Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von neuen Interaktionspartnern des humanen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktors ARHGEF6/[alpha]PIX

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(1)Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von neuen Interaktionspartnern des humanen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktors ARHGEF6/α αPIX. DISSERTATION. zur Erlangung des akademischen Grades „Doktor der Naturwissenschaften” des Fachbereichs Biologie der Universität Hamburg. vorgelegt von Georg Rosenberger aus Altenhof im Mühlviertel. Hamburg 2004.

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(3) INHALTSVERZEICHNIS. Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abkürzungen I.. Zusammenfassung …………………………...……………….…………...…...…........ 1. II.. Einleitung ………………………...………………………….………………………..... 3. 1. Das Zytoskelett ................................................................................................................ 2. Zellanhaftung, Zellausbreitung und Zellmigration .......................................................... 3. Integrine sind Verbindungsproteine zwischen der extrazellulären Matrix und dem Aktin-Zytoskelett ................................................... 4. Die Rho-GTPasen ............................................................................................................ 4.1 Die Rho-GTPasen bilden eine eigene Subfamilie ..................................................... 4.2 Der Rho-GTPase-Zyklus ........................................................................................... 4.3 p21-aktivierte-Kinasen sind wichtige Effektorproteine der GTPasen Rac1 und Cdc42 ........................................................ 5. Integrine und Rho-GTPasen sind für die Zellausbreitung wichtig .................................. 6. Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) für Rho-GTPasen ................................... 6.1 Die Domänenstruktur der GEFs ................................................................................ 6.2 Die Regulation von GEFs .......................................................................................... 7. Rho-GTPasen, GEFs und neuronale Morphogenese ......................................................... 3 5. 10 11 13 13 14 15. 8. Der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor ARHGEF6/αPIX ............................................. 9. X-chromosomale unspezifische geistige Behinderung ..................................................... 16 18. Ziel der Arbeit ……………………………………………………………………....…. 22. 7 8 8 9. III. Material und Methoden ………………………………………………………….…… 23 1. Material ............................................................................................................................ 1.1 Material für molekularbiologische Methoden ……………………………………... 1.2 Materialien für Hefe-Zwei-Hybrid-Experimente ....................................................... 1.3 Materialien für proteinbiochemische Arbeitstechniken ............................................. 1.4 Materialien für zellbiologische Methoden ………………………………………..... 1.5 Sonstige Chemikalien ................................................................................................ 1.6 Bakterienstämme, Hefestämme und Zelllinien ......................................................... 1.7 Plasmide ..................................................................................................................... 1.7.1 Ausgangsvektoren für Klonierungen .................................................................. 1.7.2 Hergestellte Konstrukte ....................................................................................... 1.7.3 Nicht selbst klonierte Konstrukte ........................................................................ 1.8 Oligonukleotide ......................................................................................................... 1.9 Antikörper ................................................................................................................... 23 23 23 24 24 25 26 26 26 27 29 30 32. I.

(4) INHALTSVERZEICHNIS 2. Molekularbiologische Methoden ..................................................................................... 2.1 Anzucht von E coli ......…………............................................................................. 2.2 Herstellung kompetenter E coli für chemische Transformation ............................... 2.3 Transformation kompetenter E.coli Zellen mit Plasmid-DNA ................................. 2.4 Isolierung von Plasmid-DNA .................................................................................... 2.5 Restriktion von DNA ................................................................................................. 2.6 Ligation von DNA ..................................................................................................... 2.7 Dephosophorylierung von 5‘-Phosphat-DNA-Enden ............................................... 2.8 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA ............................................ 2.9 Polymerase Kettenreaktion (PCR) und Megaprime PCR ......................................... 2.10 Agarosegelelektrophorese ......................................................................................... 2.11 Aufreinigung von PCR Produkten ............................................................................. 2.12 DNA-Sequenzierung .................................................................................................. 2.13 Klonierung mittels GatewayTM-Technologie ............................................................. 3. CytoTrap Hefe-Zwei-Hybrid-System .............................................................................. 3.1 Herstellung kompetenter S.cerevisiae cdc25H-Zellen und Transformation ............. 3.2 Plasmid-DNA-Isolierung aus Hefe mittels Lyticase und alkalischer Lyse ............... 3.3 Auswertung der erhaltenen Sequenzen ..................................................................... 3.4 Kultivierung, Auftauen und Einfrieren von Hefezellen ............................................ 3.5 Proteinisolierung aus Hefe ........................................................................................ 3.6 cDNA-Bibliothek und Isolierung aus E.coli ............................................................. 4. Proteinbiochemische Arbeitstechniken ............................................................................ 4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) .............................................. 4.2 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford .............................................. 4.3 Transfer von Proteinen auf eine Membran mittels Semi-dry-Blot (Western-Blot) ....................................................................... 4.4 Immunologische Detektion immobilisierter Proteine auf PVDF-Membranen .......... 4.5 Koimmunpräzipitation ............................................................................................... 4.6 GST-Pull-Down-Experimente ................................................................................... 4.7 Rac1-Pull-Down-Experimente .................................................................................. 5. Zellbiologische Methoden …………………………………………….……………….. 5.1 Zellkultur ................................................................................................................... 5.1.1 Allgemeine Kulturbedingungen .......................................................................... 5.1.2 Passagieren von Zellen ........................................................................................ 5.1.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen .................................................................... 5.1.4 Transiente Transfektion eukaryotischer Zellen mittels LipofectaminTM2000-Reagens ................................................................. 5.1.5 Stabile Transfektion eukaryotischer Zellen mittels LipofectaminTM2000-Reagens und Flp-InTM System ............................... 5.2 Immunfluoreszenz-Analysen ..................................................................................... 5.3 Experimente zur Zellausbreitung ……………………………………………..…….. 33 33 33 34 34 35 35 35 35 36 37 37 37 38 38 39 41 42 42 42 43 43 43 44 44 45 45 46 47 49 49 49 49 50 50 51 51 53. II.

(5) INHALTSVERZEICHNIS IV. Ergebnisse …………………………………………………………………………..….. 54. 1. Analyse der katalytischen Aktivität von ARHGEF6/αPIX mittels Rac1-Pull-Down-Experimenten ............................................................................ 54. 1.1. Herstellung verschiedener HA-ARHGEF6/αPIX-Konstrukte, Nachweis der Proteinexpression mittels Western-Blot und Analyse der katalytischen Aktivität von ARHGEF6/αPIX in transient transfizierten CHO-K1-Zellen .............. 1.2. 55. Herstellung verschiedener ARHGEF6/αPIX-Konstrukte zur Generierung stabil exprimierender CHO-K1-Zelllinien, Nachweis der Proteinexpression mittels Western-Blot und Analyse der katalytischen Aktivität von ARHGEF6/αPIX ................................ 58. 2. Identifizierung von neuen Interaktionspartnern des humanen ARHGEF6/αPIXProteins mit Hilfe des CytoTrap Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ......................................... 61 2.1. Herstellung verschiedener ARHGEF6/αPIX-Köderkonstrukte und Nachweis der Proteinexpression im Hefestamm cdc25A mittels Western-Blot ........................ Durchmusterung einer menschlichen fötalen Hirn cDNA-Bibliothek. 62. mit ARHGEF6/αPIX-Wildtyp als Köderprotein ........................................................ 63. Identifizierung von RAP1B als Interaktionspartner von ARHGEF6/αPIX mittels direkter Interaktion im CytoTrap Hefe-Zwei-Hybrid-System ....................... 2.3.1 Vorbemerkungen .................................................................................................. 68 68. 2.2 2.3. 2.3.2 Identifizierung von RAP1B als Interaktionspartner von ARHGEF6/αPIX ......... 2.4 Eingrenzung des jeweiligen interagierenden Bereichs von. 68. ARHGEF6/αPIX mit den putativen Interaktionspartnern ......................................... 3. Verifizierung der Protein-Protein-Interaktionen durch verschiedene biochemische Präzipitationsexperimente ……………………….……..…. 69. Verifizierung der Interaktionen zwischen ARHGEF6/αPIX und PARVB bzw. CAPNS1 durch Koimmunpräzipitationen ................................... 3.1.1 Koimmunpräzipitationen von ektopisch exprimiertem. 73. 3.1. 73. HA-ARHGEF6/αPIX mit FLAG-PARVB bzw. FLAG-CAPNS1 aus kotransfizierten CHO-K1-Zellen ....................................... 74 3.1.2. Koimmunpräzipitationen von endogenem ARHGEF6/αPIX und ARHGEF7/βPIX mit FLAG-PARVB bzw. FLAG-CAPNS1 aus transfizierten CHO-K1-Zellen ....................................................................... 3.2. 75. Verifizierung der Interaktion zwischen ARHGEF6/αPIX mit verschiedenen Bindungspartnern durch GST-Pull-Down-Experimente .................... 77. 3.3. Identifizierung einer Homodimerisierung von ARHGEF6/αPIX mittels GST-Pull-Down-Experimente ....................................................................... 4. Auswirkungen der Mutationen auf die Protein-Protein-Interaktionen. 79. und die zelluläre Lokalisation des ARHGEF6/αPIX-Proteins ......................................... 80. 4.1. Analyse der Auswirkungen der mutierten ARHGEF6/αPIX-Proteine auf verschiedene Protein-Protein-Interaktionen mittels GST-Pull-Down-Experimenten ...................................................................... 81. III.

(6) INHALTSVERZEICHNIS 4.2. Analyse der subzellulären Lokalisation von HA-ARHGEF6/αPIX. und den zwei mutierten ARHGEF6/αPIX-Proteinen in transfizierten CHO-K1-Zellen ............................................................................... 5. Charakterisierung der Protein-Protein-Interaktion zwischen ARHGEF6/αPIX und PARVB ........................................................................ 5.1 Die Funktion von PARVB ......................................................................................... 5.2 Immunzytochemische Analysen zur Protein-Protein-Interaktion. 83 85 85. von ARHGEF6/αPIX und PARVB in CHO-K1-Zellen ............................................ 86 6. Charakterisierung der Protein-Protein-Interaktion zwischen ARHGEF6/αPIX und CAPNS1 ....................................................................... 6.1 Die Funktion von Ca2+-abhängigen Calpain-Proteasen ............................................. 6.2 6.3. 91 91. Bestimmung der interagierenden Domänen von ARHGEF6/αPIX mit CAPNS1 mit Hilfe von GST-Pull-Down-Experimenten ..................................... 92 Immunzytochemische Analysen zur Protein-Protein-Interaktion. von ARHGEF6/αPIX und CAPNS1 in CHO-K1-Zellen .......................................... 7. Charakterisierung der morphologischen Auswirkungen während des Fibronektin-abhängigen Ausbreitens von CHO-K1-Zellen. 94. bei Überexpression von ARHGEF6/αPIX, PARVB oder CAPNS1 ............................... 96 7.1 Etablierung des Zellsystems zur Untersuchung des Ausbreitens von Zellen in Abhängigkeit von Fibronektin ………………..…..……. 96 7.2 Charakterisierung der Auswirkungen von überexprimiertem. 7.3. 7.4. Wildtyp- und mutierten ARHGEF6/αPIX-Proteinen auf die Fibronektin-abhängige Zellausbreitung ......................................................... Analyse der subzellulären Lokalisation von Wildtyp. 98. und mutierten HA-ARHGEF6/αPIX-Proteinen in CHO-K1-Zellen sowie deren Morphologie während der Zellausbreitung ........................................... 101 Analyse der subzellulären Lokalisation von FLAG-PARVB und FLAG-CAPNS1 sowie der Morphologie dieser transfizierten CHO-K1-Zellen ………………………...……… 104. 7.5. Analyse der Kolokalisation von HA-ARHGEF6/αPIX mit verschiedenen Proteinen des Integrin-Signalweges in CHO-K1-Zellen ………..…. 8. Analyse der Auswirkungen von verschiedenen Calpain-Inhibitoren auf das Fibronektin-abhängige Ausbreiten von CHO-K1-Zellen .................................... 8.1 Nachweis der Proteinexpression von CAPNS1, CAPN1 und CAPN2 in CHO-K1-Zellen …………………..………..….. 8.2 Analyse der Auswirkungen von verschiedenen Calpain-Inhibitoren auf das Fibronektin-abhängige Ausbreiten von CHO-K1-Zellen ………..……….... 8.3. 106 111 111 112. Auswirkungen der Überexpression von ARHGEF6/αPIX-Wildtyp, ARHGEF6/αPIX-DN oder ARHGEF6/αPIX-∆DH auf das Fibronektin-abhängige Ausbreiten von Calpain-inhibierten CHO-K1-Zellen .......... 114. IV.

(7) INHALTSVERZEICHNIS V.. Diskussion ……………………………………………………………………..………. 118. 1. Identifizierung von acht neuen ARHGEF6/αPIX-Interaktionspartnern …………..…… 118 2. ARHGEF7/βPIX, RAP1B und ABBP1/Fe65 sind in die Regulation des Aktin-Zytoskeletts involviert ....................................................... 119. 3. ARHGEF6/αPIX und PARVB verbinden die Integrin-induzierte Signalkaskade mit den Rho-GTPasen Rac1 und Cdc42 während der Zellausbreitung ............. 121 4. ARHGEF6/αPIX und CAPNS1 sind maßgeblich an der Entstehung von fokalen Adhäsionen während Zellausbreitung beteiligt ........................ 124 4.1 Identifizierung und Verifizierung der Protein-Protein-Interaktion zwischen 4.2 4.3. ARHGEF6/αPIX und CAPNS1 ................................................................................ 124 Calpaine sind Regulatoren fokaler Adhäsionen während der Zellausbreitung ………………………………………….…...………. 125 ARHGEF6/αPIX und Calpaine spielen eine Rolle bei Rho-GTPase-abhängigen Signalkaskaden während der Zellausbreitung ….……..... 125. 5. Mutationen im ARHGEF6/αPIX-Gen führen zu einer Beeinträchtigung der Protein-Protein-Interaktionen und zu einer veränderten subzellulären Lokalisation ...... 131 5.1. ARHGEF6/αPIX weist eine sehr geringe GEF-Aktivität auf ................................... 131 5.2. Mutationen in ARHGEF6/αPIX führen zu einer Beeinträchtigung von Protein-Protein-Interaktionen ................................................ 133. Mutationen in ARHGEF6/αPIX verändern die subzelluläre Verteilung des Proteins ......................................................................... 134 6. Rho-GTPase-abhängige Signalwege spielen eine wichtige Rolle bei der neuronalenMorphogenese und bei kognitiven Prozessen ……………….. 135 5.3. VI. Literaturverzeichnis .…………………………………………………………….….... 138 Danksagung Lebenslauf. V.

(8) ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS. Abkürzungen °C µ 3-AT A AA Abb. AC AP APP APS ARHGEF AS BA bidest. bp BPB BSA CAT1/2 CC Cdc42 cDNA CH CHO CRIB C-Terminus Cy3 Dbl DH DMEM DMSO DNA DNase dNTP DTE E. coli ECL EDTA et al. EtOH EZM F-Aktin FCS G g, mg, µg, pg G12V G-Aktin GAP GBD GDI GDP, GTP. Grad Celsius mikro 3-Aminotriazol Adenin Acrylamid Abbildung Eintragsnummer in Datenbamk („Accession number“) Alkalische Phosphatase amyloid-β precursor protein Ammoniumperoxodisulfat alpha Rho Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor, („alpha rho guanine nucleotide exchange factor“) Aminosäure(n) Bisacrylamid zweifach destilliert („bidestillata“) Basenpaar(e) Bromphenolblau Rinderserumalbumin („bovine serum albumin“) mit ARHGEF6/αPIX interagierendes Protein („Cool-associated, tyrosine-phosphorylated 1/2“) Proteinmotiv („coiled-coil“) Zellteilungszyklus- („cell division cycle“) Protein 42 komplementäre DNA („copy“-Desoxyribonukleinsäure) Proteinmotiv („calponin homology“) Eierstockzellen vom Chinesischen Hamster, (,,Chinese hamster ovary”) Cdc42/Rac intergierende Binderegion, („Cdc42/Rac interactive binding region“) Carboxyterminus, carboxylendständiger AS-Rest Cyanin3 onkogener Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor („diffuse B-cell lymphoma“) Proteinmotiv („Dbl homology“) Kulturmedium für Zellen (,,Dulbecco’s Modified Eagle Medium”) Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure („deoxyribonucleic acid”) Desoxyribonuklease Desoxynukleosidtriphosphat 1,4-Dithioerythritol Escherichia coli verstärkte Chemilumineszenz („enhanced chemiluminescence“) Ethylendiamintetraessigsäure und andere (et altera) Ethanol extrazelluläre Matrix filamentöses Aktin Fötales Kälberserum („fetal calf serum“) Guanin Gramm, Milligramm, Mikrogramm, Pikogramm Mutation in Rac1 von Gly zu Val globuläres Aktin GTPase-aktivierendes Protein („GTPase activating protein“) Proteinmotiv („GIT1-binding domain“) GTPase-bindendes Protein, („guanine nucleotide dissociation inhibitor“) Guanosin-5’-diphosphat, Guanosin-5’-triphosphat. VI.

(9) ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS GEF GIT1/2 GST GTPase, kleine HEK293-Zellen HPLC HRP ILK IPTG IQ kb kD l, ml, µl LB -LEU LiAc m µm, nm M, mM, µM mA Min. mol, mmol, µmol mRNA MRX NIH3T3-Zellen NK NMR NP40 nt N-Terminus OD OMIM ORF p.a. p21 PAA PAGE PAK PAK[PBD] PBS PCR PDFG PDZ PEG PH Pi PKL PMSF PVDF Rac Ras Rho RNA. Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor („guanine nucleotide exchange factor“) mit ARHGEF6/αPIX interagierendes Protein („G protein-coupled receptor kinase-interactor 1/2“) Glutathion-S-Transferase GDP/GTP-bindendes Protein mit GTPase-Aktivität menschliche embryonale Nierenzellen („human embryonal kidney“) Chromatographieverfahren, („high pressure liquid chromatography“) Meerettich-Peroxidase („horseradish peroxidase“) Integrin-bindende Kinase („integrin-linked kinase“) Isopropyl-β-D-1-thiogalaktopyranosid Intelligenzquotient Kilobase(n) Kilodalton Liter, Milliliter, Mikroliter Luria-Bertani Medium ohne die Aminosäure Leucin Lithium-Acetat Milli Mikrometer, Nanometer molar (mol/l), millimolar, mikromolar Milliampere Minute(n) mol, Millimol, Mikromol Boten-Ribonukleinsäure („messenger RNA“) unspezifische X-chromosomal gekoppelte geistige Behinderung („X-linked mental retardation“) Fibroblasten aus Mäuseembryonen Negativkontrolle Magnet-Resonanz-Verfahren („nuclear magnetic resonance”) nichtionisches Detergenz P40 Nukleotid Aminoterminus optische Dichte Datenbank „Online Mendelian Inheritance in Men” offenes Leseraster (open reading frame) zur Analyse (pro analysii) GTPase-Protein mit ca. 21 kDa Molekulargewicht Polyacrylamid Polyacrylamid-Gelelektrophorese p21 aktivierte Kinase („p21 activated kinase“) Proteindomäne von PAK („p21 activated kinase [p21-rho-binding domain]“) Phosphat-gepufferte Saline Kochsalzlösung („phosphate buffered Polymerase-Kettenreaktion („polymerase chain reaction“) Wachstumsfaktor („platelet derived growth factor“) Proteinmotiv welches u.a. in den Proteinen PDS-95, Dgl und ZO-1 vorhanden ist Polyethylenglycol Proteinmotiv („pleckstrin homology“) Orthophosphat strukturelles Protein („Paxillin-kinase linker“) Phenylmethylsulfonylfluorid (Protease-Inhibitor) Polyvinylidendifluorid (Membran) Protein mit GTPase-Aktivität („similar to ras-related C3 botulinum toxin substrate 1”) GTPase, welche in Ratten Tumore vom Sarcom-Typ induziert („rat sarcoma“) Protein mit GTPase-Aktivität („ras homology“). Ribonukleinsäure („ribonucleic acid”). VII.

(10) ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS RNaseA RT RT-PCR S. cerevisiae SD SDS Sek. SH2 SH3 Sos SRS Std. T Tab. TBS TBST TCA TE TEMED TIAM Trio Tris -TRP Tween 20 U ÜN Upm -URA UV V v/v Vav1,2,3 w/v WT wt/wt g, x g αPIX. RibonukleaseA Raumtemperatur Reverse Transkriptase-Polymerase Ketten Reaktion, („reverse transcriptase-polymerase chain reaction”) Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) Synthetisches „Dropout“ Medium Natriumdodecylphosphat („sodium dodecyl sulfate“) Sekunde(n) Proteinmotiv („Src homology 2“) Proteinmotiv („Src homology 3“) Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor („son of sevenless“) alternatives Hefe-Zwei-Hybrid-System („Sos Recruitment System“) Stunde(n) Thymin Tabelle Tris-gepufferte Kochsalzlösung („Tris-buffered saline“) Tris-gepufferte Kochsalzlösung + Tween 20 („Tris-buffered saline“) Trichloressigsäure Tris-EDTA N´-N´-N´-N´-Tetramethylethylendiamin Protein, welches in T-Zell-Lymphomen stark exprimiert ist, („T-cell lymphoma invasion and metastasis 1“) Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor („triple functional domain”) Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan ohne die Aminosäure Tryptophan Polyoxyethylensorbitan-Monolaurat Enzymeinheiten, Units enzymatische Aktivität („units“) über Nacht Umdrehungen pro Minute Uracil ultraviolett Volt Volumen pro Volumen („volume per volume“) onkogene Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren 1,2,3 („Vav oncogenes“) Gewicht pro Volumen („weight per volume“) Wildtyp Gewicht pro Gewicht („weight per weight“) Graviationskonstante, x g: Vielfaches der Erdbeschleunigung alpha PAK interagierender Austauschfaktor („alpha PAK interacting exchange factor“). Ein- und Drei-Buchstaben-Code der Aminosäuren A C D E F G H I K L. Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu. Alanin Cystein Asparaginsäure Glutaminsäure Phenylalanin Glycin Histidin Isoleucin Lysin Leucin. M N P Q R S T V W Y. Met Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr. Methionin Asparagin Prolin Glutamin Arginin Serin Threonin Valin Tryptophan Tyrosin. VIII.

(11) ZUSAMMENFASSUNG. I.. Zusammenfassung. Kleine monomere GTPasen der Rho-Familie spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen zellulären Prozessen, wie Zellteilung, -polarität, Membrantransport, Transkription und insbesondere bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts. In den letzten Jahren konnte für Rho-GTPasen gezeigt werden, dass sie für die neuronale Morphogenese sehr wichtig sind, indem sie Axonwachstum und -wegfindung, die Ausbildung von dendritischen Dornen sowie die Synapsenentstehung steuern. Für eine kontrollierte Aktivierung der Rho-GTPasen sind Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren, Rho-GEF-Proteine notwendig, welche die RhoGTPasen von der inaktiven, GDP-gebundenen Form in die aktive, GTP-gebundene Form überführen. Bemerkenswerterweise führen Mutationen in drei Genen, deren Genprodukte an unterschiedlichen Stellen in den Rho-GTPase Zyklus involviert sind, zur X-chromosomal erblichen geistigen Behinderung (MRX). Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass Mutationen im ARHGEF6/αPIX-Gen, das für einen Rac1/Cdc42-spezifischen GEF kodiert, ebenfalls zu MRX führen. In dieser Arbeit sollten zum einen neue Erkenntnisse über die biologische Funktion des ARHGEF6/αPIX-Proteins gewonnen werden und zum anderen sollte untersucht werden, welche Auswirkungen Mutationen auf die subzelluläre Verteilung, auf die GEF-Aktivität und auf die Interaktion von ARHGEF6/αPIX mit anderen Proteinen haben. Es konnte gezeigt werden, dass die subzelluläre Lokalisation der beiden mutierten ARHGEF6/αPIX-Proteine, ARHGEF6/αPIX-∆AS56-83 und ARHGEF6/αPIX-∆AS396-776, verändert ist und diese nicht mehr in Lamellipodien und Filopodien an der Zellmembran lokalisiert sind. Mit Hilfe der durchgeführten Rac-Pull-Down-Experimente konnte weder für das ARHGEF6/αPIXWildtyp-Protein noch für die beiden mutierten Proteine eine GEF-Aktivität nachgewiesen werden. Die Funktionalität dieses Testsystems wurde mit dem GEF-Protein Tiam-1 überprüft. Erst nach Koexpression von ARHGEF6/αPIX und der p21-aktivierten Kinase PAK1 bzw. PAK3 konnte eine schwache GEF-Aktivität für ARHGEF6/αPIX nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass die GEF-Aktivität dieses Proteins im Vergleich zu anderen GEFs sehr gering ist. Um neue Einsichten in die biologische Funktion von ARHGEF6/αPIX zu bekommen, wurde mit Hilfe des CytoTrap Hefe-Zwei-Hybrid-Systems („Sos recruitment system“) nach neuen Protein-Protein-Interaktionspartnern für ARHGEF6/αPIX gesucht. Es wurden insgesamt acht putative, mit ARHGEF6/αPIX-assoziierte Proteine gefunden: PARVB (β-Parvin oder 1.

(12) ZUSAMMENFASSUNG Affixin), CAPNS1 (kleine Untereinheit der Protease Calpain), APBB1 („amyloid beta precursor protein-binding, family B, member 1”)/Fe65, ARHGEF7/βPIX, RAP1B, PFDN5 (Prefoldin 5), DNLC2A („dynein light chain 2A“) und PNMA1 („paraneoplastic antigen MA1“). Während für die ersten fünf Proteine bereits eine funktionelle Verbindung zum Aktin-Zytoskelett gefunden wurde, ist für die letzten drei Interaktionspartner noch keine bekannt. Eine Interaktion mit ARHGEF6/αPIX wurde für die Proteine PARVB, CAPNS1, ARHGEF7/βPIX und RAP1B durch biochemische Experimente bestätigt. Für die beiden Proteine PARVB und Calpain wurde bereits gezeigt, dass sie während der frühen Phase der Integrin-abhängigen Zelladhäsion und -ausbreitung die Aktivität von RhoGTPasen regulieren können. Dies führt zur Bildung von fokalen Adhäsionen und zur Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts. Aufgrund dieser Daten wurde die These aufgestellt, dass ARHGEF6/αPIX ein weiteres Molekül innerhalb dieser Signalkette sein könnte. Zunächst wurde gezeigt, dass ARHGEF6/αPIX in vollständig ausgebreiteten Zellen zusammen mit PARVB bzw. der kleinen Untereinheit von Calpain in fokalen Adhäsionen zu finden ist. Nach der Etablierung eines Zellsystems, in dem die durch Fibronektin-induzierte, Integrin-abhängige Zellausbreitung untersucht werden konnte, konnte darüberhinaus gezeigt werden, dass diese Proteine auch in sehr früh sich bildenden Kontaktstellen zwischen dem Zytoskelett und der extrazellulären Matrix, in sogenannten fokalen Adhäsionen oder genauer in Integrin-haltigen Clustern, zu finden sind. Neben ARHGEF6/αPIX, PARVB und den beiden Calpain-Proteasen m-Calpain und µ-Calpain wurde auch das ILK- („integrin-linked kinase“) Protein und β1-Integrin in diesen Clustern gefunden, wohingegen Paxillin und Vinculin nicht detektiert werden konnten. Eine Inhibierung der Protease m-Calpain führte zu einer deutlichen Hemmung der Zellausbreitung. von. CHO-K1-Zellen.. Durch. die. Überexpression. des. normalen. ARHGEF6/αPIX- und einer dominant-negativen Proteinvariante wurde dieser Effekt zum größten Teil aufgehoben. Im Gegensatz dazu ist die ARHGEF6/αPIX-∆DH-Variante nicht mehr in der Lage, die Zellausbreitung unter diesen Bedingungen zu stimulieren. Aufgrund der in dieser Arbeit erzielten Daten wurde ein neues Modell entwickelt, nach dem es zu einer Integrin-induzierten Zellausbreitung kommt, die von m-Calpain abhängig ist. Stromabwärts von Calpain vermittelt ARHGEF6/αPIX durch zwei parallele Signalwege, einen GEFabhängigen und einen GEF-unabhängigen Weg, die Rho-GTPase induzierte Ausbreitung der Zellen. An dieser Stelle kann nur spekuliert werden, dass diese Signaltransduktionskette unter Umständen auch in das Neuritenwachstum und/oder die Ausbildung dendritischer Dornen in neuronalen Zellen involviert ist. 2.

(13) EINLEITUNG. II. Einleitung 1.. Das Zytoskelett. Eukaryotische Zellen besitzen die Fähigkeit, verschiedene Formen anzunehmen und koordinierte Bewegungen auszuführen. Diese Fähigkeiten werden durch ein komplexes Netzwerk unterschiedlicher Proteinfilamente, dem Zytoskelett, welches sich durch das gesamte Zytoplasma erstreckt, vermittelt. Das Zytoskelett ist eine höchst dynamische Struktur, welche sich im ständigen Umbau befindet. Es ist maßgeblich an so komplexen und unterschiedlichen Vorgängen, wie Gestaltgebung, Zellmigration, Zellteilung, Zelldifferenzierung, Kontaktaufnahme zu Nachbarzellen und zum Substrat, Transportvorgängen im Zytoplasma und Muskelkontraktion beteiligt. Darüberhinaus stellt es die Grundlage für intrazelluläre Bewegungen bereit. Die Aufgaben des Zytoskeletts hängen von drei Typen von Proteinfilamenten ab, den Aktin-Filamenten, den Mikrotubuli und den Intermediärfilamenten. Diese Filamente setzen sich aus verschiedenen Protein-Monomeren zusammen. Mikrotubuli werden aus Tubulin aufgebaut und steuern hauptsächlich die Lage der Zellorganellen. Intermediärfilamente bestehen aus Untereinheiten einer Familie fibröser Proteine, wie zum Beispiel Vimentin, Lamin oder Keratin, und verleihen einer Zelle mechanische Festigkeit. Aktin-Filamente schließlich werden aus dem Grundbaustein Aktin gebildet. Aktin-Filamente, auch Mikrofilamente genannt, sind speziell für die Veränderung der Form und für Bewegungen der Zelle verantwortlich. Diese Poteinfilamente interagieren mit einer Vielzahl akzessorischer Proteine, die einen strukturellen oder regulierenden Einfluss auf die Filamente und ihre dreidimensionale Organisation ausüben. Einige dieser Proteine koppeln die Filamente untereinander oder mit anderen Zellbestandteilen, wie der Plasmamembran. Andere regulieren den Aufbau und die Aufbaugeschwindigkeit der Filamente oder bestimmen, wann und wo diese polymerisiert werden. Darüberhinaus sind sehr viele Bewegungsproteine an die Filamente gekoppelt, welche sich an diesen entlang bewegen können. Durch diese akzessorischen Proteine erhalten besonders die Mikrotubuli und das Aktin-Filamentsystem eine große Variabilität und Flexibilität, wodurch es ihnen ermöglicht wird, die zahlreichen Funktionen des Zytoskeletts koordiniert zu erfüllen. Aktin-Filamente (F-Aktin) sind dünne, fädige und sehr biegsame Polymere, welche aus globulären Untereinheiten, dem G-Aktin, aufgebaut sind. Aktin hat unter physiologischen Bedingungen eine starke Tendenz zu polymerisieren. In vivo liegt jedoch nur die Hälfte des Aktins polymerisiert vor. Dies beruht einerseits auf verschiedenen Aktin-bindenden Proteinen, welche die Aktin-Filamente bündeln, ihre Länge begrenzen oder ihren Zerfall einleiten können, andererseits auf der raschen Polymerisation und Depolymerisation des 3.

(14) EINLEITUNG Aktins (Hall, 1994). Jedes Filament hat eine helikale Struktur und besitzt eine strukturelle Polarität mit einem schnell wachsenden Plus-Ende und einem langsam wachsenden MinusEnde. Einzelne Aktin-Filamente findet man in der Zelle kaum, sondern meist bilden sie quervernetzte Ansammlungen und Bündel, welche viel kräftiger als ein einzelnes Filament sind. Obwohl Aktin im gesamten Bereich des Zytoplasmas einer eukaryotischen Zelle zu finden ist, liegt es bei vielen Zellen entlang der Plasmamembran als sogenannter Zell-Cortex vor. Dieser stellt ein Netzwerk aus Aktin-Filamenten dar, das die äußere Hülle der Zelle von innen mechanisch unterstützt. Die Quervernetzung wird hierbei durch unterschiedliche Aktinbindende Proteine vermittelt. Dynamische Fortsätze aus Aktin-Filamenten an der Oberfläche einer Zelle sind allgemeine Kennzeichen von Tierzellen. Viele davon sind in der Lage, selbständig über eine Unterlage zu wandern, wenn man sie in eine Gewebekultur bringt. Bei den Bewegungen werden aus dem Leitsaum dünne, flächige Fortsätze, die Lamellipodien, ausgestreckt und wieder zurückgezogen, welche ein dichtes, geordnetes Geflecht von AktinFilamenten enthalten. Manche Zellen bilden auch dünne, fingerartige Auswüchse, welche ca. 20 parallele, gleich orientierte Aktin-Filamente enthalten (Welch et al., 1997). Diese Fortsätze werden Filopodien genannt und können im Fall von Nervenzellen bis zu 50 µm lang werden. Von den Kanten der Lamellipodien ragen oft noch Filopodien heraus. Bei beiden Strukturen liegen die Plus-Enden des Mikrofilamentsystems unterhalb der Plasmamembran, sodass es dann aufgrund einer hohen Rate an Neupolymerisation lokal zur Ausstülpung der Plasmamembran in Form von Lamellipodien bzw. Filopodien kommt. Diese Ausstülpungen stellen anschließend neue Zell-Matrix-Kontakte her. Lamellipodien und Filopodien, die keinen Kontakt zum Substrat ausbilden, klappen als Membranauffaltungen über die Oberseite der Zelle, ähnlich einer Welle, rückwärts zur Zellmitte hinweg. An den Kontaktstellen zwischen Zellen und Substrat kommt es zur Ausbildung von fokalen Adhäsionen (Rottner et al., 1999). In diesen sind die Aktin-Filamente im Inneren der Zelle mit der extrazellulären Matrix durch Transmembran-Verbindungsproteine verbunden. Diese Verbindungsproteine, bekannt als Integrine, fungieren als eine Art Rezeptor und vermitteln hierbei den Kontakt zum Substrat, indem sie sowohl mit Proteinen der extrazellulären Matrix als auch mit zytoplasmatischen Molekülen interagieren. Es werden drei Phasen für die Entstehung und Reifung von fokalen Adhäsionen als Orte der Zell-Matrix-Interaktion unterschieden. Zuerst kommt es durch ein extrazelluläres Signal zur Aggregation von Integrinen, welche den eigentlichen Kontakt einer Zelle mit ihrer Umgebung herstellen. Eine sehr frühe Form der fokalen Adhäsionen sind Integrin-haltige Cluster. Durch Anlagerung spezifischer Proteine an der zytoplasmatischen Seite der Integrine, welche wiederum als Plattform für weitere Signalmoleküle oder Strukturproteine dienen, entstehen in weiterer Folge sogenannte fokale Komplexe. Dies sind Stellen, welche sich im speziellen an den Rändern von Lamellipodien bilden. Aus den fokalen Komplexen entstehen schließlich 4.

(15) EINLEITUNG durch weiteren An- und Umbau fokale Kontakte, welche die reife Form der Zell-MatrixAdhäsionen darstellen. Gebündelte Aktin-Filamente, die sogenannten Stressfasern, die sich durch den gesamten Zellkörper erstrecken, enden an diesen Kontaktstellen und erzeugen so innerhalb der Zelle Spannung. Charakteristisch für Stressfasern ist, dass sie kontraktile Eigenschaften besitzen. Durch Interaktion ihrer Aktinbündel mit Myosinfilamentbündeln und ATP können sie sich verkürzen. Durch die Ausbildung neuer Zell-Matrix-Kontakte werden ungeordnete Aktin-Filamente zu so hoch organisierte Strukturen wie den Lamellipodien, Filopodien und Stressfasern, in der Zelle neu geordnet. Abbildung 1 soll einen Eindruck von den auf Aktin-basierenden Strukturen in einer Fibroblastenzelle vermitteln. Filopodien Stressfasern. fokale Kontakte. Lamellipodien [verändert nach Luo, Nat Rev Neurosci 1:173-180 (2000)]. Abb. 1: Verschiedene Organisationsformen von Aktin-Filamenten in einer Fibroblastenzelle Rechts ist die elektronenmikroskopische Aufnahme eines Fibroblasten in Zellkultur gezeigt. Auf der linken Seite ist diese Zelle schematisch dargestellt. Auf Aktin-basierende Strukturen sind in roter Farbe angezeigt. Lamellipodien, blattartige Membranstrukturen, beinhalten ein dichtes Netzwerk an Aktin-Filamenten. Die fingerförmigen Ausstülpungen stellen Filopodien dar, welche durch parallel angeordnete Aktin-Filamente charakterisiert sind. Stressfasern sind kontraktile, auffallende Strukturen des Aktin-Zytoskeletts, die den gesamten Zellkörper durchziehen. Bereiche, welche den Kontakt mit der extrazellulären Matrix vermitteln, werden fokale Kontakte genannt.. 2.. Zellanhaftung, Zellausbreitung und Zellmigration. Zellanhaftung, Zellausbreitung und Zellmigration sind komplexe Ereignisse, welche durch Interaktionen zwischen verschiedenen Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche und Proteinen der zugrunde liegenden extrazellulären Matrix ausgelöst werden. Diese ZellMatrix-Interaktionen regulieren das Aktin-Zytoskelett während der Zellanheftung und der -ausbreitung über unterschiedliche Prozesse, von der Ausbildung von Filopodien und Lamellipodien in der frühen Phase der Zellausbreitung bis zur Organisation von fokalen Kontakten in vollständig ausgebreiteten Zellen. 5.

(16) EINLEITUNG Die meisten Zelltypen reagieren auf den Kontakt mit extrazellulären Matrix-Proteinen mit Anhaftung (Adhäsion) an das Substrat und nachfolgender Ausbreitung. Zellausbreitung ist ein komplizierter Vorgang, welcher die kontinuierliche Neubildung und Remodellierung von fokalen Adhäsionsstellen erfordert, damit Zellen nach Anhaftung an ein Substrat Ausstülpungen bilden können, mit Hilfe derer sie sich ausbreiten. Dieser Prozess ist abhängig von Integrinen und erfordert dynamische Veränderungen des Aktin-Zytoskeletts. Er ist vergleichbar mit der Vorwärtsbewegung einer Zelle während der Zellmigration, nur dass sich im Fall der Zellausbreitung die Zelle in mehrere Richtungen gleichzeitig bewegt. Die Migration kann grob in drei verschiedene Phasen eingeteilt werden. Zuerst kommt es zu Ausstülpungen der Plasmamembran am Vorderpol der Zelle, im Bereich der sogenannten Führungslamelle.. An. diesen Ausstülpungen entstehen. neue. Zell-Matrix-Kontakte.. Schließlich zieht die Zelle den restlichen Zellkörper in Bewegungsrichtung nach, indem sie im hinteren Zellbereich Zell-Matrix-Kontakte löst und sich an den im Vorderpol neugebildeten Kontakten nach vorne zieht. Alle drei geschilderten Teilprozesse sind vom Aktin-Filamentsystem abhängig. In Abbildung 2 ist dieser Vorgang schematisch dargestellt.. Adhäsion. Ausbreitung Filopodien ZK. ZK ZK. fokale Adhäsionen. AktinFilamente. Stressfasern. Membran- Lamellipodien auffaltungen. Abb. 2: Schematische Darstellung der Zelladhäsion und Aktin-abhängigen Zellausbreitung Kommt eine Zelle mit Proteinen der extrazellulären Matrix in Kontakt, so aggregieren an diesen Kontaktstellen Integrine. Dies führt zur Entstehung von fokalen Adhäsionen, an welchen das Aktin-Zytoskelett in Form von Stressfasern verankert wird. Dadurch ist die Zelle in der Lage, Ausstülpungen, wie Lamellipodien und Filopodien, auszubilden und sich auszubreiten. Membranauffaltungen entstehen bei der Rückfaltung von Lamellipodien. Auf Aktin-basierende Strukturen sind in roter Farbe angezeigt. ZK=Zellkern.. Die Vorgänge während der Zellausbreitung und -migration sind durch Aus- und Rückbildung von Aktin-Filament-haltigen Plasmabereichen gekennzeichnet und in hohem Maß von Integrinen abhängig.. 6.

(17) EINLEITUNG 3.. Integrine sind Verbindungsproteine zwischen der extrazellulären Matrix und dem Aktin-Zytoskelett. Integrine sind Transmembranproteine, welche den Kontakt zwischen der extrazellulären Matrix und dem Aktin-Zytoskelett herstellen (Hynes, 1992; Burridge und ChrzanowskaWodnicka, 1996; Craig und Johnson, 1996). Eine Liganden-Bindung an die extrazelluläre Domäne von Integrinen führt zur Integrin-Aggregation (Hynes, 2002). Als ein extrazellulärer Ligand für Integrine spielt das Fibronektin eine besonders wichtige Rolle während der Zelladhäsion, -ausbreitung und -migration, indem es vorwiegend mit α5β1-Integrin interagiert. Fibronektin ist ein aus multiplen Domänen bestehendes Glycoprotein, welches physiologisch an Zelloberflächen, in Bindegeweben und im Plasma zu finden ist. Es dient als generelles Zelladhäsionsmolekül, welches Zellen an Kollagen- oder Proteoglykansubstraten verankert. Desweiteren organisiert es Zell-Matrix-Interaktionen, indem es mit verschiedenen Komponenten der extrazellulären Matrix und mit Membran-gebundenen Fibronektinrezeptoren von Zellen interagiert. Eine Interaktion zwischen Fibronektin und Integrinen führt zu Veränderungen in der zytoplasmatischen Domäne der Integrin-Proteine. Dies führt zum Abbruch bestehender Protein-Protein-Interaktionen und ermöglicht die Ausbildung neuer Interaktionen mit Proteinen des Zytoskeletts und Molekülen, welche Zelladhäsion, -ausbreitung oder -migration regulieren. Gleichzeitig können auch innerhalb der Zelle entstandene Signale zu Veränderungen in der Affinität der Integrine zum jeweiligen Liganden führen (Chen et al., 1994). An der zytoplasmatischen Seite der Integrine dienen Adapter-Proteine, wie z.B. Paxillin, Vinculin, Talin oder auch ILK („integrin-linkedkinase”) als Plattform für weitere Signalmoleküle oder Strukturproteine (Zamir und Geiger, 2001a; b; Brakebusch und Fässler, 2003). ILK ist ein Integrin-bindendes Protein mit KinaseAktivität und ist für viele Integrin-abhängige Signalkaskaden essentiell. Es entstehen nacheinander die oben schon erwähnten Integrin-haltigen Cluster, die fokalen Komplexe und durch weitere Umstrukturierungen die fokalen Kontakte, welche nicht nur als Verankerungspunkte dienen, sondern auch Signale von der extrazellulären Matrix an das Zytoskelett weiterleiten. Diese Prozesse sind durch bedeutende Restrukturierungen des AktinZytoskeletts gekennzeichnet. Um eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts zu induzieren, werden bestimmte Proteine, insbesondere die Rho-GTPasen, benötigt. Integrine und kleine Rho-GTPasen koordinieren gemeinsam die Ereignisse während der Zelladhäsion und -ausbreitung, und sind daher zusammen an komplexen Signalkaskaden beteiligt (Hotchin und Hall, 1995; Burridge und Chrzanowska-Wodnicka, 1996; Schwartz und Shattil, 2000). 7.

(18) EINLEITUNG 4.. Die Rho-GTPasen. 4.1. Die Rho-GTPasen bilden eine eigene Subfamilie. Rho-GTPasen („Ras homology“) bilden eine Untergruppe der Ras-GTPasen. Bei den RasGTPasen handelt es sich um 20-25 kDa GDP/GTP-bindende Proteine, welche als Signalmoleküle an der Steuerung von Zellwachstum, -proliferation und -differenzierung beteiligt sind (Bourne et al. 1990a; Bourne et al. 1991; Bokoch und Der, 1993). Für die Organisation des Aktin-Zytoskeletts werden die Rho-GTPasen benötigt. Rho-GTPasen wurden erstmals 1985 von Madaule und Axel beschrieben. Es wurden in rascher Folge zu RhoA, B und C homologe GTPasen entdeckt, sodass der Begriff „Rho“ mittlerweile zur Kennzeichnung der ganzen Subfamilie benutzt wird. Die Familie der Rho-GTPasen umfasst bis heute 14 Mitglieder (Aspenström, 1999). Von diesen sind RhoA, Rac1 und Cdc42 am besten untersucht und charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wird von „Rac“ gesprochen, wenn es nicht klar dokumentiert wurde, um welche Isoform (Rac1, Rac2 oder Rac3) es sich handelt. Rho-GTPasen haben sich als die wichtigsten Regulatoren des Aktin-Zytoskeletts in allen eukaryotischen Zellen herausgestellt (Nobes und Hall, 1995a; b; Ridley, 1996; Machesky und Hall, 1997; Hall, 1998). Rho stimuliert in Fibroblasten die Ausbildung von Stressfasern und die Bildung von fokalen Adhäsionen (Ridley und Hall, 1992). Die Ausbildung von Lamellipodien und Membranauffaltungen an der Zellmembran wird durch die kleine Rho-GTPase Rac1 induziert. Darüberhinaus stimuliert Rac1 die Entstehung fokaler Komplexe (Ridley et al., 1992; Nobes und Hall, 1995a). Aktives Cdc42 kann ebenfalls die Ausbildung fokaler Komplexe induzieren, führt aber in erster Linie durch AktinPolymerisation zur Bildung von Filopodien (Kozma et al., 1995; Nobes und Hall, 1995a; b). Zwischen den einzelnen Rho-GTPasen bestehen enge Verknüpfungen hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf das Zytoskelett, denn eine Aktivierung von Cdc42 führt zur lokalen Aktivierung von Rac1, und somit ist die Bildung von Filopodien eng mit der von Lamellipodien verbunden. Aktives Rac1 kann in ruhenden Fibroblasten wiederum Rho aktivieren und damit die Bildung von Stressfasern induzieren (van Aelst und D’Souza-Schorey, 1997; Mackay und Hall, 1998).. 8.

(19) EINLEITUNG 4.2. Der Rho-GTPase-Zyklus. Rho-GTPasen können als molekulare Schalter angesehen werden, welche von einer „abgeschalteten“, inaktiven, GDP-gebundenen in eine „angeschaltete“, aktive, GTPgebundene Form ineinander überführt werden können. Allen ist eine Mg2+-abhängige Nukleotidbindung und die Hydrolyse von GTP zu GDP und Orthophosphat gemeinsam (Valencia et al., 1991). Durch den Austausch von GDP zu GTP wird die Affinität der GTPasen zu ihren jeweiligen Zielproteinen stark erhöht, wodurch es zu einer Fortsetzung der Signaltransduktionskaskade kommt. Dieser Austausch wird durch Guanin-NukleotidAustauschfaktoren (GEFs; „guanine nucleotide exchange factors”) stimuliert, die die Affinität der GTPase zu GDP stark vermindern und somit dessen Dissoziation fördern. Da in der Zelle unter physiologischen Bedingungen GTP viel höher konzentriert ist als GDP, bindet GTP präferentiell an die unbeladene GTPase. Dies führt zu einer Konformationsänderung und somit zur Aktivierung der GTPase. Die Inaktivierung der GTPase erfolgt durch Hydrolyse von GTP zu GDP. Durch GTPase-aktivierende-Proteine (GAPs; „GTPase activating proteins“) kann die Geschwindigkeit der Hydrolyse um ein Vielfaches erhöht werden. Die GTP-Hydrolyse stellt einen irreversiblen Schritt dar, wodurch gewährleistet wird, dass der Zyklus nur in einer Richtung abläuft. Guanin-Nukleotid-Dissoziationsinhibitoren (GDIs; „guanine nucleotide dissociation inhibitor) beeinflussen das Gleichgewicht zwischen den beiden Aktivitätszuständen, indem sie die Dissoziation des gebundenen GDPs stark vermindern und dadurch den inaktiven Konformationszustand begünstigen (Boguski und McCormick, 1993). In der Abbildung 3 ist der GTPase-Zyklus für Rho-GTPasen dargestellt.. GEF GDP. GTP. GDI. Rho GDP. Rho GTP. Pi. Effektor. GAP. Abb. 3: Schematische Darstellung des Rho-GTPase-Zyklus Durch einen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) wird der Austausch von GDP nach GTP an der RhoGTPase stimuliert. Die GTPase wird somit aktiviert, kann mit einem Effektor-Protein interagieren und ein intrazelluläres Signal weiterleiten. Durch die Hydrolyse von GTP zu GDP wird die Rho-GTPase in die inaktive Form überführt. Dieser Vorgang wird durch das GTPase-aktivierende Protein (GAP) beschleunigt. Der inaktive Zustand wird durch GDP-Dissoziationsinhibitoren (GDI) stabilisiert. GDP: Guanosin-5’-diphosphat; GTP: Guanosin-5’-triphosphat; Pi: Orthophosphat.. 9.

(20) EINLEITUNG 4.3. p21-aktivierte-Kinasen sind wichtige Effektorproteine der GTPasen Rac1 und Cdc42. Zu den am besten charakterisierten Zielproteinen von Cdc42 und Rac1 zählen die p21aktivierten-Kinasen 1-3 (PAK1-3; „p21 activated kinase“). Diese Serin/Threonin-Kinasen werden durch die Aufhebung einer autoinhibitorischen Konformation nach einer Interaktion mit Cdc42 oder Rac1 aktiviert (Manser et al., 1994; Bagrodia et al, 1995; Manser et al., 1995). In Abwesenheit einer GTPase wird die Kinaseaktivität von PAK durch eine intramolekulare Interaktion zwischen der regulatorischen, N-terminalen und der katalytischen, C-terminalen Domäne unterdrückt (Zhao et al., 1998; Frost et al., 1998; Tu und Wigler, 1999). Zwei wichtige zelluläre Prozesse werden durch diese Proteine gesteuert, einerseits die Genexpression und andererseits die Reorganisation des Zytoskeletts (Bagrodia und Cerione, 1999; Daniels und Bokoch, 1999). Die PAK-Kinase-Aktivität ist essentiell für einen Rhoabhängigen Abbau von fokalen Adhäsionen sowie für die Aktin-Polymerisierung in Fibroblasten (Manser et al., 1994; Lim et al., 1996; Sells et al., 1997; Daniels et al., 1998). PAK-Proteine enthalten ein hochkonserviertes Aminosäuremotiv, die p21-bindende Domäne (PBD, „p21-rho-binding domain“), auch Cdc42/Rac-interaktive Binderegion (CRIB, „Cdc42/Rac-interactive binding region“) genannt, sowie mehrere prolinreiche Sequenzen und eine Region mit überwiegend sauren Aminosäureresten. Bei den prolinreichen Abschnitten handelt es sich um PxxP-Motive, welche für die Interaktion von Proteinen mit einer Srchomologen 3-Domäne (SH3; „src homology 3“) benötigt werden (Knaus und Bokoch, 1998). Die Interaktion zwischen PAK und Cdc42 oder Rac1 erfolgt über die PBD-Domäne (Burbelo et al., 1995; Symons et al., 1996) und führt zur Aktivierung von PAK. Die genaue Funktion, welche PAK-Proteine bei der Reorganisation des Zytoskeletts übernehmen, ist noch nicht gut verstanden und scheint zelltypspezifisch zu sein. Einerseits scheint eine Interaktion zwischen PAK und Rac1 bzw. Cdc42 und damit die PAK-Aktivität für die Bildung von Lamellipodien bzw. Filopodien nicht notwendig zu sein (Lamarche et al., 1996; Joneson et al., 1996; Westwick et al., 1997), andererseits induziert konstitutiv-aktives PAK1 die Entstehung von Membranauffaltungen und fokalen Adhäsionen trotz eines Defekts in der PBD-Domäne (Sells et al., 1997).. 10.

(21) EINLEITUNG 5.. Integrine und Rho-GTPasen sind für die Zellausbreitung wichtig. Rho-GTPasen können durch extrazelluläre Wachstums- oder Serumfaktoren aktiviert werden und in Folge zelluläre Signaltransduktionskaskaden stimulieren. In erster Linie wird über diese Signalketten das Aktin-Zytoskeletts organisiert, aber auch die Expression verschiedener Gene, das Zellwachstum und die embryonale bzw. fötale Morphogenese werden reguliert (Van Aelst und D’Souza-Schorey, 1997; Mackay und Hall, 1998). In der Abbildung 4 sind zwei Signalwege schematisch dargestellt: Wenn Wachstums- oder Serumfaktoren an Zelloberflächenrezeptoren binden, kommt es an den intrazellulären Domänen der Rezeptoren durch verschiedene Mechanismen, wie z.B. Membranrekrutierung, Phosphorylierung, zur Aktivierung von Rho-GTPasen. Rac1 kann durch PDGF („plateletderived growth factor“) oder Insulin aktiviert werden, was zur Aktinpolymerisation und Ausbildung von Lamellipodien und Membranauffaltungen an der Zellperipherie führt. Durch das Plasmaprotein Bradykinin wird Cdc42 aktiviert, was wiederum die Bildung von Filopodien stimuliert. Lamellipodien und Filopodien sind hauptsächlich bei mobilen und in neuronalen Zellen zu finden und spielen bei der Zellausbreitung eine wichtige Rolle. Lamellipodien enthalten kleine Integrin-haltige Aggregate, Kontaktstellen mit der extrazellulären Matrix. Die GTPase RhoA kann schließlich durch den Wachstumsfaktor Lyophosphatsäure (LPA) aktiviert werden, und aktives RhoA induziert die Bildung von fokalen Adhäsionen und Stressfasern. Wachstum sfaktoren. Abb.. 4:. Schematische. Darstellung. von. Wachstumsfaktor-induzierten Rho-GTPaseP. P. α β Gα γ. GTP. Rho GDP. Rho GTP. abhängigen Signal-transduktionsketten Bei. Bindung. von. Wachstumsfaktoren. an. Zelloberflächenrezeptoren, wie Tyrosinkinaserezeptoren oder heterotrimeren GProtein-gekoppelten Rezeptoren, kommt es zur Aktivierung von Rho-GTPasen. Aktive RhoGTPasen induzieren die Bildung von Lamellipodien, Filopodien, Stressfasern und fokalen Adhäsionen und steuern somit die. GDP. Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts. GDP: Guanosin-5’-diphosphat; GTP: Guanosin5’-triphosphat;. Bildung von Lamellipodien, Filopodien und fokalen Adhäsionen; Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts. P:. Phosphatrest;. Gα,β,γ:. Untereinheiten eines heterotrimeren G-Proteins.. 11.

(22) EINLEITUNG Neuere Daten deuten darauf hin, dass Integrine ebenfalls die Aktivität von Rho-GTPasen regulieren können (Clark et al., 1998; Price et al., 1998; Ren et al., 1999; del Pozzo et al., 2000). Die Kooperation zwischen Integrinen und monomeren GTPasen der Rho-Familie ist besonders während der Zelladhäsion und Zellausbreitung wichtig (Schwartz und Shattil, 2000). Die Zellausbreitung ist durch den ständigen Aufbau von neuen fokalen Adhäsionen und Abbau von nicht mehr benötigten gekennzeichnet. Auch werden immer wieder neue Lamellipodien und Filopodien geformt und wieder zurückgebildet (Burridge und Chrzanowska-Wodnicka, 1996). Bei der Entstehung von fokalen Adhäsionen werden drei Phasen unterschieden (Abb. 5).. e -haltig n i r g e t In. Fi bro. ne kti. I nte g. Fokale Komplexe. r C luste. F o ka l e K on. takte. n. ri n e. GTP 1 Rac GDP. Rac1 GTP. inculin n V Paxilli. 1 Rac T G P. GDP. RhoA GTP. GTP RhoA GDP. RhoA GTP. GDP. Abb. 5: Schematische Darstellung der Ereignisse während der Entstehung von Zell-Matrix-Kontakten Nach Anheftung an extrazelluläre Matrix-Proteine (Fibronektin) koaggregieren Integrine und bilden zusammen mit anderen Proteinen (Vinculin, Paxillin) Integrin-haltige Cluster. Es kommt zur Rekrutierung und Aktivierung von Rac1, welches die Bildung von fokalen Komplexen induziert. Schließlich entstehen durch Rekrutierung und Aktivierung von RhoA die fokalen Kotakte, welche die extrazelluläre Matrix mit dem Aktin-Zytoskelett verbinden und als Verankerungspunkte der Zelle dienen. GDP: Guanosin-5’-diphosphat; GTP: Guanosin-5’triphosphat.. Durch den Kontakt einer Zelle mit Proteinen der extrazellulären Matrix, wie z.B. Fibronektin, kommt es zur Bildung von Integrin-haltigen Clustern an den Kontaktstellen. In diesen Clustern sind neben Integrinen noch weitere Proteine, wie z.B. Vinculin und Paxillin, enthalten. In der Folge kommt es zur Rekrutierung und Aktivierung von Rac1, und es werden fokale Komplexe gebildet. Der Mechanismus, wie Rac1 rekrutiert und aktiviert wird, ist noch nicht bekannt. Fokale Komplexe befinden sich meistens am Saum von Lamellipodien und 12.

(23) EINLEITUNG dienen der Zellausbreitung oder -migration. Die GTPase RhoA wird zu den fokalen Komplexen relokalisiert und aktiviert, und aus den fokalen Komplexen entstehen durch Änderung der Proteinzusammensetzung und durch die Reorganisation Aktin-abhängiger Strukturen fokale Kontakte. Diese stellen dann die reife Form der Zell-Matrix-Adhäsionen dar, sind mit Stressfasern verknüpft und dienen als Verankerungspunkte der Zelle. Integrinhaltige. Cluster,. fokale. Komplexe. und. fokale. Kontakte. können. aufgrund. ihrer. unterschiedlichen Proteinzusammensetzung voneinander unterschieden werden.. 6.. Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) für Rho-GTPasen. 6.1 Die Domänen-Struktur der GEFs. Der erste Säuger-GEF wurde 1985 als Onkogen in der DNA eines B-Zell-Lymphoms entdeckt und Dbl genannt („diffuse B-cell lymphoma“; Eva und Aaronson, 1985). Aminosäuresequenzvergleiche zeigten, dass eine 180 Aminosäuren große Region des Proteins signifikante Homologie zum Hefeprotein CDC24 aufweist. Dieses Protein war bereits als Aktivator der GTPase CDC42 bekannt (Bender und Pringle, 1989). Kurz darauf wurde beschrieben, dass Dbl in vitro den Nukleotid-Austausch an der humanen GTPase Cdc42 katalysiert (Hart et al., 1991), und für diese Aktivität eine konservierte Domäne, die DHDomäne („Dbl homology-domain“) nötig ist (Hart et al., 1994). Mit Hilfe der vorliegenden humanen Genomsequenz werden etwa 60 GEF-Proteine vorhergesagt, von denen die Hälfte bisher auf ihre Guanin-Nukleotid-Austauschaktivität untersucht wurde (Schmidt und Hall, 2002). Interessanterweise zeigen GEFs, welche die gleiche GTPase als Substrat besitzen, oft nur weniger als 20 % Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz. Kristallographische und NMR- („nuclear magnetic resonance”) Analysen zeigten jedoch eine sehr ähnliche dreidimensionale Struktur für die verwandten GEFs ARHGEF7/βPIX, Sos1, Trio und Tiam-1 (Aghazadeh et al., 1998; Liu et al., 1998; Soisson et al., 1998; Worthylake et al., 2000). Beinahe alle Rho-GEFs besitzen neben der DH-Domäne auch noch eine PH-Domäne („pleckstrin homology domain”), und in den meisten Fällen ist die tandemförmige Anordnung der DH- und PH-Domänen das Minimalmodul, welche für die Austauschaktivität verantwortlich ist. PH-Domänen binden an Phosphoinositide und andere Proteine (Rebecchi und Scarlata, 1998; Lemmon und Ferguson, 2000). In Verbindung mit einer DH-Domäne vermittelt die PH-Domäne die volle katalytische Aktivität des GEFs (Liu et al., 1998). Desweiteren wirkt die PH-Domäne als intrazelluläres Lokalisationssignal (Stam 13.

(24) EINLEITUNG und. Collard,. 1999).. Darüberhinaus. besitzen. die. meisten. GEFs. Protein-Protein-. Interaktionsdomänen (SH2, SH3, GBD, PDZ, „coiled coil“) oder noch weitere Module mit katalytischer Aktivität. Es ist anzunehmen, dass die GEFs durch die Protein-ProteinInteraktionsdomänen an vorgeschaltete Signalmoleküle und/oder Rezeptoren, aber auch an Effektorproteine gekoppelt werden. 6.2. Die Regulation von GEFs. Aufgrund ihrer prominenten Stellung innerhalb des GTPase-Zyklus müssen GuaninNukleotid-Austauschfaktoren streng reguliert werden, wofür es bisher drei beschriebene Mechanismen gibt: Entfernung einer intramolekularen inhibitorischen Aminosäure-Sequenz, Stimulation oder Unterdrückung der GEF-Aktivität durch Protein-Protein-Wechselwirkungen und Veränderung der subzellulären Lokalisation. Viele GEFs enthalten eine intramolekulare inhibitorische Aminosäure-Sequenz, deren Konfigurationsänderung oder Abspaltung zur Aktivierung des Proteins führt (Schmidt und Hall, 2002). Hervorzuheben ist hierbei die CH-Domäne (“calponin homology domain”) der Vav-Familie, die zu den GEFs gehören. Die CH-Domäne interagiert intramolekular mit dem aktiven Zentrum und inhibiert die GEFAktivität. Eine konstitutive Aktivierung von Vav wird durch eine Abspaltung dieser N-terminalen CH-Domäne erreicht (Katzav et al., 1991) oder durch eine Phosphorylierung dieser Domäne, was zu einer Konfigurationsänderung und Aktivierung der katalytischen Domäne führt (Aghazadeh et al., 2000). Einige GEFs werden durch Protein-ProteinInteraktionen oder auch Homooligomerisierung stimuliert. Beispielsweise führt die Homooligomerisierung von Dbl zu dessen Aktivierung (Zhu et al., 2001). Die Veränderung der subzellulären Lokalisation stellt ebenfalls eine Regulierungsmöglichkeit für GEFs dar, denn viele zelluläre Funktionen von GTPasen sind örtlich begrenzt. Die PH-Domäne transloziert GEFs an die Membran und an Strukturen des Zytoskeletts. Eine Deletion dieser Domäne oder der Austausch einer Aminosäure in dieser Domäne führt zum Verlust der in vivo Aktivität diverser GEFs (Whitehead et al., 1995; 1996; 1997; Zheng et al., 1996; Olson et al., 1997). Andere GEFs wiederum werden über Adapterproteine an die Membran rekrutiert, wie z.B. Sos1 („son of sevenless 1”) oder interagieren, wie beispielsweise Vav, direkt mit der zytoplasmatischen Hälfte von Zelloberflächen-Rezeptoren (Buday und Downward 1993; Gale et al., 1993; Skolnik et al., 1993; Bustelo, 2000; Shamah et al., 2001). Über die Inaktivierung von GEFs ist noch sehr wenig bekannt. Neuere Daten deuten auf eine Ubiquitinierung mit nachfolgender Degradierung hin (De Sepulveda et al., 2000; de Hoog et al., 2001; Pham und Rotin, 2001). 14.

(25) EINLEITUNG 7.. Rho-GTPasen, GEFs und neuronale Morphogenese. Während der Entwicklung des Nervensystems wandern neuronale Vorläuferzellen in zukünftiges Nervengewebe ein und differenzieren sich, indem sie Neuriten und Dendriten ausbilden und Synapsen mit entsprechenden Zielzellen bilden. Gesteuert wird das Auswachsen von Axonen über repulsive und attraktive Signale, welche durch die sensorische Funktion der Axonspitzen, auch Wachstumskegel genannt, verarbeitet werden. Die entstandenen intrazellulären Signale führen letztlich zu Veränderungen in Form und Motilität des Wachstumskegels. Dies geschieht durch eine Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts über Aus- und Rückbildung von Filopodien und Lamellipodien (Heidemann, 1996; Mackay et al., 1995; Luo et al., 1997). Rho-GTPasen spielen in erster Linie bei der Wegfindung von Neuriten eine Rolle (Ramakers, 2002). Dabei scheinen Rac1 und Cdc42 stimulierend auf das Auswachsen eines Axons zu sein, während Rho inhibierend wirkt (Luo, 2000). In der Abbildung 6 sind Aktin-abhängige Strukturen eines Wachstumskegels dargestellt.. Abb. 6: Organisationsformen von AktinFilamenten. eines. Lamellipodium. Neuriten-. Wachstumskegels In roter Farbe sind auf Aktin basierende Strukturen angezeigt. Lamellipodien beinhalten ein dichtes Netzwerk an AktinFilamenten. Die stachelförmigen Ausstülpungen stellen Filopodien dar, welche durch. parallel. angeordnete. Aktin-. Filamente charakterisiert sind.. AktinFilamente Filopodien [Luo, Nat Rev Neurosci 1:173-180 (2000)]. Dendriten verzweigen sich stark und bilden dendritische Dornen aus, welche zur Synapsenbildung mit anderen Neuronen dienen. Dendritische Dornen ähneln im unreifen Zustand Filopodien und besitzen erst ausgereift eine pilzförmige Form. Die Ausbildung der dendritischen Dornen hängt von der Reorganisation des Zytoskeletts ab, wobei Rho-GTPasen eine wichtige Rolle spielen (Luo, 2000; Dickson, 2001; Nikolic, 2002). Während die Aktivität von Rac1 und Cdc42 stimulierend auf die Entstehung und Verzweigung von Dendriten wirkt, inhibiert Rho das Dendriten-Wachstum (Luo, 2000; Ramakers, 2002). Desweiteren gibt es 15.

(26) EINLEITUNG Hinweise darauf, dass Rho-GTPasen an der Ausbildung von prä- und postsynaptischen Strukturen beteiligt sind (Nakayama et al., 2000). Verschiedene Rho-GEFs wurden bereits mit den Vorgängen während der neuronalen Morphogenese in Verbindung gebracht und als regulatorisch wirkende Proteine sowohl für die zeitliche als auch die örtliche Aktivierung von GTPasen innerhalb dieser komplexen Mechanismen beschrieben (Schmidt und Hall, 2002).. 8.. Der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor ARHGEF6/α αPIX. Das vom ARHGEF6-Gen („alpha rho guanine nucleotide exchange factor 6“) codierte Protein, in der Literatur als αPIX („α α PAK interacting exchange factor”) oder Cool-2 („cloned out of library-2) bekannt, besteht aus mehreren funktionellen Domänen (Abb. 7).. CH. SH3. DH. PH. GBD CC. ARHGEF6/α PIX. Abb. 7: Schematische Darstellung der Domänenstruktur von ARHGEF6/α αPIX Funktionelle Proteindomänen sind als Blöcke gezeigt. CH/ 3; DH/. : Dbl homology; PH/. : calponin homology; SH3/. : pleckstrin homology; GBD/. : Src homology. : GIT1-binding domain; CC/. :. coiled-coil.. Wie alle GEFs besitzt ARHGEF6/αPIX eine DH- und eine PH-Domäne, welche die katalytische Einheit darstellen. Der N-Terminus von ARHGEF6/αPIX weist neben einer SH3-Domäne, welche eine Bindung mit prolinreichen Regionen anderer Proteine vermittelt, eine singuläre CH-Domäne auf, deren Funktion noch nicht völlig geklärt ist (Gimona et al., 2002). Neueste Berichte weisen daraufhin, dass CH-Domänen Bindemotive für andere Proteine darstellen (Menice et al., 1997; Leinweber et al., 1999; Groysman et al., 2000). Am C-Terminus von ARHGEF6/αPIX befinden sich zwei weitere funktionelle Domänen, die GBD- und die CC-Domäne. Vor kurzem wurde gezeigt, dass ARHGEF6/αPIX mit dem Protein Cat-1 („Cool-associated tyrosine phosphosubstrate 1“), auch GIT1 („G proteincoupled receptor kinase interactor 1“) genannt, interagiert (Bagrodia et al., 1999; Turner et al., 1999). Die für diese Bindung verantwortliche Domäne ist die GBD-Domäne („GIT1binding domain“). Die Interaktion mit GIT1 deutet u.a. auf eine Rolle von ARHGEF6/αPIX bei der Integrin-abhängigen Signaltransduktion hin (Bagrodia et al., 1999), bei der Regulation von fokalen Adhäsionen (Zhao et al., 2000) sowie bei der Bildung von dendritischen Dornen. 16.

(27) EINLEITUNG (Zhang et al., 2003) und beim Auswachsen von Neuriten (Albertinazzi et al., 2003). Schließlich weist ARHGEF6/αPIX noch eine CC-Domäne („coiled coil domain“) auf. Diese lässt auf eine Interaktion mit Proteinen, die ebenfalls eine solche Domäne aufweisen, schließen. In vielen Fällen ist die Anwesenheit dieser Domäne ein Hinweis auf die Bildung von Homodimeren des Proteins bzw. von Heterodimeren mit anderen Proteinen. Für ARHGEF6/αPIX wurde bereits eine Heterodimerisierung mit ARHGEF7/βPIX gezeigt (Koh et al., 2001). ARHGEF6/αPIX wurde als ein Rac1/Cdc42-spezifischer GEF mit einer im Vergleich zu anderen Rho-GEF-Proteinen geringen GEF-Aktivität beschrieben (Manser et al., 1998, Reza Ahmadian, persönliche Mitteilung). Dies wird besonders offensichtlich bei einem Vergleich mit stark aktivierenden GEFs, wie z.B. Tiam-1 für die GTPase Rac1. Nichtsdestotrotz wurde gezeigt, dass die Aktivierung von ARHGEF6/αPIX zur Reorganisation des AktinZytoskeletts, genauer zur Ausbildung von Membranauffaltungen führt (Koh et al., 2001). ARHGEF7/β βPIX bzw. Cool-1 ist ein zu ARHGEF6/αPIX sehr homologer, ebenfalls für Rac1 und Cdc42 spezifischer GEF (Bagrodia et al., 1998; Manser et al., 1998). Von diesem Protein wurden bisher fünf verschiedene Isoformen identifiziert, die durch alternatives Spleißen entstehen. Interessanterweise sind drei dieser βPIX-Isoformen sehr spezifisch im Gehirn exprimiert (Kim et al., 2000; Kim und Park, 2001; Koh et al., 2001). Für ARHGEF6/αPIX wurden bisher keine Isoformen beschrieben. Die Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren ARHGEF6/αPIX und ARHGEF7/βPIX wurden als Interaktionspartner von PAK1 bzw. PAK3 identifiziert (Manser et al., 1998, Bagrodia et al, 1998). Sie zeigen eine hohe Affinität zu einer prolinreichen Sequenz des PAK1-Proteins, und können PAK1 aus dem Zytoplasma an die Membran zu Cdc42- und Rac1-induzierten fokalen Komplexen rekrutieren (Manser et al., 1997, 1998; Daniels et al., 1999). ARHGEF6/αPIX ist in der Lage, die Kinase-Aktivität von PAK3 bzw. die von PAK1 zu erhöhen (Bagrodia et al., 1999; Yoshii et al., 1999; Daniels et al., 1999). Die Interaktion zwischen PAK1 und ARHGEF6/αPIX hat nicht nur eine Stimulierung der Kinase-Aktivität von PAK1 zur Folge sondern rückwirkend auch einen positiven Einfluss auf die Austauschaktivität von ARHGEF6/αPIX, wobei der Mechanismus noch nicht verstanden wird (Daniels et al., 1999; Feng et al., 2002a). PAK-Proteine wirken also einerseits als Rac/Cdc42-Effektorproteine und andererseits durch die Interaktion mit dem GEF ARHGEF6/αPIX oberhalb von Rac1 und Cdc42. Ein anderer kürzlich identifizierter Interaktionspartner von ARHGEF6/αPIX, Cbl, konkurriert hingegen mit PAK um die Interaktion mit ARHGEF6/αPIX und blockiert somit 17.

(28) EINLEITUNG die PAK-abhängige Signaltransduktionskaskade (Flanders et al., 2003). Auch das Cbl-Protein ist in der Lage, die GEF-Aktivität von ARHGEF6/αPIX zu stimulieren (Feng et al., 2002b). Weitere bekannte, vorgeschaltete Aktivatoren von ARHGEF6/αPIX sind der PDGF- und der EphB2- („ephrin B2“) Rezeptor (Yoshii et al., 1999), die beide durch lösliche Wachstumsfaktoren stimuliert werden. Es konnte auch gezeigt werden, dass ARHGEF6/αPIX über eine Integrin-vermittelte Signalkaskade PAK1 aktiviert, wobei die beteiligten Proteine dieses Signalweges noch nicht bekannt sind (Yoshii et al., 1999).. 9.. X-chromosomale unspezifische geistige Behinderung. Geistige Behinderung (MR) ist definiert als unzulängliches adaptives Sozialverhalten und die Unfähigkeit, ein der entsprechenden Altersgruppe angemessenes Maß an Intelligenz zu erreichen. Etwa 2-3 % der Bevölkerung zeigen Lern- oder Verhaltensstörungen in Verbindung mit einem Intelligenzquotienten (IQ) unter 70 (Crow und Tolmie, 1970). Unter allen Patienten mit geistiger Behinderung kommen die leichten (IQ 50-70) bis mittelschweren (IQ 35-49) Formen häufig vor, während schwere (IQ 20-34) und sehr schwere (IQ <20) geistige Behinderung mit 0,3-0,5 % eher selten ist. Es ist anzunehmen, dass geistige Behinderung häufig das Resultat der Synergie von genetischen und Umweltfaktoren ist. Im Folgenden wird auf einige monogene Ursachen der MR eingegangen. Eine geistige Behinderung tritt signifikant öfter bei Männern als bei Frauen auf, was zur Vermutung führte, dass bei einem bedeutenden Anteil der Patienten der geistigen Behinderung Mutationen von X-chromosomalen Genen zugrunde liegen (Lehrke, 1972). Prinzipiell unterscheidet man die geistige Behinderung, die zusammen mit anderen klinischen Veränderungen, wie z.B. Dysmorphien oder Stoffwechselstörungen auftritt, von den nichtsyndromalen Formen. Zu den letzteren gehören alle Erkrankungen, bei denen die Patienten außer einer geistigen Behinderung keine weiteren klinischen Auffälligkeiten zeigen. Sie werden auch unter dem Begriff X-chromosomale unspezifische geistige Behinderung (MRX) zusammengefasst. Die Prävalenz von MRX beträgt 0,9-1,4 in 1000 Männern. Chromosomale Anomalien, die das X-Chromosom betreffen und bei Patienten mit geistiger Behinderung beobachtet wurden, haben in den letzten Jahren die Identifizierung von Krankheitsgenen für MRX erheblich beschleunigt. In vielen Fällen wurde das MRX-Gen aufgrund. einer. X/autosomalen-Translokation. identifiziert.. Mutationsanalysen. bei. sporadischen und/oder familiären Fällen haben dann zur Identifizierung von mindestens einer weiteren Mutation in demselben Gen geführt. Man geht davon aus, dass es bis zu 100 18.

(29) EINLEITUNG MRX-Gene gibt. Derzeit sind 15 MRX-Gene bekannt, welche in Abbildung 8 gezeigt sind (Chelly and Mandel, 2001; Ropers et al., 2003). In dieser Arbeit soll auf jene eingegangen werden, welche in Rho-GTPase-Zyklen involviert sind. Xp22 RPS6KA3, STK9 Xp21. ARX IL1RAPL1 TM4SF2. Abb. 8: Gene für die X-chromosomal vererbte unspezi-. Xp11 PQBP1. fische geistige Behinderung Xq12 OPHN1. Links ist das Idiogramm des X-Chromosoms gezeigt. Einige G-Banden des X-Chromosomes sind angegeben. Alle bis heute bekannten MRX-Gene sind auf der rechten Seite des. Xq22 FACL4. PAK3. Idiogramms gezeigt. Gene, welche für Proteine des Rho-. Xq24 AGTR2 Xq26. GTPase-Zyklus codieren, sind fett gedruckt.. ARHGEF6. Xq28 FMR2, GDI1. X. MECP2, SLC6A8. Bemerkenswerterweise wurden Mutationen in drei Genen, deren Proteine an unterschiedlichen Stellen in den Rac1- bzw. Cdc42-GTPase-Zyklus involviert sind, mit der Entstehung X-chromosomal erblicher geistiger Behinderung in Verbindung gebracht (Abb. 9).. GTP. ARHGEF6// α PIX. Rac1/Cdc42 GDP. Pi. GDP. Rac1/Cdc42. PAK3. GTP. OPHN1 Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts und neuronale Entwicklung. Abb. 9: Genprodukte von MRX-Genen, welche am Rho-GTPase-Zyklus beteiligt sind ARHGEF6/αPIX stimuliert den Austausch von GDP nach GTP und aktiviert Rac1 bzw. Cdc42. OPHN1 erhöht die GTPase-Aktivität von Rac1 und Cdc42 und inaktiviert diese GTPasen. PAK3 interagiert mit aktivem Rac1 bzw. Cdc42 und kann dadurch ein Signal weiterleiten. Die Aktivierung von PAK3 führt zur Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts, insbesondere während der neuronalen Entwicklung. GDP: Guanosin-5’-diphosphat; GTP: Guanosin-5’-triphosphat; Pi: Phosphat-Rest.. 19.