und Reinigung von rekombinanten Proteinen in Aspergillus niger
Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina
zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation
von Andreas Heribert Friedrich Josef Roth aus Würzburg
Inhaltsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis ... 1
Tabellenverzeichnis ... 111
Abkürzungsverzeichnis ... IV
Einleitung ... 1
1.1 Einführung ... 1
1 .2 Mikroorganismen in der biotechnologischen Anwendung ... 1
1.3 Proteinherstellung durch Mikroorganismen ... 2
1 .3.1 Prokaryonten ... 3
1.3.2 Eukaryonten ... 4
1.4 Aspergillus niger ... ... 6
1.4.1 Industrielle Bedeutung ... 7
1.4.2 Rekombinante Proteinproduktion ... 8
1.5 1.5.1 Expressionssysteme in Aspergillus niger ... 8
Transkription ... 9
1.5.2 Induzierbarer Promotor der ß-Fructofuranosidase ... 11
1.5.3 Konstitutiver Promotor der Pyruvatkinase A ... 12
1.6 Kleine funktionelle Peptide ... 13
1.6.1 Histidin-Affinitätspeptid ... 14
1.6.2 Strepll-Affinitätspeptid ... 15
1.6.3 Peptidase Schnittstelle Kex2 ... 15
1.7 Modellproteine ... 16
1.7.1 Grün Fluoreszierendes Protein ... 16
1.7.2 Hydrolase aus Thermobifida fusca ... 17
2 Zielsetzung ... 18
3 Material und Methoden ... 19
3.1 Material ... 19
3.1.1 Stämme ... 19
3.1 .2 Plasmide ... 20
3.1.3 Oligonukleotide ... 22
3.2 Medien und Lösungen ... 24
3.2.1 Medien für Escheriehia eoli ... 24
3.2.2 Medien für Aspergillus niger ... 24
3.2.3 Lösungen ... 26
3.3 Mikrobiologische Methoden ... , ... 29
3.3.1 Gewinnung von Aspergillus niger Sporen ... 29
3.3.2 Wachstum von Escherichia coliund Aspergillus niger ... 29
3.3.3 Optische Dichte ... 30
3.3.4 Lagerung von Escheriehia eoli und Aspergillus niger Kulturen ... 30
3.3.5 Aufschluss von Mycel aus einer Flüssigkultur ... ··30
3.3.6 Sterilisation ... 31
3.4 Molekularbiologische Methoden ... 31
3.4.1 Isolierung von RNA ... 31
3.4.2 Isolierung von DNA ... 32
3.4.2.1 Plasmid DNA ... 32
3.4.2.2 Genomische DNA ... 32
3.4.3 Bestimmung der DNA Konzentration ... 33
3.4.4 DNA-Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion ... 33
3.4.5 DNA Fragmentierung durch Restriktionsendonukleasen ... 34
3.4.6 Reinigung von DNA Fragmenten ... 35
3.4.7 Ligation von DNA Fragmenten ... 35
3.4.6 Oligonukleotide ... 35
3.4.6.1 Phosphorylierung der Oligonukleotide ... 36
3.4.6.2 Hybridisierung der Oligonukleotide ... 36
3.4.9 TranSformation von Eseherichia eoli durch Elektroporation ... 36
3.4.10 RbCI2 Transformation von Escherichia coli ... 37
3.4.11 Transformation von Aspergillus niger Protoplasten ... ·36
3.4.12 Sequenzieren von DNA ... 36
3.4.13 Konstruktion der Vektoren ... 39
3.4.13.1 3.4.13.2 3.4.13.3 Ausstattung der Vektoren mit Hexahistidin-Sequenzen ... .40
Ausstattung der Vektoren mit Strepll-Sequenzen ... .42
Ausstattung der Vektoren mit Stop-Codons ... ·.43
3.4.13.4 Ausstattung der Vektoren mit Fusionssequenzen für die Sekretion ... 44
3.4.14 Erhöhung der Proteinkonzentration ... .45
3.5 Analytische Methoden ... .46
3.5.1 Elektrophoretische Trennmethoden ... .46
3.5.2 3.5.2.1 3.5.2.2
Immune 810t ... 47
RNA Nachweis ... .47
DNA Nachweis ... .48
3.5.2.3 Proteinnachweis ... .48
3.5.3 Analyse der GFP Fluoreszenz ... 49
3.5.4 Fluoreszenzmikroskopie ... 49
3.5.5 Analyse der TFH Aktivität.. ... 50
3.5.6 Analyse der SUC1 Aktivität ... 50
3.5.7 8estimmung der Gesamtproteinmenge ... 51
3.5.8 Proteinreinigung mittels Affinitätschromatographie ... 51
3.5.9 8estimmung der Biotrockenmasse ... 52
3.5.10 Dünnschichtchromatographie ... 52
4 Ergebnisse ... 54
4.1 Charakterisierung des induzierbaren ~-Fructofuranosidase-Promotors ... 54
4.1.1 Induktionsverlauf des endogenen suc1 Promotors ... 54
4.1.2 Vergleich unterschiedlicher Kohlenstoffquel/en ... 56
4.1.3 Untersuchung verschiedener Wachstumsbedingungen ... 61
4.1.4 Induktionsverlauf des rekombinanten suc1 Promotors ... 68
4.2 Der konstitutive pkiA Promotor ... 74
4.3 Der induzierbare glaA Promotor ... 76
4.4 Grundvektoren des neuen Vektorsystems ... 77
4.4.1 Vektorsequenzen ... 78
4.4.2 Aufbau der Vektoren ... 78
4.4.3 Vektorsystem ... 79
4.5 Funktionalität des Vektorsystems ... 81
4.5.1 Untersuchung der A. niger Transformanten ... 82
4.5.2 Auswirkung der Kopienanzahl im Genom auf die Expression ... 84
4.5.3 Die Model/proteine im Vektorsystem ... 86
4.5.4 Proteinreinigung mittels optimiertem Histidin-Affinitätspeptid ... 88
4.5.5 Proteinreinigung mittels optimiertem Strepll-Affinitätspeptid ... 91
4.5.6 Proteinkonzentrationen der gereinigten Fraktionen ... 93
4.6 Sekretion von Zielproteinen mittels der ~-Fructofuranosidase ... 93
4.6.1 Exportsequenz der ~-Fructofuranosidase ... 94
4.6.2 Fusionspartner SUC1201 und suc1soo für die Sekretion ... 97
4.6.3 ß-Fructofuranosidase als Fusionspartner für die Sekretion ... 98
5 Diskussion ... 100
5.1 Die Expression der ß-Fructofuranosidase ... 100
5.2 Der ß-Fructofuranosidase Promotor ... 1 01 5.2.1 Expression des Grün Fluoreszierenden Proteins ... 1 02 5.2.2 Basalexpression ... 103
5.3 Kulturheterogenität ... 1 04 5.4 Vektorsystem ... 1 05 5.4.1 Funktionalität des Vektorsystems ... 1 05 5.4.2 Zusammenhang von Kopienanzahl und Expressionsstärke ... 106
