blaues Anregungs-
licht
2
angeregtes gelbgrünes Fluoreszenz-
licht
restliches blaues Anregungs-
licht
reines Fluoreszenz-
licht
3 4
Darstellung: Fluoreszenzmikroskop, 1) Lichtquelle, 2) Durchlaßfilter für Anre- gungslicht, 3) Präparat mit Fluorochrom, 4) Sperrfilter für Anregungslicht, 5) Beobachter
UV blau gelb rot IR
Zur Fortbildung Aktuelle Medizin DEFINITION
Fluoreszenz-Mikroskopie
Die Fluoreszenzmikroskopie nutzt in der Mikroskopie die Tatsache aus, daß manche biologisch und medizi- nisch interessierenden Stoffe durch Strahlung zum Leuchten angeregt werden können; ein Effekt, den man als Fluoreszenz bezeichnet. Dabei wird ein Teil der eingestrahlten Energie in Wärme umgewandelt, der kleinere Rest wieder als Strahlung emittiert. Da Strahlungsenergie und Wellenlänge in umgekehrtem Ver- hältnis zueinander stehen, ist die Fluoreszenzstrahlung gegenüber der Anregungsstrahlung längerwel- lig: bei der Fluoreszenz wird mit kurz- welligem Licht angeregt, durch Fluoreszenz erzeugtes, längerwelli- ges Licht emittiert.
In der klassischen Fluoreszenzmi- kroskopie wurde mit unsichtbarem Ultraviolettlicht angeregt, auf Grund der längerwelligen Fluoreszenz- strahlung lag die emittierte Strah- lung im sichtbaren Bereich. Oder anders ausgedrückt: Die Substanz wurde mit unsichtbaren Strahlen zum Leuchten angeregt. Heute wird auch mit sichtbarem Licht, zum Bei- spiel Blaulicht, angeregt und im gelbgrünen Fluoreszenzbereich be- obachtet.
Voraussetzung für eine Fluoreszenz beziehungsweise für ihre Anwen- dung in der Mikroskopie ist natür- lich die Existenz einer Substanz in dem zu untersuchenden Stoff, die sich zum Fluoreszieren anregen läßt. Manche Stoffe fluoreszieren von Natur aus. Die Objekte, die in der medizinischen Mikroskopie aber im allgemeinen besonders interes- sieren, wie Zellen und Gewebe, be- sitzen meist keine natürliche Fluo- reszenz. Man kann aber diese Stoffe zum Fluoreszieren bringen und dar- über hinaus sogar dazu, daß nur ge- wisse Strukturen in diesen Objekten fluoreszieren und auf diese Weise die Teile herausheben, für die man sich besonders interessiert. Dazu appliziert man analog den mikrosko- pischen Färbeverfahren Stoffe, so- genannte Fluorochrome, die sich in, den interessierenden Objektstruktu-
ren ablagern und sie zum Fluores- zieren bringen. Die Konzentration der applizierten Fluorochrome ist sehr gering, sie erscheinen bei der normalen Durchlichtmikroskopie deshalb farblos. Erst bei Anregung mit Licht der richtigen Wellenlänge leuchten sie auf. Als Fluorochrome werden neben vielen anderen auch einige in der Histologie schon seit langer Zeit benützte normale Farb- stoffe verwandt.
Den Aufbau eines Fluoreszenzmi- kroskopes zeigt das Schema. Die Lichtquelle liefert die zur Anregung der Fluoreszenz erforderliche Strah- lung geeigneter Wellenlänge. Das Anregungsfilter läßt nur die für das Verfahren notwendige Wellenlänge auf das Präparat mit dem Fluoro- chrom fallen. Alle restlichen Wellen- längen werden von dem Filter zu- rückgehalten.
Ein dem Präparat nachgeschaltetes selektives Sperrfilter hält das über- schüssige, im Objekt nicht absor- bierte Erregerlicht zurück, so daß nur das von den interessierenden Strukturen ausgehende Fluores- zenzlicht in das Auge des Beobach- ters gelangt.
Neben dem Einsatz von Fluores- zenzverfahren in den Gebieten der Bakteriologie, Mikrobiologie, Virolo- gie, Zytologie und Parasitologie und zum Beispiel der quantitativen DNA- Bestimmung ist das heute am weite-
sten verbreitete Teilgebiet der Fluo- reszenzmikroskopie die Immunfluo- reszenzmikroskopie. Die Immun- fluoreszenz erlaubt den Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen durch Nachweis des dort auftreten- den Fluoreszenzlichtes. Dazu wer- den die Antikörper in einer Lösung mit einem geeigneten Fluorochrom eingefärbt. Untersucht man die Fluoreszenz dieser Lösung mit dem zu untersuchenden Material nach ei- nem entsprechenden Waschprozeß, zeigt die Fluoreszenz die Stellen an, an denen sich Antigene mit den fluo- rochromierten Antikörpern verbun- den haben. Sind die Antikörper da- gegen ausgewaschen worden, wa- ren sie also nicht die spezifisch rich- tigen, tritt keine Fluoreszenz auf.
Der Test fällt negativ aus.
Vorteile der Fluoreszenzmikrosko- pie gegenüber der konventionellen Mikroskopie liegen in ihrer hohen Empfindlichkeit, da bei einem guten Fluoreszenzbild der Kontrast außer- ordentlich hoch ist, in der großen Spezifität, in der Tatsache, daß man direkt an Substraten arbeiten kann, ohne diese vorher aufbereiten oder anreichern zu müssen und auch in der Einfachheit der Fluoreszenzver- fahren, die nicht schwieriger als konventionelle Färbeverfah ren
sind. A. Habermehl
Literatur
Holz, H. M.: Was man von der Fluoreszenz- Mikroskopie wissen sollte. Carl Zeiß, Oberko- chen, Bestell-Nr. K 41-005
2698 Heft 45 vom 10. November 1977
