Informationen:
www.ukw.de/anaesthesie/
veranstaltungen
E-Mail: wat_wuerzburg@ukw.de Anschrift:
Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie
Universitätsklinikum Würzburg Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. N. Roewer (Sekretariat Frau P. Urenkov) Oberdürrbacher Straße 6 97080 Würzburg, Deutschland Tel.: 0931 20130015
Fax: 0931 20130019
* siehe: Anästh Intensivmed 2001:42:805-807
Personalisiertes hämodynamisches Management bei abdominalchirurgischen Hochrisiko- patienten mit dem Ruhe-Herzindex als Zielvariable: eine prospektive, randomisiert-kontrollierte klinische Studie
J.Y. Nicklas · S.M. Coldewey · O. Diener · M. Leistenschneider · C. Sellhorn · G. Schön ·
N. Krieg · P. Baumbach · R.A. Claus · M. Gräler · J. Schröder · M. Bauer · D.A. Reuter · B. Saugel 365 D-4F, ein bimodal wirkendes Therapeutikum im traumatisch-neuropathischen Schmerzmodell in Nagern
B. Oehler · M. Mohammadi · R.S. Sauer · M. Popp · N. Roewer · A. Brack · R. Blum ·
H.L. Rittner 366
12-HETE aktiviert mitochondrialen TRPV1 in Endothelzellen und fördert die Entstehung einer Endotheldysfunktion in diabetischen Mäusen
M. Otto · W. Liu · C. Bucher · M. Müller · T. Schmidt · N.M. Wagner 367 Häm sensibilisiert den Capsaicin-Rezeptor TRPV1 über Redox- und Proteinkinase C-abhängige Mechanismen
N. Palmaers · C. Herzog · M. Eberhardt · A. Leffler 368
Langfristiges Überleben, Folgeerkrankungen und der Einfluss von Rehabilitation bei schweren Infektionen im Vergleich zur Sepsis: eine retrospektive Studie
T. Rahmel · S. Schmitz · H. Nowak · K. Schepanek · L. Bergmann · P. Halberstadt · S. Hörter ·
J. Peters · M. Adamzik 369
Assoziation zwischen mechanischer Beatmungsleistung und Lungenschädigung im experimentellen akuten Lungenversagen am Schwein
M. Scharffenberg · R. Huhle · A. Braune · J. Wittenstein · M. Herzog · T. Bluth · T. Koch ·
M. Gama de Abreu 370
Einfluss von niedrig dosiertem Vasopressin auf die intestinale Mikrozirkulation in der septischen Ratte
J. Schulz · R. Truse · C. Vollmer · A. Herminghaus · I. Bauer · O. Picker 371 Modellierung von Linezoliddosierungen anhand von Plasma- und Gewebespiegel
normalgewichtiger und adipöser Patienten
P. Simon · D. Petroff · R. Werdehausen · L. Ehmann · D. Busse · S. Hochstädt · A. Dietrich ·
C. Kloft · M. Zeitlinger · C. Dorn · F. Kees · S. Stehr · H. Wrigge 372 Die Ribonuklease A vermindert die kardiale Dysfunktion nach Induktion einer
polymikrobiellen Sepsis im Mausmodell
L. Stiehler · C. O’Riordan · E. Zechendorf · S. Coldewey · B. Wissuwa · F. Dohmen ·
D. Hinkelmann · A. Ostareck-Lederer · D. Ostareck · G. Marx · C. Thiemermann · L. Martin 373 Ketogene Ernährung verbessert die Homöostase des adaptiven Immunsystems
G. Strauß · M. Hübner · D. Effinger · X. Marstaller · S. Kreth 374 Exogenes Vasopressin führt dosisabhängig zu einer Vasopressin 1A-Rezeptor-vermittelten
Modulation der gastralen mikrozirkulatorischen Oxygenierung beim Hund
R. Truse · S. Grewe · J. Schulz · A. Herminghaus · I. Bauer · O. Picker · C. Vollmer 375 Einfluss von Subjekt-Respirator-Asynchronie auf die pulmonale Schädigung im experimentellen akuten Lungenversagen am Schwein
J. Wittenstein · M. Scharffenberg · R. Huhle · T. Bluth · A. Braune · M. Leiderman · M. Herzog ·
T. Koch · M. Gama de Abreu 376
P2Y1 und P2Y12 Adenosin-5‘-diphosphat (ADP)-Rezeptoren regulieren die T-Zell-Aktivierung
T. Woehrle · C. Ledderose 377
Die Addition von Kohlenstoffmonoxid wirkt kardio- und neuroprotektiv bei der extrakorporal unterstützten Reanimation im Schweinemodell
J. Wollborn · E. Rütten · C. Steiger · L. Meinel · S. Maier · M.A. Schick · U. Göbel 378 Regulation der mitochondrialen Biogenese und Gehalt an Atmungskettenkomplexen bei der Critical Illness Myopathie (CIM)
T. Wollersheim · J. Grunow · N.Carbon · C. Spies · J. Fielitz · S. Weber-Carstens 379 Determinanten der neuropathischen Schmerzgenese nach Öffnung der Nervenbarriere bei Ratten
A.K. Reinhold · S. Yang · J.T.C. Chen · S.M. Krug · R.-S. Sauer · N. Roewer · A. Brack · H.L. Rittner 380
Fragestellung
Bei der ischämischen „Fern-Präkonditionie- rung“ (remote ischemic preconditioning, RIPC) soll eine Kardioprotektion durch wiederhol- te, kurzandauernde Ischämie-/Reperfusions- Episoden in Ischämie-robusten Körperteilen erzeugt werden. Der Signaltransduktionsme- chanismus des RIPC-Signals ist weitgehend unbekannt, könnte aber extrazelluläre Vesikel (EVs) umfassen [1–2]. Da widersprüchliche Daten zum RIPC-Effekt mit unterschiedlichen Anästhesieregimen in Verbindung stehen [3], prüften wir die Thesen, dass 1) nach RIPC von koronarkranken, sich einer geplanten aortokoronaren Bypass (ACB)-Operation un- terziehenden Patienten isolierte EVs sowie 2) EVs von hypoxisch präkonditionierten Kardiomyozyten eine Protektion gegenüber Hypoxie-induzierter Apoptose vermitteln und 3) diese Effekte durch Propofol blockiert wer- den.
Methodik
Nach Zustimmung der Ethikkommission wur- den EVs von 10 Patienten im zeitlichen Ver- lauf vor und nach RIPC-/Sham-Manövern bei ACB-OPs aus Serum isoliert und quantifiziert.
H9c2-Zellen wurden in einem In-vitro-Mo- dellsystem in An- und Abwesenheit von Isoflu- ran oder Propofol für 6 h mit diesen Patienten- EVs (1x109 Nanopartikel/ml) inkubiert, gefolgt von einer 18-stündigen normoxischen oder hypoxischen Kultivierung. In einem weiteren Ansatz wurden H9c2-Zellen 6 h mit Medi-
um von hypoxisch präkonditionierten Zellen (H/R-Medium) vor einer weiteren 18-stündi- gen Hypoxie mit 6-stündiger Reoxygenation (H/R) kultiviert. Endpunkt war zelluläre Apo- ptose (Durchflusszytometrie). Statistik: Mittel- werte ± SEM, zweiseitige t-Tests, adjustiert für multiple Vergleiche, bzw. Kruskal-Wallis-Tests mit Dunn’s Post-hoc-Test, p < 0,05.
Ergebnisse
60 min nach RIPC kam es bei Patienten zu einem EV-Konzentrationsanstieg (RIPC 2,5x1011 ± 4,9x1010; Sham: 1,2x1011 ± 2,0x1010 Nanopartikel/ml; p = 0,04). In vitro führte Hypoxie bei Kontrollzellen ohne Inkubation mit EVs zu einem Anstieg der Apoptose von H9c2-Zellen (Hypoxie 8,4% ± 0,6; Normo- xie: 2,5% ± 0,1; p < 0,0001). RIPC-EVs von ACB-Patienten reduzierten die Apoptoserate, wohingegen Sham-EVs keinen Effekt hatten (fold change (fc) RIPC-EVs: 0,83; Sham-EVs:
0,97; p = 0,04; Abb. 1A). Auch Medium von hypoxisch präkonditionierten H9c2-Zellen reduzierte die Apoptose (H/R 6,5% ± 0,4 vs.
H/R + H/R-Medium: 2,7% ± 0,02; p < 0,001;
Abb. 1B). Unter Propofol-Exposition war der Apoptose-reduzierende Effekt sowohl in RIPC-EV exponierten Zellen (fc RIPC-EVs:
1,01 vs. Sham-EVs: 0,94; p = n.s.; Abb. 1A) als auch mit H/R-Medium exponierten Zellen (H/R: 6,5% ± 0,4 vs. H/R-Medium+Propofol:
3,6% ± 0,6; p = n.s.; Abb. 1B) aufgehoben.
Interpretation
RIPC induziert einen Anstieg der EV-Kon- zentration bei ACB-Patienten, und deren EVs vermitteln Protektion von Kardiomyozyten gegenüber Hypoxie-induzierter Apoptose.
Analoge Ergebnisse werden bei hypoxisch präkonditionierten Kardiomyozyten beobach- tet. Diese protektiven Effekte werden durch Propofol aufgehoben. Somit vermitteln 1) hu- mane, nach RIPC isolierte EVs zelluläre Pro- tektion gegenüber Hypoxie und 2) Propofol blockiert diesen Effekt. Dies lässt Propofol als Störfaktor im Rahmen eines durch EVs-ver- mittelten RIPC-Mechanismus vermuten.
Literatur
1. Frey UH, et al: Remote ischaemic precon- ditioning increases serum extracellular vesicle concentrations with altered micro-RNA signature in CABG patients. Acta Anaesthesiol Scand 2018;382:597
2. Giricz Z, et al: Cardioprotection by remote ischemic preconditioning of the rat heart is mediated by extracellular vesicles. J Mol Cell Cardiol 2014;68:75–78
3. Peters J: Anaesthetics and remote ischaemic preconditioning: do not stop the music, despite a (yet) unhappy marriage. Basic Res Cardiol 2016;111:48.
Remote ischemic preconditioning induziert eine durch extrazelluläre Vesikel vermittelte Reduktion Hypoxie-induzierter Apoptose von Kardiomyozyten nach Isofluran, nicht aber Propofol-Exposition
F. Abel1,2 · L. Yahsaly1,2 · F. Murke3 · C. Ochsenfarth1,2 · B. Giebel3 · J. Peters2 · U.H. Frey1,2
1 Klinik für Anästhesiologie, operative Intensiv- medizin, Schmerz- und Palliativmedizin, Marien Hospital Herne, Universitätsklinikum der Ruhr-Universität Bochum
2 Klinik für Anästhesiologie und Intensiv- medizin, Universität Duisburg-Essen 3 Institut für Transfusionsmedizin, Universität
Duisburg-Essen
Korrespondenz: frederikabel@gmx.net
Abbildung 1
1,4 1,2 1,9 0,8 0,6
8
6
4
2
Fold Change apoptotische Zellen Apoptotische Zellen (%) 0
Hypoxie Hypoxie
+ Isofl uran Hypoxie + Propofol
* **
*
H/R + H/R-Medium
+ Propfol H/R
+ H/R-Medium H/R
Sham-EVs RIPC-EVs
A B
A: EVs von koronarkranken Patienten nach RIPC-Intervention verringern die Apoptosehäufigkeit von H9c2-Zellen im Vergleich zu humanen Sham-EVs. Unter Einfluss von Propofol ist der protektive Effekt nicht zu beobachten.
B: Hypoxisch präkonditioniertes Zellmedium reduziert die Apoptosehäufigkeit von H9c2-Zellen nach Hy- poxie und Reoxygenation, wobei der Effekt unter Propofol-Exposition aufgehoben ist.
Fragestellung
Der neuronale Guidance-Rezeptor Plexin C1 nimmt – wie bereits gezeigt werden konnte – Einfluss auf immunrelevante Mechanismen wie Phagozytose [1] und die Aktivierung von Monozyten und Makrophagen [2].
Methodik
Im Mausmodell wurde durch zäkale Liga tion und Punktion (CLP) eine Sepsis induziert.
Über 7 Tage beobachteten wir PlxC1-/--Tiere und Littermate-Kontrollen. 24 Stunden nach
CLP wurde Peritoneallavage für Untersuchun- gen entnommen: zur Messung von Zytoki- nen, Quantifizierung der Bakterienlast (CFU- Wachstum) und für einen Antikörper-Array zur zellulären Signalweg-Analyse. Entnom- mene Peritonealmakrophagen (PlxC1-/- vs.
WT) wurden mit LPS und Bakterien stimuliert, um IL-6, TNF-α und IL-1β zu messen.
Ergebnisse
Fehlen von Plexin C1 führt bei polymikrobi- eller Sepsis zu eingeschränkter Rekonstitution von Temperatur und Gewicht und schlechte- rem Überleben. 24 Stunden nach CLP ist die Last an IL-6, TNF-α, KC und IL-1β bei PlxC1-/- signifikant höher, das CFU-Wachstum aus der Lavage dichter als bei WT. Die zellulä- re Signalweg-Analyse zeigt bei PlxC1-/- eine stärkere Aktivität des LPS-stimulierten MAP- Kinase-Signalwegs und die Beeinflussung weiterer immunrelevanter Signalwege. Ex vivo produzieren PlxC1-/--Peritonealmakro- phagen signifikant höhere Spiegel an IL-6, TNF-α und IL-1β nach Stimulation mit LPS und diversen Bakterien.
Interpretation
Plexin C1 verbessert das Überleben bei poly- mikrobieller Sepsis. Der Rezeptor erhöht die bakterielle Clearance und dämpft die Produk- tion diverser Zytokine. Zelluläre Signalwege wie der LPS-stimulierte MAP-Kinase-Signalweg und Apoptose sind bei Plexin C1-/- stärker ak- tiviert, wir gehen von einer immunmodulato- rischen Funktion des Rezeptors aus. Ex vivo produzieren PlxC1-/--Peritonealmakrophagen nach Stimulation mit LPS und Bakterien sig- nifikant mehr proinflammatorische Zytokine.
Daher hoffen wir, den Sepsisverlauf durch die Beeinflussung von Plexin C1 im klinischen Alltag verbessern zu können.
Literatur
1. Walzer T, Galibert L, Smedt TD: Poxvirus semaphorin A39R inhibits phagocytosis by dendritic cells and neutrophils. Eur J Immunol 2005;35:391–398
2. Takamatsu H, Okuno T, Kumanogoh A:
Regulation of immune cell responses by semaphorins and their receptors. Cell Mol Immunol 2010;7:83–88.
Plexin C1 beeinflusst das Überleben während einer polymikrobiellen Sepsis
A. Bernard · A. Körner · C. Eggstein · V. Mirakaj · P. Rosenberger
Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Eberhard Karls Universität Tübingen, Universitätsklinikum Tübingen Korrespondenz:
alice.bernard@med.uni-tuebingen.de
Abbildung 1
0 PlxC1-/-
* 24 h CLP: TNT-
WT
50 100 150 200 250 A
E
0 PlxC1-/-
* 24 h CLP: IL-6
WT
2.000 4.000 6.000 8.00010.000 B
0 PlxC1-/-
**
24 h CLP: IL-1
WT
100 200 300 400
C
0 PlxC1-/-
* 24 h CLP: IL-8
WT
2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 D
Expr Fold Change AFT1
AFT2 CHUK CREB1 ELK1 FGFR1 FOS FRS2 GAB1 IKBKB KKBKG IRS1 JUN MAP2K1 MAP2K2 MAP2K4 MAP2K6 MAP3K5 MAPK14 MAPK3 MAPK8 NFKB1 NFKB2 NFKBIA NFKBIB NFKBIE PAK1 PIK3R1 PRKCA PRKCB PRKCD PRKCE PRKCQ PRKCZ PRKD1 PTPN11 RAC1 RAF1 RELA SRF
Phospho Fold Change
downregulated
in PlxC1-/- upregulated in PlxC1-/-
A-D: 24 Stunden nach CLP ist die Konzentration an (A: IL-6, B: TNFα, C: IL-8, D: IL-1β) bei PlxC1-/- signifikant höher als bei Littermate-Kontrollen.
E: Der LPS-stimulierte MAP-Kinase-Signalweg ist durch den Rezeptor reguliert und bei PlxC1-/- insgesamt stärker aktiviert.
Fragestellung
Das CRPS ist eine chronische Schmerzerkran- kung, die sich nach Traumen der Extremitäten entwickelt. Die klinische Diagnose beruht neben inadäquat starken Schmerzen auf den sogenannten Budapestkriterien. Diese sind u.a. durch inflammatorische, autonome so- wie neuropathische Symptome (Allodynie) gekennzeichnet. Der differentialdiagnosti- sche Vergleich zu Patienten mit Trauma aber ohne CRPS ist wichtig für die Abgrenzung eines CRPS von normalen Traumafolgen.
Neben klinischen Parametern wurden spezi- elle nicht-kodierende RNAs hinsichtlich ihrer Ausprägung in beiden Gruppen untersucht.
Methodik
Nach Einwilligung in die EU-weite ncRNA- pain-Studie fanden eine Blutentnahme, eine neurologische Untersuchung und eine quan- titative sensorische Testung (QST) statt. Aus dem Serum einer Subgruppe (CRPS n=30, FC n=20, gesunde Kontrollen, C n=20) wurden Exosomen isoliert und die zwei barriere- und immunregulierenden microRNAs hsa-miR- 144-5p und hsa-miR-223-5p quantifiziert [1,2]. Außerdem erhielten alle Studienteil- nehmer standardisierte Schmerzfragebögen (Patient Reported Outcomes, PROs). Zur Aus- wertung wurden RM-ANOVA/ANCOVA mit posthoc Bonferroni-korrigiertem t-Test oder Kruskal-Wallis und eine Principle Component Analysis (PCA) verwendet.
Ergebnisse
Im Gruppenvergleich (FC: n=35; CRPS: n=106) gab es keine signifikanten Altersunterschiede, jedoch waren signifikant mehr Männer in der FC Gruppe. Klinisch leiden CRPS-Patienten unter signifikant stärkeren Schmerzen (4 vs.
1; 0–10 NRS), die einen deutlichen neuropa- thischen Charakter haben (PRO, neuropathic pain symptom inventory, NPSI). Im Gruppen- vergleich waren CRPS-Patienten empfindlicher für Hitzeschmerz und mechanische Schmerz- reize als FC (Abb. 1A). Allodynie war beinahe ausschließlich bei CRPS-Patienten zu beob- achten (19/106 vs. 1/35). In den PROs erga- ben sich höhere Werte für Depressivität und
Ängstlichkeit bei CRPS-Patienten. Eine PCA basierend auf zwei Hauptkomponenten zeigt eine Trennung der beiden Gruppen (Abb. 1B).
Molekular war die exosomale hsa-miR 223-5p bei CRPS-Patienten signifikant erniedrigt (Abb.
1C). Dies korrelierte negativ mit dem CRPS-Se- verity-Score und war abhängig vom Vorliegen eines Ödems.
Schlussfolgerung
CRPS-Patienten und FC unterscheiden sich in Schmerzintensität/-charakter, der Emp- findlichkeit für Hitzeschmerz und mechani- sche Schmerzreize sowie der Expression der miR-223-5p. MiR-223-5p ist möglicherweise protektiv nach Trauma. Die Untersuchungen liefern wertvolle Hinweise zu klinischen Trau- mafolgen in Abwesenheit eines CRPS. Ge- nauere Untersuchungen der FC können somit zum besseren Verständnis der Entstehung ei- nes CRPS beitragen.
Gefördert durch die EU sowie die Studienstif- tung des deutschen Volkes.
Literatur
1. Birklein F, Ajit SK, Goebel A, Perez RSGM, Sommer C: Complex regional pain syndrome – phenotypic characteristics and potential biomarkers. Nat Rev Neurol 2018;14:272–284 2. Reinhold AK, Rittner HL: Barrier function in
the peripheral and central nervous system – a review. Pflugers Arch 2017;469:123–134
Klinische und molekulare Signatur zur Differenzierung von Patienten nach Trauma versus komplexem regionalem Schmerzsyndrom (CRPS)
C. Dietz1 · M. Müller1 · A.K. Reinhold1 · L. Karch1 · B. Schwab1 · M.E. Brede1 · R. Jakubietz2 · N. Roewer1 · C. Sommer3 · V. Dimova4 · F. Birklein4 · H.L. Rittner1 1 Klinik für Anästhesiologie, 2 Chirurgische Klinik II, 3 Neurologische Klinik, Universitätsklinikum Würzburg
4 Neurologische Klinik, Universitätsklinikum Mainz
Korrespondenz: Dietz_C4@ukw.de
Abbildung 1
CDT test CRPSCDT test FC
WDT test CRPS TSL test CRPSCPT test CRPSHPT test CRPS PPT test CRPSMPT test CRPSMPS test CRPSWUR test CRPSMDT test CRPSVDT test CRPSWDT test FC TSL test FC CPT test FC HPT test FC PPT test FC MPT test FC MPS test FC WUR test FC MDT test FC VDT test FC
CRPS FC Controls Adjusted expression of miR-223-5p relative to HY3
QST parameters
* *
z-scores
25
20
A B
C
* 10
5
0
-5
-10
40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 CRPS
FC
PC2
PC1
Sensorische Funktion, Principle Component (PC) 1/2 Analyse und Expression der hsa-miR-223-5p differenzieren CRPS-Patienten und FC
A: Mittelwerte und Standardabweichung der z-Werte von allen QST-Parametern der CRPS-Patienten (rot) und Frakturkontrollen (FC blau; *b<0,05 RM-ANOVA, Post- hoc-T-Test, Bonferroni corrected). B: Ausprägung von PC1 und PC2 für jeden einzelnen Patienten. C: Expression der hsa-miR-223-5p in CRPS, FC und gesunden Kon- trollen (*p<0,05, repeated measurements ANOVA (A), ANCOVA analysis on ranks without outliers, Kruskal-Wallis-Test (C)).
Fragestellung
Spannungsabhängige Natriumkanäle (Navs) sind essentiell für die Generierung und Wei- terleitung von Aktionspotentialen in erreg- baren Geweben. Die Schalteigenschaften und die Expression von Navs können durch regulatorische Proteine (β-Untereinheiten) moduliert werden [1]. Mutationen in diesen Untereinheiten sowie deren Funktionsverlust prädisponieren zu Arrhythmien und sind mit hereditären Arrhythmiesyndromen assoziiert [1].
Kürzlich konnte gezeigt werden, dass der kar- diale Natriumkanal Nav1.5 durch mechani- schen Stress moduliert werden kann [2] und dass die regulatorische β1-Untereinheit den neuronalen Natriumkanal Nav1.7 gegenüber mechanischen Reizen stabilisieren kann [3].
Durch die zyklische Kontraktion des Herzens sind Kardiomyozyten in besonderem Maße mechanischen Kräften ausgesetzt.
Ziel dieser Arbeit ist es daher, die Auswirkun- gen der Expression der pathophysiologisch relevanten β1- und β3-Untereinheit auf die Mechanosensitivität des kardialen Natrium- kanals zu untersuchen.
Methodik
HEK293-Zellen wurden transient mit Nav1.5 alleine oder zusätzlich der β1- oder β3- Untereinheit transfiziert. Es wurden Patch- Clamp-Experimente im Voltage-Clamp-Modus mit und ohne mechanischen Stress durch standardisierte, schwerkraftabhängige Per- fusion durchgeführt. Durch verschiedene Spannungsprotokolle wurden die Einflüsse auf unterschiedliche Schalteigenschaften wie Aktivierung und Inaktivierung von Nav1.5 untersucht und mittels Bolzmann-Gleichung die Spannung der halbmaximalen Aktivierung und Inaktivierung (V1/2) ermittelt.
Ergebnisse
In Übereinstimmung mit vorherigen Studien führte mechanischer Stress zu einer Hyperpo- larisation der Aktivierung und Inaktivierung von Nav1.5 (Abb. 1) [2].
Die Koexpression von β1 mit Nav1.5 hatte keinen Einfluss auf die Aktivierung, jedoch wurde die Inaktivierung in Anwesenheit von β1 signifikant depolarisiert. Unter mechani- schem Stress wurde der Einfluss von β1 auf Nav1.5 aufgehoben und es kam zu einer ver- gleichbaren mechanoinduzierten Hyperpo- larisation wie ohne Expression von β1 (Abb.
1A).
Die β3-Untereinheit führte zur signifikanten Depolarisierung der Aktivierung und Inakti- vierung von Nav1.5. Dieser Effekt blieb für die Aktivierung auch unter mechanischem Stress erhalten (Abb. 1B). Bei der Inaktivie- rung wurde die mechanoinduzierte Hyperpo- larisation von Nav1.5 durch die Koexpression von β3 verhindert.
Interpretation
Für den neuronalen Nav1.7 führt β1 zu ei- ner Stabilisierung der Schalteigenschaften gegenüber mechanoinduzierten Änderungen [3]. Unsere Daten zeigen, dass im Gegensatz dazu der kardiale Nav1.5 trotz Expression von β1 mechanosensibel bleibt und die de-
polarisierende Wirkung von β1 auf die Inak- tivierung aufgehoben wird. Dahingegen führt die Koexpression von β3 zu einer Resistenz des Kanals gegenüber mechanischem Stress und die Effekte von β3 auf Aktivierung und Inaktivierung bleiben größtenteils erhalten.
β1 und β3 könnten daher an der mecha- noelektrischen Rückkopplung im Myokard beteiligt sein und ein Teil ihrer rhythmussta- bilisierenden Eigenschaften über den diffe- rentiellen Einfluss auf die Mechanosensitivität von Nav1.5 bedingt sein.
Literatur
1. O’Malley HA, Isom LL: Sodium channel β subunits: emerging targets in channelopathies.
Annu Rev Physiol 2015;77:481–504 2. Beyder A, Rae JL, Bernard C, Strege PR, Sachs
F, Farrugia G: Mechanosensitivity of Nav1.5, a voltage-sensitive sodium channel. J Physiol 2010;558:4969–4985
3. Körner J, Meents J, Machtens JP, Lampert A:
β1 subunit stabilises sodium channel Nav1.7 against mechanical stress. J Physiol 2018;596:2433–2445.
Differentielle Effekte regulatorischer Untereinheiten auf die Mechano- sensitivität des kardialen Natrium- kanals Nav1.5
M. Maroni1,2 · B. Winner2 · A. Lampert3 · J. Schüttler1 · E. Eberhardt1
1 Anästhesiologische Klinik, 2 Stammzellbiologische Abteilung, Universitätsklinikum Erlangen
3 Institut für Physiologie, RWTH Aachen Korrespondenz:
esther.eberhardt@uk-erlangen.de
Abbildung 1
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
-150 -130 -110 -90 -70 -50 -80 -60 -40 -20 0
Spannung (mV) Spannung (mV)
-110 -105 -100 -95 -90
V1/2 (mV) V1/2 (mV)
-50 -45 -40 -35 -30
A B
l/lmax G/Gmax
Nav1.5
Nav1.5 mechanischer Stress Nav1.5+β3
Nav1.5+β3 mechanischer Stress Nav1.5
Nav1.5 mechanischer Stress Nav1.5+β1
Nav1.5+β1 mechanischer Stress
Regulation verschiedener Schalteigenschaften von Nav1.5 durch mechanischen Stress in Abhängigkeit von β1 (Inaktivierung, A) und β3 (Aktivierung, B; Mittelwerte ± Standardfehler; ANOVA mit Tukey Post-hoc-Test;
Signifikanzniveau * p≤0,05; ** p≤0,01; *** p≤0,001)
I: Strom; G: Leitfähigkeit; V1/2: Spannung der halbmaximalen Aktivierung und Inaktivierung
Fragestellung
Endothelzellen können abhängig von ihrem Ursprung aus der Mikro- oder Makrozirkula- tion phänotypisch variieren. Dieser Aspekt wird in der Endothelzellforschung häufig ver- nachlässigt. Es gibt präklinische Evidenz, dass der Lipidmediator Sphingosin-1-Phosphat (S1P) und die Adenosinmonophosphat-ab- hängige Kinase (AMPK) für die Stabilisierung der endothelialen Barriere in der Inflam- mation und Sepsis eine Rolle spielen [1,2].
S1P-Serumspiegel septischer Patienten sind reduziert und verhalten sich umgekehrt pro- portional zur Erkrankungsschwere [1]. Bisher wurde nur in makrovaskulären Endothelzel- len eine S1P-vermittelte Phosphorylierung der AMPK beschrieben [3]. Die mögliche Interaktion von S1P und AMPK und deren Be- deutung für die Stabilisierung der Barriere im mikrovaskulären Endothel wurde bisher nicht untersucht und ist Gegenstand dieser Studie.
Methodik
Mittels Immunoblotanalysen in humanen der- malen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC- 1) und murinen glomerulären Endothelzellen (GENCs) wurde der zeitliche Verlauf der Phos- phorylierung der AMPK α1/2-Untereinheiten an Threonin172 nach S1P-Stimulation untersucht und mit dem Mann-Whitney-U-Test gegen die unstimulierte Kontrolle statistisch ausgewertet.
Parallel wurde dieser Zeitverlauf mit Methanol untersucht, dem Vehikel, in welchem S1P ge- löst wurde. Als Positivkontrolle der Phospho- rylierung der AMPK α1/2-Untereinheiten an Threonin172 diente 5-Aminoimidazol-4-carbox- amid-Ribonukleotid (AICAR). Unter Verwen- dung eines „electric cell-substrate impedance sensing“ (ECIS)-Systems, welches über eine Messung der Impedanz die Charakterisierung der Barrierefunktion (Analyse der Resistenz) und der Proliferation (Analyse der Kapazität)
Bedingungen untersucht. Die statistische Aus- wertung der ECIS-Daten erfolgte mittels zwei- faktorieller ANOVA mit Messwiederholung und P-Wert-Korrektur nach Holm-Sidak. P-Werte
< 0,05 wurden als statistisch signifikant bewer- tet.
Ergebnisse
In HMEC-1 erfolgte bereits nach ein- und zweiminütiger Stimulation mit S1P eine frü- he Aktivierung der AMPK, angezeigt durch eine vermehrte Phosphorylierungsrate des Threonin172, während in GENCs eine Aktivie- rung erst nach 30 Minuten auftrat (Abb. 1).
Da die 30-minütige Stimulation mit Vehikel in GENCs ebenfalls zur Phosphorylierung des Threonin172 führte (Daten nicht gezeigt), ist von einer metabolischen Aktivierung der AMPK durch Methanol auszugehen und nicht von S1P-vermittelten Effekten. Die Stimula- tion mit S1P führte in HMEC-1 nach zwei bis fünf Stunden zu einer Verstärkung der endo- thelialen Barriere, während sie in GENCs kei- ne Effekte zeigte.
Interpretation
Die Signaltransduktion in mikrovaskulären Endothelzellen kann abhängig von ihrem Ursprung variieren. Während S1P in GENCs weder einen Einfluss auf die Aktivierung der AMPK noch auf die endotheliale Barriere zu haben scheint, ist die Verstärkung der endo-
thelialen Barrierefunktion in HMEC-1 mit ei- ner frühen Aktivierung der AMPK durch S1P assoziiert. Bei der Untersuchung neuer Stra- tegien, die zum Schutz der endothelialen Bar- riere die S1P-AMPK-Signaltransduktionsachse modulieren können, sollten daher Zelltyp- spezifische Unterschiede beachtet werden.
Die hier gezeigten Daten und Abb. 1 sind mittlerweile publiziert in [5].
Literatur
1. Coldewey SM, Benetti E, et al: Elevation of serum sphingosine-1-phosphate attenuates impaired cardiac function in experimental sepsis. Sci Rep 2016;6:27594
2. Creighton J, Jian M, et al: Adenosine monophosphate-activated kinase alpha1 promotes endothelial barrier repair. FASEB J 2011;25(10):3356–3365
3. Kimura T, Tomura H, et al: Mechanism and role of high density lipoprotein-induced activation of AMP-activated protein kinase in endothelial cells. J Biol Chem 2010;285(7):4387–4397 4. Giaever I, Keese CR: Micromotion of
mammalian cells measured electrically. Proc Natl Acad Sci U S A 1991;88(17):7896–7900 5. Dennhardt S, Finke KR, et al: Sphingosine-
1-phosphate promotes barrier-stabilizing effects in human microvascular endothelial cells via AMPK-dependent mechanisms.
Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 2019;1865(4):774–781.
Sphingosin-1-Phosphat vermittelt über AMPK-abhängige Mechanismen in humanen mikrovaskulären Endo- thelzellen Barriere-stabilisierende Effekte
K.R. Finke1,2 * · S. Dennhardt1,2,3 * · A. Huwiler4 · S.M. Coldewey1,2,3
1 Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, 2 Zentrum für Innovationskompetenz Septomics, 3 Center for Sepsis Control and Care, Universitätsklinikum Jena
4 Institut für Pharmakologie, Universität Bern, Inselspital Bern
* KRF und SD haben gleichwertig zu dieser Arbeit beigetragen
Korrespondenz: sina.coldewey@med.uni-jena.de
Abbildung 1
AMPK pThr172/ AMPK 1/2 Ratio (HMEC-1) AMPK pThr172/ AMPK 1/2 Ratio (GENCs)
norm. Resistenz () HMEC-1 norm. Resistenz () GENCs
AMPK pThr172
AMPK 1/2 AMPK pThr172
AMPK 1/2
HMEC-1 +S1P
HMEC-1
GENCs +S1P
GENCs
HMEC-1 GENCs
*
0 2 4 6 0 2 4 6
Zeit (h) Zeit (h)
A
C
B
8 6 4 2 0
* *
30 min15 min10 min5 min2 min1 min0,5 minunstimAICAR D
1.300 1.200 1.100 1.000 900 800 0
1.300 1.200 1.100 1.000 900 800 0 8
6 4 2 0
* * *
unstim0,5 min1 min2 min5 min10 min15 min30 minAIC AR
Unterschiedliche Effekte der Stimulation mit S1P auf die Aktivierung der AMPK durch Veränderung der Phosphorylierungsrate des Threonins172 in HMEC-1 und GENCs sowie auf die Stabilität ihrer endothelialen Barriere. A–B: Repräsentative Immunoblots für AMPK pThr172 und der gesamten AMPK α1/2-Untereinheiten und semi-quantitative Auswertung der Daten in (A) HMEC-1 und (B) GENCs. Gezeigt sind MW+SD für n=4,
*p<0,05 gegen unstimulierte Kontrolle. C–D: Messung der Resistenz zur Beurteilung der endothelialen Bar-
Fragestellung
Der Ionenkanal TRPV2 ist essentiell für die Phagozytose von Makrophagen und damit auch für das angeborene Immunsystem [1].
Während TRPV2 bei Nagern durch hohe Temperaturen > 50°C aktiviert wird, gilt der humane Ionenkanal als Hitze-insensitiv [2].
Der pathophysiologische Stimulus, der zur endogenen Aktivierung von TRPV2 führt, ist bis dato unbekannt. Der mit TRPV2 eng ver- wandte Ionenkanal TRPV1 kann über che- mische Modifikation von Cysteinen aktiviert werden [3]. Ziel des Projektes war es zu un- tersuchen, ob auch TRPV2 durch oxidativen Stress sensibilisiert oder aktiviert werden kann.
Methodik
Die Ionenkanäle TRPV2 und TRPV1 wurden transient in HEK293-Zellen exprimiert. Mu- tationen wurden mittels zielgerichteter Muta- genese generiert. Diese Zellen sowie humane monozytäre Zellen untersuchten wir mittels der Patch-Clamp-Technik. TRPV2-abhängige Phagozytose von Fluoreszein (FITC)-markier- ten, abgetöteten E. coli-Bakterien wurde in humanen monozytären Zellen bestimmt.
Ergebnisse
Hitze-induzierte Einwärtsströme in Zellen mit rTRPV2, aber auch mit hTRPV2, lassen sich durch das Oxidationsmittel Chloramin T (ChT 0,1 – 1 mM; Abb. 1A) sowie durch UVA- Licht, nicht aber durch H2O2 (10 mM), unter Abfall der Temperaturschwelle auf 35°C sen- sibilisieren. Die gleichzeitige Gabe des Anti- oxidans Dithiothreitol (DTT, 5 mM) verhindert die Sensibilisierung von rTRPV2, während eine einmal erfolgte ChT-vermittelte Sensi- bilisierung Hitze-induzierter Einwärtsströme in rTRPV2 durch DTT nur partiell reversibel ist. ChT sensibilisiert auch Einwärtsströme,
die durch den Agonisten 2-Aminoethoxydi- phenylborat (2-APB) induziert werden. An hTRPV2, der sogar als 2-APB-insensibel be- schrieben wurde [2], verursacht 1 mM ChT eine Potenzierung 2-APB-induzierter Strö- me (35 ± 18 auf 461 ± 62 pA, n=8, p < 0,02, Wilcoxon-Test). An humanen monozytären Zellen sensibilisiert 1 mM ChT ebenfalls Hitze-induzierte Einwärtsströme (Abb. 1B), diese lassen sich durch den TRP-Kanal-Blo- cker Ruthenium Rot (RR, 10 µM) blockieren.
RR reduziert auch die Phagozytose von FITC- markierten, abgetöteten E. coli-Bakterien um 25 ± 3%, vergleichbar mit der Reduktion um 32 ± 4% durch die Applikation von 5 mM DTT (Kruskal Wallis ANOVA, Dunn-Test, p<0,05 jeweils). Experimente an hTRPV1 zei- gen, dass die Sensibilisierung Hitze-induzier- ter Einwärtsströme durch UVA-Licht in der H2O2-insensitiven Mutante C158A/C391A/
C767A-hTRPV1 erhalten ist. Auch die fehlen- de Sensibilisierung von TRPV2 durch H2O2
deutet auf einen möglicherweise Cystein- unabhängigen Mechanismus hin, der in TRPV1 und TRPV2 konserviert sein könnte.
Ein in der Pore liegendes konserviertes Methio nin in rTRPV2 (M607) und hTRPV1 (M645) gilt durch die Bildung einer oberen Engstelle als Selektivitätsfilter in beiden Io- nenkanälen. Eine Oxidation dieser Methioni- ne könnte demnach die Porenweite beeinflus- sen und so die Sensitivität der Kanäle deutlich verändern. Tatsächlich zeigten sich durch den Austausch des Methionins (M607I) an rTRPV2
deutlich reduzierte Effekte durch ChT und UVA-Licht an Hitze- und 2-APB-induzierten Einwärtsströmen bei erhaltender Sensibilität gegenüber 2-APB und Hitze. Auch in hTRPV1 führte der zusätzliche Austausch von M645 zu Isoleucin in der C158A/C391A/C767A- hTRPV1-Mutante zu einem deutlichen Verlust der UVA-induzierten Sensibilisierung Hitze- induzierter Einwärtsströme bei erhaltener Capsaicin-Sensibilität.
Interpretation
Eine Sensibilisierung von TRPV-Kanälen durch die chemische Modifikation von Me- thioninen ist bis dato unbekannt. Die in dieser Arbeit gezeigte, Methionin-abhängige Redox-Sensitivität von TRPV2 könnte einen entscheidenden endogenen Mechanismus für die Aktivierung von TRPV2 in Makrophagen darstellen.
Literatur
1. Link TM, Park U, Vonakis BM, et al: TRPV2 has a pivotal role in macrophage particle binding and phagocytosis. Nature immunology 2010;11:232–239
2. Neeper MP, Liu Y, Hutchinson TL, et al:
Activation properties of heterologously expressed mammalian TRPV2: evidence for species dependence. The JBC 2007;282:15894–15902
3. Chuang HH, Lin S: Oxidative challenges sensitize the capsaicin receptor by covalent cysteine modification. PNAS 2009;106:20097–20102.
Der Hitze-sensitive Ionenkanal TRPV2 wird über eine Oxidation intrazellulärer Methionine aktiviert
T. Fricke · C. Herzog · F. Echtermeyer · A. Leffler · M. Eberhardt
Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin, Medizinische Hochschule Hannover
Korrespondenz:
Eberhardt.Mirjam@mh-hannover.de
Abbildung 1
A B
45 35 25
45 35 25 50
40 30
rTRPV2 humane monozytäre Zellen
°C °C
10 s 15 s
Temp. Schwelle (°C)
1 nA 0,5 nA
Kontrolle 1mM ChT
20
ChT 1 mM ChT 1 mM RR 10 µM
Chloramin T (ChT) sensibilisiert Hitze-induzierte Einwärtsströme in rTRPV2 (A) und humanen monozytären Zellen (B). Diese können durch Ruthenium Rot (RR) blockiert werden. Die Temperaturschwelle zur Aktivie- rung von rTRPV2 wird durch ChT in physiologische Bereiche verschoben (A rechts; n=14, p<0,001, ge- paarter Wilcoxon-Test).
Fragestellung
Direkt wirkende orale Antikoagulantien (DOAK) sind Standard zur Antikoagulation bei nicht-valvulärem Vorhofflimmern und tie- fer Beinvenenthrombose und ersetzen zuneh- mend Vitamin-K-Antagonisten. Wegen ihrer relativ stabilen Pharmakokinetik sind i.d.R.
keine Gerinnungskontrollen notwendig. Die Messung substanzspezifischer Anti-Faktor-IIa- bzw. -Xa-Aktivität erlaubt zwar grundsätzlich einen Rückschluss auf die Plasmakonzen- trationen, ist jedoch zeitintensiv und nicht ubiquitär verfügbar. Dies wirft die Frage des Monitorings von DOAKs in Notfallsituationen auf. Plasmatische Gerinnungsvariablen (INR, aPTT, Thrombinzeit) und klassische rotations- thrombelastometrische Tests (ROTEM®; Tests:
INTEM®, EXTEM®, FIBTEM®) sind unzurei- chend [1,2].
Daher haben wir die Hypothesen getestet, dass 1) mittels des ecarinbasierten (ECATEM®) bzw. niedrigkonzentrierten Gewebefaktortests (TFTEM®) das Vorliegen von IIa- und Xa-An- tagonisten mittels ROTEM im Blut nachge- wiesen und 2) zwischen Faktor Xa- und di- rekten Thrombininhibitoren unterschieden werden kann.
Methodik
Bei positivem Ethikkommissionsvotum wur- den aufsteigende Konzentrationen der Rein- substanzen von Dabigatran und Rivaroxaban (0; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 µg/l) dem Blut von 10 gesunden Probanden zugegeben und anschließend ROTEM®-Tests (FIBTEM®, ECATEM®, TFTEM®) sowie Bestimmungen der Anti-IIa- bzw. Xa-Plasmakonzentration durchgeführt. Zur Bestätigung unserer Ergeb- nisse haben wir den ECATEM®- und TFTEM®- Tests spezifische Antagonisten zugegeben.
Im nächsten Schritt wurden vorgenannte Tests im Zeitverlauf bei je 10 Patienten, die neu auf eines der genannten DOAKs eingestellt wur- den, durchgeführt.
Statistik
Zum Vergleich beider Gruppen wurde bei nicht normalverteilten Daten der Friedmann- Test (entsprechend ANOVA bei nicht nor- malverteilten Daten) und als Post-hoc-Test bei multiplem Testen der Dunn-Test verwen- det. Zudem wurden ROC-Analysen für die verschiedenen Tests durchgeführt. Die Ent- wicklung der spezifischen Antagonisten fand in Zusammenarbeit mit TEM International GmbH statt.
Ergebnisse
Dabigatran führt zu einer konzentrationsab- hängigen Verlängerung der ClottingTime (CT in sec) im ECATEM® (Median: 99 s, 151 s, 195 s, 270 s*, 436 s*, 696 s*, * vs. Vollblut ohne Wirkstoff: p < 0,05), nicht hingegen Ri- varoxaban (98,5 s, 98 s, 99,5 s, 107 s, 107,5 s, 109,5 s). Beim TFTEM® führen sowohl Riva- roxaban als auch Dabigatran zu einer deut - lichen Verlängerung der CT (Rivaroxaban 112,5 s; 281,5 s; 317,5 s; 453,5 s*; 527,5 s*;
711 s*; * vs. Vollblut ohne Wirkstoff p < 0,05/
Dabigatran: 136,5 s; 154,5 s; 178,5 s; 213 s*;
258,5 s*; 399 s*; * vs. Vollblut ohne Wirkstoff p < 0,05). Insbesondere der Quotient aus CTTFTEM und CTECATEM diskriminiert zwischen Dabigatran und Rivaroxaban (Cutoff 2,0).
Klassische Gerinnungsvariablen, FIBTEM® und NATEM® zeigten unspezifische Ände- rungen. Die Zugabe spezifischer Antagonis- ten normalisiert konzentrationsabhängig die
CTTFTEM bzw. CTECATEM. Im nächsten Schritt un- tersuchten wir Patienten mit Neueinstellung auf Dabigatran und Rivaroxaban. Hier zeig- ten sich analoge Ergebnisse. Der Quotient aus TFTEM/ECATEM diskriminiert zwischen Dabigatran und Rivaroxaban (AreaUndertheCurve
der ROC-Analyse in vitro und in vivo: 1,0) Interpretation
Die neuen rotationsthrombelastometrischen Tests TFTEM® und ECATEM® detektieren Ri- varoxaban und Dabigatran, der Quotient er- möglicht eine Diskrimination zwischen den Substanzen. Vorhergehende Studien konnten bereits den Zusammenhang zwischen Clot- ting Time in den klassischen ROTEM-Tests und Dabigatran- bzw. Rivaroxaban-Plasma- spiegel zeigen [2]. Die neuen Tests sind zu- dem in der Lage, zwischen den Substanzen zu unterscheiden.
Diese Diskrimination kann in der Zukunft eine spezifischere Behandlung der erfolgten Antikoagulation in Notfallsituation oder vor geplanten Interventionen ermöglichen.
Literatur
1. Samuelson BT, Cuker A, Siegal DM, Crowther M, Garcia DA: Laboratory Assessment of the Anticoagulant Activity of Direct Oral Anticoagulants: A Systematic Review. Chest 2017;151(1):127–138
2. Henskens YMC, Gulpen AJW, van Oerle R, Wetzels R, Verhezen P, Spronk H, et al:
Detecting clinically relevant rivaroxaban or dabigatran levels by routine coagulation tests or thromboelastography in a cohort of patients with atrial fibrillation. Thromb J 2018;1;16:3.
Neuartiger POC-Test detektiert die Wirkung direkter oraler Antikoagu- lantien (DOAK) und diskriminiert zwischen Dabigatran und Rivaroxa- ban in vitro und in vivo
P. Groene1 · T. Wiederkehr1 · T. Kammerer1 · A. Acevedo1 · V. Brummer1 · K. Feil2 · L.C. Hinske1 · S.T. Schäfer1
1 Klinik für Anästhesiologie, 2 Neurologische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München, LMU München 3 Institut für Anästhesiologie und Schmerz-
therapie, HDZ NRW, Ruhr-Universität Bochum Korrespondenz:
Philipp.Groene@med.uni-muenchen.de
Abbildung 1
DOAC-Konzentration Vollblut in µg/l 0 200 400 600
1) Vor Erstgabe 2) 3 h nach Erstgabe 3) Nach 24 h vor nächster Gabe 4) 3 h nach vorangegangener Gabe
Dabigatran Rivaroxa- ban 8
6 4 2 0
Ratio
1 2 3 4 8
6 4 2 0
Ratio
a) b)
Veränderungen der Ratio aus CTTFTEM und CTECATEM (Median + IQR; n=10;). Mögliche Diskrimination zwi- schen Rivaroxaban und Dabigatran durch die gebildete Ratio. a) in vitro b) in vivo.
Fragestellung
Komplexe pathophysiologische Krankheits- bilder wie die Sepsis und das Acute Respi- ratory Distress Syndrome (ARDS) sind durch die Ausschüttung multipler inflammatorischer Zytokine und Chemokine gekennzeichnet.
Über deren Zusammenspiel im lokalen Ent- zündungsmilieu ist nur wenig bekannt. Von großem klinischen Interesse sind die Media- toren, die den Scheideweg zwischen ord- nungsgemäßer Beendigung und schädlicher Aufrechterhaltung der Entzündung determi- nieren. Im Fokus unserer Arbeit steht der Ent- zündungsmediator „macrophage migration inhibitory factor“ (MIF), ein pleiotropes aty- pisches Chemokin (ACK) mit alarminartigen und proinflammatorischen Eigenschaften [1].
Chemokine sind wesentlich an der Leukozy- tenrekrutierung in entzündetes Gewebe be- teiligt und prägen so das dort vorherrschende Immunzellprofil. MIF ähnelt den Chemokinen zwar funktionell, jedoch unterscheidet es sich strukturell. Die Funktionen von MIF-2, einem erst kürzlich charakterisierten MIF-Homolog, sind noch weitgehend unbekannt. Es gibt zu- nehmend Hinweise auf strukturelle und funk- tionelle Interaktionen klassischer Chemokine untereinander und mit ihren Rezeptoren [2].
Ziel des Projektes war es, mögliche Chemo- kin-Interaktionspartner von MIF und MIF-2 zu identifizieren und zu charakterisieren, um das Verständnis über ACK-Chemokin-In- teraktionen und deren Auswirkungen im Ent- zündungsmilieu zu erweitern. Das klassische Chemokin CCL20, das im Paracetamol-indu- zierten Leberversagen an der Entzündungs- Resolution beteiligt ist [3], ist ein potenzieller Interaktionspartner von MIF-2. Ob diese In- teraktion in vitro bestätigt werden kann und welche molekularen Mechanismen zu Grun- de liegen, ist Ausgangspunkt für diese Arbeit.
Methodik
Zur Identifikation möglicher Interaktions- partner wurden MIF-2-Chemokin-Arrays mit immobilisierten Chemokinen und Inkubation mit markiertem MIF-2-Protein durchgeführt.
Mittels Pulldown-Assay und Micro scale Ther-
mophoresis (MST) wurde eine mögliche Inter- aktion in vitro geprüft. Der Pulldown-Assay basiert auf der Bindung von Biotin-markier- tem MIF-2 an paramagnetische Streptavidin Beads, es folgt die Inkubation mit CCL20.
Im Falle einer MIF-2-CCL20-Interaktion haf- tet der Komplex ebenfalls an den Beads und kann mittels SDS-Page/Westernblot detek- tiert werden. MST ermöglicht die Quantifizie- rung biomolekularer Interaktionen basierend auf den temperaturabhängigen Diffusions- eigenschaften von fluoreszenzmarkiertem MIF-2 nach Inkubation mit CCL20. Um mög- liche Protein-Protein-Bindungsdomänen der Interaktion zu identifizieren, wurden kurze Chemokin-Peptidsequenzen, bestehend aus 15 Aminosäuren (AS), mit 3 AS Versatz auf einen Objektträger gespottet und dann mit markiertem MIF-2 inkubiert. Ergänzt werden diese Verfahren durch strukturelle In-silico- Analysen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse dieses Projekts weisen eine Komplexbildung des proinflammatorischen ACK MIF-2 mit dem Resolution-fördernden Chemokin CCL20 nach. Ein MIF-2-Chemo- kin-Array lässt auf eine Interaktion von MIF-2 mit klassischen Chemokinen schließen. Die Interaktion von MIF-2 und CCL20 konnte mittels Pulldown (Abb. 1A) und MST bestätigt werden. Ein CCL20-Peptid-Microarray zeigt
potenzielle Interaktionen von MIF-2 mit den N-terminalen Peptidsequenzen von CCL20 (Abb. 1B). In-silico-Analysen (Abb. 1C) deu- ten an, wie ein potenzieller MIF-2-CCL20- Komplex aussehen könnte.
Interpretation
Unsere Befunde sind ein wichtiger Ausgangs- punkt zur Charakterisierung des komplexen molekularen Netzwerks im Entzündungsmili- eu. Darauf basierend soll im weiteren Projekt- verlauf untersucht werden, ob auf die struktu- relle eine funktionelle Interaktion folgt und ob eine therapeutische Regulation sinnvoll ist.
Literatur
1. Rex S, Kraemer S, Grieb G, Emontzpohl C, Soppert J, Goetzenich A, et al: The role of macrophage migration inhibitory factor in critical illness. Mini Rev Med Chem 2014;14(14):1116–1124
2. Von Hundelshausen P, Agten SM, Eckardt V, Blanchet X, Schmitt MM, Ippel H, et al:
Chemokine interactome mapping ena- bles tailored intervention in acute and chronic inflammation. Sci Transl Med 2017;9(384):eaah6650
3. Scheiermann P, Bachmann M, Hardle L, Pleli T, Piiper A, Zwissler B, et al: Application of IL-36 receptor antagonist weakens CCL20 expression and impairs recovery in the late phase of murine acetaminophen-induced liver injury. Sci Rep 2015;5:8521.
Komplexbildung von MIF-2 und CCL20 – strukturelle Interaktion von atypischen und klassischen Chemoki- nen in vitro
A. Hoffmann1,2 · M. Brandhofer2 · P. Scheiermann1 · J. Bernhagen2 1 Klinik für Anästhesiologie,
2 Lehrstuhl für Vaskuläre Biologie, Institut für Schlaganfall- und Demenzforschung, Klinikum der Universität München Korrespondenz:
Adrian.Hoffmann@med.uni-muenchen.de
Abbildung 1
A
B C
CCL20 Peptide-MIF-2
Chemilumineszenz-Intensität (-)
6,00 4,00 2,00 2,00 -2,00
15 kDa
8 kDa
Kontrolle B-MIF-2 CCL20
Pulldown B-MIF-2 neg.
Kontrolle
C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07
Peptide
Strukturelle Interaktion von MIF-2 und CCL20. A: Pulldown von CCL20 (rot) mit Biotin-MIF-2 (grün) mittels paramagnetischer Streptavidin-Beads. B: CCL20-Peptid-Microarray mit Bindung von MIF-2 an N-terminale Peptide (AS-Sequenz C14–C17: DCCLGYTDRILHPKFIVGFTRQLA). C: in silico MIF-2 (blau)-CCL20 (grau;
rot: N-terminale AS-Sequenz C14–C17)-Komplex.
Fragestellung
Schädel-Hirn-Traumata (SHT) sind weltweit vor allem im jungen Erwachsenenalter eine gravierende Problematik mit hoher Mortali- tät und Morbidität [1]. All-trans-Retinsäure (ATRA) ist ein bioaktiver Vitamin A-Metabolit mit wichtigen Funktionen während der Ent- wicklung des Gehirns. Darüber hinaus wurden neuroprotektive Effekte durch Admi- nistration von ATRA vor ischämischen Hirn- verletzungen in Ratten berichtet [2]. Ziel der vorliegenden Studie war es, den potenziellen therapeutischen Nutzen post-traumatisch applizierter ATRA auf sekundäre Hirnschä- digungsprozesse im experimentellen SHT zu untersuchen.
Methodik
Alle Tierexperimente wurden mit Genehmi- gung durch das Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz durchgeführt. Durch einen rechtsparietalen „controlled cortical impact“
(CCI) wurde unter Isoflurananästhesie eine traumatische Hirnschädigung an C57BL6/N Mäusen induziert. Unmittelbar nach Hirn- schädigung sowie an Tag 1–3 wurde 10 mg/kg Körpergewicht ATRA (Sigma) intraperitoneal appliziert (CCI (Vehikel n = 12, ATRA n = 12) und Scheinversuch (Vehikel n = 8, ATRA n = 8)). Vor und nach Trauma wurde ein neu- rologischer Defizit-Score (NDS, 0–12 Punkte) erhoben. Nach sieben Tagen Überlebenszeit wurde das histopathologische Kontusionsvo- lumen bestimmt sowie die Astrozytenaktivie-
rung mittels Immun-Histologie, quantitativer PCR und Western-Blot analysiert. Die statis- tische Auswertung erfolgte bei parametrischer Verteilung mittels unabhängigem zweiseiti- gem t-Test, bei nicht-parametrischer Vertei- lung mittels Mann-Whitney-U-Test. Multiple Vergleiche zwischen Gruppen wurden mit- tels ANOVA und Holm-Sidak-Korrektur durchgeführt (Si gnifikanz bei p < 0,05, Mittel- wert ± SEM).
Ergebnisse
Im geschädigten Hirngewebe zeigte sich durch ATRA-Gabe eine Abschwächung der posttraumatisch erhöhten mRNA-Expression für Retinaldehyd-Dehydrogenase um 14%, wodurch die Wirksamkeit von ATRA im Hirngewebe indirekt nachgewiesen wurde.
Sowohl die Scheinversuch- als auch die CCI-Tiere zeigten keine phänotypischen Än- derungen durch die ATRA-Gabe. Der NDS war sieben Tage nach CCI durch ATRA im Ver- gleich zur Vehikel-Behandlung reduziert (CCI:
ATRA 0,9 ± 0,3 vs. Vehikel 1,9 ± 0,5 Punkte;
p = 0,04). Gleichermaßen war das Hirnläsi- onsvolumen in ATRA-behandelten Tieren sig- nifikant kleiner (CCI: ATRA 10,9 ± 0,5% ispi- laterale Hemisphäre vs. Vehikel 12,7 ± 0,7;
p = 0,04; Abb. 1). Der posttraumatische An- stieg der GFAP mRNA-Expression als Mar- ker für reaktive Astrogliose im periläsionalen Hirngewebe verringerte sich durch ATRA (p = 0,0008), ebenso wie sich im Immunoblot
eine verringerte GFAP-Expression und Spal- tung darstellte (p = 0,04). Immunhistochemi- sche Analysen zeigten eine deutliche Reduk- tion in der Anzahl GFAP-immunoreaktiver Partikel im periläsionalen Narbengewebe (p = 0,009).
Interpretation
Unsere Daten zeigen erstmals, dass ATRA bei repetitiver systemischer Gabe neuroprotektiv wirkt und die reaktive Astrogliose in einem klinisch relevanten, experimentellen SHT- Modell vermindert.
Die posttraumatische Gabe von ATRA könnte somit eine interessante therapeutische Op - tion für die Behandlung sekundärer Hirnschä- digungsprozesse darstellen, insbesondere da ATRA als orales Medikament bereits die FDA- /EMA-Zulassung zur Behandlung akuter pro- myelozytischer Leukämie vorweist [3].
Literatur
1. Maas AIR, Stocchetti N, Bullock R: Moderate and severe traumatic brain injury in adults. The Lancet Neurology 2008;7(8):728–741 2. Kong L, et al: Retinoic acid ameliorates
blood-brain barrier disruption following ischemic stroke in rats. Pharmacol Res 2015;99:125–136
3. Kayser S, Schlenk R F , Platzbecker U:
Management of patients with acute promyelocytic leukemia. Leukemia 2018;32(6):1277–1294.
All-trans-Retinsäure (ATRA) ist neu- roprotektiv und vermindert reaktive Astrogliose in einem experimentellen Modell traumatischer Hirnschädigung
R. Hummel1,2 · S. Ulbrich1 · S. Zander1 · W. Bobkiewicz1 · C. Gölz1 · M.K.E. Schäfer1,3 1 Klinik für Anästhesiologie, Universitätsmedizin
Mainz
2 Mainz Research School of Translational Biomedicine (TransMed)
3 Focus Program Translational Neurosciences (FTN) Mainz
Korrespondenz: rehummel@uni-mainz.de
Abbildung 1
A) Vehikel CCI B) ATRA CCI
15
10
5
0
Vehikel CCI Läsionsvolumen (% ipsilaterale Hemisphäre)
*
ATRA CCI C)
Histopathologischer Hirnschaden nach CCI und ATRA Gabe. A,B: Kresylviolett-gefärbte koronare Hirn- schnitte nach CCI in Vehikel und ATRA-behandelten Mäusen. C: Diagramm des histopathologischen Hirn- schadensvolumen sieben Tage nach CCI in % der ipsilateralen Hemisphäre (Vehikel CCI n=12, ATRA CCI n=10, t-Test, * p<0,05).
