Effekte spezifischer Milch- und Eidotterkomponenten bei der Konservierung von Hengstsperma
INAUGURAL – DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von Stefanie Volker
Hannover
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Harald Sieme
Klinik für Pferde
Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken
1. Gutachter: Prof. Dr. Harald Sieme
2. Gutachter: Prof. Dr. h.c. Karl Fritz Weitze
Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2011
Ein Beitrag aus dem Virtuellen Zentrum für Reproduktionsmedizin Niedersachsen.
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 11
2 Literaturübersicht ... 13
2.1 Grundlagen der Frischsamenkonservierung 13 2.1.1 Anforderungen an einen Frischsamenverdünner ... 13
2.2 Allgemeine Bestandteile eines Frischsamenverdünners 15 2.2.1 Milch und Milchinhaltsstoffe ... 16
2.2.2 Eidotter ... 21
2.2.3 Synthetisch erzeugte Verdünnerzusätze ... 25
2.2.4 Zucker ... 25
2.2.5 Puffersubstanzen ... 26
2.2.6 Elektrolyte ... 27
2.2.7 Antibiotika ... 28
2.2.8 Membranprotektiva ... 30
2.3 Einflüsse auf die Frischsamenkonservierung 32 2.3.1 Einfluss der Zentrifugation auf die Samenqualität ... 32
2.3.2 Einfluss der Lagerung auf die Samenqualität ... 33
3 Material und Methoden ... 35
3.1 Versuch1: Computervideomikrographische Motilitätsanalyse und durchflusszytometrische Untersuchung von Hengstsperma unter Veränderung der Milchkomponente des Samenverdünners 35 3.1.1 Versuchstiere ... 35
3.1.2 Samengewinnung ... 36
3.1.3 Standardspermatologische Untersuchungen ... 36
3.1.4 Versuchskonzept ... 37
3.1.5 Durchführung der computervideomikrographischen Untersuchung .... 44
3.1.6 Durchführung der durchflusszytometrischen Untersuchungen ... 45
3.2 Versuch II: Computervideomikrographische Motilitätsanalyse und durchflusszytometrische Untersuchung von kryokonserviertem Sperma unter Verwendung unterschiedlicher Herstellungsverfahren des im Samenverdünner verwendeten Eidotters 47 3.2.1 Versuchstiere ... 47
3.2.2 Samengewinnung ... 48 3.2.3 Standardspermatologische Untersuchung ... 48 3.2.4 Versuchskonzept ... 48 3.2.5 Durchführung der computervideomikrographischen
Motilitätsanalyse ... 52 3.2.6 Durchführung der durchflusszytometrischen Untersuchungen ... 52
3.3 Statistische Auswertungen 52
4 Ergebnisse ... 53 4.1 Versuch I: Computervideomikrographische Motilitätsanalyse und
durchflusszytometrische Untersuchung der Membranintegrität equiner Spermatozoon unter Veränderung der Milchkomponente des
Samenverdünners 53
4.1.1 Versuchsabschnitt I: Einfluss der Milchkomponente Casein auf die Motilität, Plasmamembranintegrität und den akrosomalen Status
der Spermien ... 53 4.1.2 Versuchsabschnitt II: Einfluss von ß-Lactoglobulin auf Motilität,
Membranintegrität und den akrosomalen Status der Spermien ... 67 4.1.3 Versuchsabschnitt III: Einflüsse dreier kommerziell erhältlicher
Verdünnermedien auf Motilität, Membranintegrität und den
akrosomalen Status der Spermien ... 72 4.1.4 Versuchsabschnitt IV: Einflüsse von Casein und Molkepulver auf
Motiliät, Membranintegrität und den akrosomalen Status der
Spermien ... 75 4.1.5 Versuchsabschnitt V: Einflüsse zweier Caseine, Magermilchpulver
und UHT-Milch im Vergleich zu synthetisch hergestellten Verdünnermedien auf Motiliät, Membranintegrität und den
akrosomalen Status der Spermien ... 80 4.2 Versuch II: Computervideomikrographische Motilitätsanalyse und
durchflusszytometrische Untersuchung von kryokonserviertem Sperma unter Verwendung unterschiedlicher Herstellungsverfahren
des im Samenverdünner verwendeten Eidotters 90
4.2.1 Einfluss unterschiedlicher Herstellungsverfahren des im Samenverdünner verwendeten Eidotters auf Motilität, Plasmamembranintegrität und den akrosomalen Status der
Spermien ... 90
5 Diskussion ... 95
5.1 Probenmaterial 95 5.2 Untersuchungsmethoden 96 5.3 Effekte spezifischer Milchinhaltsstoffe auf die Haltbarkeit von Frischsamen (Versuch I) 97 5.4 Einfluss verschiedener Eidotterkomponenten (LDLs) auf die Qualität von kryokonservierten Spermien (Versuch II) 103 5.5 Schlussbetrachtung 106 6 Zusammenfassung ... 108
7 Summary ... 110
8 Literaturverzeichnis ... 112
9 Anhang ... 128
9.1 Zusammensetzung der Verdünner 128
9.2 Medien 129
9.3 Fluorochrome 131
9.4 Geräte und Instrumente zur Spermaaufbereitung 131
9.5 Abbildungsverzeichnis 131
9.6 Tabellenverzeichnis 132
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ALH Amplitude of Lateral Head Displacement ATP Adenosintriphosphat
BCF Beat-Cross-Frequenzy BSA bovines Serumalbumin BSP bull seminal plasma bzw. beziehungsweise C Celsius
ca. circa
CASA computerassistierte Spermienanalyse Ch.-B. Chargenbezeichnung
CLCs cholesterol loaded cyclodextrines CRISP cysteinreiche, sekretorische Proteine DNA Desoxyribonukleinsäure
DAP Distance Average Path DCL Distance Curve Line
DFI DNA-Fragmentationsindex EDTA Ethylendiamintetraacetat
Fa. Firma
FITC Fluoreszeinisothiocyanat FL 1-3 Fluoreszenzkanäle 1-3 g Gramm
g Erdbeschleunigung GSH Gluthation-Sulfhydril h Stunde
H2O2 Wasserstoffperoxid H2O Wasser
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethansulfonic-(acid) HGLL Hepes, Glucose, Lactose
HSP Hauptseminalplasma-Protein
Ka Kalium Kap. Kapitel l Liter
LDL Low Density Lipoprotein LIN Linearität
m Anzahl Ejakulate pro Proband
mg Milligramm
min Minute Mio Million ml Milliliter mM Millimolar mmol Millimol modif. modifiziert
MOPS 3-(N-Morpholino)-propansufonlsäure mOsmol Milliosmol
MOT Gesamtmotilität n Probandenzahl
Na Natrium
NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
NFDSMG Non-fat dried skimmed milk-glucose extender
nm Nanometer
NPPC natives Phosphocaseinat O2 Sauerstoff
p Signifikanz
PAS positiver akrosomaler Status PI Propidiumiodid
PI plasmamembranintakt
PMI plasmamembranintakte Spermien PMS progressive Motilität
PMSF Phenylmethansulfonylfluorid PNA Peanut Agglutinin
PSA Pisum sativum Agglutinin
PSA Pisum sativum Agglutinin PVA Polyvinylalkohol
ROS reaktive Sauerstoffspezies s. siehe
SAS Statistical Analysis System
SCSA Sperm Chromatin Structure Assay
sec Sekunde
SP 1-4 Spermienpopulation 1-4
±SD Standardabweichung STR Straightness
SZ Samenzellen
Tab. Tabelle
TG-VD Tiefgefriersamenverdünner TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U Umdrehungen
U Unit
UHT ultrahocherhitzt VAP Velocity Average Path VCL Velocity Curved Line Verd. Verdünner
VSL Velocity Straight Line
X arithmetischer Mittelwert z.B. zum Beispiel
μg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM Mikromolar
µm Mikrometer
1 Einleitung
Mit einem Besamungsanteil von über 80% in der deutschen Warmblutzucht (Jahresbericht FN 2009) basiert ein Großteil der modernen Pferdezucht auf der instrumentellen Samenübertragung. Neben dem primären mikrobiologischen Ziel der reduzierten Verbreitung von Infektionserregern durch den Hengst, bietet die instrumentelle Samenübertragung den Vorteil einer bestmöglichen Nutzung des Vatertiers. So wird eine wirtschaftliche, intensive und überregionale Nutzung stark frequentierter Deckhengste ermöglicht.
Die Lagerung und der Transport von flüssigkonserviertem Pferdesamen sind durch eine Beeinträchtigung der biologischen Samenbeschaffenheit im Verlauf der gekühlten Lagerung begrenzt. Als Versandsperma eingesetzte Samenproben sind 36-48 Stunden nach der Samengewinnung befruchtungsfähig, wobei die Mindestanforderung an die biologische Samenbeschaffenheit entsprechend den Empfehlungen der WBFSH (World Breeding Federation for Sporthorses) >35%
vorwärtsbewegliche Samenzellen nach 24-stündiger Lagerung bei +5°C beträgt.
Die Zusammensetzung des verwendeten Verdünners spielt eine wichtige Rolle im Hinblick auf die Vitalität der Samenzellen während der Lagerung und des Transportes. In unterschiedlichen Studien wurden insbesondere Milchinhaltsstoffe bezüglich ihrer Konservierungseigenschaften für Hengstsperma untersucht (BATELLIER et al. 1997), um die Lagerungsfähigkeit des flüssigkonservierten Samens zu verbessern.
Der Einsatz von kryokonserviertem Hengstsamen hat sich in der equinen Reproduktionsmedizin etabliert, da sie den Erhalt genetisch wertvollen Materials über die Lebenszeit des Hengstes hinaus und den Zuchteinsatz unabhängig von Krankheit oder Turniereinsatz des Hengstes ermöglicht. Außerdem wird der internationale Samenhandel erleichtert, da Tiefgefriersperma über weite Strecken und Zeiträume transportiert werden kann, ohne Qualitätseinbußen zu erleiden. Im Vergleich zu flüssigkonserviertem Sperma werden trotz des Fortschrittes in der Aufbereitung und Kryokonservierung schlechtere Befruchtungsergebnisse erzielt.
Einer reduzierten Zellvitalität nach dem Einfrier- und Auftauprozess (MULLER 1982;
KLUG 1989; VIDAMENT 1999) soll durch den Einsatz kryoprotektiver Substanzen
Einleitung
vorgebeugt werden. Neben dem Kryoprotektivum Glycerol kommt Eidotter als Membranprotektivum in Tiefgefrierverdünnern zum Einsatz (WATSON 1976).
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss spezifischer Milch- und Eiinhaltsstoffe wie natürlich und synthetisch hergestellte Caseine und Caseinmicellen sowie verschiedene Eidotterkomponenten (Low Density Lipoproteine) auf die Motilität, Plasmamembranintegrität und den akrosomalen Status im Verlauf der gekühlten Lagerung bei +5°C und der Kryokonservierung von Hengstsperma zu untersuchen.
Die daraus gewonnenen Erkenntnisse wurden zu einer Verbesserung der Konservierungs- bzw. Einfriereigenschaften durch die Herstellung eines optimierten Verdünners genutzt.
2 Literaturübersicht
2.1 Grundlagen der Frischsamenkonservierung
Die instrumentelle Samenübertragung ermöglicht die überregionale Nutzung des Hengstsamens. Die Flüssigkonservierung führt zum Erhalt der Befruchtungsfähigkeit während der Lagerung und ermöglicht den Transport über weite Entfernungen.
Bei flüssigkonsverviertem Hengstsamen wird zwischen Frischsperma (fresh- extended), das am Tag der Samengewinnung bei Raumtemperatur oder +5°C gelagert und innerhalb von 12 Stunden versamt wird und Versandsperma (cooled- transported), das nach einer Äquilibrierungszeit bei +5°C gelagert wird und innerhalb von 24-36 Stunden nach der Samengewinnung zur instrumentellen Samenübertragung eingesetzt wird, unterschieden.
Da der unverdünnte Nativsamen durch die Ansammlung toxischer Stoffwechsel- und Autolyseprodukte nur für wenige Stunden lagerungsfähig ist (KATILA 1997), wird die unmittelbare Zugabe eines geeigneten Verdünnermediums nach der Samengewinnung empfohlen.
2.1.1 Anforderungen an einen Frischsamenverdünner
Durch die Konservierung mit Frischsamenverdünner werden die Spermien mit metabolischen Substraten versorgt und vor dem Kälteschock geschützt. Der Verdünner sorgt neben einer Verdünnung des Seminalplasmas für die Stabilisierung von pH-Wert und Osmolarität und hemmt durch Antibiotikazusatz die bakterielle Kontamination, so dass die Alterungsprozesse der Spermatozoen vermindert und diese vor ungünstigen Umwelteinflüssen geschützt werden.
Die folgenden Anforderungen sollte ein idealer Frischsamenverdünner erfüllen:
1. Erhalt der Vitalitätseigenschaften im Verlauf der gekühlten Lagerung bei +5°C 2. verbesserte Beurteilung der Spermaqualitätsparameter (vor allem Motilität) im
Vergleich zu nativem Samen
3. geeignete Osmolarität von ca. 300 mOsmol (PICKETT und AMANN 1987) 4. adäquate Kombination von Nährstoffen (Energiequelle und Proteinquelle)
Literatur
5. Schutz vor Temperaturschwankungen, isothermal (VARNER 1991)
6. Neutralisation toxischer Substanzen und Stabilisation des pH-Wertes (6,8-7,4) 7. ausgewogenes Mineralstoffverhältnis (PICKETT 1992)
8. Schutz und Stabilisation enzymatischer Systeme und der Membranintegrität (PICKETT und AMANN 1987)
9. Vergrößerung des Volumens für die instrumentelle Samenübertragung (PICKET und AMANN 1987)
10. Antibiotikazusatz zur Kontrolle der originären Keimflora (PICKET und AMANN 1987)
2.1.1.1 pH-Wert
Der pH-Wert des Samens liegt bei einem Hengst im ersten Ejakulat zwischen 7,4 und 7,6. In einem zweiten - im Abstand von einer Stunde gewonnenen - Ejakulat steigt der pH-Wert auf 7,5 und 7,7 (PICKETT et al. 1976). Der Frischsamenverdünner sollte annähernd dem pH-Wert des Samens entsprechen.
Der pH-Wert des Samens wird ebenfalls von den Anteilen der verschiedenen Sekrete der akzessorischen Geschlechtsdrüsen beeinflusst, wobei Ejakulate mit geringerer Spermiendichte meist einen höheren pH-Wert haben (KATILA 1997).
Der ideale pH-Wert für Hengstfrischsamenverdünner wurde bisher noch nicht ermittelt. Allerdings wurde festgestellt, dass Hengstspermien eine große Spanne des pH-Wertes ohne negativen Effekt auf die Fertilität tolerieren. Der pH-Wert der meisten Magermilchverdünner liegt zwischen 6,5 und 7,0 (PICKETT und AMANN 1987).
BIELANSKI und KACZMARSKI (1979) stellten in ihren Untersuchungen ein pH-Wert- Optimum zwischen 6,8 und 7,4 fest.
2.1.1.2 Osmolarität
Die Osmolarität gibt die Anzahl der osmotisch aktiven Teilchen pro Liter an (Osmol/l) und ist somit ein Maß für den osmotischen Druck.
Um die Diffusion von Wasser durch die Plasmamembran der Spermien zu begrenzen, ist der Erhalt der Osmolarität wichtig. Sie ist abhängig von der
Zusammensetzung des Verdünners und dem Verhältnis von Elektrolyten zu Nicht- Elektrolyten (PICKETT und AMANN 1987).
Ist die Osmolarität des Verdünners zu niedrig (hypoton), kommt es zum Eintritt von Wasser in die Zelle. Die Samenzelle schwillt an und es kann zur Ruptur der Plasmamembran kommen. Ist die Osmolarität des Verdünners hingegen zu hoch (hyperton), führt dies zu einer zytoplasmatischen Hypertonie und es kommt durch den Verlust von Wasser durch die Plasmamembran zur Dehydratation mit Beeinträchtigung der Zellfunktionen.
Hengstsperma hat eine Osmolarität von ca. 300 mOsmol/l. Die Osmolarität von Frischsamenverdünnern variiert zwischen 250 und 400 mOsmol (KATILA 1997). Eine Osmolarität von 350 mOsmol/l scheint nach 12-stündiger Lagerung bei +5°C in einem Magermilchverdünner hinsichtlich der Motilität als optimal (VARNER 1991).
Hypertone Verdünner scheinen die Spermaqualität weniger zu beeinträchtigen als hypotone Medien (DAVIES MOREL 1999). So beobachteten LAGARES et al. (2000), dass eine zunehmende Hypotonie des Verdünners die Motilität und Plasmamembranintegrität negativ beeinflusst.
2.2 Allgemeine Bestandteile eines Frischsamenverdünners
Die meisten Frischsamenverdünner enthalten Milch- und Milchinhaltsstoffe bzw.
Eidotter als Energie- und Proteinlieferanten und als Membranprotektiva. Je nach Zusammensetzung und den Anforderungen des Verdünners werden weitere Nährstoffe und Energiequellen, Antioxidantien, Puffer und Antibiotika verwendet.
Während der Aufbereitung und Lagerung der Samenprobe ist die Plasmamembran als äußere physikalische Barriere am stärksten den degenerativen Prozessen der Samenzelle ausgesetzt. Eine vorzeitige Destabilisierung der Membran durch Lipidverlagerungen und den Verlust von Lipiden sowie die durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) hervorgerufene Lipidperoxidation kann durch verschiedene Lipidkomponenten begrenzt werden.
Als „Membranprotektiva“ werden in erster Linie Milch, Eigelb und Phosphatidylcholin eingesetzt.
Literatur
2.2.1 Milch und Milchinhaltsstoffe
Milch- und Milchnebenprodukte enthalten zum Schutz der Spermien und zum Erhalt der Motilität notwendige Inhaltsstoffe wie Lipoproteine und Phospholipide (PICKETT und AMANN 1987), die durch Anlegerung an die Plasmamebran einen positiven Effekt auf die Frischsamenkonservierung haben (KATILA 1997). Daher basiert der Großteil der heute kommerziell verwendeten Frischsamenverdünner auf Milch, meist fettreduzierter Magermilch oder Trockenmilch. Milch ist eine biologische Flüssigkeit, die sich aus folgenden Komponenten zusammensetzt:
- ca. 87% Wasser - ca. 4% Milchfett
- ca. 9% andere Feststoffe (3% Proteine, 5% Laktose, 0,6% Mineralien, 0,2%
Säuren, Enzyme, Gase, Vitamine)
Da Magermilch genauso effizient zur Stabilisierung der Plasmamebran beiträgt, scheint der Fettanteil nicht in erster Linie für die Schutzwirkung verantwortlich zu sein. In verschiedenen Studien wurden die einzelnen Milchkomponenten untersucht.
2.2.1.1 Fettreduzierte Magermilch und Magermilchpulver/Trockenmilch
Vor der Verwendung flüssiger Magermilch im Frischsamenverdünner wird diese für zehn Minuten auf 92–95°C erhitzt, um das in unerhitzten Milchprodukten vorhandene Lactenin zu inaktivieren. Lactenin ist ein Anti-Streptokokken-Faktor, der auf Pferde- und Bullensperma toxisch wirkt (HOUSEHOLDER et al. 1981).
Viele Verdünner basieren auf Trockenmilch bzw. Magermilchpulver. Hierzu zählt der nach seinem Erfinder als Kenney-Verdünner bezeichnete Non-fat dried skimmed milk-glucose extender (NFDSMG) (Zusammensetzung s. Anhang) (KENNEY 1975), der in einer modifizierten Form (E-Z-MixinTM, Animal Reproduction Systems, Chino, USA) in Nordamerika zur gekühlten Spermalagerung beim Frischsamenversand verwendet wird. Dieser unterscheidet sich vom Kenney-Verdünner hauptsächlich in der Verwendung von Polymyxin-B-Sulfat (PROVINCE et al. 1984) als Antibiotikazusatz. Neben einer einfachen, günstigen Herstellung ermöglichen die aufgrund fehlender Fettkügelchen im Vergleich zu den mit flüssiger Magermilch
hergestellten Verdünnern optisch klareren NFDSMG-Verdünner eine erleichterte Spermaevaluierung.
Eine weitere Modifikation des Kenney-Verdünners ist der KMT-Verdünner (Kenney- Magermilch-Tyrode-Verdünner), der zu 65% aus NFDSMG und zu 35% aus modifiziertem Tyrode-Medium besteht. In einer Studie von PADILLA und FOOTE (1991) zeigten mit KMT verdünnte und zentrifugierte Samenproben nach 72- stündiger Lagerung bei +4°C signifikant höhere Motilitäten als die mit Kenney- Verdünner zentrifugierten Samenproben.
INRA 82 (Zusammensetzung s. Anhang) ist ebenfalls ein Frischsamenverdünner auf Milchbasis, der in Europa weit verbreitet ist (MAGISTRINI et al. 1992). Mit INRA 82 verdünnte Samenproben zeigten eine bessere Motilität nach 96-stündiger Lagerung bei +5°C im Vergleich zu mit Kenney oder E-Z-MixinTM verdünnten Samenproben (IJAZ und DUCHARME 1995). Außerdem wurde nach Verdünnung mit INRA 82 nach 36-stündiger Lagerung bei +4°C eine signifikant höhere Vorwärtsbeweglichkeit beobachtet als nach Verdünnung mit ultrahocherhitzter 1,5% Fett enthaltender Magermilch mit Zusatz von Penicillin und Gentamicin oder Magermilch mit Glucose.
Hinsichtlich der Trächtigkeitsrate wurden in dieser Studie keine signifikanten Unterschiede festgestellt (VIDAMENT 1999).
2.2.1.2 Caseine und Molkeproteine
Mit Hilfe von Filtrationsverfahren und Gefriertrocknung extrahierten Forscher von INRA (L’Institut National de la Recherche Agronomique, Nouzilly, Frankreich) verschiedene Milchbestandteile und isolierten natives Phosphocaseinat (NPPC) und ß-Lactoglobulin als wirksame Komponenten zur Erhaltung von Motilität und Fertilität equiner Spermatozoen (BATELLIER et al. 1997).
Caseine machen ungefähr 80% der Milchproteine aus. Die wichtigsten Caseinfraktionen sind α-s1-, α-s2-, β- und κ-Casein. Caseine sind Phosphoproteine, wobei die Phosphorsäuremoleküle über Esterbindungen an die Hydroxylgruppen der Aminosäure Serin gekoppelt sind. Alle Caseine besitzen einen hohen Prolin- und Lysingehalt. Sie haben eine niedrige Löslichkeit unter einem pH-Wert von 4,6 (SIENKIEWICZ et al. 2006).
Literatur
Die meisten Caseine liegen in großen kolloidalen Aggregaten vor, den sogenannten Caseinmicellen. Sie bestehen zu 92–93% aus Caseinen und zu 7-8% aus anorganischen Bestandteilen (Calcium-Magnesium-Phosphat-Citrat-Komplex). Durch die mizellare Form und besondere Struktur der Proteine hat Milch eine hohe thermische Stabilität. Es gibt unterschiedliche Modelle der räumlichen Struktur von Caseinmicellen (SIENKIEWICZ et al. 2006):
- Submizellen-Modell (WALSTRA 1999), Abb. 1
- Modell der „Internen Struktur“ mit einer diskontinuierlichen Verteilung der Caseine und des Calciumphosphates in der Micelle und der Orientierung der κ-Caseine in der Oberflächenregion (HOLT 1996, HORNE 1998, HORNE 2002), Abb.2
- Mantel/Kern-Model (PAYENS 1966).
In Übereinstimmung ist bei allen Modellen der größte Teil der κ-Caseine an der Oberfläche angeordnet. Die hydrophilen Teile ragen von der Mizellenoberfläche in die sogenannte haarige Außenschicht. Im Mantel/Kern-Modell sind im Inneren αs1- Caseinmoleküle, die in einem Netzwerk über ß-Caseine gebunden sind. Die Oberfläche der Caseinmizellen ist mit κ-Caseinen bedeckt und das Calciumphosphat ist sowohl auf der Oberfläche als auch im Inneren der Caseinmizelle lokalisiert (PAYENS 1966).
Abb.2: Modell der „Internen Struktur“ (University of Guelph, www.foodsci.uoguelph.ca/deicon/casein.html)
Als Molkeproteine werden alle Milchproteine bezeichnet, die nach Ausfällung der Caseine bei einem pH-Wert von 4,6 bei +20°C in Lösung verbleiben. Es werden Serumproteine (ß-Lactoglobulin, α-Lactoglobulin, Serumalbumin, Immunglobuline), die Proteose-Pepton-Fraktion (hitzestabile Proteolyseprodukte des ß-Casein) und verschiedenen Minorkomponenten unterschieden.
Das ß-Lactoglobulin ist eines der größten wasserlöslichen Proteine und das bedeutendste Serumprotein. Es gehört zu den globulären Proteinen, die kleine hydrophobe Moleküle binden können.
Eine Fraktionierung der Milch durch Mikrofiltration, Ultrafiltration, Diafiltration und Gefriertrocknung erlaubt die Aufbereitung der einzelnen Fraktionen (PIERRE 1992).
Da die Untersuchungen von INRA ergaben, dass natives Phosphocaseinat (NPPC), bestehend aus verschiedenen Milchcaseinen (α, β, κ), und ß-Lactoglobulin den größten protektiven Effekt auf die Motilität und Fertilität der Spermien haben (BATELLIER et al. 1997), wurden diese Milchinhaltsstoffe in der Verdünnerentwicklung eingesetzt.
Literatur
Mit Zusatz von NPPC zum Basisverdünner wurde insbesondere bei hohen Lagerungstemperaturen von +15°C eine deutlich höhere Spermienvitalität festgestellt als mit INRA 82, Magermilch oder BSA-haltigen Vergleichsmedien.
In einem HGLL-BSA-Verdünner mit NPPC und einer aeroben Lagerung des Samens über 24 Stunden bei +15°C war die Trächtigkeitsrate im Vergleich zu INRA 82 und einer anaeroben Lagerung des Samens bei +4°C signifikant höher (BATELLIER et al.
1997). Die Wirkungsweise des NPPC ist nicht genau geklärt. Vermutlich bindet das NPPC Lipid-bindende Proteine im Seminalplasma (HSP), die sich während der Lagerung der Spermien negativ auf dessen Qualität auswirken.
Aus diesen Kenntnissen wurde der chemisch genau definierte, milchfreie Verdünner INRA 96® (IMV Technologies, L`Aigle, Frankreich) entwickelt, dem NPPC anstelle von Milch zugesetzt ist (Zusammensetzung s. Anhang). Er dient zur Frischsamenlagerung bei +15°C unter aeroben Bedingungen, wird aber auch zur Frischsamenlagerung bei +5°C unter anaeroben Bedingungen eingesetzt.
INRA 96® zeigt nach 24-stündiger Lagerung im Vergleich zu herkömmlichen Frischsamenverdünnern (Kenney und INRA 82) eine höhere Motilität und Fertilität (Trächtigkeitsrate pro Rosse 57%, n = 178 vs 40%, n = 173, p<0.001).
Nach 72-stündiger, aerober Lagerung bei +15°C konnte mit INRA 96® eine Trächtigkeitsrate von 48% (n = 52) erzielt werden (BATELLIER et al. 1998). In einer späteren Studie wurden die Trächtigkeitsraten zwischen in INRA 96® bei +15°C gelagertem und in herkömmlichen Verdünnern (Kenney und INRA 82) bei +4°C gelagertem Sperma verglichen. Es wurden signifikant höhere Trächtigkeitsraten nach Verdünnung mit INRA 96® ermittelt (BATELLIER et al. 2001).
PILLET et al. (2008) führten eine Tiefgefrierstudie mit drei Welshponyhengsten durch, in der sie INRA 96® und INRA 82 Eidotter und Glycerin zufügten. Nach dem Auftauen, zeigten die mit INRA 82 tiefgefrorenen Samenproben eine signifikant höhere Vorwärtsbeweglichkeit und mittlere Bahngeschwindigkeit (VAP). Die Anzahl der plasmamembranintakten Zellen war jedoch nach Verdünnung und Tiefgefrierung mit INRA 96® höher. An die spermatologischen Versuche schloss sich ein Besamungsversuch mit 84 Stutenzyklen an. Die Stuten wurden einmalig mit einer Dosis von 400 x 106 Spermien in 4 ml Verdünner besamt. Mit INRA 96® wurde im
Vergleich zu INRA 82 eine signifikant höhere Trächtigkeitsrate erzielt (71% vs 40%, p<0,01).
Der sterilisierte, gebrauchsfertige Verdünner Equi ProTM (Fa. Minitüb, Tiefenbach) enthält definierte Caseine und Molkeproteine und verschiedene Zucker anstelle von Magermilchpulver und zeigte eine verbesserte Lagerungsfähigkeit der Spermien über 48 Stunden im Vergleich zum Kenney-Magermilchverdünner (PAGL et al. 2006).
2.2.2 Eidotter
Eidotter wird als Membranprotektivum eingesetzt, zeigt eine protektive Wirkung auf das empfindliche Membransystem der Samenzelle und reduziert Kälte-Schock induzierte Membranveränderungen an der Spermienplasmamembran (WATSON 1976; FOULKES 1977, AMANN und PICKETT 1987). Auf Eidotter basierende Verdünner resultieren im Frischspermaeinsatz im Vergleich zu Magermilchverdünnern nicht in einer verbesserten Samenqualität oder Befruchtungsfähigkeit (MALMGREN et al 1994), werden jedoch aufgrund ihrer kryoprotektiven Wirkung in Konzentrationen von 2% bis 25% für die Samentiefgefrierung verwendet. Da Eidotter aufgrund seiner Opazität für die Samenbeurteilung ungünstig ist, wird durch Ultrazentrifugation klarifiziertes Eigelb gewonnen. Verschiedene Detergentien, wie z.B.Equex STM™ (Delta-Amino-Sodium- Lauryl-Sulfat), wurden zur Verbesserung der Löslichkeit der Eidotter-Lipide und Lipoproteine eingesetzt, um ihre Interaktionen mit der Spermienplasmamembran zu erleichtern (AMANN und PICKETT 1987).
Es wird vermutet, dass die sogenannten LDLs (Low Density Lipoproteine) als Bestandteile des Eidotters für den Membranschutz verantwortlich sind (MOUSSA et al. 2002; AMIRAT et al. 2004). LDLs bestehen aus ca. 12% Proteinen und 87%
Lipiden. Sie bestehen aus fünf großen Apoproteinen (ANTON 2003) und besitzen aufgrund ihrer niedrigen Dichte eine hohe Löslichkeit. Der genaue Wirkungsmechanismus der Lipoproteine ist bisher unklar.
Eine erste Hypothese besagt, dass sich LDLs an die Plasmamembran der Spermien anlagern und der schützende Effekt durch eine Stabilisierung der Membran erfolgt (WATSON 1975; FOULKES 1977; MACDONALD und FOULKES 1981).
Literatur
Eine zweite Hypothese besagt, dass die in den LDLs enthaltenen Phospholipide einen schützenden Film über der Spermienoberfläche bilden (QUINN et al. 1980) oder während des Einfrierprozesses beschädigte bzw. verlorengegangene spermienmembraneigene Phospholipide ersetzen und so das Spermium schützen (FOULKES et al. 1980; GRAHAM und FOOTE 1987). Untersuchungen mit Eidotter- Phosphatidylcholin und Soja-Phosphatidylcholin ergaben, dass diese eine ebenso gute protektive Wirkung auf Hengstsperma haben wie Eidotter, ohne in die Spermienmembran eingebaut zu werden (RICKER et al. 2006). Eine dritte Hypothese besagt, dass LDL mit schädlichen kationischen Seminalplasmapeptiden um das Binden an die Spermienmembran konkurrieren, wodurch die Plasmamebran geschützt wird (VISHWANATH 1992). Im Seminalplasma von Bullen wurden spezielle Lipid-bindende Proteine (BSP - Proteine) entdeckt, die negative Effekte auf die Membranintegrität der Spermien haben und mit den LDLs interagieren.
(MANJUNATH et al. 2002; BERGERON et al. 2004). Diese Erkenntnisse können auf Hengstejakulate, die ähnliche Seminalplasmaproteine enthalten, übertragen werden (CALVETE 1994).
Aufgrund der Beobachtung, dass die BSP-Proteine stabile Komplexe mit den LDLs bilden, wurde eine neue Hypothese über die Schutzfunktion von LDL für den Samen aufgestellt: Während der Ejakulation werden BSP-Proteine von den akzessorischen Geschlechtsdrüsen sezerniert (MANJUNATH et al. 1994). BSP-Proteine binden an die Spermienmembran (DESNOYERS und MANJUNATH 1992; MANJUNATH et al.
1994) und verursachen einen Cholesterol- und Phospholipidaustritt (THERIEN et al.
1997; THERIEN et al. 1998). So kommt es ohne Verdünnung durch die BSP- Proteine zu einem fortlaufenden Lipidverlust, der die Widerstandsfähigkeit der Spermien gegen Abkühlung und Tiefgefrierung mindert. Wird der Samen direkt nach der Ejakulation mit eidotterhaltigem Verdünner versetzt, bindet LDL einen Großteil der BSP–Proteine, wodurch die Plasmamembranveränderungen reduziert werden und sich die Haltbarkeit des Samens verbessert (s. Abb. 3).
Untersuchungen ergaben, dass in Samen, der mit Eidotter- bzw. LDL-haltigen Medien verdünnt wurde, 80% weniger BSP-Proteine mit dem Sperma reagieren. Der reduzierte Lipidverlust während der Lagerung (BERGERON et al. 2004; BERGERON
et al. 2007) führte zu einer verbesserten Motilität, Akrosomintegrität und Viabilität der Spermien.
In Studien mit Hundesperma wurden unterschiedliche LDL-Konzentrationen (4, 5, 6, 8 und 10%) zum Tiefgefriersamenverdünner hinzugefügt und mit Eidotterverdünner verglichen. Hierbei wurde festgestellt, dass 6% LDL im Tiefgefriersamenverdünner, im Vergleich zum Eidotter-Verdünner zu einer signifikante Verbesserung hinsichtlich der Motilität, des akrosomalen Status, der Plasmamembran- und DNA-Integrität der Spermien führte (BENCHARIF et al. 2008a). In einer weiteren Untersuchung konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den Konzentrationen 6, 8 und 10%
LDL im Tiefgefriersamenverdünner ermittelt werden (VARELA JUNIOR et al. 2009).
Durch Zugabe von 20 mmol Glutamin zu dem 6% LDL enthaltenden Verdünner konnte eine weitere Optimierung der Motilität, des akrosomalen Status und der Plasmamembranintegrität von Hundespermien erzielt werden (BENCHARIF et al.
2008b).
Bei der Untersuchung von Bullensperma wurde eine Verbesserung der Motilität, des akrosomalen Status und der Plasmamembran- und DNA-Integrität bei einer Konzentration von 8% LDL im Tiefgefriersamenverdünner beobachtet (HU et al.
2010, VERA-MUNOZ et al. 2009).
Ein Zusatz von 8% LDL und 25 mmol Glutamin erhöhte die Motilität, den akrosomalen Status, die Plasmamembran- und DNA-Integrität im Ziegensperma ebenfalls signifikant (AMIRAT-BRIAND et al. 2009).
Literatur
Abb.3: Mechanismus zum Schutz der Spermien durch Eidotter (MANJUNATH et al. 2002)
2.2.3 Synthetisch erzeugte Verdünnerzusätze
Zur Kryokonservierung von Bullensperma wurde ein auf Sojabohnen-Lecithin-Basis, synthetisch hergestellter Verdünner (AndromedTM) entwickelt und erfolgreich eingesetzt (AIRES et al. 2003). Aufgrund der membranprotektiven Eigenschaften des enthaltenden Phosphatidylcholin wurde ein modifizierter Verdünner für Hengstsamen eingeführt (Andromed-ETM). Eine Studie mit Equi ProTM (Pulverform, zum Auflösen in destilliertem Wasser vor Gebrauch), Equi ProTM (sterilisiert, gebrauchsfertig) und Andromed-ETM bei einer Lagerung bei +5°C für 48 Stunden ergab hinsichtlich der Gesamtmotilität und der Geschwindigkeitsparameter VAP, VCL, VSL, DAP, DCL und DSL vergleichbare Ergebnisse (AURICH et al. 2007).
2.2.4 Zucker
Als häufigste Energiequelle und Substrat für die ATP-Produktion wird in Frischsamenverdünnern Glukose verwendet (KATILA 1997). Es können auch andere metabolisierbare Zucker zum Einsatz kommen. Untersuchungen ergaben, dass Laktose, Raffinose und Sukrose keine signifikanten Unterschiede in der Vorwärtsmotilität im Verlauf der Lagerung bei +4°C und +37°C über 24 Stunden ergaben. Arabinose und Galactose erwiesen sich als nicht brauchbar, da sie eine schädliche Wirkung auf Spermien zeigten (ARNS et al. 1987). Fruktose kann ebenfalls als Energiequelle verwendet werden (MANN 1975; KATILA 1997), sollte jedoch nur in begrenzten Mengen eingesetzt werden, da die Aufnahme und der Transport von Fruktose durch fehlende Fruktose-spezifische Carrier-Proteine in der Plasmamembran von Hengstspermien begrenzt sind.
Trehalose wurde als Kryoprotektivum bei der Tiefgefrierung von Hengstsperma eingesetzt, wobei verschiedene Verdünnervarianten mit unterschiedlichen Trehalosekonzentrationen untersucht wurden. Während die Gesamt- und Vorwärtsmotilität von der Trehalosekonzentration nicht beeinflusst wurde, war ein membranstabilisierender Effekt durch höhere Trehalosekonzentrationen erkennbar (STEINMANN 1996).
Mannose wurde in einer neueren Studie von KING et al. (2006) als Energiequelle in Samenverdünnern getestet, da es die Fähigkeit besitzt, die bakterielle Kontamination
Literatur
der Uterusschleimhaut zu reduzieren. 75% der Glukose, die in herkömmlichen Samenverdünnern verwendet wird, kann durch Mannose ersetzt werden, ohne dass es zu Veränderungen der Spermienmotilität und Fertilität kommt. Es ist allerdings unklar, ob Mannose von Hengstsperma tatsächlich metabolisiert werden kann.
2.2.5 Puffersubstanzen
Bei der Lagerung von Hengstsperma kommt es durch Akkumulation von End- oder Zwischenprodukten des anaeroben Stoffwechsels (z.B. Laktat) zu einer Absenkung des pH-Wertes und einem toxischen Effekt auf die Spermien. Um die Spermienvitalität und –funktion zu erhalten, werden dem Verdünnermedium neutralisierende und pH-Wert stabilisierende Puffersubstanzen zugefügt (PICKETTund AMANN 1987). Ein guter Puffer sollte folgende Anforderungen erfüllen (GOOD und IZAWA 1972):
- Abdeckung eines weiten pH-Bereiches (pH zwischen 6,0 und 8,0 (idealerweise 7,0))
- gute Wasserlöslichkeit
- schwere bzw. keine Penetration von biologischen Membranen
- geringer Einfluss von Pufferkonzentration, Temperatur und Ionenzusammensetzung auf die Dissoziation des Puffers
- bekannte Metallbindungseigenschaften
- Widerstandsfähigkeit und Stabilität gegenüber enzymatischer und nicht enzymatischer Degradierung
Für die Konservierung von Hengstsperma kommen unterschiedliche Puffer zum Einsatz. Natriumhydrogenkarbonat (NaHCO3, pH-Optimum 6,8-7,2) besitzt gute pH- stabilisierende und neutralisierende Eigenschaften. Es wird im Magermilch-Glukose- Verdünner für Hengstsamen eingesetzt (KENNEY 1975). Bei Eberspermien führt es relativ schnell zu Veränderungen im Lipidaufbau der Plasmamembran. Es kommt zur Destabilisierung der Membran und einer Begünstigung der Kapazitation (HARRISON 1996; JOHNSON et al. 2000).
Zitronensäure wird meist in Form von Natriumcitrat (pH-Bereich von 8,0) eingesetzt.
Membranlipide und wirkt sich somit positiv auf die Lagerung von Spermien aus. Bei der Kühlung von Spermien kommt es zum vermehrten Calciumaustritt, da die Membranpermeabilität erhöht wird. Zitronensäure besitzt die Eigenschaft, Komplexe mit Calciumionen zu bilden und verhindert somit den Austritt von Calcium durch die Membran (JONES et al. 1979). Da sie jedoch depressiv auf die Motilität der Samenzellen wirkt, ist sie für Hengstsperma ungeeignet (NISHIKAWA 1975).
Ethylendiamintetraacetat (EDTA, pH-Bereich 4,0-5,0) ist ein Puffer, der auch bivalente Metallionen, besonders Calcium binden kann und wie Zitronensäure die Kapazitation und die Akrosomreaktion verhindert (JOHNSON et al. 2000). EDTA findet häufig Anwendung bei der Konservierung von Ebersperma.
Heutzutage werden meist die sogenannten Zwitterionenpuffer HEPES (N-(2- Hydroxyethyl)piperazin-N-(2-Ethansulfonsäure)), MOPS (3-(N-Morpholino)- propansulsäure) und TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) verwendet. Diese Puffer kontrollieren den pH-Wert und binden Schwermetalle. MOPS (pH-Bereich 7,2- 7,8) wird hauptsächlich für die Konservierung von Ebersperma eingesetzt. TRIS wird bei der Konservierung von Bullen- und Ebersperma (REVELL 1985) verwendet, ist jedoch für die Lagerung von Hengstsperma ungeeignet, da es schon nach kurzer Lagerungsdauer negative Effekte auf die Vitalität der Hengstspermien zeigt (PICKET et al. 1975). HEPES (pH-Bereich 7,0-8,0) wird häufig bei der Konservierung von Hengstsperma verwendet (PADILLA und FOOTE 1991; MAGISTRINI et al. 1992).
Untersuchungen ergaben, dass eine negative Korrelation zwischen Ionenstärke und Spermienmotilität besteht (CRABO et al. 1972). HEPES und MOPS besaßen die geringste Ionenstärke.
2.2.6 Elektrolyte
Die Osmolarität eines Verdünners wird durch die Relation der Elektrolyte zueinander bestimmt. Eine besonders große Rolle spielt das Verhältnis der Natrium- und Kaliumionen zueinander. Über die zelluläre Na/K-Pumpe wird der Kaliumgehalt in der Zelle aufrechterhalten und somit ein Motilitätsverlust verhindert (JOHNSON et al.
2000). Die Anteile verschiedener Elektrolyte im Seminalplasma variieren zwischen den unterschiedlichen Ejakulatfraktionen. Die Gehalte von Calcium, anorganischem Phosphat und Magnesium sind in der spermienreichen Fraktion am höchsten
Literatur
(KARESKOSKI et al. 2005). Während die Calciumkonzentration positiv mit dem Ejakulatvolumen korreliert, bestehen zwischen der Konzentration von Eisen, Kupfer und Zink und dem Ejakulatvolumen negative Korrelationen. Die Konzentration von Eisen und Zink wird außerdem von der Spermienkonzentration beieinflusst (PESCH et al. 2006). Höhere Konzentrationen von Chlorid und Natrium sind bei Anwesenheit von Vorsekret vorhanden (KARESKOSKI et al. 2005), welche die Lagerungsfähigkeit von Sperma beeinflussen können (KARESKOSKI et al. 2006). Da sich Vorsekret negativ auf die Spermienmotilität während der Lagerung auswirkt, sollte es bei der Samengewinnung nicht in die Samenprobe gelangen. Hohe Calciumionen- Konzentrationen mindern die Motilität, hemmen den Spermienstoffwechsel und führen zur Agglutination. Hierdurch kommt es bei Hengst- und Bullensperma zu einer schlechten und verfälschten Motilitätsbeurteilung.
2.2.7 Antibiotika
Die Penis- und Präputiumoberfläche des Hengstes ist physiologischerweise mit einer Vielzahl von Oberflächenkeimen besiedelt, die in der Regel nicht pathogen sind und somit auch nicht zu einer Genitalinfektion einer gesunden Stute führen (VARNER et al. 1998). Es können jedoch Veränderungen in der physiologischen Keimflora des äußeren Genitales von Hengsten durch vermehrtes Wachstum potenziell pathogener Keime entstehen, die nach der Bedeckung oder Besamung zu Infektionen des weiblichen Genitaltraktes führen können.
Während der Samengewinnung mit einer geschlossenen künstlichen Scheide, kann eine Kontamination des Samens mit Erregern der Penis- und Präputiumoberfläche nicht verhindert werden. So wurde aus 408 Ejakulaten ein durchschnittlicher Keimgehalt von 316.000 Keimen/ml Samen (Spannbreite: 100.000 bis 4,7 Mio.
Keime/ml) ermittelt (CLEMENT 1995; LINDEBERG et al. 1999). Zudem birgt die Produktion und Lagerung der Verdünnermedien, insbesondere während der Erwärmung im Wasserbad, ein Kontaminationsrisiko (AURICH 2011). Neben der potenziellen Gefahr der Kontamination des weiblichen Genitaltraktes bei der Belegung (BURNS et al. 1975; LINDEBERG et al. 1999), kann die bakterielle Kontamination die biologische Samenbeschaffenheit während der Lagerung negativ
werden Samenverdünnern Antibiotika zugesetzt (KLUG et al. 1998). So wird die Lagerungsfähigkeit der Spermien, die mit den Bakterien um dieselben Substrate konkurrieren verbessert und durch den Antibiotikazusatz Stuten mit reduzierter genitaler Immunabwehr gegen Infektionen geschützt (CLEMENT 1995).
Die Antibiotika sollten in dem Verdünnermedium gelöst werden. Sie werden meist in einer Konzentration von einem Gramm pro Liter Verdünner eingesetzt (KLUG et al.
1998), wobei die Verdünnerzusammensetzung einen Einfluss auf die maximal tolerierte Konzentration besitzt. So führte Gentamicin in einer Konzentration von 1 mg/ml nicht zu einer Reduktion der Lagerungsfähigkeit der Spermien in Kenney Verdünner (Varner et al. 1998), während bei Verdünnung mit Equi ProTM nur eine Gentamicinzugabe von 250 µg/ml hinsichtlich der Samenqualität tolerierbar war (AURICH und SPERGSER 2007).
Da Antibiotika bei Temperaturen oberhalb von +15°C effektiv sind, können sie ihre Wirkung bei gekühlt gelagertem Samen nur im Zeitraum der Abkühlung von der Verdünnungstemperatur bis zum Erreichen der Lagerungstemperatur voll entfalten.
Bei einer Kühlrate von 0,1 bis 0,05°C/min. zwischen +20 und +5°C ist das Antibiotikum nur für drei bis sechs Stunden effizient (KAYSER et al. 1992). Es kommen verschiedene Antibiotika als Hengstsamenverdünnerzusatz zum Einsatz.
VARNER et al. (1998) führten Untersuchungen bezüglich der Wirksamkeit verschiedener Antibiotika im Hengstsamen bei einer Lagerung von 24 Stunden bei +5°C durch. Amikacin war das effektivste der untersuchten Aminoglykoside und Kalium-Penicillin das effektivste der ß-Lactamantibiotika. Eine Kombination aus beiden Antibiotika erwies sich optimal hinsichtlich der Erhaltung der Motilität und der antibakteriellen Wirkung. Allerdings konnte keines der getesteten Antibiotika das Bakterienwachstum komplett verhindern. Amikacin wird in den USA vielen Verdünnermedien zugesetzt. Da sein Einsatz in Europa jedoch als Reserveantibiotikum für die Humanmedizin und aufgrund höherer Kosten limitiert ist, wird in Europa in erster Linie eine Kombination von Gentamicin und Penicillin eingesetzt, die ein ähnliches Wirkspektrum aufweist (AURICH 2011).
Für Gentamicin wurde eine bessere Wirksamkeit als für ß-Lactamantibiotika (Penicillin, Amoxicillin, Ticarcillin) festgestellt. Eine Konzentration von 50 μg/ml war genauso effektiv in der Keimreduzierung wie eine Konzentration von 500 μg/ml
Literatur
Gentamicin (CLEMENT 1995). Dem negativen Effekten von Gentamicin auf die Spermienqualität wurde in der neueren Studie von AURICH und SPERGSER (2007) durch Reduktion der Gentamicinkonzentrationen auf 0,25g/l entgegengewirkt, wobei noch nicht endgültig geklärt ist, ob die niedrige Antibiotikazugabe effektiv gegen das bakterielle Wachstum während der Lagerung der Samenprobe wirkt.
Polymyxin B zeigte in verschiedenen Untersuchungen eine schädliche Wirkung auf die Motilität von Hengstsperma (JASKO et al. 1993; VARNER et al. 1998). Eine andere Studie ergab, dass eine Kombination von Gentamicin und Polymyxin B effektiv gegen Pseudomonas aeruginosa wirkt, bei nichtspezifischen Bakterien nach 24 und 48 Stunden Lagerung bei +20°C jedoch nicht das Wachstum reduziert (VAILLANCOURT et al. 1993).
Ticarcillin, ein Penicillinderivat, erwies sich als ein Antibiotikum mit einem weiten Wirkungsspektrum. Aus unbekannten Gründen wurde der Verkauf von Ticarcillin in den USA eingestellt. Eine Untersuchung von DIETZ et al. (2007) zeigte jedoch in Kenney Verdünner vergleichbare Wirkung von Ticarcillin und Piperacillin.
2.2.8 Membranprotektiva
Es werden einem Samenverdünner neben Milch und Eigelb häufig weitere membranprotektive Substanzen zum Erhalt von Motilität und Vitalität der Spermien hinzugefügt.
2.2.8.1 Bovines Serumalbumin (BSA)
BSA eliminiert freie Radikale von oxidativen Reaktionen, wodurch die Spermienmembran vor Lipidperoxidation geschützt wird.
Durch Zugabe von BSA zum Verdünner wurde eine erhöhte Vorwärtsbeweglichkeit und Gesamtmotilität beobachtet, die auf den Schutz vor den negativen Einflüssen der Lipidperoxidation zurückgeführt wurde (KLEM et al. 1986). BSA werden eigene enzymatische Reaktionen (Esterase-, Peptidase- und Phospholipaseaktivität) und die Bindung von enzymschädigenden Substanzen oder toxischer Stoffwechselprodukte von Bakterien und Spermien (BAMBA und SONE 1981) zugesagt. Außerdem wurden bei Verdünnern mit BSA-Zusatz weniger Agglutinationen festgestellt (HARRISON et
Es wurden zwar Effekte des BSA ermittelt, die jedoch im Verlauf der Lagerung nicht erhalten werden konnten (BAAS et al. 1983, DIXON et al. 1980; KREIDER et al.
1985).
BSA reduziert die negativen Einflüsse der Zentrifugation auf die Samenqualität. Mit einem modifizierten Magermilch-BSA-Verdünner wurden nach Zentrifugation signifikant bessere Motilitätswerte im Verlauf der Lagerung erzielt als mit dem herkömmlichen Kenney-Verdünner (PADILLA und FOOTE 1991).
Die Konzentration von BSA im Verdünner scheint hinsichtlich der Haltbarkeit von Hengstsperma eine große Rolle zu spielen. Während bei einem 0,5%igen BSA- Zusatz die besten Motilitätsergebnisse erzielt werden konnten, wurde bei einer BSA- Konzentration über 3% eine Abnahme der Motilität beobachtet (GOODEAUX 1978).
Bei Untersuchungen von Schafsperma wurde beobachtet, dass Konzentrationen unter 20g BSA/ml Verdünner keinen ausreichenden Schutz für die Spermien bieten (UYSAL 2007).
2.2.8.2 Polyvinylalkohol (PVA) und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)
PVA ist eine synthetisch hergestellte makromolekulare Substanz, mit der in Versuchen mit Hamsterspermien vergleichbare Ergebnisse hinsichtlich der Spermienmotilität wie bei der Zugabe von BSA erzielt wurden. In unterschiedlichen Studien wurde ein positiver Effekt auf die Spermienmotilität, insbesondere nach Zentrifugation beobachtet (CLAY et al. 1984, PICKETT und AMANN 1987). Da PVA synthetisch hergestellt wird, enthält es im Gegensatz zu kommerziell erhältlichem BSA keine chemischen Verunreinigungen (CLAY et al. 1984).
PMSF ist ein Proteinaseinhibitor und zeigte beim Zusatz zu einem Tiefgefrierverdünner für Hengstsperma eine Tendenz zur Verbesserung der Kopfkappenintegrität der Spermien (OETJEN 1988). In weiteren Untersuchungen wurden keine Erhöhungen der Motilitätswerte (SCHROP 1992), jedoch eine signifikante Verbesserung der Kopfkappenintegrität der Spermien festgestellt (HEFFE 1993).
Literatur
2.3 Einflüsse auf die Frischsamenkonservierung
2.3.1 Einfluss der Zentrifugation auf die Samenqualität
Da sich ein hoher Anteil von Seminalplasma ungünstig auf die Motilität und Fertilität von Hengstspermien nach gekühlter Lagerung auswirkt (JASKO et al. 1992a), wird der Samen auf eine Konzentration von 25 x 106 Spermien/ml verdünnt oder der Seminalplasmaanteil durch Zentrifugation auf 5–20% reduziert (JASKO et al. 1992a;
LOOMIS 2006). Der Verlust von ca. 25% der Spermien im Überstand nach Zentrifugation stellt ein großes Problem dar (LOOMIS 2006). Die Verwendung eines iodixanolhaltigen „cushion“ Mediums ermöglicht eine höhere Zentrifugationskraft, bei der die Vitalität der Spermien erhalten bleibt und der Spermienverlust verringert wird (WAITE et al. 2008).
In einer Studie von BRINSKO et al. (2000) wurden Hengste in „good coolers“ und
„bad coolers“ unterteilt. Besonders in der Gruppe der „bad coolers“ konnte die Motilität nach 48-stündiger Lagerung durch Reduktion des Seminalplasmas durch Zentrifugation verbessert werden.
Untersuchungen zu den Effekten verschiedener Seminalplasmafraktionen auf die Haltbarkeit von Samen während der gekühlten Lagerung sind widersprüchlich.
Während sich in einer Studie von AKCAY et al. (2006) der Zusatz von Seminalplasma der spermienreichen Fraktion im Gegensatz zu Seminalplasma der spermienarmen Fraktion negativ auf Motilität und Plasmamembranintegrität der Spermien auswirkte, ergaben andere Untersuchungen nach 24-stündiger Lagerung bei +25°C eine höhere Motilität in der spermienreichen Fraktion als im Gesamtejakulat (VARNER et al. 1987).
In einer neuen Studie wurde der Einfluss des Seminalplasmas auf den DNA- Fragmentationswert (DFI-Wert) vor und nach Lagerung bei 43 Hengsten getestet. Es wurden vor und nach Lagerung bei +5°C für 24 Stunden in der spermienreichen Fraktion signifikant niedrigere DFI-Werte festgestellt als in der spermienarmen Fraktion. Seminalplasma wirkte sich während der Lagerung (Seminalplasma:Verdünner 1:2) negativ auf die Lagerungsfähigkeit der Spermien aus (KARESKOSKI und KATILA 2008). Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit einer
signifikante Erhöhungen des DFI-Wertes bei zunehmender Konzentration von Seminalplasma in der Samenprobe. Es wurden keine signifikanten Veränderungen in der Spermienmotilität festgestellt.
In einer weiteren Untersuchung von WEBB (2009) wurden Samenproben mit drei kommerziell erhältlichen Frischsamenverdünnern versetzt. Es wurden verdünnte und zentrifugierte Halteproben hergestellt, die nach 24, 48 und 72 Stunden hinsichtlich der Vorwärtsbeweglichkeit und Gesamtmotilität der Samenzellen untersucht wurden.
Während nach 24 Stunden noch keine signifikanten Unterschiede zwischen den verdünnten und zentrifugierten Proben ermittelt wurden, zeigten die zentrifugierten Proben nach 48- und 72-stündiger Lagerung eine höhere Spermienmotilität.
2.3.2 Einfluss der Lagerung auf die Samenqualität
Eine Lagerungstemperatur von +5°C wird für Hengstsperma als optimal für den Erhalt der Motilität (VARNER et al. 1988) und der Fertilität (VARNER et al. 1989) bei einer Lagerung über 24 bis 48 Stunden angesehen. Wird der Samen innerhalb von 12 Stunden nach der Samengewinnung und Aufbereitung zur Insemination verwendet, so kann er bei Raumtemperatur gelagert werden (VARNER et al. 1989;
LOVE et al. 2002).
Bei der Abkühlung von Sperma im kritischen Temperaturbereich von +18 bis +8°C kann der sogenannte „Kälteschock“ (MORAN et al. 1992), insbesondere bei Kühlraten >0,3°C/min., zu einer Beeinträchtigung der Membran- und Akrosomenintegrität, abnormalen Bewegungsmustern und einer Motilitätsminderung führen.(PICKETT und AMANN 1987). Folglich kommt es zu einer Beeinträchtigung der Samenqualität von Versandsperma (Lagerung bei +5°C über 24 Stunden) und einer reduzierten Trächtigkeitsrate im Vergleich zu Frischsamen (JASKO et al.
1992b).
Neben Schädigungen der Plasmamembran könnten DNA-Fragmentationen zu einer reduzierten Fertilität bei gelagertem Samen führen. Bei der Ermittlung des DFI- Wertes im SCSATM–Test wird bei fertilen Hengsten bei ordnungsgemäßer Verdünnung, Aufbereitung und Lagerung kein signifikanter Anstieg des DFI-Wertes nach 24-stündiger Lagerung bei +5°C beobachtet (LOVE 2005).
Literatur
So blieb in einer Studie von LOVE et al. (2002) zum Einfluss der Fertilität auf die Lagerungsfähigkeit von Spermien der DFI-Wert von fertilen Hengsten bei einer Lagerung bei +5°C konstant. Bei subfertilen Hengsten stieg der DFI-Wert nach 20- stündiger Lagerung signifikant an. In weiteren Untersuchungen zeigten sich Anstiege des DFI-Wertes bei fertilen Hengsten erst nach 48-stündiger Lagerung bei +5°C (LINFOR und MEYERS 2002). Bei Lagerungstemperaturen von +20°C und +37°C zeigten sich Veränderungen in der DNA-Struktur bereits nach sieben Stunden Lagerung (LOVE et al. 2002). Es wird vermutet, dass apoptotische Prozesse durch Kühlung und Lagerung hervorgerufen werden, die zu DNA-Fragmentationen führen (LOPEZ-FERNANDEZ et al. 2007).
3 Material und Methoden
Die Untersuchungen zum Einfluss spezifischer Milch- und Eiinhaltsstoffe umfassten zwei Versuchsteile. Im ersten Versuchsteil wurde der Einfluss verschiedener Milchinhaltsstoffe auf die Motilität, Plasmamembranintegrität und den akrosomalen Status im Verlauf der gekühlten Lagerung bei +5°C untersucht, während im zweiten Versuchsteil die Spermaqualität kryokonservierterten Hengstsamens nach unterschiedlichen Eidotteraufbereitungsverfahren im Verdünner Equi ProTM neu untersucht wurde.
Der erste Versuchsteil gliederte sich in fünf Versuchsabschnitte und wurde während der routinemäßigen Spermatiefgefrierung 2009/2010 (Oktober 2009 bis Februar 2010) und der Besamungssaison 2009 (Juli 2009) an Ejakulaten von Zuchthengsten des Niedersächsischen Landgestütes in Celle durchgeführt.
Nach Auswertung des ersten Versuchsteils schloss in der routinemäßigen Spermatiefgefrierung 2009 (Oktober - Dezember 2009) der zweite Versuchsteil an.
Die Samengewinnung und -aufbereitung sowie die spermatologische Standarduntersuchung der Ejakulate fanden in der Zentralen Besamungsstation des Niedersächsischen Landgestütes statt. Die computervideomikrographische Motilitätsanalyse sowie die durchflusszytometrische Untersuchung der bei +5°C gelagerten Halteproben sowie der Tiefgefrierspermaproben wurde in der Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover durchgeführt.
3.1 Versuch1: Computervideomikrographische Motilitätsanalyse und durchflusszytometrische Untersuchung von Hengstsperma unter Veränderung der Milchkomponente des Samenverdünners
3.1.1 Versuchstiere
Für die Durchführung der Versuche standen insgesamt zehn Warmbluthengste des Niedersächsischen Landgestütes Celle im Alter zwischen vier und zweiundzwanzig Jahren zur Verfügung. Während der routinemäßigen Tiefgefrierspermasaison
Material und Methoden
2009/2010 erfolgte die Ejakulatgewinnung dreimal wöchentlich (Mo, Mi, Fr). Während der Besamungssaison wurde eine tägliche Samengewinnung durchgeführt. Die Hengste zeigten ein ungestörtes Allgemeinbefinden und waren erb- und geschlechtsgesund. Das Deckverhalten war ungestört.
Die Tiere befanden sich in Einzelboxenhaltung auf Stroheinstreu. Die Fütterung bestand aus Heu, Hafer und Pelletts. Wasser stand aus Selbsttränken zur freien Verfügung.
3.1.2 Samengewinnung
In Anwesenheit einer rossigen Stute erfolgte die Samenentnahme an einem Phantom (Modell „Celle“, (KLUG 1993)). Der Samen wurde hierbei von einer künstlichen Scheide (Modell „Hannover“, (KLUG 1993)) aufgefangen, die für jede Samenentnahme neu mit einem Einmalfolienschlauch (Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen wurde. Als Auffanggefäß diente eine skalierte, sterile Glasflache, die mit einem Schraubring an der Scheidenfolie befestigt wurde. Die Glasflasche wurde zum Abtrennen grober Verunreinigungen und der Schleimfraktion mit einem Samenfilter (Fa. Minitüb, Tiefenbach) versehen. Ein gepolsterter Überzug diente dem Auffanggefäß zum Schutz und sollte Temperaturschwankungen während der Samengewinnung verhindern.
Die anschließende Aufbereitung des Samens und standardspermatologische Untersuchung erfolgte bei Raumtemperatur (+20°C), die verdünnten und zentrifugierten Halteproben wurden anschließend bei +5°C gelagert.
3.1.3 Standardspermatologische Untersuchungen
Direkt im Anschluss an die Samengewinnung wurden im Rahmen der makroskopischen Untersuchung das Volumen (ml) der schleimfreien Ejakultatfraktion, die Farbe (grau, weiß, gelb) und die Konsistenz (wässrig, molkig, milchig, rahmig) erfasst. Das Ejakulat wurde auf das Vorhandensein von Beimengungen geprüft. Die Dichtebestimmung des Nativsamens erfolgte photometrisch („Spermacue“, Fa. Minitüb, Tiefenbach). Die Motilität des Nativsamens sowie der verdünnten Frischsamenprobe wurde durch eine visuell-mikroskopische
Schätzung mithilfe eines Phasenkontrastmikroskopes bei 200-facher Vergrößerung durch subjektive Begutachtung dreier Gesichtsfelder bestimmt. Der Mikroskoptisch (HAT 400, Fa. Minitüb, Tiefenbach) sowie die Objektträger und Deckgläschen wurden vorgewärmt (+38°C). Es erfolgte eine Einteilung in vorwärts-, orts- und unbewegliche Spermien.
3.1.4 Versuchskonzept
Der erste Versuchsteil gliederte sich in fünf Versuchsabschnitte:
I. Vergleich verschiedener Verdünnermedien unter Zugabe von Casein als Milchkomponente
II. Einfluss von ß-Lactoglobulin auf die Spermaqualität
III. Vergleich kommerziell erhältlicher Verdünnermedien (Equi ProTM (Fa.
Minitüb, Tiefenbach), INRA 96® (IMV, Fa. L`Aigle, Frankreich) mit Verdünner C
IV. Einfluss von Casein und Molkepulver auf die Spermaqualität
V. Einfluss von Caseinen, Magermilchpulver, UHT-Milch und Ready to use Verdünnern auf die Spermaqualität
3.1.4.1 Samenaufbereitung im Versuchsabschnitt I des ersten Versuchsteils (Effekte von Milchinhaltsstoffen)
Im ersten Versuchsabschnitt wurde der Einfluss verschiedender kommerziell erhältlicher Verdünner unterschiedlicher Zusammensetzungen auf die Motilität, Membranintegrität und den akrosomalen Status flüssigkonservierten Hengstsamens untersucht. (s. Abb. 5) Als Vergleichsmedien dienten folgende Verdünner (s. Tab. 1, Zusammensetzung s. Anhang).
Material und Methoden
Tab. 1: Verdünner und Milchkomponenten Versuchsabschnitt I
Verdünner Milchkomponente Mengenangabe pH/Osmol.
INRA 82 UHT-Milch 1:1 7,0/300
INRA 82 Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) 30g ad 1000 ml 7,0/303 INRA 96® (IMV, Fa. L`Aigle, Frankreich)
INRA 96 UHT-Milch 1:1 6,9/326
INRA 96 Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) 30g ad 1000 ml 6,9/305
B UHT-Milch 1:1 7,1/323
B Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) 30g ad 1000 ml 7,1/310
Die tiefgefrorenen Verdünner wurden bei Raumtemperatur (+20°C) aufgetaut. Für die computervideomikrographische und durchflusszytometrische Untersuchung wurde ein Teil des Nativsamens mit den o.a. auf +37 °C vorgewärmten Medien auf eine Dichte von 50 Millionen Spermien/ml verdünnt. Die Lagerung bis zu den Untersuchungen erfolgte aufrecht stehend bei +5°C im Kühlschrank bzw. für den Transport zur Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken der Tierärztlichen Hochschule Hannover in einer mit einem Kühlakku versehenen Frischsamentransportbox (Fa. Georg Utz AG, Bremgarten, Schweiz) bei +5°C.
Zur Untersuchung des Einflusses verschiedener Verdünner auf die Spermaqualität zentrifugierter Frischsamenproben wurden wie oben beschrieben acht weitere Probenansätze hergestellt, auf 50 Millionen Spermien/ml verdünnt und anschließend bei 600 x g zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert (Tischzentrifuge Universal 32, Fa. Hettich, Tuttlingen).
Nach Zentrifugation wurde der Überstand vorsichtig mittels Wasserstrahlpumpe abgesaugt und das Samenpellett auf einem Rüttler resuspendiert. Anschließend wurden die Samenproben mit dem entsprechenden Verdünner auf 50 Millionen Spermien/ml verdünnt und bei +5°C gelagert.
Computervideomikrographische (s. Kap. 3.1.5) und durchflusszytometrische Messungen (s. Kap. 3.1.6) der verdünnten und zentrifugierten Proben erfolgten nach 2, 24, 48, und 72 Stunden.
Abb. 5: Schema Versuchsaufbau im Versuchsabschnitt I des ersten Versuchsteils (Effekte von Milchinhaltsstoffen)
Samengewinnung n = 4 Hengste m = 3 Ejakulate
Standardspermatologie - Volumen - Dichte - GSZ - Motilität
Verdünnung mit
- INRA 82 + UHT-Milch - INRA 82 + Casein - INRA 96®
- INRA 96 + UHT-Milch - INRA 96 + Casein - B + Casein
- B+ UHT-Milch 50 x 106 SZ/ml
Verdünnte Halteproben
Zentrifugation 10 min. 600 x
Zentrifugierte Halteproben
Lagerung bei +5°C
Computermikrographische US - Motilität
- Geschwindigkeitsparameter 2 h, 24 h,48 h,72 h
Durchflusszytometrische US - Plasmamembranintegrität - Akrosomaler Status
FITC-PNA/PI-Assay 2 h, 24 h, 48 h, 72 h
Material und Methoden
3.1.4.2 Samenaufbereitung im Versuchsabschnitt II des ersten Versuchsteils (Effekte von Milchinhaltsstoffen)
In diesem Versuchsabschnitt wurde der additive Effekt von ß-Lactoglobulin auf die Motilität, Membranintegrität und den akrosomalen Status flüssigkonservierten Hengstsamens untersucht.
Der Verdünner B (Zusammensetzung s. Anhang) wurde mit verschiedenen Inhaltsstoffen wie folgt versetzt (s. Tab. 2).
Tab. 2: Verdünner und Milchkomponenten Versuchsabschnitt II
Verd. Milchkomponente Mengenangabe pH/Osmol.
B Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) 30g ad 1000 ml 7,1/310 B ß-Lactoglobulin (Fa. SIGMA) 7,1g ad 1000 ml 7,1/303 B Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) +
ß-Lactoglobulin (Fa. SIGMA)
30g ad 1000 ml 7,1g ad 1000 ml
7,1/310
Die Herstellung, Lagerung und Untersuchung der zentrifugierten Halteproben erfolgte wie in Kap. 3.1.4.1 beschrieben (s. Abb. 6).
Abb. 6: Schema Versuchsaufbau im Versuchsabschnitt II des ersten Versuchsteils (Effekte von Milchinhaltsstoffen)
Samengewinnung n = 4 Hengste m = 3 Ejakulate
Standardspermatologie - Volumen - Dichte - GSZ - Motilität
Verdünnung mit - B + Casein
- B + ß-Lactoglobulin
- B + Casein + ß-Lactoglobulin 50 x 106 SZ/ml
Zentrifugierte Halteproben Zentrifugation 10 min 600 x g
Computermikrographische US - Motilität
- Geschwindigkeitsparameter 2 h, 24 h, 48 h, 72 h
Durchflusszytometrische US - Plasmamembranintegrität - Akrosomaler Status
FITC-PNA/PI-Assay 2 h, 24 h, 48 h, 72 h
Material und Methoden
3.1.4.3 Samenaufbereitung im Versuchsabschnitt III des ersten Versuchsteils (Effekte von Milchinhaltsstoffen)
In diesem Versuchsabschnitt wurden drei Verdünnermedien hinsichtlich ihres Einflusses auf die Motilität, Membranintegrität und den akrosomalen Status flüssigkonservierten Hengstsamens untersucht. Als Vergleichsmedien dienten folgende Verdünner (s. Tab. 3, Zusammensetzung s. Anhang):
Tab. 3: Verdünner und Milchkomponente Versuchsabschnitt III
Verd. Milchkomponente INRA 96® (IMV, Fa. L`Aigle, Frankreich)
Equi ProTM (Fa. Minitüb, Tiefenbach)
C (pH 7,0, Osmol. 305) 30g Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach)
Die Herstellung, Lagerung und Untersuchung der zentrifugierten Halteproben erfolgte wie in Kap. 3.1.4.1 beschrieben. Der Versuchsaufbau entspricht dem Versuchsabschnitt II (s. Abb. 6).
3.1.4.4 Samenaufbereitung im Versuchsabschnitt IV des ersten Versuchsteils (Effekte von Milchinhaltsstoffen)
In diesem Versuchsabschnitt wurde der Effekt von Casein und Molkepulver auf die Spermaqualität flüssigkonservierten Hengstsamens verglichen. Als Vergleichsmedien dienten folgende Verdünner (s. Tab. 4, Zusammensetzung s.
Anhang):
Tab. 4: Verdünner und Milchkomponente Versuchsabschnitt IV
Verd. Milchkomponente Mengenangabe pH/Osmol.
C Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) 30g ad 1000 ml 7,0/305
C UHT-Milch 1:1 6,9/306
C Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) + Molkepulver (Fa. Minitüb, Tiefenbach)
30g ad 1000 ml 10g ad 1000 ml
7,0/305
C Molkepulver (Fa. Minitüb, Tiefenbach) 20g ad 1000 ml 7,0/306
Die Herstellung, Lagerung und Untersuchung der zentrifugierten Halteproben erfolgte wie in Kap. 3.1.4.1 beschrieben. Der Versuchsaufbau entspricht dem Versuchsabschnitt II (s. Abb. 6).
3.1.4.5 Spermaaufbereitung im Versuchsabschnitt V des ersten Versuchsteils (Effekte von Milchinhaltsstoffen)
In diesem Versuchsabschnitt wurden der Einfluss zweier unterschiedlicher Caseine, UHT-Milch, Magermilchpulver und drei kommerziell erhältlicher Verdünner auf die Motilität, Membranintegrität und den akrosomalen Status flüssigkonservierten Hengstsamens untersucht.
Als Vergleichsmedien dienten folgende Verdünner (s. Tab. 5, Zusammensetzung s.
Anhang):
Material und Methoden
Tab. 5:Verdünner und Milchkomponente Versuchsabschnitt V
Verdünner Milchkomponente Mengenangabe pH/Osmol.
C Casein (Fa. Minitüb, Tiefenbach) 30g ad 1000 ml 6,9/299
C Casein (Fa. SIGMA) 10g ad 1000 ml 6,9/286
C Magermilchpulver (Fa. Nestlé, Typ
„Gloria“)
10g ad 1000 ml 6,9/306
C UHT-Milch 1:1 6,9/322
INRA 96® (IMV, Fa. L`Aigle, Frankreich) Equi ProTM modif. (Fa. Minitüb, Tiefenbach) Equi ProTM (Fa. Minitüb, Tiefenbach)
C Casein (Fa. SIGMA) 30g ad 1000 ml 6,9/290
Die Herstellung, Lagerung und Untersuchung der zentrifugierten Halteproben erfolgte wie in Kap. 3.1.4.1 beschrieben. Der Versuchsaufbau entspricht dem Versuchsabschnitt II (s. Abb. 6). Es wurden zusätzlich Untersuchungen nach 96 und 144 Stunden Lagerung durchgeführt.
3.1.5 Durchführung der computervideomikrographischen Untersuchung
Die computervideomikrographische Motilitätsanalyse erfolgte mit Hilfe des CASA- Systems Sperm VisionTM (Fa. Minitüb, Tiefenbach).
Vor Beginn der Messung wurden Messkammern und Pipettenspitzen auf einer Heizplatte (HAT 300, Fa. Minitüb, Tiefenbach) auf +38°C vorgewärmt. Aus den bei +5°C gelagerten Probenröhrchen wurde nach mehrfachem Schwenken 500 µl Spermiensuspension in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß pipettiert und zehn Minuten bei +38°C in einem Heizblock (Rotilabo Heater 250, Fa. Roth, Karlsruhe) inkubiert.
Anschließend wurden 20 µm tiefen Messkammern (20 Mikron, SC 20-01-04-B, Fa.
Leja, GN Nieuw-Vennep, NL) mit 2,5µl Probensuspension nach Angaben des Herstellers Minitüb befüllt und analysiert. Mittels des automatisierten Mikroskoptisches wurden sieben Gesichtsfelder ausgewertet, aus denen der Durchschnittswert als Gesamtergebnis angegeben wurde. Die Messzeit betrug 15
Folgende Bewegungsparameter wurden ermittelt:
- Gesamtmotilität (MOT) - Progressive Motilität (PMS)
- Mittlere Geschwindigkeit entlang der geglätteten Bahn-Velocity Average Path (VAP)
- Kurvolineare Geschwindigkeit-Velocity Curved Line (VCL)
3.1.6 Durchführung der durchflusszytometrischen Untersuchungen
Die Untersuchung der Plasmamembranintegrität und des akrosomalen Status der Spermien erfolgten mittels durchflusszytometrischer Verfahren unter Verwendung spezifischer Färbemethoden.
Die Messungen wurden an einem Durchflusszytometer Cell Lab QuantaTM SC der Firma Beckmann Coulter, Krefeld vorgenommen. Das Quanta System enthält eine 125µm große, dreieckige Flow-Zelle, die mit steriler, isotoner HBS-Lösung (Zusammensetzung s. Anhang) anstelle von kommerziell erhältlicher Sheath-Lösung gefüllt wurde.
Die Anregung der Fuoreszenzfarbstoffe, mit denen unterschiedliche Zellkompartimente angefärbt wurden, erfolgte mit einem Argonionenlaser der Wellenlänge 488 nm.
Das emittierte Licht wurde über folgende Filter auf Photomultiplikatordetektorenröhren (PMT´s) gerichtet, die entsprechend der Fuoreszenzintensität analoge Spannungsimpulse herstellten:
- FL1 (525/20 nm) für die grüne Fluoreszenz - FL 2 (575/20 nm) für die orange Fluoreszenz - FL 3 (670 LP nm) für die rote Fluoreszenz
Die Probenlösung gelangte in einen kapillären Spalt zwischen zwei Elektroden. Beim Durchqueren dieses elektrischen Feldes verdrängte das Spermatozoon die umgebende Flüssigkeit. Der elektrische Widerstand wurde erhöht. Da die Amplitude des erzeugten Spannungspulses proportional zum Volumen der Zelle war, war eine Größenbestimmung und Partikelzählung unabhängig von Zellform und Granularität möglich.
