Die Wirkung Aprotinins (Trasylol) auf die koronare endothelabhängige Vasorelaxation des Schweines und des Kaninchens

Die Wirkung Aprotinins (Trasylol

) auf die koronare endothelabhängige Vasorelaxation

des Schweines und des Kaninchens

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Maren Steinhoff aus Wolfenbüttel

Hannover, 2004

1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. G. Breves 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher

Tag der Mündlichen Prüfung: 25.11.2004

1. Einleitung 1

1.1 Endothelabhängige Vasorelaxation 1

1.2 Aprotinin 4

2 Material und Methoden 7

2.1 Organentnahme 7

2.1.1 Kaninchenherzen 7

2.1.2 Koronarien von Hausschweinen 8

2.2 Verwendete Lösungen 9

2.2.1 Reperfusionslösung (KHkan ): 9

2.2.2 Kardioplegische Lösung (KHK+): 10

2.2.3 Inkubationslösung (KHs): 10

2.3 Untersuchung der entnommenen Organe 10

2.3.1 Perfusion der Kaninchenherzen an der Langendorffapparatur 10

2.3.2 Messung der Funktion der Schweinekoronarien 16

2.4 Versuchsauswertung 20

3 Ergebnisse 21

3.1 Kaninchenherzen 21

3.1.1 Organentnahme 21

3.1.2 Perfusion der Kaninchenherzen an der Langendorffapparatur 21

3.1.3 Sauerstoffpartialdruck (pO2): 21

3.1.4 pH-Wert 22

3.1.5 Veränderung der Elektrolyt-Zusammensetzung

der KHKan-Lösung durch den Zusatz von Aprotinin 23

3.1.6 Funktionsprüfung 23

3.1.7 Flow 24

3.1.7.1 Basisflow 24

3.1.7.2 Flowanstieg und Flowabfall 26

3.1.7.3 Maximale Flowveränderung 31

3.1.8 Linksventrikuläre Druckamplitude (LVP) 32

3.1.9 Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit (dp/dt) 34

3.1.10 Herzfrequenz 35

3.2.3 Funktion der Koronararterien vom Schwein 36

4. Diskussion 39

4.1 Versuchstiere 39

4.2 Verwendeten Lösungen 40

4.3 Mechanismen der endothelabhängigen Relaxation 42

4.3.1 Stickstoffmomoxid 43

4.3.2 Prostazyklin 45

4.3.3 EDHF 46

4.3.4 Substanz P 48

4.3.5 Bradykinin 50

4.3.6 Serotonin 52

4.3.7 Sodiumnitroprussid 54

4.3.8 Acetylcholin 54

4.3.9 Aprotinin 56

5. Zusammenfassung 66

6. Summary 68

7. Literaturverzeichnis 71

8. Bereits publizierte Teilergebnisse 84

9. Lebenslauf 85

10. Erklärung 87

11. Danksagung 88

1. Einleitung

1.1 Endothelabhängige Vasorelaxation

Als Grenzschicht zwischen dem strömenden Blut und der Gefäßwand übt das Endothel eine Reihe von Funktionen aus, die für die Kontrolle der Hämostase, für den Stoffaustausch zwischen intra- und extravasalem Raum sowie für den Ablauf akuter und chronischer Entzündungsreaktionen und verschiedener immunologischer Prozesse von Bedeutung sind. Im aktivierten Zustand wird das Endothel selbst die Bildungsstätte von Zytokinen, Wachstumsfaktoren und freien Sauerstoffradikalen (Weidinger und Frick, 2000). Auf verschiedene physikalische und chemische Einflüsse hin setzt das Endothel vasoaktive Substanzen frei, die sowohl gefäßzusammenziehend als auch gefäßerweiternd wirken können, und spielt dadurch eine zentrale Rolle bei der Regulation des lokalen Gefäßtonus. So können die Scherkräfte des zirkulierenden Blutes, die durch die Herzaktion induzierten pulsatorischen Dehnungs- und Entdehnungszyklen, Hypoxie und rezeptorvermittelt eine Reihe von Substanzen wie z.B. Acetylcholin, Bradykinin, Substanz P, Adenosintriphosphat, Adenosindiphosphat und aus Thrombozyten freigesetztes Serotonin je nach Gefäß- und Rezeptortyp eine Gefäßerweiterung bedingen (Pohl und Busse, 1989; Schmidt und Thews, 1995; Tschudi und Lüscher, 1996).

Diese endothelabhängige Relaxation (aus dem Englischen: endothelial-derived- relaxation, EDR) wird über die Bildung und Freisetzung dreier "Faktoren" reguliert:

dem Stickstoffmonoxid (NO) (Palmer et al., 1987; Ignarro et al., 1987), dem durch die Cyclooxygenase aus Arachidonsäure produzierten Prostaglandin I2 (Prostazyklin) (Moncada und Vane, 1979) und dem aus dem Endothel stammenden hyperpolarisierenden Faktor (Englisch: endothelium derived hyperpolarisation factor), der über eine Aktivierung kalziumabhängiger Kaliumkanäle sowohl zu einer Vasodilatation als auch zu einer Hyperpolarisation der glatten Muskelzellmembran führt, dessen chemische Identität jedoch noch nicht gänzlich geklärt ist (He, 2003).

Moncada und Vane berichteten schon 1979 davon, dass Prostazyklin als eine aus dem Endothel freigesetzte Substanz eine Relaxation an der glatten Muskulatur bewirkte. Furchgott und Zawadzki entdeckten 1980, dass für eine Vasorelaxation isolierter Aortenstreifen des Kaninchens mittels Acetylcholin die Anwesenheit eines intakten Endothels essenziell ist. Die Autoren vermuteten, dass Acetylcholin aus dem Endothel eine endothelabhängige humorale Substanz freisetze und bezeichneten diese als „endothelium-derived-relaxing-factor“ (EDRF). Palmer et al. und Ignarro et al. identifizierten den EDRF 1987 unabhängig voneinander als Stickstoffmonoxid.

1998 erhielten Furchgott, Ignarro und Murad den Nobelpreis für die Entdeckung von Stickstoffmonoxid.

Die Existenz eines endothelialen, die glatte Gefäßmuskulatur hyperpolarisierenden und relaxierenden Faktors, der nicht mit Sickstoffmonoxid oder Prostazyklin identisch ist, wurde bereits wenige Jahre nach Furchgotts Erstbeschreibung eines humoralen, übertragbaren EDRF vermutet. So postulierten Bolton und Mitarbeiter 1984, dass die Hyperpolarisation, die sich an kleinen, endothelintakten Mesenterialarterien des Meerschweinchens durch den muskarinergen Agonisten Carbachol auslösen ließ, durch einen aus dem Endothel freigesetzten Faktor zustande kam. 1988 wurden von Taylor et al. an Segmenten der Rattenaorta, die mit K⁺-Markerisotop Rb⁸⁶ beladen waren, beobachtet, dass es nach Acetylcholingabe zu einer Relaxation mit Hyperpolarisation und gleichzeitig zu einem verstärkten Rb^86-Efflux kam.

Nitroprussid, als reiner Stickstoffmonoxid-Donator, bewirkte dagegen keine Veränderungen des Membranpotenzials bzw. des Rb^86-Effluxes. Ein aus dem Endothel stammender, hyperpolarisierender und vasodilatierender Faktor wurde fortan in der Literatur als endothelabhängiger hyperpolarisierender Faktor, kurz EDHF bezeichnet (Chen et al., 1988; Félétou und Vanhoutte, 1988).

Seitdem die obligatorische Rolle des Gefäßendothels für die lokale Durchblutung und Kontrolle des vaskulären Tonus entdeckt war, rückte das koronare Endothel als essenzielle Struktur und funktionales Element des kardiovaskulären Systems immer mehr in den Mittelpunkt der Forschung. Der kardiale Metabolismus korreliert sehr dicht mit der koronaren Zirkulation. Ein erhöhter Sauerstoffbedarf des Myokards wird über eine sofortige Anpassung durch den koronaren Blutfluss geregelt. Diese

„metabolische Autoregulation" wird durch die kleinsten Arterien und Arteriolen (der koronaren Mikrozirkulation) gewährleistet, welche das Widerstandssystem bilden, während die größeren Arterien das Leitungssystem darstellen.

Der relative Anteil der drei Substanzen an der endothelabhängige Gefäßerweiterung variiert ja nach Spezies, Gefäßtyp, Gefäßgröße, Rezeptortyp und der auslösenden vasodilatatorischen Substanz (Lüscher et al., 1990). So beschrieben Laughlin et al.

(2003), dass das Protein der im Endothel vorkommenden Stickoxidsynthase eNOS (vgl. 4.3.1, S.43), bezogen auf das arterielle Gesamtprotein anteilig kleiner war, je kleiner der Gefäßdurchmesser wurde. Vanheel und Van de Voorde (2000) berichteten davon, dass mit kleiner werdendem Gefäßdurchmesser der relative Anteil des EDHF an der gesamten endothelabhängigen Relaxation zunahm. Am isolierten Kaninchenherzen soll die Prostazyklinausschüttung besonders stark in der Hypoxiephasen sein (Nakhostine et al., 1995), während Koronararterien vom Schwein auf Prostazyklin hin nicht zu dilatieren scheinen (Kilpatrick et al., 1994).

Stickstoffmonoxid ist nicht nur für einen Teil der endothelabhängige Gefäß- erweiterung verantwortlich, sondern es verhindert auch die Adhäsion und Aktivierung der Thrombozyten (Rodeberg et al., 1995). Auch Prostazyklin hemmt die Thrombozytenanheftung. Eine Beeinträchtigung der Stickstoffmonoxid und/oder Prostazyklinfreisetzung würde also die Entstehung einer Thrombose begünstigen.

Substanzen, die bei intaktem Endothel gefäßerweiternd wirken, wie Serotonin und Acetylcholin, können bei endothelialer Schädigung über eine direkte Wirkung auf die glatte Muskulatur zu einer Gefäßverengung, im schlechtesten Fall auch zu einem Gefäßspasmus führen (Weidinger und Frick, 2000). Eine Störung der endothelabhängigen Vasodilatation würde eine Minderperfusion des Myokards zur Folge haben, sodass ein von der zu leistenden Arbeit abhängiger Mehrbedarf an Sauerstoff, nicht gedeckt werden kann und somit zur Hypoxie des Myokards führen würde.

1.2 Aprotinin

Aprotinin ist ein Kallikreininhibitor, der von Kraut, Frey und Werle 1930 in Parotis, Lymphknoten, Leber, Milz und Rückenmark des Rindes gefunden wurde (Kraut et al., 1930). 1936 gelangen Kunitz und Northrop die Isolierung eines Trypsininhibitors aus der Bauchspeicheldrüse des Rindes. Seither spricht man auch von der Familie der Kunitz-Typ-Inhibitoren (Kunitz et al., 1936). Ebenfalls beim Rind fand Astrup 1959 in Lungenextrakten einen Hemmstoff der Fibrinolyse. Laut Trautschold et al. (1965) stellten Werle und Mitarbeiter 1952 den Zusammenhang zwischen diesen Inhibitoren her, wobei es sich wahrscheinlich um eine persönliche Mitteilung handelte. Aprotinin gilt als Hemmkörper für Kallikrein und wurde durch die Hemmung der blutdrucksenkenden Wirkung des Kallikreins in vivo bestimmt (vgl. 4.3.9 auf S. 56).

KIE steht für „Kallikrein inhibierende Einheit" und bezeichnet die Menge, welche benötigt wird, um von zwei Kallikreineinheiten die Hälfte zu hemmen (vgl. 4.3.9 auf S.

56) (Trautschold, 1965). 1 KIE entspricht 0,14 g des kristallinen Wirkstoffes.

Laut Haberland, (1967) wird Aprotinin enteral nicht resorbiert, verteilt sich aber nach parenteraler Verabreichung schnell im Extrazellulärraum. Das Eliminationsorgan für Aprotinin ist die Niere. Kaller berichtete 1967 davon, dass Aprotinin nicht im Harn ausgeschieden wurde, vermutete aber, dass der Proteinaseninhibitor entweder schon in der Niere metabolisiert oder aber in inaktivierter Form im Harn ausgeschieden werde (vgl. 4.3.9, S. 57). 1953 wurde Aprotinin ist in der handelsüblichen Lösung Trasylol^ (Fa. Bayer, Leverkusen, Deutschland) erhältlich.

Es ist in 0,9 prozentiger steriler Natriumchloridlösung gelöst (ca. 70 mg Aprotinin in 50 ml 0,9% NaCl). Eine Flasche Trasylol^ à 50ml Volumen enthalten 500 000 KIE Aprotinin, was einer Konzentration von 10 000 KIE/ml Aprotinin entspricht.

Die biochemische Bindung soll durch reversible konzentrationsabhängige und durch Wasserstoffionenkonzentration beeinflusste Bindung an Proteinasen zustande kommen. Haberland beschrieb 1967, dass Aprotinin eine hemmende Wirkung auf ganz unterschiedliche Proteinasen wie Trypsin, Kallikrein und Plasmin habe und

dadurch auch die Aktivierung von Kallikreinogen zu Kallikrein durch Trypsin hemme.

Auch die Aktivierung der Gerinnungskaskade werde durch Aprotinin an verschiedenen Stellen unterbrochen, insbesondere bei Faktor VIII und IX. Thrombin werde dagegen nicht durch Aprotinin inaktiviert. Ebenso wurde Aprotinin zur allgemeinen Aktivitätssteigerung des Gerinnungssystems, der Fibrinolyse und des Kininsystems eingesetzt und sollte so Hilfe bei den verschiedensten Krankheiten wie z.B. bei Hämorrhagien, Pankreatitis, Peritonitis, Fruchtwasserembolien und in Schockzuständen bringen. Seine tatsächliche therapeutische Wirksamkeit konnte aber nicht wissenschaftlich einheitlich bewiesen werden und stellte sich wie am Beispiel der Therapie akuter Pankreatitis enttäuschend dar (Imrie et al., 1978; Dietze, 2004).

Anders verhielt es sich zunächst in der offenen Thoraxchirurgie: Nachdem Royston et al. (1987) und Bidstrup et al. (1988) Aprotinin das erste Mal in der Herzchirurgie einsetzten und von einer bis zu fünfzigprozentigen Reduktion der Blutverluste durch die Anwendung von Aprotinin in der so genannten High-Dose-Therapie ( 250 KIE/ml Aprotinin, vgl. 4.3.9 auf S. 57) berichtet hatten, wurde Aprotinin bei Herzoperationen mit erhöhtem Blutungsrisiko weltweit routinemäßig benutzt. Zahlreiche Ver- öffentlichungen bestätigten diesen so genannten bluteinsparenden Effekt des Aprotinins (Bidstrup et al., 1988; Havel et al., 1992; Royston et al., 1987; Van Oeveren et al., 1987 und 1992). Bei Operationen mit extrakorporalem Kreislauf soll man laut Gebrauchsinformation des Produktes Trasylol^ initial 2 Millionen KIE (entsprechen ca. 280 mg) über 20 Min ab Operationsbeginn, gefolgt von einer Dauerinfusion von 500 000 KIE/Stunde bis zum Operationsende infundieren; eine zusätzliche Gabe von 2 Millionen KIE Aprotinin werden für das Priming Volumen der Herz-Lungen-Maschine empfohlen. Dies entspricht einer Aprotininkonzentration von 250 KIE/ml Plasmavolumen und damit der so genannten High-Dose-Therapie (vgl.

4.3.9 auf S.57). Trotz des anhaltenden großzügigen Einsatzes von Aprotinin bei solchen Eingriffen ist der genaue Effekt und Wirkmechanismus dieses Medikamentes am koronaren Endothel bzw. auf die endothelabhängige Vasorelaxation gesunder Herzen noch nicht geklärt und nach wie vor Gegenstand der aktuellen Forschung. So berichten neuere Studien davon, dass Aprotinin bei der Ratte die endothelabhängige

Relaxation in Aortenringen und am isolierten Herzen selektiv hemmte und die basale Stickstoffmonoxidfreisetzung aus mit Kollagenasen und Trypsin behandelten extrahierten und anschließend kultivierten Endothelzellen von Rattenherzen beeinflusste (Ülker et al., 2001 und 2002). Inwiefern diese Beeinträchtigung der endothelabhängigen Vasodilatation durch Aprotinin auch auf das koronare Endothel anderer Spezies zutrifft, wurde bisher noch nicht weiter untersucht. Ziel unserer Studie war die Klärung des Einflusses, den Aprotinin in verschiedenen Konzentrationen auf die koronare endothelabhängige Relaxation am Schwein und am Kaninchen ausübt. Die von uns benutzten Konzentrationen richteten sich nach den in der Klinik gebräuchlichen Dosierungen (Hardy und Desroches, 1992) sowie nach Studien von Ülker et al. (2001), Hill et al. (1997) und Bruda et al. (1998) (vgl.

4.3.9 auf S. 57).

2. Material und Methoden

2.1 Organentnahme:

2.1.1 Kaninchenherzen

Es wurden 14 männliche Kaninchen der Rasse „weiße Neuseeländer“ (Fa. Rollié, D- 59302 Oelde) mit einem mittleren Gewicht von 3,27 ± 0,27 kg (Mittelwert ± Standardabweichung) für die Untersuchung der Wirkung Aprotinins (Trasylol^®, Fa.

Bayer, Leverkusen, Deutschland) auf das koronare Widerstandssystem am Kaninchenherzen benutzt. Für die Herzentnahme bekamen die Kaninchen 6 mg/kg Xylazinhydrochlorid (Rompun^ 2%, Fa. Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany) und 60 mg/kg Ketaminhydrochlorid (Ketavet^ 100 mg/ml; Fa. Pharmacia & Upjohn, Erlangen, Germany) in einer Mischspritze intramuskulär in die kaudale Oberschenkelmuskulatur injiziert. Nach 20 Minuten waren die Tiere ausreichend narkotisiert und wurden in Rückenlage auf einer Operationsbank aus Kunststoff ausgebunden. Nacken und Kopf der Tiere wurden leicht hyperextendiert. Nach medianer Tracheotomie wurde ein Trachealtubus (Tracheal Tube, Size 3,0 mm, Fa.

Portex Limited, Hythe, Kent, England) eingeführt und fixiert.

Die Aufrechterhaltung der Narkose erfolgte mittels Inhalationsnarkose über ein Beatmungsgerät (Engström RS 300 LKB Medical; Bromma, Sweden). Als Inhalationsnarkotikum diente Isofluran (Forene, Fa. Abbott GmbH, Wiesbaden, Germany). Die Tiere wurden mit einem Atemzugvolumen von 45 – 60 ml und einer Frequenz von 25 Atemzügen/Minute beatmet.

Die Haut samt Hautmuskel wurden von der Medianen aus über Thorax und Abdomen stumpf abpräpariert. Die Eröffnung des Abdomens erfolgte cranial des Nabels bis zum Schaufelknorpel entlang der Linea Alba mit seitlicher Verlängerung des Schnittes parallel der kaudalen Rippenbögen. Das Diaphragma wurde zirkulär entlang der Wandung des Thorax abgetrennt. Zur Sicherung der Aa. Intercostales, der Aa. thoracicae internae und der Aa. subclaviae wurden im dorsalen Drittel des

Thorax zwei starke Klemmen von der Apertura thoracis caudalis bis zur Apertura cranialis gesetzt und entlang dieser die Rippen durchtrennt. Der ventrale Teil des Thorax konnte nun komplett abgesetzt werden. Zur besseren Übersicht wurde zunächst der Thymus abgelöst, das Perikard entfernt, die V. cava cranialis dextra, V.

cranialis sinister sowie der Arcus aortae dargestellt und vom umliegenden Bindegewebe befreit. In die V. cava caudalis wurden 2500 I.E. Heparin (Liquemin^ N 25 000, Fa. Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Whylen, Deutschland) injiziert, um eine Thrombenbildung ausschließen zu können. Nach 2 Minuten wurden die blutzuführenden Venen mit je einer Bulldog-Gefäßklemme abgeklemmt. Die Aorta wurde eröffnet und mit einer Gefäßkanüle mit eichelförmiger Spitze (4 mm, Fa.

Meditronic DLP, Grand Rapids, U.S.A.) kanüliert, die mit kardioplegischer Lösung gefüllt war. Der linke Vorhof sowie die A. Pulmonalis wurden zur Druckentlastung und für den widerstandsfreien Abfluss der kardioplegischen Lösung inzidiert.

Das koronare System wurde sofort über die in die Aorta eingebundene Kanüle orthograd mit 0–1°C kalter kardioplegischer Lösung (KHK+, Tab.1) und konstantem Druck (75 mmHg) bis zum Herzstillstand durchspült. Der konstante Druck wurde mittels eines 102 cm über dem Herzen angebrachten Steigrohres, das über ein Schlauchsystem mit der Gefäßkanüle verbunden war, gewährleistet. Zeitgleich mit der Zufuhr der kardioplegischen Lösung wurde das Herz mit 250 ml auf Eis gekühlter Krebs-Henseleit-Lösung (KHKan, Tab.1) übergossen, um den Herzstillstand zu beschleunigen. Nach Stillstand des Herzens wurde dieses unter Durchtrennung der Vv. cavae und der Aorta distal der Kanülierungsstelle entnommen, innerhalb von vier Minuten an die Langendorffapparatur (Abb.1) angeschlossen und mit warmer, oxygenierter KHKan-Lösung (Tab.1) perfundiert (2.3.1).

2.1.2 Koronarien von Hausschweinen

Die Untersuchung des Einflusses von Aprotinin auf die endothelabhängige Dilatation der großen Koronararterien wurde an Herzen frisch geschlachteter Hausschweine aus dem Kölner Schlachthof (Fa. FVK GmbH) durchgeführt. Die Tiere sind zum

Zeitpunkt der Schlachtung zwischen 100 - 120 kg schwer und 5 – 7 Monate alt. Die Herzen wurden während des Schlachtvorganges entnommen und der Ramus interventricularis der linken Herzkranzarterie sofort mit 0 - 4°C kalter, oxygenierter Krebs-Henseleit-Lösung (KHs, Tab.1) frei gespült, grob frei präpariert und in der KHs- Lösung zum Institut für experimentelle Medizin der Universität zu Köln transportiert.

2.2 Verwendete Lösungen

Bestandteile KHkan KHK+ KHs

Na²⁺ 143,10 mmol/l 143,10 mmol/l 143,10 mmol/l

K⁺ 5,90 mmol/l 20,00 mmol/l 5,90 mmol/l

Ca²⁺ 1,80 mmol/l 1,80 mmol/l 1,60 mmol/l

Mg²⁺ 1,30 mmol/l 1,30 mmol/l 1,20 mmol/l

Cl^- 122,80 mmol/l 136,90 mmol/l 126,00 mmol/l

HCO3

- 25,00 mmol/l 25,00 mmol/l 25,00 mmol/l

H2PO4

- 1,20 mmol/l 1,20 mmol/l 1,20 mmol/l

SO4

2- 1,30 mmol/l 1,30 mmol/l 1,20 mmol/l

Glucose 11,11 mmol/l 11,11 mmol/l 5,10 mmol/l

Insulin (Insuman^® Rapid,

Hoechst Marion Roussel) 1,00 I.E./l

Tabelle 1: Zusammensetzung der Krebs-Henseleit-Lösungen für die Reperfusion des Kaninchenherzens an der Langendorffapparatur (KH_kan) für die Kardioplegie (KH_K+) und für die Inkubation der Schweinekoronarien KH_s

2.2.1 Reperfusionslösung (KHkan ):

Als Reperfusionslösung für die Langendorffapparatur wurde eine Krebs-Henseleit- Lösung mit dem typischem Ca²⁺-Gehalt des Kaninchenplasmas von 1,80 mmol/l benutzt. Die Lösung wurde auf 38,5 °C erwärmt und mit Carbogen (Carbogen: 95%

Sauerstoff und 5% Kohlendioxid; Fa. Linde AG, TC, Höllriegelskreuth, Deutschland)

so begast, dass ein Sauerstoff-Partialdruck (pO2) von >550 mmHg und ein pH-Wert von 7,4 erreicht werden konnten. Dies konnte durch frequente Messungen am Radiometer (ABL 150 und EML 105, Radiometer-Copenhagen, Dänemark) überprüft werden. Insulin wurde erst kurz vor Verwendung der Lösung zugegeben.

2.2.2 Kardioplegische Lösung (KHK+):

Für die Stilllegung des Herzens wurde die Krebs-Henseleit-Lösung KHkan, (jetzt als KHK+ bezeichnet) zusätzlich mit Kalium-Chlorid (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland) auf 20 mmol/l K⁺ eingestellt, auf Eiswasser gekühlt und mit Carbogen (Carbogen:

95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid; Fa. Linde AG, TC, Höllriegelskreuth, Deutschland) gesättigt.

2.2.3 Inkubationslösung (KHs):

Die Inkubationslösung für die Schweinekoronarien entsprach in der Zusammen- setzung der speziestypischen Plasmakonzentration. Die Lösung wurde für die Messungen am Lever Transducer (siehe 2.3.2) auf 38°C erwärmt und mit Carbogen (Carbogen: 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid; Fa. Linde AG, TC, Höllriegelskreuth, Deutschland) auf einen Sauerstoffpartialdruck (pO2) von >550 mmHg und ein pH-Wert von 7,4 gebracht.

2.3 Untersuchung der entnommenen Organe

2.3.1 Perfusion der Kaninchenherzen an der Langendorffapparatur

Zur initialen vollständigen Eröffnung der koronaren Kapillaren wurde mittels Schwerkraftperfusion in der ersten Minute durch Verwendung eines 102 cm hohen Steigrohres ein Druck von 75 mmHg erzeugt. Für die weitere Perfusionsdauer wurde durch Reduktion der Steigrohrhöhe auf 68 cm der Perfusionsdruck auf 50 mmHg eingestellt. Ausgehend von einem mit zwei Liter KHkan-Lösung gefüllten Vorratsgefäß

wurde die Lösung mittels einer Schlauchpumpe (Masterflex^, Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, U.S.A.) durch einen schlangenförmigen Wärmeaustauscher mit Windkessel aus Glas befördert. Dieser befand sich kurz vor dem Herzen und sicherte einen normothermen Zustand der Lösung bei Eintritt in die Aorta sowie eine Dämpfung der durch die Pumpe verursachten Druckschwankungen. Mehrere Filter (Schwarzrandfilter, FP 30/5,0 CN Filtereinheit, 5,0 m, Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) sicherten, dass keine Partikel mit einer den Kapillardurchmesser überschreitenden Größe aus dem Pumpenschlauchabrieb oder Salzkristalle die Koronargefäße obstruierten.

Abb. 1: Langendorffapparatur

Über die Aortenkanüle gelang das Perfusat in das koronare Widerstandsystem. Die Flüssigkeitsmenge, die pro Minute die Koronargefäße durchströmte (der so genannte

Flow, Einheit: ml/min), wurde von einem vor die Aorta geschalteten Flowsensor (Transonic^ Flowprobe; Transonic Systems Inc., U.S.A.) registriert, das Signal über einen Verstärker (TTFM-SA Typ 700; Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland) an einen Schreiber (Graphtec Linearcorder WR 3310, Fa. Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland) geleitet und kontinuierlich aufgezeichnet (Abb.3). Da der Flowsensor durch den Hersteller auf den Durchfluss von Blut geeicht war, mussten die mit KHkan-Lösung erzielten Ergebnisse für die Auswertungen um den in Eichversuchen ermittelten Faktor 1,1 reduziert werden.

Um alle vom Herzen ausgeworfene Flüssigkeit ohne Volumenverlust wieder in die Rezirkulation leiten zu können, wurde ein PVC-Röhrchen mit einem anhängenden gebogenen Stück Infusionsschlauch (Abb.2) in die A. pulmonalis eingesetzt.

Abb. 2: Detaildarstellung eines Kaninchenherzens an der Langendorffapparatur

Durch das linke Herzohr wurde ein Latexballon (Größe 12, Vol. 1,3 ml, 12x17mm;

Hugo Sachs Elektronik, March, Deutschland) in den linken Ventrikel vorgeschoben (Abb.2), der mit einem Druckaufnehmer (P23 Db Drucktransducer; Hugo Sachs Elektronik, March, Deutschland) verbunden war. Mit diesem konnte der linksventrikuläre Druck (LVP, Einheit: mmHg) festgestellt und durch einen Brückenverstärker mit Differenzierer (HSE Model 336; Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Deutschland) verstärkt werden. Die Druckveränderungen pro Zeiteinheit (dp/dt, Einheit: mmHg/sec) als erste Ableitung des linksventrikulären Drucks wurden parallel errechnet. Ein EKA-Puls-Messgerät (EKA-Puls; Fa. Hugo Sachs Elektronik, Hugstetten, Deutschland) ermittelte die Herzfrequenz (Herzschläge/Minute). Alle Daten wurden von dem oben beschriebenen Schreiber kontinuierlich aufgezeichnet.

Der Ballon wurde bis zum Erreichen eines enddiastolischen Druckes von 10 mmHg mit Aqua injectabile gefüllt. Neben den Latexballon wurde ein Entlastungskatheter, ein so genannter Vent (3 cm Intravenous Catheter (PUR) Ø 1,0 –1,5 mm G.17; Fa.

VYGON, Ecouen, Frankreich) eingebracht (Abb. 2), über welchen ein eventueller insuffizienter Aortenklappenschluss diagnostiziert und der damit einhergehenden Überdehnung des Ventrikels entgegengewirkt werden konnte.

Mittels Venenpunktionsbesteck (W.I.N. 25G, Abbott, Ireland, Rep. Of Ireland) und Perfusor wurden endothelabhängige vasoaktive Substanzen für jeweils eine Minute oberhalb des Flowsensors dem Herzen zugeführt (Abb.1). Sodiumnitroprussid (Konzentration siehe Tab.2) als endothelunabhängiger Vasodilatator wurde eineinhalb Minuten lang infundiert, da nach einer Minute noch keine konstante Flowveränderung erreicht war. Zum Erreichen einer von der aktuellen Durchflussrate unabhängigen definierten Endkonzentration wurde die infundierte Menge jeweils auf der Grundlage des Basisflows berechnet.

Die Substanzen wurden von folgenden Herstellern bezogen: Substanz P und Serotonin von der Firma Fluka Chemie GmbH (Neu-Ulm, Deutschland), Bradykinin,

Acetylcholin und Sodiumnitroprussid von der Firma Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Deutschland).

Wirkung Substanzen Abkür- zung

Konzentration der Stamm-

lösung

Infusion pro Minute und pro ml Basis-

perfusatflow

Konzentration im Perfusat

Substanz P SP 10,0 mol/l 0,500 l 1 x 10^-8 M

Bradykinin B 0,1 mmol/l 0,500 l 1 x 10^-7 M

Serotonin S 1,0 mmol/l 0,500 l 1 x 10^-6 M

Ach0,01 0,3 mmol/l 0,017 l 1 x 10^-8 M Ach_0,03 0,3 mmol/l 0,050 l 3 x 10^-8 M Ach0,1 0,3 mmol/l 0,167 l 1 x 10^-7 M Endothel-

abhängige Gefäß- Dilatatoren

Acetylcholin

Ach0,3 0,3 mmol/l 0,500 l 3 x 10^-7 M Endothel-

unabhängiger Gefäß- Dilatator

Sodium-

nitroprussid SNP 1,0 mmol/l 0,500 l 1 x 10^-6 M

Tabelle 2: Verwendete vasoaktive Substanzen für das Langendorffsystem

Um zu verhindern, dass die Substanzen rezirkulierten, wurde mit Beginn ihrer Infusion über zwei Minuten lang die Flüssigkeit, die aus dem Herzen kam, umgeleitet und verworfen (Abb.1). Vor der Zugabe der verschiedenen Substanzen musste jeweils ein stabiler Basisflow erreicht werden. Die Wirkung der Substanzen auf die koronaren Gefäße ließ sich anhand von Flowveränderungen feststellen: Eine Flowsteigerung erzeugte eine Vasodilatation, eine Flowsenkung wies auf eine Vasokonstriktion hin.

Jede Reperfusion begann mit der Kontrollgruppe. Es wurden der Reihenfolge nach die Wirkung von Substanz P, Bradykinin, Serotonin, Sodiumnitroprussid und Acetylcholin auf die koronaren Gefäße getestet (Konzentrationen siehe Tab. 2). Um zeitliche Veränderungen berücksichtigen zu können, wurde Substanz P am Ende eines Kontrolldurchganges erneut getestet (Abb. 3). Der Kontrollgruppe folgte die Untersuchung der Wirkung von 250 KIE/ml Aprotinin (A250) auf das Koronarsystem.

Hierfür wurde der Vorratsbehälter bis zur 1950 ml Markierung mit einer KHkan-Lösung aufgefüllt, die bereits auf 38,5°C erwärmt und mit Carbogen begast war. Nun wurden 50 ml Trasylol^ (entsprechen 500 000 KIE Aprotinin in 50 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung) zugesetzt und nacheinander Substanz P, Bradykinin und Sodiumnitroprussid in der Kontrolle entsprechenden Art und Konzentration getestet.

Anschließend wurde die Wirkung von 1000 KIE/ml Aprotinin (A1000) untersucht.

Hierzu wurden von der 250 KIE/ml Aprotinin enthaltenden Lösung 1847 ml (also mit 461 750 KIE Aprotinin) verwendet und mit 154,3 ml Trasylol^ (entsprechen 1 543 000 KIE Aprotinin) versetzt. Somit konnte eine Konzentration von 1000,4 KIE/ml Aprotinin erreicht werden. Die fünf vasoaktiven Substanzen der Tabelle 1 wurden ebenfalls entsprechend der Kontrollgruppe getestet. Der dabei entstandene Kalziumabfall wurde umgehend auf 1,8 mmol/l Ca²⁺ ausgeglichen.

Abb. 3: Registrierung des koronaren Flows

Alle quantitativen Angaben werden als Mittelwert  Standardabweichung angegeben.

Kontrolle A250 A1000

ml/min 70

Zeit 

60 50

SP B S SNP Ach SP SP B SNPSP B S SNP Ach

2.3.2 Messung der Funktion der Schweinekoronarien

Die Koronararterien des Schweines wurden im Institut für experimentelle Medizin der Universität zu Köln vorsichtig von überflüssigem Bindegewebe befreit und in 5 mm lange Ringe unterteilt. Hierbei wurde darauf geachtet, dass keine mechanischen Endothelschäden entstanden. Zur Registrierung ihrer Funktion wurden die Ringe jeweils zwischen zwei triangelförmige Gefäßhalter aus Stahldraht in eine Apparatur (Abb.4) eingespannt. Sie waren somit einerseits am Boden des Organbades fixiert und andererseits mit einem 2g beschwerten, balkenförmigen Wegaufnehmer (Lever Transducer B 40 Type 373; Hugo Sachs Electronic, March, Deutschland) verbunden.

Abb. 4: Versuchsaufbau zur Messung der Funktion der Schweinekoronarien

In den Organbädern befanden sich je 10 ml einer KHs-Lösung (Tab.1), die durch eine Wärmepumpe (Wärmepumpe: Haake, Typ N3, Deutschland) auf 38°C erwärmt wurde. Je nach Zugabe der verschiedenen vasoaktiven Substanzen (Tab.3) kam es zur isotonischen Kontraktion oder Dilatation der Koronarringe.

Die Substanzen wurden von folgenden Firmen bezogen: N^G-Nitro-L-Arginin, Papaverin und Indomethacin von der Firma Sigma-Aldrich GmbH (Steinheim, Deutschland), Kaliumchlorid von der Firma Merck (Darmstadt, Deutschland), Substanz P von der Firma Fluka Chemie GmbH (Neu-Ulm, Deutschland) und Prostaglandin F2 (Dinolytic^) von der Firma Pharmacia GmbH (Erlangen, Deutschland).

Wirkung Substanzen Abkür- zung

Konzentration in der Stammlösung

Zugaben in das Organbad

Konzentration im Organbad

Kontraktion durch depolarisierende

Wirkung an glatten Muskelzellen

Kalium-Chlorid KCl 2,4 mol/l 250 l 60 mmol/l

Hemmung der Prostazyklin-

Synthese Indomethacin Indo 10,0 mmol/l 10 l 10 mol/l

Kontraktion Prostaglandin

F2 PGF2 14,3 mmol/l 7 l 10 mol/l

endothel- abhängige

Dilatation

Substanz P SP 10,0 mol/l 10 l 10 nmol/l

Kontraktion N^G-Nitro-L-

Arginin L-NNA 50,0 mmol/l 60 l 300 mol/l

Dilatation über Wirkung an

glatten Muskelzellen

Papaverin Pap 62,5 mmol/l 32 l 200 mol/l

Tabelle 3:

Verwendete kontraktive und dilatative Substanzen für die Schweinekoronarien

Die bei der Verwendung von Substanz P oder N^G-Nitro-L-Arginin möglichen Effekte des Lösungsmittels können ausgeschlossen werden, da hier lediglich destilliertes Wasser als Lösungsmittel Verwendung fand. Auch der Verdünnungseffekt ist bei Mengen von 10 l bzw. 60 l in einem Gesamtvolumen von 10 ml im Organbad zu vernachlässigen.

Jede Reaktion der Koronararterien wurde von dem Wegaufnehmer über einen Verstärker (Transducer-Amplifier Module Type 705/1; Hugo Sachs Electronic, March, Deutschland) auf einen Kompensationsschreiber (Multi-Pen Recorder; Rikadenki Kogyo Co. Tokyo, Japan) übertragen und kontinuierlich aufgezeichnet (Abb.5). An einem Koronarring wurde zunächst die Kontraktionsfähigkeit der glatten Muskelzellen durch Zugabe von 250 l Kaliumchlorid (Tab.3) überprüft. Durch dreimaliges Auswaschen (wash-out) der Pharmakon enthaltenden Organbadlösung mit der KHs- Lösung (Tab.1), konnte ein stabiles Gleichgewicht (steady state) der Gefäßdehnung erreicht werden. Anschließend wurde ein Kontrollgang durchgeführt.

Abb. 5: Aufzeichnung der koronaren Kontraktion und Dilatation in KHs-Lösung mit und ohne Anwesenheit von 300 mol/l N-Nitro-L-Arginin

Dieser begann mit der Zugabe von Indomethacin, um dem Einfluss von Prostazyklinen entgegenzuwirken. Mit Prostaglandin F_2 wurde eine Kontraktion des Arterienringes provoziert. Zum Zeitpunkt der stärksten Kontraktion, die sich auf ein gleich bleibendes Niveau einstellte, wurde mit Substanz P eine endothelabhängige Dilatation erzeugt. Ein Durchgang endete immer mit dem Erreichen des

Fließgleichgewichts nach dreimaligem Auswaschen. Um die Wirkung von Aprotinin beurteilen zu können, wurde nach der Zugabe von Indomethacin entweder 500 l Trasylol^ (entsprechen 5000 KIE Aprotinin) dem Organbad zugeführt und damit eine Konzentration von 500 KIE/ml erreicht (As-500) oder 1000 l Trasylol^ (entsprechen 10 000 KIE Aprotinin), um eine Konzentration von 1000 KIE/ml zu erzielen (As-1000).

Die Ringe der As-500 Gruppe wurden für 15 Minuten, die der As-1000-Gruppe für 30 Minuten lang inkubiert. Die anschließende Reaktion auf Prostaglandin F2 und Substanz P gab Aufschluss über die endothelabhängige Dilatationsfähigkeit unter Aprotinineinfluss. Die verschiedenen Konzentrationen von Aprotinin wurden richteten sich nach den in der Klinik gebräuchlichen Dosierungen (Hardy und Desroches, 1991) sowie nach Studien von Ülker et al. (2001), Hill et al. (1997) und Bruda et al.

(1998) (vgl. 4.3.9 auf S 57).

Um beurteilen zu können, inwiefern die endothelabhängige Dilatation auf eine Stickstoffmonoxidproduktion zurückzuführen ist, wurde bei einigen Ringen nach dem ersten Kontrolldurchlauf eine weitere Kontrolle mit N^G-Nitro-L-Arginin (L-NNA- Kontrolle), anschließend ein Durchlauf mit gleichzeitiger Inkubation von N^G-Nitro-L- Arginin 1000 KIE/ml Aprotinin (L-NNA+As-1000) und schließlich eine zweite L-NNA- Kontrolle durchgeführt. Ein Versuch wurde beendet, indem ein Ring jeweils mit Papaverin zur maximalen Dilatation gebracht wurde.

Alle quantitativen Angaben werden als Mittelwert  Standardabweichung der jeweiligen Gruppe angegeben.

2.4. Versuchsauswertung

Alle Daten wurden mit dem Tabellenkalkulationsprogramm „Framework“ bearbeitet und Mittelwert sowie Standardabweichung berechnet.

Für die statistische Auswertung wurde das Programm „Primer of Biostatics (3.

Edition, Glantz SA, Mc Graw-Hill, Singapore 1992) benutzt. Zuerst wurde eine Varianzanalyse durchgeführt, dem sich der Student-Newman-Keuls-Test anschloss.

Eine Signifikanz wurde bei p< 0,05 angenommen.

Die Erstellung der Tabellen erfolgte mit dem Programm „Excel“. Die Abbildungen wurden in dem Macintoshprogramm „Quark“ und „Photoshop“ erstellt.

3 Ergebnisse

3.2 Kaninchenherzen

3.1.1 Organentnahme

Vom Zeitpunkt des Operationsbeginns bis zum Beginn der hypothermen Kardioplegie vergingen im Mittel 40,9  4,9 Minuten (n=7). Von Beginn der hypothermen Kardioplegie an bis zum Herzstillstand dauerte es 47,4  18,0 Sekunden (n=7). Für die Kardioplegie wurden 43,6  10,0 ml (n=7) der kardio- plegischen Lösung bei einer mittleren Perfusionsgeschwindigkeit von 1,0  0,3 ml/sec (n=7) benötigt. Bis zum erneuten Schlagen des Herzens an der Langendorff- apparatur vergingen 3,7 ± 0,8 Minuten.

3.1.2 Perfusion der Kaninchenherzen an der Langendorffapparatur

Sieben Kaninchenherzen konnten ohne technische Störungen untersucht werden.

Sie wurden 336,4 ± 95,6 Minuten lang an der Langendorffapparatur reperfundiert (n=7). Vom Anschluss an die Apparatur bis zum Beginn der Messungen vergingen durchschnittlich 83,5 ± 24,5 Minuten (n=7). In dieser Zeit wurde das Herz im Detail präpariert (siehe Abb.2). Ein Kontrolldurchgang dauerte 111,4 ± 32,4 Minuten, wobei in Versuch 2 und 7 im Anschluss an den ersten Kontrolldurchgang ein zweiter folgte, der 69,5 ± 36,1 Minuten dauerte (n=2). Für die Gruppe A250 wurden 76,8 ± 40,3 Minuten benötigt (n=6). Der A1000-Durchgang dauerte im Mittel 88,5 ± 17,1 Minuten lang (n=6). Ab Versuch 3 wurden die Aprotininkonzentrationen 250 KIE/ml und 1000 KIE/ml immer nacheinander untersucht.

3.1.3 Sauerstoffpartialdruck (pO2):

Im rezirkulierenden System der Langendorffapparatur konnte der pO2 in der KHKan

bereits zu einem frühen Zeitpunkt des Kontrolldurchgangs über 550 mmHg gebracht werden. Lediglich bei Versuch 1 lag der pO2 zu Beginn unter 500 mmHg.

Nach dem Einstellen der KHKan auf Aprotinin stieg der pO2 bei allen Versuchen leicht an (vgl. Tab. 4). Im Folgenden werden in den Tabellen die Abkürzungen „MW“ für den Mittelwert, „SD“ für die Standardabweichung und „n“ für die Anzahl der Versuche benutzt.

pO2

Vers.-Nr. frühe Kontrolle späte Kontrolle A250 A1000

1 483,2 484,4 --- 573,0

2 600,2 612,3 630,8 ---

3 601,3 615,9 638,0 639,8

4 558,2 592,2 620,4 609,4

5 581,2 567,5 616,9 644,5

6 564,9 527,4 597,4 593,5

7 571,4 575,6 607,4 594,9

MW 565,8 567,9 618,5 609,2

SD 40,0 47,5 14,9 28,1

n 7 7 6 6

Tabelle 4: pO2 der KHKan in mmHg gemessen zu einem frühen und einem späten Zeitpunkt des Kontrolldurchgangs sowie unmittelbar nach Zugabe von 250 KIE/ml und 1000 KIE/ml Aprotinin

3.1.4 pH-Wert

pH-Wert

Vers.-Nr. frühe Kontrolle späte Kontrolle A250 A1000

1 7,57 7,53 --- 7,44

2 7,48 7,47 7,46 ---

3 7,49 7,47 7,46 7,43

4 7,51 7,50 7,48 7,44

5 7,5 7,51 7,49 7,45

6 7,54 7,57 7,50 7,46

7 7,51 7,48 7,49 7,47

avg 7,51 7,50 7,48 7,45

S.D. 0,03 0,04 0,02 0,01

n 7 7 6 6

Tabelle 5: pH-Wert der KHKan gemessen zu einem frühen und einem späten Zeitpunkt des Kontrolldurchgangs sowie unmittelbar nach Zugabe von 250 KIE/ml und 1000 KIE/ml Aprotinin

3.1.5 Veränderung der Elektrolytzusammensetzung der KHKan-Lösung durch den Zusatz von Aprotinin

Bei der Einstellung der unterschiedlichen Konzentrationen von Aprotinin während des Langendorffexperiments kam es zu einer signifikanten Verdünnung der Glukose- und der Kaliumkonzentration. So verdünnte sich der Glukosegehalt von anfangs 10,8

 0,4 mmol/l (n=7) unter A250 auf 10,2 ± 0,4 mmol/l (n=6) und bei einer Aprotininkonzentration von 1000 KIE/ml auf 8,9 ± 0,6 mmol/l (n=6). Kalium fiel von 5,5 ± 0,0 mmol/l (n=7) in der Kontrolle auf 5,4 ± 0,0 mmol/l unter A250 (n=6) und auf 5,0 ± 0,0 mmol/l in der A1000-Gruppe (n=6). In dem handelsüblichen Produkt Trasylol^ sind außer Aprotinin nur noch 0,9 prozentige sterile Kochsalzlösung enthalten. Andere Angaben sind von der Fa. Bayer nicht deklariert. Entsprechend fiel der von uns gemessene Kaliumgehalt in Abhängigkeit vom gegebenen Trasylol- Volumen um bis zu 10% ab (in der höchsten Konzentration). Der durch die Zugabe von Aprotinin entstandene Kalziumabfall wurde sofort korrigiert, sodass die Kalziumkonzentration sich stetig auf 1,8 mmol/l belief.

3.1.6 Funktionsprüfung

Die Funktion des kapillären Widerstandsystems am Kaninchenherzen wurde an Hand verschiedener Parameter bewertet. Der so genannte Flow, welcher das Volumen in ml bezeichnet, welches pro Minute das Gefäßsystem des Kaninchenherzens durchströmte, diente zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit des Endothels und der glatten Gefäßmuskulatur. Im Besonderen wurde hier der Basisflow als stabiles Durchflussniveau, welcher vor und nach der Gabe der verschiedenen Substanzen wieder erreicht wurde, im Zeitverlauf betrachtet. Der Flowanstieg bzw. der Flowabfall wurde berechnet, indem der höchste bzw. niedrigste Wert des Flows, der sich nach Zugabe der verschiedenen Substanzen einstellte, von dem des Basisflows vor der jeweiligen Substanz subtrahiert wurde. Ein Flowanstieg kennzeichnete eine Gefäßdilatation, ein Flowabfall wies auf eine Kontraktion hin. Der maximale Flow stellte den Wert der höchsten Durchflussrate dar, der minimalste

Um den Verlauf des Basisflows während eines Experimentes beurteilen zu können, wurde der Flow direkt vor der Zugabe von Substanz P zu verschiedenen Zeitpunkten betrachtet. Dies geschah am Anfang (Minute 0) und am Ende (Minute 106,2 ± 37,9;

n=7) eines Kontrolldurchganges sowie am Anfang des A250-Durchgangs (Minute 167,2 ± 69,7; n=6) und der A1000-Gruppe (Minute 199,0 ± 71,2; n=6).

Der Basisflow sank stetig im Verlauf der Zeit in der Kontrolle von anfänglichen 60,26

± 7,4 ml/min (n=7) auf 53,0 ± 8,5 ml/min (n=7). Unter 250 KIE/ml Aprotinin erreichte er 51,1 ± 8,2 ml/min (n=6) und unter A1000 48,5 ± 7,5 ml/min (n=6). Im Student- Newman-Keuls-Test zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen.

frühe Kontrolle Kontrolle A250 A1000

MW 63,5 54,2 51,8 50,7

SD 6,9 10,0 9,8 9,5

SP

n 5,0 5,0 5,0 4,0

MW --- 57,4 52,6 51,8

SD --- 7,3 4,9 10,2

B

n --- 6,0 5,0 5,0

MW --- 58,3 --- 50,9

SD --- 5,7 --- 11,1

S

n --- 6,0 --- 6,0

MW --- 57,3 54,1 49,0

SD --- 6,5 4,5 8,3

SNP

n --- 6,0 4,0 6,0

MW --- 57,1 --- 51,7

SD --- 5,4 --- 11,6

ACH0,01

n --- 6,0 --- 6,0

MW --- 57,4 --- 51,7

SD --- 5,3 --- 12,2

Ach0,03

n --- 6,0 --- 6,0

MW --- 55,6 --- 52,1

SD --- 5,7 --- 11,6

Ach0,1

n --- 6,0 --- 6,0

MW --- 54,4 --- 55,6

SD --- 4,6 --- 13,5

Ach0,3

n --- 5,0 --- 5,0

Tabelle 6: Basisflow unmittelbar vor Zugabe der einzelnen Substanzen in ml/min.

Bezogen auf den Basisflow unmittelbar vor der Zugabe der einzelnen Substanzen wurde eine generelle Basisflowsenkung von anfangs 63,5  6,9 ml/min (erster gemessener Wert, n=5) bis auf 55,6  13,5 ml/min (letzter gemessener Wert, n=5) ermittelt (vgl. Tab. 6). Hiervon abweichend verhielt sich nur Versuch 2 (siehe Abb.6).

3.1.7.2 Flowanstieg und Flowabfall

Ausgenommen Acetylcholin (Tab.7), provozierten alle Substanzen eine Flowsteigerung. Dies war unabhängig von der Anwesenheit von Aprotinin.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

frühe Kontrolle späte Kontrolle A 250 A 1000 m l/m in

Basisflow Flowanstieg

Abbildung 7: Flowanstieg unter Substanz P-Einfluss im Vergleich zum Basisflow zu Beginn der Kontrolle (n=5), sowie unter 250 KIE/ml (n=5) und unter 1000 KIE/ml (n=4) Aprotinineinfluss. Mittelwert  Standardabweichung des Flowanstiegs.

= p < 0,05 gegenüber dem Flowanstieg der anderen Gruppen.

*

*

Die Zugabe von 10 nmol/l Substanz P bewirkte eine Flowsteigerung von 8,5 ± 3,1 ml/min am Anfang und 16,3 ± 4,5 ml/min am Ende des Kontrolldurchganges (n=5). In der A250-Gruppe bewirkte Substanz P einen Flowanstieg von 18,9 ±7,7 ml/min (n=5) und in der A1000-Gruppe von 19,3 ± 3,8 ml/min (n=4). Im Student-Newman-Keuls–

Test ist der Flowanstieg der frühen Kontrolle gegenüber den späteren Messungen signifikant niedriger. Der maximale Flow blieb hierbei weitgehend konstant (Abb.7).

Unter der Einwirkung von 100 nmol/l Bradykinin stieg der Flow in der Kontrolle um 13,0  2,5 ml/min (n=6), in der A250-Gruppe veränderte sich der Flow um 19,6  6,9 ml/min (n=5) und unter A1000 kam es zu einem Flowanstieg von 19,3  4,8 ml/min (n=5). Im Mehrgruppen-Vergleich konnten keine Signifikanzen festgestellt werden.

Auch hier blieb der maximale Flow weitgehend konstant (Abb. 8).

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0

K o n tro lle A 2 50 A 1 0 0 0

m l/m in

B a s is flo w F lo w a n s tie g

Abbildung 8: Flowanstieg unter Bradykinin-Einfluss im Vergleich zum Basisflow (n=6), mit 250 KIE/ml Aprotinin (n=5) und mit 1000 KIE/ml Aprotinin (n=5). Mittelwert  Standardabweichung des Flowanstiegs.

Mit 1 mol/l Serotonin ließen sich eine Flowsteigerung von 8,6  2,4 ml/min (n=6) in der Kontrolle und unter A1000 einen Flowanstieg von 10,2  4,7 ml/min (n= 6) provozieren. Es gab keine signifikanten Unterschiede (Abb. 9).

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0

K o n t r o l l e A 1 0 0 0 m l / m i n

B a s i s f l o w F l o w a n s t i e g

Abbildung 9: Flowanstieg unter Serotonin-Einfluss im Vergleich zum Basisflow.

Kontrolle (n=6) und mit 1000 KIE/ml Aprotinin (n=6). Mittelwert  Standardabweichung des Flowanstiegs.

Nach der Sodiumnitroprussidzugabe kam es in der Kontrollgruppe zu einem Flowanstieg von 9,2  3,2 ml/min (n=6), unter A250 von 14,5  2,7 ml/min (n=4) und unter A1000 von 12,4  4,9 ml/min (n=6). Es fällt ein leicht verstärkter Flowanstieg in der A250-Gruppe auf, jedoch ergaben sich im Mehrgruppenvergleich keine Signifikanzen. Der Basisflow sank im Zeitverlauf stetig geringradig ab (Abb. 10).

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Kontrolle A 250 A 1000

ml/min

Basisflow Flowanstieg

Abbildung 10: Flowanstieg unter Sodiumnitroprussid-Einfluss im Vergleich zum Basisflow (n=6), sowie mit 250 KIE/ml Aprotinin (n=4) und mit 1000 KIE/ml Aprotinin (n=6). Mittelwert  Standardabweichung des Flowanstiegs.

Die Flowsteigerung von Acetylcholin war dosisabhängig: Die maximale Vasodilatation erreichte man mit 0,01 mol/l Acetylcholin. Je stärker man Acetylcholin konzentrierte, desto schwächer fiel der Flowanstieg aus. In der Einzelbetrachtung kam es bei einer Konzentration von 0,03 mol/l Acetylcholin in Versuch 5 zu einem schwachen Flowabfall (siehe Tab. 7), welcher sich bei einer Konzentration von 0,1mol/l Acetylcholin noch verstärkte. In der höchsten benutzen Acetylcholinkonzentration von 0,3 mol/l konnte auch im Mittel ein deutliches Absinken des Basisflows beobachtet werden. Vergleicht man die Kontrollgruppen von Acetylcholin mit denen von Substanz P und Bradykinin, fiel die durch Acetylcholin maximal induzierbare Flowveränderung im Mittel signifikant niedriger aus. Die durch 0,3 mol/l Acetylcholin verursachte Flowsenkung in der Kontrolle

unterschied sich signifikant von allen durch die anderen vasodilatativen Substanzen provozierten Flowsteigerungen.

Im Mehrgruppenvergleich der A1000-Gruppe wird deutlich, dass Substanz P und Bradykinin einen signifikant höheren Flowanstieg als Acetylcholin jedwelcher Konzentration provozieren. Der durch Serotonin und Sodiumnitroprussid induzierte Flowanstieg unterschied sich signifikant von der durch 0,3 mol/l Acetylcholin verursachten Flowsenkung. Betrachtet man die durch Acetylcholin in den verschiedenen Konzentrationen verursachten Flowveränderungen untereinander, konnten in der A1000 Gruppe keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden.

In einer Konzentration von 0,3 mol/l Acetylcholin kam es jedoch zu einem signifikanten Flowabfall in der Kontrolle im Vergleich zu den Kontrollgruppen mit einer niedrigeren Acetylcholinkonzentration.

maximale Flowveränderungen

0,01 mol Ach 0,03 mol Ach 0,1 mol Ach 0,3 mol Ach

Vers.-

Nr.: Kontrolle A1000 Kontrolle A1000 Kontrolle A1000 Kontrolle A1000

1 4,6 0,9 3,6 3,6 5,5 6,4 4,5 5,5

2 --- --- --- --- --- --- --- ---

3 0,9 3,6 2,7 0,0 6,4 0,9 1,8 2,7

4 2,7 1,8 1,8 1,8 2,7 12,7 --- ---

5 15,5 1,8 -1,8 -2,7 -7,3 -15,0 -21,8 -29,1

6 2,7 3,6 1,8 3,6 2,7 3,6 -11,8 -3,6

7 0,0 0,9 2,7 8,2 1,8 0,0 -3,6 -7,3

MW 4,4 2,1 1,8 2,4 2,0 1,4 -6,2 -6,4

SD 5,6 1,2 1,9 3,7 4,9 9,3 10,7 13,7

n 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 5,0 5,0

Tabelle 7: maximale Flowveränderungen unter Acetylcholineinfluss in der Einzelbetrachtung.

3.1.7.3 Maximale Flowveränderung

Als maximale Flowveränderung bezeichneten wir den maximal erreichten Wert des Flows nach Zugabe einer Substanz. Nach Zugabe von 0,3 mol/l Acetylcholin kam es zu einer Flowsenkung (vgl. Tab. 7).

In den Kontrollen unterschied sich die durch Gabe von 0,3 mol/l Acetylcholin maximal erreichte Flowveränderung signifikant von dem der anderen Substanzen.

Signifikante Unterschiede waren auch zwischen der maximalen Flowveränderung nach Substanz P1-Gabe und der maximalen Flowveränderung nach Gabe von 0,1

mol/l Acetylcholin zu vermerken. Innerhalb der A250-Gruppe gab es keine signifikanten Unterschiede bezüglich der maximalen Flowveränderung. Unter Einfluss von 1000 KIE/ml Aprotinin lag die durch 0,3 mol/l Acetylcholin erzeugte maximale Flowveränderung signifikant unter der durch Bradykinin ausgelösten maximalen Flowveränderung.

Kontrolle A250 A1000

MW SD n MW SD n MW SD n

SP1 72,0 7,1 5 70,7 7,0 5 70,0 13,2 4

B 70,4 8,9 6 72,2 8,0 5 71,1 9,9 5

S 67,0 6,0 6 --- --- -- 61,1 11,1 6

SNP 66,5 7,3 6 68,6 6,0 4 61,4 12,7 6

Ach0,01 61,5 9,7 6 --- --- -- 53,8 11,2 6

Ach0,03 59,3 4,1 6 --- --- -- 54,8 12,2 6

Ach0,1 57,6 3,7 6 --- --- -- 52,0 6,8 6

Ach0,3 48,2 7,7 5 --- --- -- 49,3 5,8 5

SP2 70,5 8,4 5 --- --- -- --- --- -- Tabelle 8: Übersicht der maximalen Flowveränderung nach Zugabe der Substanzen.

Mittelwert  Standardabweichung.

3.1.8 Linksventrikuläre Druckamplitude (LVP)

Die linksventrikuläre Druckamplitude, betrachtet zum Zeitpunkt unmittelbar vor Substanzgabe und bei durch die Substanz verursachten maximalem Flow, sank im Zeitverlauf kontinuierlich geringfügig ab (Tab. 9). Bei maximalem Flow war die linksventrikuläre Druckamplitude tendenziell höher als die bei initialem Flow. Nach der Gabe von 0,3 mol/l Acetylcholin kam es statt einer Gefäßerweiterung zu einer Vasokonstriktion. Entsprechend dieser Flowverminderung kam es in zwei Versuchen auch zu einer Verringerung der linksventrikuläre Druckamplitude.

frühe Kontrolle Kontrolle A250 A1000

bei initialem Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

MW 98,2 98,2 89,4 92,2 88,4 90,8 85,8 88,5

SD 15,7 15,2 14,1 13,3 13,5 12,9 14,9 12,5

SP

n 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,0 4,0

MW --- --- 98,2 98,7 87,8 89,4 89,4 91,0

SD --- --- 15,3 15,0 13,9 12,6 15,9 14,5

B

n --- --- 6,0 6,0 5,0 5,0 5,0 5,0

MW --- --- 95,8 96,3 --- --- 87,5 90,7

SD --- --- 15,5 16,0 --- --- 16,1 14,5 S

n --- --- 6,0 6,0 --- --- 6,0 6,0

MW --- --- 94,0 95,0 85,3 88,0 87,3 90,8

SD --- --- 16,9 16,7 15,2 14,0 15,7 14,8

SNP

n --- --- 6,0 6,0 4,0 4,0 6,0 6,0

Tabelle 9: Übersicht der Linksventrikulären Druckamplitude in mmHg vor der Applikation der einzelnen Substanzen und bei durch die Substanzen provozierten maximalem Flow. Mittelwert  Standardabweichung.

0,01 mol/l Ach 0,03 mol/l Ach Vers.-

Nr.: Kontrolle A1000 Kontrolle A1000

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

1 120,0 12,02 102,0 102,0 122,0 122,0 105,0 105,0

2 --- --- --- --- --- --- --- ---

3 88,0 88,0 80,0 80,0 86,0 87,0 80,0 80,0

4 88,0 90,0 78,0 83,0 87,0 89,0 79,0 81,0

5 94,0 94,0 89,0 89,0 94,0 94,0 86,0 92,0

6 74,0 74,0 65,0 68,0 74,0 74,0 64,0 66,0

7 93,0 91,0 108,0 108,0 90,0 90,0 108,0 108,0

MW 92,8 93,2 87,0 88,3 92,2 92,7 87,00 88,67

SD 15,1 15,8 16,0 14,7 16,1 15,9 16,78 16,12

n 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0

0,1 mol/l Ach 0,3 mol/l Ach

Vers.-

Nr.: Kontrolle A1000 Kontrolle A1000

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

bei initialem

Flow

bei maximaler

Flow- veränderung

1 120,0 122,0 103,0 105,0 118,0 120,0 103,0 103,0

2 --- --- --- --- --- --- --- ---

3 86,0 86,0 80,0 82,0 86,0 86,0 80,0 80,0

4 88,0 88,0 79,0 81,0 --- --- --- ---

5 92,0 92,0 86,0 86,0 92,0 83,0 86,0 80,0

6 68,0 70,0 62,0 66,0 70,0 58,0 62,0 72,0

7 77,0 77,0 106,0 106,0 71,0 74,0 106,0 108,0

MW 88,5 89,2 86,0 87,7 87,4 84,2 87,4 88,6

SD 17,7 18,0 16,4 15,4 19,5 22,8 18,0 15,9

n 6,0 6,0 6,0 6,0 5,0 5,0 5,0 5,0

Tabelle 10 und 11: Einzelbetrachtung der Linksventrikulären Druckamplitude in mmHg vor der Applikation von Acetylcholin in den verschiedenen Konzentrationen.

Mittelwert  Standardabweichung.

3.1.9 Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit (dp/dt)

Die Kontraktionsgeschwindigkeit nahm im Verlauf der Versuche ab (siehe Tab. 12).

Die mittlere Kontraktionsgeschwindigkeit aller Versuche betrug 1097,3  58,5 mmHg/sec (n=20). Die Relaxationsgeschwindigkeit des Herzens verminderte sich nur geringfügig im Zeitverlauf. Im Mittel erreichte sie 973,9  37,0 mmHg/sec (n=20).

Es zeigten sich weder für die Kontraktionsgeschwindigkeit noch für die Relaxationsgeschwindigkeit signifikante Veränderungen.

frühe Kontrolle Kontrolle A250 A1000

+dp/dt -dp/dt +dp/dt -dp/dt +dp/dt -dp/dt +dp/dt -dp/dt MW 1223,4 1005,8 1059,8 1014,2 1043,4 1007,6 1072,5 982,2

SD 80,3 228,3 106,2 101,0 92,1 102,5 197,9 147,9

SP

n 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 4,0 4,0

MW --- --- 1207,2 1056 1003,6 1012,4 1110,8 989,4

SD --- --- 155,7 105,5 89,8 107,6 158,6 111,3

B

n --- --- 6,0 6,0 5,0 5,0 5,0 5,0

MW --- --- 1185,5 970,0 --- --- 1082,2 970,3

SD --- --- 160,7 199,9 --- --- 180,6 118,9

S

n --- --- 6,0 6,0 --- --- 6,0 6,0

MW --- --- 1162,5 957,5 1031,3 1001,3 1093,8 970,3

SD --- --- 167,8 201,9 132,8 110,8 161,1 118,9

SNP

n --- --- 6,0 6,0 4,0 4,0 6,0 6,0

MW --- --- 1129,7 950,8 --- --- 1070,5 970,3

SD --- --- 183,4 219,3 --- --- 162,8 118,9

Ach0,01

n --- --- 6,0 6,0 --- --- 6,0 6,0

MW --- --- 1118,3 951,0 --- --- 1081,5 970,3

SD --- --- 199,9 197,9 --- --- 147,2 118,9

Ach_0,03

n --- --- 6,0 6,0 --- --- 6,0 6,0

MW --- --- 1073,2 925,5 --- --- 1067,7 933,3

SD --- --- 206,2 230,6 --- --- 159,8 141,0

Ach0,1

n --- --- 6,0 6,0 --- --- 6,0 6,0

MW --- --- 1048,0 891,2 --- --- 1082,0 947,4

SD --- --- 233,9 240,1 --- --- 145,3 128,8

Ach0,3

n --- --- 5,0 5,0 --- --- 5,0 5,0 Tabelle 12: Übersicht der linken Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit unmittelbar vor der Zugabe der verschiedenen Substanzen. Mittelwert  Standardabweichung.