Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der [beta]1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals

Aus dem Institut für Tierschutz und Verhalten (Heim-, Labortiere und Pferde)

der Tierärztlichen Hochschule Hannover und

dem Institut für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf

Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca²⁺-aktivierten Kaliumkanals

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Mareike Kristina Budack

aus Hamburg

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung:

Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth Univ. Prof. Dr. H. Ehmke

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth 2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. B. Schröder

Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2004

Meinen Eltern

BUDACK, M., M.E. BLANK, J. FAULHABER u. H. EHMKE (2003):

In vitro Untersuchungen zur Aldosteronfreisetzung an isolierten Nebennieren der Maus.

Posterpräsentation der kardiovaskulären Forschung am UKE Hamburg, 14.10.2003

Vorab zur Veröffentlichung eingereichte Teilergebnisse dieser Arbeit:

FAULHABER, J., M. BUDACK, M.E. BLANK u. H. EHMKE (2004):

In vitro determination of aldosterone secretion in isolated mice adrenal glands.

83. Jahreskongress der Deutschen Physiologischen Gesellschaft Leipzig, 14.-17.03.2004, in prep.

INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung ... 11

2 Literaturübersicht ...13

2.1 Blutdruckregulation ... 13 2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ... 15

2.1.1.1 Aldosteron ... 17

2.1.1.2 Hyperaldosteronismus ... 22

2.2 Ionenkanäle ... 24

2.2.1 Kaliumkanäle ... 24

2.2.1.1 Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal ... 27

2.2.1.1.1 SK-Kanal ... 27

2.2.1.1.2 IK-Kanal ... 28

2.2.1.1.3 BK-Kanal ... 29

2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle auf die Blutdruckregulation ... 37

2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung ... 40

3 Material und Methode ... 41

3.1 Material ... 41

3.1.1 Lösungen und Puffer ... 41

3.1.1.1 Nebenniereninkubation ... 41

3.1.1.2 Gelelektrophorese ... 42

3.1.2 Chemikalien und Enzyme ... 43

3.2 Versuchstiere ... 44

3.2.1 Versuchsserien und Stichprobenumfang ... 45

3.3 Methoden ... 47

3.3.1 Genotypisierung der Mäuse ... 47

3.3.1.1 Lysierung der Ohrprobe ... 47

3.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion ... 48

3.3.1.3 Gelelektrophorese ... 49

3.3.2 Hämodynamische Untersuchungen an wachen Mäusen ... 50

3.3.2.1 Katheterherstellung ... 50

3.3.2.2 Operative Katheterimplantation ... 50

3.3.2.3 Blutdruckmessung ... 53

3.3.3 Spironolactonapplikation ... 55

3.3.4 Bestimmung von Blutparametern ... 56

3.3.4.1 Blutabnahme ... 56

3.3.4.1.1 Blutabnahme für die Elektrolyt-/ Kreatininbestimmung ... 56

3.3.4.2.2 Chlorid ... 58

3.3.4.2.3 Kreatinin ... 59

3.3.4.2.4 Renin ...… 59

3.3.4.2.5 Aldosteron ... 60

3.3.5 Morphometrische Untersuchungen ... 62

3.3.6 Inkubation von Nebennieren in vitro ... 63

3.3.6.1 Organentnahme und Präparation ... 63

3.3.6.2 Inkubation ... 63

3.3.6.2.1 Vorversuche ... 64

3.3.6.2.2 Kaliumstimulation ... 65

3.3.6.2.3 ANG II-Stimulation ...… 66

3.3.6.2.4 ACTH-Stimulation ... 67

3.3.7 Statistik ... 68

4 Ergebnisse ... 69

4.1 Genotypisierung ... 69

4.2 Versuchsserie 1 und 2 ... 71

4.2.1 Hämodynamische Daten ... 71

4.2.2 Morphometrische Daten ... 72

4.2.3 Ergebnisse der Blutuntersuchungen ... 74

4.2.3.1 Elektrolyte und Kreatinin ... 74

4.2.3.2 Renin ... 75

4.2.3.3 Aldosteron ... 76

4.3 Versuchsserie 3 ... 77

4.3.1 Hämodynamische Daten ... 77

4.3.2 Morphometrische Daten ... 78

4.4 Versuchsserie 4 ... 79

4.4.1 Vorversuch ... 80

4.4.2 Kaliumstimulation ... 81

4.4.2.1 Dosis-Wirkungskurve ... 81

4.4.2.2 Stimulation mit Kalium ... 82

4.4.3 ANG II-Stimulation ... 84

4.4.3.1 Dosis-Wirkungskurve ... 84

4.4.3.2 Stimulation mit ANG II ... 85

4.4.4 ACTH-Stimulation ... 88

4.4.4.1 Dosis-Wirkungskurve ... 88

4.4.4.2 Stimulation mit ATCH ...…. 89

5 Diskussion ... 92

6 Zusammenfassung ... 108

7 Summary ... 111 8 Literaturverzeichnis ... 114 9 Anhang ... 138

A. Arterie

Abb. Abbildung

ACTH Adrenocorticotropeshormon

ANG II Angiotensin II

AT1 Angiotensin-Rezeptor Typ 1

AT2 Angiotensin-Rezeptor Typ 2

BK-Kanal big conductance Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

BW Körpergewicht

°C Grad Celsius

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat

cm Zentimeter

C-Terminus Carboxyterminus von Proteinen bzw. Peptiden

dl Deziliter

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP 2´-Desoxyribonukleotid-5´-triphosphat ED50 50% der Effektiven Dosis

EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure

et al. et alii (und weitere)

Fa. Firma

g Gramm h Stunde

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino)-ethansulfonsäure

HGW Herzgewicht

H2O Wasser

HZV Herzzeitvolumen

I.D. Innendurchmesser

I.E. Internationale Einheiten

IK-Kanal intermediate conductance Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal in prep. in preparationem (in Vorbereitung)

i.p. intraperitoneal

Kap. Kapitel

kb Kilobasenpaare

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

Kir einwärts gleichrichtender Kaliumkanal

KO Knockout Maus

Kv spannungsabhängiger Kaliumkanal l Liter

Lig. Ligamentum

LV linker Ventrikel

M molar

MAD mittlerer arterieller Blutdruck

mg Milligramm

min Minute

MJ Megajoule

ml Milliliter

mm Millimeter

mM millimolar

mosmol Milliosmol

MW Mittelwert

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

n Anzahl

ng Nanogramm

nm Nanometer

nM nanomolar

N. Nervus

NO Stickoxid

N-Terminus Aminoterminus von Proteinen bzw. Peptiden

O.D. Aussendurchmessser

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

PGI2 Prostaglandin I2 (Prostacyclin)

PKA Proteinkinase A (cAMP-abhängig) PKC Proteinkinase C (Ca²⁺-abhängig)

PKG Proteinkinase G (cGMP-abhängig)

pmol Picomol

PRC Plasmareninkonzentration

pS Picosiemens

® eingetragenes Warenzeichen

RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

RIA Radioimmunoassay

RT Raumtemperatur

RV rechter Ventrikel

s.c. subkutan

SD Standardabweichung

SEM Standardfehler des Mittelwerts

SK-Kanal small conductance Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBE Tris-Borsäure-EDTA

TM Transmembransegment

TPR totaler peripherer Widerstand

Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf UV-Licht ultraviolettes Licht

V Volt

V. Vene

VIP vasoaktives intestinales Peptid

WT Wildtyp Maus

x g x-fache Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/sec²)

ZVD zentral venöser Druck

Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt.

Einleitung

1 Einleitung

Die arterielle Hypertonie ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem, von dem 25 % der erwachsenen Bevölkerung der Industrieländer betroffen sind (BURT et al. 1995, STOWASSER u. GORDON 2003). Trotz der herausragenden Bedeutung des erhöhten Blutdrucks als Krankheitsursache ist seine Ätiologie weitgehend unbekannt.

Durch die Anwendung genetischer Methoden haben sich für die Analyse von Faktoren, die an der Entstehung einer Hypertonie beteiligt sind, völlig neue Perspektiven eröffnet. Die gezielte Ausschaltung identifizierter Gene ermöglicht es, primäre physiologische Mechanismen auch in vivo zu charakterisieren. Tatsächlich hat die Untersuchung seltener erblicher Formen von arterieller Hypertonie, bei denen Mutationen einzelner Gene mit großen Effekten auf den Blutdruck korreliert sind, wichtige neue Einsichten in fundamentale Wege der Blutdruckregulation beim Menschen aufgezeigt (LIFTON et al 2001). Bislang konnten mindestens 8 Gene identifiziert werden, bei denen spezifische Fehlfunktionen direkt zu einer Hypertonie führen. Bemerkenswert ist hierbei, dass in allen Fällen Genprodukte betroffen waren, welche die renale Salzreabsorbtion und Volumenhomöostase beeinflussen.

Bei einer Reihe von genetischen Veränderungen betraf die pathophysiologische Störung direkt die Regulation des Blutdrucks und der Salzhomöostase durch das Renin-Angiotensin- Aldosteron-System, z.B. über eine erhöhte Aldosteronsynthese (PASCOE et al. 1992), eine gesteigerte Aldosteronsekretionsrate (LIFTON et al. 1992) oder eine veränderte Aldosteron- Mineralocorticoidrezeptor-Interaktion (GELLER et al. 1998 u. 2000).

Die Konzentrationen von Aldosteron im Plasma unterliegen einer strengen physiologischen Regulation. Die Aldosteronsekretion wurde in früheren Studien bereits intensiv an in vitro kultivierten Zona glomerulosa-Zellen untersucht (HILBERS et al. 1999, LOTSHAW 1997 a, b u. 2001). Die Resultate legten nahe, dass die Kontrolle der Aldosteronsekretion vor allem über Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration infolge von Membranpotential- änderungen erfolgt, wodurch die sekretorische Aktivität der Zona glomerulosa-Zellen entscheidend beeinflusst wird. Da die Höhe des Membranpotentials eng an die Aktivität von Kaliumkanälen geknüpft ist (NELSON et al. 1995), wurde bereits seit längerem vermutet, dass eine Modulation von Kaliumkanälen maßgeblich an der Regulation der Aldosteronsekretion beteiligt ist. Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Prof. H. Ekmke

(2003) konnte an akut dissoziierten Zona glomerulosa-Zellen von Wildtyp Mäusen tatsächlich ein sehr ausgeprägter spannungs- und calciumabhängiger Kaliumstrom nachgewiesen werden, der sich durch Zugabe von 100 nM Iberiotoxin vollständig blockieren ließ. Dieser Befund unterstützt die Vorstellung, dass BK-Kanäle an der Regulation der Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen beteiligt sein könnten.

In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielen, indem sie einen negativen Feedback-Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermitteln (JAGGAR et al.

2000). Diese Interpretation schien in hervorragender Weise durch den Phänotyp von Mäusen bestätigt zu werden, bei denen die β1−Untereinheit genetisch inaktiviert wurde (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000). Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde geschlussfolgert, dass die arterielle Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz des erhöhten Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b, STANDEN 2000, PATTERSON et al. 2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher Mechanismus wäre von größtem wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich hierbei um den erstmaligen Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie handeln würde.

Allerdings könnte der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen auch eine alternative Erklärung finden. In Anbetracht der starken funktionellen Expression von BK-Kanälen in Zona glomerulosa-Zellen wäre es sehr gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der BKβ1−Untereinheit zu einer gestörten Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen, dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind. Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten starken linksventrikulären Hypertrophie (BRENNER et al. 2000 b) beitragen.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob BKβ1-/- Mäuse pathologische Veränderungen des Aldosteronsystems aufweisen, die für die Entstehung der Hypertonie ursächlich verantwortlich sind. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, soll im Rahmen dieser Arbeit des Weiteren untersucht werden, ob diese Störung durch eine veränderte Regulation der Aldosteronsekretion in den Nebennieren unter Beteiligung der BK-Kanäle verursacht wird.

Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Blutdruckregulation

Als Blutdruck wird der in den Gefäßen des Körper- und Lungenkreislaufs herrschende Druck bezeichnet, welcher die treibende hämodynamische Kraft für die Blutzirkulation darstellt. Im eigentlichen Sinne stellt der mittlere arterielle Blutdruck (MAD) den im arteriellen System auf Herzhöhe gegen den Atmosphärendruck gemessenen Druck dar. Dieser wird als Produkt des Herzzeitvolumens (HZV) und des totalen peripheren Widerstandes (TPR) zuzüglich des zentral venösen Drucks (ZVD) definiert.

MAD = (HZV x TPR) + ZVD

Der totale periphere Widerstand ist abhängig von dem Tonus und der Elastizität der Gefäßwände, während das Herzzeitvolumen eine Funktion der Herzfrequenz und des Schlagvolumens ist.

Die Regelung des Blutdrucks erfolgt durch Änderung des peripheren Widerstands durch Vasodilatation bzw. Vasokonstriktion der Widerstandsgefäße oder durch Veränderung des Herzzeitvolumens (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).

Eine Vielzahl physiologischer Systeme, die humorale, nervöse und metabolische Faktoren einschließen, ist an der Blutdruckregulation beteiligt (GUYTON 1991, COWLEY 1992, PERSSON 1996). Diese Systeme interagieren in komplexer Wechselwirkung, wodurch eine adäquate Durchblutung der peripheren Gewebe sowie die Aufrechterhaltung des MAD gewährleistet werden. Anhand des Zeitraums, in welchem die Regulationssysteme wirksam werden, können kurzfristige, mittelfristige und langfristige Systeme unterschieden werden.

Die kurzfristige Blutdruckregulation basiert vor allem auf der Wirkung des vegetativen Nervensystems. Die schnellste der nervalen Reaktionen wird durch arterielle Pressorezeptoren vermittelt, die in der Gefäßwand des Carotissinus sowie des Aortenbogens lokalisiert sind und den Pressorezeptorenreflex auslösen. Diese Mechanorezeptoren detektieren den mittleren Blutdruck sowie Schwankungen des systemischen Blutdrucks, der Herzfrequenz und der Anstiegssteilheit des Druckpulses anhand einer veränderten

Wandspannung und senden über Afferenzen der IX. und X. Hirnnerven Signale zum Nucleus tractus solitarii und Nucleus ambiguus in der dorsalen Medulla oblongata. Über efferente sympathische Nervenbahnen erfolgt eine Regulation der Herzfrequenz, der Kontraktilität des Herzens und des TPR, wohingegen parasympathische Efferenzen ausschließlich eine Reduktion der Herzfrequenz induzieren. Aufgrund dieser Mechanismen werden Schwankungen des MAD innerhalb von Sekunden abgepuffert (TIMMERS et al. 2003). In Volumenexpansions-Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch eine Ausschaltung des Pressorezeptorenreflexes einerseits die schnelle Blutdruckregulation hochgradig gestört war, sich andererseits der Blutdruck jedoch innerhalb einer Stunde nach Expansion des Blutvolumens mittels Infusion wieder normalisierte (DOBBS et al. 1971). In weiteren Experimenten an verschiedenen Säugetierspezies konnte gezeigt werden, dass durch Denervierung der Pressorezeptoren eine Hypertonie induziert wurde, die jedoch innerhalb von 7-14 Tagen wieder kompensiert wurde (COWLEY et al. 1973, ITO u. SCHER 1978, SHADE et al. 1990). Diese Normalisierung des Blutdrucks wurde durch andere, verzögert wirkende Kontrollmechanismen ausgelöst.

So greift nach einigen Minuten das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) in die Blutdruckregulation ein und zählt neben der Volumenverschiebung zwischen den Kapillaren und dem extravasalen Raum, dem Kinin-Kallikrein-System (RHALEB et al. 2001, TRABOLD et al. 2002) sowie parakrinen Faktoren (RUSKOAHO et al. 1997) zu den wichtigsten mittel- bis langfristig wirkenden Regulationsmechanismen (GUYTON 1991).

Die dominierende Rolle der Niere bei der langfristigen Blutdruckregulation konnte in klinischen und experimentellen Studien gezeigt werden (COWLEY u. ROMAN 1996).

Infolge von Schwankungen des Perfusionsdrucks der Niere erfolgt eine Regulation der Wasser- und Natriumausscheidung, woraus eine Veränderung des Blutvolumens resultiert (GUYTON 1992). Ebenso bestätigen die Ergebnisse von Nierentransplantationsstudien die wichtige Rolle der Niere bei der Langzeitregulation des arteriellen Drucks und der Pathogenese genetischer Formen der arteriellen Hypertonie. So konnte gezeigt werden, dass es bei der Transplantation der Niere einer genetisch hypertensiven Ratte in eine histokompatible normotensive Ratte zur Auslösung einer arteriellen Hypertonie kommt (GRAF et al. 1993, RETTIG 1993). Bei Transplantation der Niere einer normotensiven Ratte in eine bilateral nephrektomierte spontan hypertensive Ratte (SHR) konnte ein gesenkter

Literaturübersicht

2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

Das systemische Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ist von zentraler Bedeutung für die mittel- bis langfristige Blutdruckregulation und die Homöostase des Wasser- und Elektrolythaushalts des Organismus. Die Peptidase Renin wird in den Epitheloidzellen des juxtaglomerulären Apparats der Niere synthetisiert (BARAJAS 1979). Die Sekretion von Renin aus den Epitheloidzellen wird durch unterschiedliche Stimuli induziert. So wird die Reninfreisetzung durch Abnahme des Nierenperfusionsdrucks, durch Verringerung der Na⁺- Konzentration im proximalen Teil des distalen Tubulus (Macula densa) und durch eine gesteigerte Sympathikusaktivität stimuliert. Die Reninsekretion unterliegt außerdem der Kontrolle durch humorale Faktoren einschließlich Angiotensin II (ANG II), NO, Endothelin und Steroidhormonen (TAUGNER et al. 1984, WAGNER et al. 1998). Spezielle Second messenger wie cAMP (Steigerung der Reninsekretion), Ca²⁺ und Proteinkinase C (Hemmung der Reninsekretion) sowie cGMP (Steigerung/Hemmung der Reninsekretion) vermitteln unter anderem auf zellulärer Ebene die Signalweiterleitung (FRIIS et al. 2002).

Renin spaltet aus dem von der Leber synthetisierten und ins Plasma freigesetzte Angiotensinogen das Dekapeptid Angiotensin I ab. Dieses wird unter Abspaltung zweier Aminosäuren durch das ubiquitär vorkommende Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) in das stark biologisch aktive Oktapeptid ANG II umgewandelt (siehe Abb. 1).

Angiotensinogen (452 AS)

Angiotensin I (10 AS)

Angiotensin II (8 AS)

AT1 AT2

ACE Renin

• Zelldifferenzierung

• Hemmung der Proliferation

• Blutdruckregulation

• Vasokonstriktion

• Aldosteronfreisetzung

• Kardiale Kontraktilität

• Catecholaminfreisetzung

• Kardiale u. vaskuläre Hypertrophie

• Aufrechterhaltung der GFR

• Steigerung der Na⁺-Resorption

Abbildung 1: Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). AS: Aminosäure;

ACE: Angiotensin-Converting-Enzym; AT1: Angiotensin-Rezeptor Typ 1;

AT2: Angiotensin-Rezeptor Typ 2; GFR: glomeruläre Filtrationsrate

Die Wirkungen von ANG II werden über die G-Protein-gekoppelten AT1- und AT2- Rezeptoren vermittelt. Bei Nagetieren konnten 2 Isoformen des AT1-Rezeptors, AT1a- und AT1b-Rezeptor, identifiziert werden. Die Rezeptoren sind an der Plasmamembran von Zellen kardiovaskulärer, endokriner und endothelialer Organe lokalisiert (KASCHINA u. UNGER 2003). Der AT1a-Rezeptor ist unter anderem an der peripheren Vasokonstriktion, der Hypertrophie glatter Muskulatur, der renalen Salz- und Wasserresorption und an der zentralen Blutdruckregulation beteiligt. Der AT1b-Rezeptor wird unter anderen in endokrinen Organen wie der Nebenniere und der Hypophyse sowie in mesangialen und juxtaglomerulären Zellen exprimiert und ist beispielsweise an der Regulation der Aldosteronsekretion in den Nebennieren beteiligt (KASCHINA u. UNGER 2003). Der AT2-

Literaturübersicht

Rezeptor ist für die fetale Entwicklung, die Zelldifferenzierung, die Apoptose und Regeneration von Gewebe sowie die Blutdruckregulation wichtig (CAREY et al. 1999).

Neben dem klassischen systemischen, endokrinen System, bei dem alle Komponenten des RAA-Systems in der Blutbahn zirkulieren und so zu den Zielorganen transportiert werden, sind in den letzten Jahren lokale Systeme in verschiedenen Organen einschließlich Gehirn, Herz, Gefäße, Fettgewebe, Niere und Nebenniere beschrieben worden (PHILLIPS et al.

1993). Die physiologische Bedeutung und die gewebsspezifische Regulation dieser lokalen Renin-Angiotensin-Systeme ist derzeit nur unvollständig bekannt. Untersuchungen stützen jedoch die Hypothese, dass diese lokalen Systeme unter anderem eine pathogenetische Rolle bei der Entwicklung bestimmter Hypertonieformen und Nephropathien spielen sowie an den Hypertonie-assoziierten Endorganschäden beteiligt sind (PINTO et al. 1997, LUFT et al.

1999, PARK et al. 2003).

2.1.1.1 Aldosteron

Aldosteron gehört zu den Steroidhormonen mit 21 C-Atomen und wird aufgrund seiner speziellen Wirkung auf den Elektrolythaushalt als Mineralocorticoid bezeichnet.

Aldosteron wird in den Nebennieren synthetisiert, welche morphologisch in die Rindenschicht (cortex) und das Mark (medulla) unterteilt werden. In der Rindenschicht lassen sich histologisch drei Zonen differenzieren: die äußere Zona glomerulosa, in der Aldosteron produziert wird, die Zona fasciculata als Produktionsregion der Glucocorticoide sowie die innen gelegene Zona reticularis, in der vor allem Androgene synthetisiert werden.

In der einheitlich strukturierten Medulla werden die Catecholamine Adrenalin und Noradrenalin produziert (DUNN 1970, BLAND et al. 2003).

Wie alle Steroidhormone wird Aldosteron über Zwischenprodukte aus Cholesterol als Ausgangssubstrat synthetisiert (siehe Abb. 2). Über die Substrate Pregnenolon und Progesteron entsteht 11-Desoxycorticosteron, aus welchem sowohl Corticosteron als auch Aldosteron gebildet werden kann. Entscheidend für die Differenzierung in Corticosteron bzw. Aldosteron sind zwei Enzyme, welche die letzten Syntheseschritte katalysieren und eine spezifische Lokalisation in der Nebenniere aufweisen. Die 11β-Hydroxylase CYP11B1 (auch P450c11 genannt) wird in Zellen der Zona fasciculata exprimiert und

vermittelt die Bildung der wichtigsten Glucocorticoide Corticosteron und Cortisol. Im Gegensatz dazu kommt die Aldosteronsynthase CYP11B2 (auch P450aldo genannt) ausschließlich in Zona glomerulosa-Zellen vor und katalysiert die drei letzten Aldosteronsyntheseschritte (MULLER 1998).

Cholesterol

11-Desoxycorticosteron (DOC)

17-OH-Pregnonolon Pregnenolon

Side chain cleavage enzyme

(CYP11A)

17α−Hydroxylase

17-OH-Progesteron Progesteron

11-Desoxycortisol 3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (CYP17)

21-Hydroxylase (CYP21)

Aldosteron Corticosteron Cortisol

Corticosteron 11β-Hydroxylation

18-Hydroxylation

18-Oxidation Corticosteron

18-Hydroxy- corticosteron

Aldosteronsynthase (CYP11B2) (P450aldo) 11β-Hydroxylase (CYP11B1)(P450c11)

11β-Hydroxylation

ACTH (kurzfristig), ANG II, K ⁺

ANG II, K ⁺ ACTH (langfristig)

Abbildung 2: Syntheseschritte und Regulatoren der Aldosteronproduktion.

Die Aldosteronproduktion unterliegt einem multifaktoriellen Kontrollsystem, durch welches die Plasmaaldosteronkonzentration an akute und chronische Veränderungen des Wasser- und Elektrolythaushalts angepasst wird. Neben den wichtigen Regulatoren ANG II

Literaturübersicht

und der extrazellulären Kaliumkonzentration (VINSON et al. 1985, LOTSHAW 2001, PEARCE et al. 2003) kontrollieren zahlreiche weitere Substanzen einschließlich Adrenomedullin (NUSSDORFER et al. 1997), Vasopressin (GALLO-PAYET u.

GUILLON 1998) und Prolactin (GLASOW et al. 1996) die Aldosteronproduktion. In diversen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass ergänzend zu dem systemischen ANG II das lokale Renin-Angiotensin-System der Nebennierenrinde einen bedeutenden Stimulus der Aldosteronproduktion darstellt (HILBERS et al. 1999, MAZZOCCHI et al.

2000). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnten alle Komponenten des Renin- Angiotensin-Systems in den Zellen der Zona glomerulosa nachgewiesen werden (MULROW 1999).

ACTH, der dominierende Regulator der Glucocorticoidproduktion, bewirkt hingegen nur eine zeitlich begrenzte Stimulation und wirkt über längeren Zeitraum inhibierend auf die Aldosteronproduktion (LUMBERS 1999, SEWER u. WATERMAN 2003). In zahlreichen Experimenten an isolierten Nebennierenzellen und Nebennierenstücken konnten weitere Faktoren identifiziert werden, die einen modulierenden Einfluss auf die Aldosteronsekretion ausüben. Hierzu gehören unter anderem Endothelin (ROSOLOWSKY u. CAMPBELL 1990), Stickoxid (HANKE u. CAMPBELL 2000), das atriale natriuretische Peptid (ATARASHI et al. 1985) und Veränderungen der extrazellulären Osmolalität (MAKARA et al. 2000).

Die Regulation der Aldosteronsekretion auf zellulärer Ebene erfolgt über verschiedene Signalkaskaden. So wird die ACTH-Wirkung über cAMP und die Stimulierung mittels ANG II unter anderem durch den Phosphatidylinositolmechanismus vermittelt (SPÄT 1988, SPÄT et al. 1991). Intensive in vitro Untersuchungen unterstreichen jedoch die große Bedeutung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration (siehe Abb. 3). So wird durch einen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration die Aldosteronsekretion stimuliert (SPÄT et al. 1991, ROSSIER et al. 1996 a). Der Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration erfolgt aufgrund einer Aktivierung von T- und L-Typ Ca²⁺-Kanälen (ROSSIER et al. 1996 b) und nichtselektiven Kationenkanälen (LOTSHAW u. LI 1996) sowie durch Freisetzung von Ca²⁺ aus intrazellulären Calciumspeichern (BARRETT et al. 1989). Die spannungsabhängigen T- und L-Typ Ca²⁺-Kanäle werden durch Membrandepolarisation unter anderem infolge eines Anstiegs der extrazellulären K⁺-Konzentration aktiviert und, wie Untersuchungen zeigten, durch ANG II in ihrer Funktion moduliert (CHEN et al. 1999

b). Da die Höhe des Membranpotentials eng mit der Aktivität von Kaliumkanälen korreliert, wurde bereits seit längerem vermutet, dass eine Modulation von Kaliumkanälen durch Änderung der extrazellulären Kaliumkonzentration und/oder ANG II maßgeblich an der Regulation der Aldosteronsekretion beteiligt sein könnte. Trotz zahlreicher Untersuchungen und des Nachweises einer Reihe von Kaliumkanaluntereinheiten in Zellen der Zona glomerulosa konnte jedoch bis heute kein Konsens hinsichtlich ihrer Relevanz für die Aldosteronsekretion herbeigeführt werden (BRAUNEIS et al. 1991, VASSILEV et al.

1992, PAYET et al. 1995, LOTSHAW 1997 a, b).

ANG II

Ca ²⁺

ACTH

(AT1_b-Rezeptor)

IP₃

Ca²⁺

Ca²⁺ Ca²⁺

Ca ²⁺

K

Ca ²⁺

Ca ²⁺

DAG

PKC

Calmodulin

CaMK

(ACTH-Rezeptor)

Ca ²⁺

cAMP ATP

Aldosteronsynthese

Ca ²⁺

(T-typ Ca²⁺-Kanal)

PKA

(G-Protein)

(NSCC)

Abbildung 3: Schematische Darstellung der zellulären Signalkaskade bei Stimulation der Aldosteronsekretion durch K⁺, ANG II und ACTH. NSCC: nichtselektiver Kationenkanal; PKA: Proteinkinase A; PKC: Proteinkinase C; IP3: Inositoltriphosphat; DAG:

Diacylglycerol; ATP: Adenosintriphosphat; cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; CaMK: Ca²⁺/Calmodulinabhängige Proteinkinase.

Literaturübersicht

Seit langem ist die essentielle Bedeutung von Aldosteron für die Homöostase des Wasser- und Elektrolythaushaltes bekannt, welche in neueren Untersuchungen an transgenen Mäusen eindrucksvoll bestätigt wurde (BERGER et al. 1998). So besteht die wichtigste systemische Funktion des Aldosterons in der Steigerung des transepithelialen Ionentransports (insbesondere für Na⁺, K⁺ und Cl^-) vor allem in der Niere, jedoch auch dem Kolon, den Speicheldrüsen und den Schweißdrüsen. Hieraus resultiert eine Veränderung der Ionenkonzentration im Plasma sowie des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens und des Blutdrucks (PEARCE et al. 2003). In der Niere führt Aldosteron in den distalen Tubulusabschnitten zu einer funktionellen Aktivierung des Epithelialen Natriumkanals

„ENaC“ (CHEN et al. 1999 a, ROSSIER et al. 2002, KAMYNINA u. STAUB 2002), der Na⁺/K⁺-ATPase (VERREY et al. 2003), des Na⁺/Cl^--Cotransporter (ABDALLAH et al.

2001) und des Cl^-/Anionen-Austauscher „Pendrin“ (VERLANDER et al. 2003).

Durch zahlreiche Untersuchungen konnten darüber hinaus Mineralocorticoidrezeptoren in nicht-epithelialen Geweben einschließlich Blutgefäßen und Herz identifiziert werden (MOGUILEWSKY u. RAYNAUD 1980, COIRINI et al. 1983, GOMEZ-SANCHEZ 1997, BARBATO et al. 2002). Durch verschiedene Arbeitsgruppen wurde die Hypothese gefestigt, dass Aldosteron auch in den Blutgefäßen regulierend an dem zellulären Elektrolyttransport beteiligt ist (ALZAMORA et al. 2003, JIANG et al. 2003). Die Wirkung von Aldosteron auf kardiale Zellen unter physiologischen Bedingungen ist bis heute jedoch nicht zweifelsfrei geklärt. Im Gegensatz hierzu konnte deutlich gezeigt werden, dass Aldosteron in die Pathogenese von kardialen Erkrankungen einschließlich Herzhypertrophie und –fibrose sowie Arrhythmien involviert ist und auch ein lokales, kardiales Aldosteronsystem an dem Krankheitsgeschehen beteiligt ist (DELCAYRE et al.

2000, WEBER et al. 2003). Durch pharmakologische Untersuchungen mit Aldosteronrezeptor-Antagonisten wie Spironolacton und Eplerenon sowie durch experimentelle Studien an transgenen Mausmodellen konnte diese Hypothese untermauert werden (ROCHA et al. 2000, DELYANI et al. 2001, OESTREICHER et al. 2003, STIER et al. 2003).

2.1.1.2 Hyperaldosteronismus

Hyperaldosteronismus ist eine Erkrankung, die durch eine gesteigerte Sekretion des Mineralocorticoids Aldosteron verursacht wird und mit spezifischen Symptomen einhergeht. Anhand der Ätiologie werden ein primärer (adrenaler) und ein sekundärer (extraadrenaler) Hyperaldosteronismus unterschieden.

Der primäre Hyperaldosteronismus wird neben der erhöhten Aldosteronproduktion in der Regel durch Hypertonie, Hypokaliämie und in vielen Fällen durch eine Hypernatriämie charakterisiert (EDER u. GEDIGK 1990). Die Hypokaliämie kann klinische Symptome wie Muskelschwäche, Muskelkrämpfe, Obstipation und EKG-Veränderungen verursachen.

Weiterhin kann sich infolge der Hypokaliämie eine metabolische Alkalose entwickeln (NUSSBERGER 2003, MELBY 1989).

Auf zellulärer Ebene werden die Folgen des Hyperaldosteronismus in erster Linie durch eine Funktionssteigerung des Epithelialen Natriumkanals im distalen Tubulussystem hervorgerufen (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Durch zahlreiche Arbeitsgruppen konnte nachgewiesen werden, dass Aldosteron sowohl eine Aktivierung der vorhandenen Kanäle bewirkt als auch eine Steigerung der Expression des Epithelialen Natriumkanals in der apikalen Plasmamembran induziert (ROTIN et al. 2001, VERREY et al. 2003).

Hierdurch erfolgt primär eine verstärkte Reabsorption von Na⁺ und sekundär, durch Zunahme des transepithelialen Potentials, eine Steigerung der transepithelialen Diffusion von Cl^-. Auf der basolateralen Seite wird durch Aldosteron die Aktivität der Na⁺/K⁺- ATPase gesteigert, so dass die Natriumionen vermehrt aus den Zellen ins Blut transportiert werden. Durch die Aktivität der Na⁺/K⁺-ATPase steigt intrazellulär die Kaliumkonzentration, wodurch eine erhöhte Sekretion von Kaliumionen durch Kaliumkanäle der apikalen Plasmamembran, die ebenfalls direkt durch Aldosteron hochreguliert werden, in das Lumen erfolgt (FRINDT et al. 2002). Durch sekundäre Steuerungsprozesse erfolgt aufgrund der Elektrolytverschiebung eine Wasserretention, welche zu einem erhöhten Blutvolumen und damit verbundener Hypertonie führt.

In den letzten Jahren konnte durch verschiedene Arbeitsgruppen demonstriert werden, dass Hyperaldosteronismus neben den beschriebenen systemischen auch organische Veränderungen induzieren kann. So wurde die Beteiligung von Aldosteron bei der

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entstehen, nachgewiesen (NICOLETTI et al. 1995, FIEBELER et al. 2001, MIHAILIDOU et al. 2002). BROWN et al. (2000) stellten des Weiteren einen ätiologischen Zusammenhang zwischen der Wirkung von Aldosteron und der Entwicklung von Nephrosklerosen fest.

Das Krankheitsbild des primären Hyperaldosteronismus wurde erstmals von CONN (1955) beschrieben und hat als Conn-Syndrom Eingang in die Literatur gefunden. Aktuell gewinnt der primäre Aldosteronismus im Zusammenhang mit der Erforschung primärer Hypertonien an Bedeutung. Neueren Untersuchungen zufolge soll seine Prävalenz 2,6 bis 11 Prozent in Spezialambulanzen betragen und somit eine häufige Ursache arterieller Hypertonien sein (REINCKE et al. 2003). Der primäre Hyperaldosteronismus entsteht durch eine gesteigerte Aldosteronfreisetzung, die auf pathologische Veränderungen der Nebennieren zurückzuführen ist (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Als Folge des erhöhten Plasmaaldosteronspiegels wird die Produktion von Renin durch negativen Feedback reduziert. Ursachen der gesteigerten Aldosteronfreisetzung können beispielsweise aldosteronproduzierende Nebennierenrindentumore, Nebennierenhyperplasien sowie verschiedene genetische Defekte sein. In den letzten Jahren konnte eine Reihe von genetischen Mutationen identifiziert werden, die zu einem Hyperaldosteronismus führen (LIFTON et al. 1992, PASCOE et al. 1992, STOWASSER u. GORDON 2000).

Die Ätiologie des sekundären Hyperaldosteronismus ist sehr umfangreich. Verschiedene Erkrankungen wie Nierenarterienstenosen, chronische Nierenerkrankungen, reninproduzierende Tumore, Herzinsuffizienzen und autosomal-rezessiv vererbte renale Tubulusstörungen mit Kaliumverlust, das sogenannte „Bartter-Syndrom“, können einem sekundären Hyperaldosteronismus zu Grunde liegen (DeGROOT 1989).

Als Folge der primären Erkrankung kommt es zu einer Stimulation des Renin-Angiotensin- Aldosteron-Systems, welche durch eine Steigerung der Plasmarenin- und Aldosteronkonzentrationen charakterisiert ist.

2.2 Ionenkanäle

Alle Zellen des Organismus werden von ihrer Umgebung sowie anderen Zellen durch hydrophobe Diffusionsbarrieren, den Membranen, abgegrenzt, durch welche jedoch eine Kommunikation mit der Umgebung erfolgen kann. So werden aufgrund von Ionenbewegungen durch die Membran wichtige zelluläre Mechanismen wie beispielsweise Membranpotentialänderungen und daran gekoppelte physiologische Prozesse vermittelt. Die Lipiddoppelschicht der Zellmembran ist jedoch für geladene Teilchen quasi nicht permeabel, und so erfolgt der zelluläre Ionenaustausch über verschiedene integrale Transmembranproteine. Zu diesen Transportproteinen gehören neben Ionenpumpen, die unter Energieverbrauch Ionen entgegen ihres Konzentrationsgefälles transportieren, sogenannte Ionenkanäle, welche Ionen entlang ihres Konzentrationsgefälles den Durchtritt durch die Plasmamembran per Diffusion ermöglichen. Die meisten dieser Kanäle besitzen aufgrund von sogenannten Selektivitätsfiltern extrem unterschiedliche Leitfähigkeiten für spezifische Ionen, so dass sie wegen ihrer Selektivität unter anderem in Ca²⁺-, K⁺-, Na⁺- sowie Cl^-- Kanäle eingeteilt werden können. Differenzierte physikalische Eigenschaften ermöglichen eine weitere Spezifizierung der Kanäle. So lassen sich mit Hilfe biophysikalischer Untersuchungsmethoden die Aktivierungs- und Inaktivierungskinetiken bestimmen sowie Regulatoren des Schaltverhaltens und pharmakologische Sensitivitäten identifizieren (ASHCROFT 1999, HILLE 2001).

2.2.1 Kaliumkanäle

Kaliumselektive Ionenkanäle wurden bis heute in allen Zelltypen nachgewiesen. So werden Kaliumkanäle sowohl in erregbaren als auch in nicht-erregbaren Zellen exprimiert und sind an zahlreichen physiologischen Mechanismen beteiligt. Dazu gehören unter anderem die Kontraktion und Relaxation glatter Muskelzellen, die Weiterleitung von Aktionspotentialen, die Sekretion von Insulin, die Homöostase des Salz- und Wasserhaushalts in Nierenzellen, die Zellproliferation und in Neuronen die Steuerung elektrischer Erregbarkeit und synaptischer Plastizität. Einige Kaliumkanäle sind von Natur aus aktiv, wohingegen jedoch

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Membranpotentialänderung, Second messenger) aktiviert werden (JAN u. JAN 1994).

Darüber hinaus wird die Sensitivität der Kaliumkanäle gegenüber dem physiologischen Signal in vielen Fällen durch Proteinphosphorylierung bzw. -dephosphorylierung moduliert (LEVITAN 1999).

Die meisten Kaliumkanäle setzen sich aus mindestens zwei verschiedenen Untereinheiten zusammen, den porenbildenden α-Untereinheiten und β-Untereinheiten, die regulatorische Eigenschaften aufweisen. Durch Interaktion von vier α-Untereinheiten entsteht ein tetrameres integrales Membranprotein, welches den lipophilen Kanal bildet (ASHCROFT 1999).

Die Kaliumkanäle werden aufgrund der unterschiedlichen Anzahl von hydrophoben Transmembransegmenten (TM) der α-Untereinheiten in zwei umfassende Strukturklassen eingeteilt. Die erste Klasse umfasst die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus sechs transmembranen Helices besteht (6TM-Klasse). Zu dieser Klasse gehören unter anderem die Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanäle (Kv), die KCNQ Kanäle, die Familie der Eag Kanäle und die calciumaktivierten Kaliumkanäle (Ca²⁺-aktivierte K⁺-Kanäle). Das S4 Segment der spannungsgesteuerten Kanäle dieser Klasse enthält in regelmäßiger Abfolge basische Aminosäuren (v.a. Arginin und Lysin) und fungiert als Spannungsmesser (HILLE 2001). Bei allen Mitgliedern der 6TM-Klasse befindet sich die Porenregion zwischen den Transmembransegmenten S5 und S6 (siehe Abb. 4).

Zur zweiten großen Klasse gehören die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus zwei transmembranen Helices gebildet werden (2TM-Klasse). Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal (Kir) ist ein Vertreter dieser Gruppe (ASHCROFT 1999, MILLER 2000).

Alle bisher bekannten α-Untereinheiten von Kaliumkanälen besitzen mit kleinen Variationen die sogenannte Signatursequenz (S) in der Porenregion. Diese Signatursequenz umfasst einen Bereich von 21 Aminosäuren und zeigt eine sehr starke Homologie innerhalb der Mitglieder der Kaliumkanäle. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Bereich innerhalb der Kanalpore einen Selektivitätsfilter für Kaliumionen darstellt (HARTMANN et al. 1991, HEGINBOTHAM et al. 1994).

Abbildung 4: Membrantopologie und wichtigste Bestandteile der α-Untereinheit von Kv und Kir. Nummerierung der transmembranen Helices: Kv S1-S6 u. Kir; M1-M2; P = Pore; S = Signatursequenz; N = Aminoterminus; C = Carboxyterminus; T1 = T1 Domäne; die extrazelluläre Seite befindet sich oberhalb der einzelnen Abbildungen.

In der Regel sind bei den Vertretern beider Klassen sowohl der N-Terminus als auch der C- Terminus cytoplasmatisch lokalisiert. Eine Ausnahme bildet der spannungsgesteuerte und calciumaktivierte Kaliumkanal großer Leitfähigkeit (BK-Kanal), der ein zusätzliches Transmembransegment S0 besitzt, aufgrund dessen der N-Terminus extrazellulär lokalisiert ist (MEERA et al. 1997).

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2.2.1.1 Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal

GARDOS demonstrierte an Erythrozyten 1958 als Erster, dass durch Änderung der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration der Kaliumfluss durch die Zellmembran reguliert wird.

Bis heute wurden der Familie der Ca²⁺-aktivierten K⁺-Kanälen drei strukturell unterschiedliche Kaliumkanäle, die SK-, IK- und BK-Kanäle, zugeordnet, die alle durch einen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration aktiviert werden. Anhand ihrer Einzelkanalleitfähigkeit lassen sich die drei Subfamilien elektrophysiologisch differenzieren (VERGARA et al. 1998). Darüber hinaus besitzen sie unterschiedliche Spannungssensitivitäten und reagieren differenziert auf pharmakologisch wirksame Substanzen.

2.2.1.1.1 SK-Kanal (small conductance Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal)

SK-Kanäle besitzen sehr kleine Einzelkanalleitfähigkeiten ≤ 20 pS (in 140 mM symmetrischer KCl-Lösung). Im Gegensatz zu den BK-Kanälen werden die SK-Kanäle bereits durch nanomolare Ca²⁺-Konzentrationen spannungsunabhängig aktiviert (Vergara et al. 1998, LATORRE et al. 1989). Ca²⁺ interagiert jedoch nicht direkt mit dem SK-Kanal, vielmehr wird die Aktivierung durch Calmodulin vermittelt, welches einen heteromeren Komplex mit der α-Untereinheit des Kanals bildet (XIA et al. 1998).

Mittels Klonierung konnten drei Typen von SK-Kanälen (SK1, SK2 und SK3) identifiziert werden, die alle eine große strukturelle Ähnlichkeit mit den Kv-Kanälen aufweisen (KÖHLER et al. 1996). Die Unterscheidung der drei SK-Kanäle ist pharmakologisch aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber dem Bienengift Apamin möglich (GRUNNET et al. 2001).

SK-Kanäle konnten in zahlreichen erregbaren und nicht-erregbaren Zellen (Skelettmuskelzellen, glatte Muskelzellen, Zentrales Nervensystem, chromaffine Zellen der Nebenniere, T-Lymphozyten etc.) nachgewiesen werden (GRUNNET et al. 2001). In erregbaren Zellen fällt den SK-Kanälen eine fundamentale Rolle bei der Hyperpolarisation des Membranpotentials zu. So werden sie durch den Anstieg der intrazellulären Ca²⁺- Konzentration während eines Aktionspotentials aktiviert, was zu einer

Membranhyperpolarisation und damit zu einer Hemmung der Erregbarkeit der Zellen führt (VERGARA et al. 1998).

2.2.1.1.2 IK-Kanal (intermediate conductance Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal)

IK-Kanäle besitzen eine mittlere Einzelkanalleitfähigkeit zwischen 20 und 80 pS. Die IK- Kanäle werden genau wie die SK-Kanäle bereits durch nanomolare Ca²⁺-Konzentration spannungsunabhängig aktiviert (LATORRE et al. 1989, VERGARA et al. 1998). Ebenfalls vermittelt auch bei den IK-Kanälen Calmodulin die Ca²⁺-abhängige Aktivierung der Kanäle (JOINER et al. 2001).

IK-Kanäle werden hauptsächlich in nicht-erregbaren Zellen (wie Blut-, Endothel- und Epithelzellen) exprimiert, konnten jedoch auch in glatten Muskelzellen nachgewiesen werden. In nicht-erregbaren Zellen wird die Ca²⁺-Freisetzung aus intrazellulären Speichern durch verschiedene Substanzen wie beispielsweise Bradykinin, ATP und Histamin, induziert (GRYGORCZYK u. SCHWARZ 1983, JENSEN et al. 1998).

Pharmakologisch lassen sich die IK-Kanäle eindeutig von den SK- und BK-Kanälen unterscheiden. So können die IK-Kanäle durch das Skorpiongift Charybdotoxin und das Antimykotikum Clotrimazol reversibel blockiert werden. Im Gegensatz zu den BK- Kanälen sind sie jedoch insensitiv gegenüber dem Skorpiongift Iberiotoxin. Von den SK- Kanälen können sie durch ihre Insensivität gegenüber Apamin differenziert werden (ISHII et al. 1997).

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2.2.1.1.3 BK-Kanal (big conductance Ca²⁺-aktivierter K⁺-Kanal) Vorkommen und Funktion

BK-Kanäle (auch als KCNM1, Slo (slowpoke) oder MaxiK⁺-Kanal bezeichnet) werden ubiquitär in Zellen und Geweben mit Ausnahme der Myozyten des Herzens exprimiert (TORO et al. 1998). So konnten bis heute BK-Kanäle aus zahlreichen Geweben einschließlich Neuronen des zentralen Nervensystems (TSENG-CRANK et al. 1994), glatten Muskelzellen (SCORNIK et al. 1993, KNAUS et al. 1994) und renalen Tubuluszellen (KNAUS et al. 1995) isoliert und mittels molekularbiologischer Nachweise identifiziert werden.

Die ubiquitäre Verteilung legt nahe, dass die BK-Kanäle an zahlreichen physiologischen Mechanismen beteiligt sind. So konnte gezeigt werden, dass die BK-Kanäle unter anderem in die Regulation der Sekretion exokriner Drüsen (TRAUTMANN u. MARTY 1984), die Regulation des Elektrolyt- und Wasserhaushalts in der Niere und im Kolon (GRUNNET et al. 1999, BRAVO-ZEHNDER et al. 2000, HAY-SCHMIDT et al. 2003, PLUZNICK et al.

2003), die Regulation der Magenmotilität (CARL et al. 1990) und der Neurotransmitterfreisetzung in Neuronen (TSENG-CRANK et al. 1996) involviert sind. In glatten Muskelzellen übernehmen die BK-Kanäle eine Schlüsselrolle bei der Regulation der myogenen Kontraktilität (NELSON et al. 1995).

Ferner konnte nachgewiesen werden, dass die BK-Kanäle in unmittelbarer Nachbarschaft von L-Typ Calciumkanälen und sarkoplasmatischen Calciumspeichern lokalisiert sind und als Rückkopplungsmodulatoren dieser Calciumkanäle fungieren. Durch Aktivierung der BK-Kanäle erfolgt ein Kaliumauswärtsstrom, infolgedessen eine Hyperpolarisation der Plasmamembran mit Inaktivierung der L-Typ Ca²⁺-Kanäle erfolgt. Dadurch werden die zellulären Mechanismen gedämpft, die durch einen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺- Konzentration und/oder Membrandepolarisation eingeleitet wurden (NELSON et al. 1995).

Molekulare Struktur

BK-Kanäle bestehen aus hetero-oligomeren Komplexen von Poren-bildenden α- Untereinheiten (neue Nomenklatur: KCNM1) sowie assoziierten β-Untereinheiten (neue Nomenklatur: KCNMB1-4) mit regulatorischen Eigenschaften (GARCIA-CALVO et al.

1994, BEHRENS et al. 2000). Essentiell für die Bildung eines funktionellen Kanals ist die Assoziation von 4 α-Untereinheiten zu einem tetrameren Proteinkomplex.

α-Untereinheit

Die α-Untereinheit wurde zuerst aus der Fliege Drosophila melanogaster (ATKINSON et al. 1991) und später aus verschiedenen anderen Spezies einschließlich Mensch kloniert (BUTLER et al. 1993, TSENG-CRANK et al. 1994, VOGALIS et al. 1996). Sie wird von nur einem Gen kodiert, das jedoch mehrere Splicestellen aufweist (TSENG-CRANK et al.

1994, KNAUS et al. 1995). Die Splicestellen sind auf dem C-Terminus lokalisiert, welcher 2/3 der gesamten Länge der Untereinheit einnimmt (ORIO et al. 2002). Die verschiedenen Splicevarianten unterscheiden sich hinsichtlich ihrer biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften, wodurch gewebespezifische Unterschiede in der Regulation und in der physiologischen Funktion der BK-Kanäle erklärt werden können (KNAUS et al. 1995).

Die α-Untereinheit weist eine große Homologie zu der α-Untereinheit der Kv-Kanäle auf.

Zusätzlich zu den 6 Transmembransegmenten besitzt sie jedoch ein 7.

Transmembransegment (S0), das dem S1-Segment vorgeschaltet ist. Durch dieses zusätzliche Segment verlagert sich der N-Terminus der α-Untereinheiten auf die extrazelluläre Seite. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl diese extrazelluläre Lokalisation als auch das S0-Segment entscheidend für die Interaktion mit der regulatorischen β-Untereinheit ist (WALLNER et al. 1996, MEERA et al. 1997).

Die α-Untereinheit wird in zwei große Abschnitte unterteilt (siehe Abb. 5): einerseits den Kern (core), welcher sich vom N-Terminus bis zur Verbindung zwischen dem S8 und dem S9 Segment erstreckt, und anderseits den sich anschließenden Schwanz (tail). Der Kern umfasst unter anderem den N-Terminus, den Spannungssensor im S4-Segment und die Pore. Im Schwanz sind ein wichtiger Ca²⁺-Sensor und das Ende des C-Terminus lokalisiert.

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Abbildung 5 (ORIO et al. 2002): Molekulare Struktur des BK-Kanals.

Topologie der α- und β-Untereinheit.

Die β-Untereinheit

Die β-Untereinheiten der BK-Kanäle sind im Gegensatz zu den cytosolisch lokalisierten β- Untereinheiten der Kv-Kanäle membranständige Proteine (KNAUS et al. 1994, WALLNER et al. 1999, XIA et al. 1999). Sie wurden zuerst von KNAUS et al. (1994) aus Gewebe von Rindertracheen isoliert. Bis heute konnten 4 Varianten der β-Untereinheit (β1–β4) identifiziert werden, die in chronologischer Reihenfolge nach ihrer Entdeckung nummeriert wurden. Die β-Untereinheiten weisen untereinander eine große Homologie auf. Sie besitzen zwei homologe membranspannende Segmente, intrazellulär lokalisierte N- und C- Termini (siehe Abb. 5) und eine große extrazelluläre Schleife mit zwei Glycosylierungsstellen und vier Cysteinloci, welche Disulfidbrücken ausbilden (BRENNER et al. 2000 a, JIANG et al.

1998). Am N-Terminus befindet sich eine Phosphorylierungsregion für die cAMP- abhängige Proteinkinase PKA (CHANG et al. 1997).

Die vier β-Untereinheiten werden gewebespezifisch unterschiedlich stark exprimiert:

o Die β1-Untereinheit kommt hauptsächlich in glatten Muskelzellen vor (KNAUS et al.

1994, VOGALIS et al. 1996), konnte jedoch auch im Gehirn (TSENG-CRANK et al.

1996, CHANG et al. 1997) und in Haarzellen von Vögeln (RAMANATHAN et al.

1999 u. 2000) detektiert werden.

o Die β2-Untereinheit konnte unter anderem in humanen chromaffinen Zellen und in humanem Hirngewebe nachgewiesen werden (WALLNER et al. 1999, BRENNER et al. 2000 b).

o Die β3-Untereinheit wird in zahlreichen Geweben relativ schwach exprimiert und konnte von BRENNER et al. (2000 a) bei Menschen nur im Hodengewebe in größeren Mengen nachgewiesen werden.

o Die β4-Untereinheit ist die β-Untereinheit mit der geringsten Homologie und wird vor allem im Gehirn in verschiedenen Regionen exprimiert (MEERA et al. 2000).

Die β-Untereinheiten variieren außerdem in ihrem stoichometrischen Verhalten gegenüber der α-Untereinheit. In der Regel wird die β1-Untereinheit in den glatten Muskelzellen im Verhältnis 1:1 zu der α-Untereinheit exprimiert (KNAUS et al. 1994), wohingegen im Gehirn die α-Untereinheit deutlich häufiger als die β4-Untereinheit vorkommt (CHANG et al. 1996, WANNER et al. 1999).

Durch die β-Untereinheiten wird in außerordentlichem Masse die Ca²⁺-Sensitivität und die Öffnungskinetik der BK-Kanäle moduliert. So konnte mittels elektrophysiologischer Untersuchungen gezeigt werden, dass durch die Koexpression der β-Untereinheiten die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der BK-Kanäle verlangsamt und deren Ca²⁺- Sensitivität erhöht wurde (VOGALIS et al. 1996, ORIO et al. 2002, QIAN u. MAGLEBY 2003). Nur die β2-Untereinheit, welche die Aktivierungszeit des Kanals verkürzt, stellt eine Ausnahme dar. Diese Inaktivierung wird durch einen Inaktivierungsball am N-Terminus der β2-Untereinheit vermittelt, welcher mit der α-Untereinheit interagiert (WALLNER et al. 1999).

Durch die Koexpression der α- und β-Untereinheit werden außerdem die pharmakologischen und biochemischen Eigenschaften sowie die Toxinbindung der BK- Kanäle moduliert (HANNER et al. 1997 u. 1998, ORIO et al. 2002, PATTERSON et al.

2002).

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Aktivierung

BK-Kanäle lassen sich elektrophysiologisch anhand ihrer hohen Einzelkanalleitfähigkeit von den vorher beschriebenen SK- und IK-Kanälen unterscheiden. So werden in der Literatur Einzelkanalleitfähigkeiten zwischen 100 und 250 pS in symmetrischer KCl- Lösung beschrieben (LATORRE et al. 1989). Im Gegensatz zu den IK- und SK-Kanälen werden die BK-Kanäle spannungsabhängig durch Membranpotentialänderungen aktiviert.

Der Spannungssensor ist bei den BK-Kanälen wie bei den KV-Kanälen im S4-Segment lokalisiert (DIAZ et al. 1998, SMITH-MAXWELL et al. 1998).

Durch lokalen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration über 1µM wird die Spannungssensitivität moduliert (STEFANI et al. 1997, TORO et al. 1998). So zeigten HORRIGAN u. ALDRICH (2002) in sehr umfangreichen Experimenten, dass durch Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen die Offenwahrscheinlichkeit der BK- Kanäle in Abhängigkeit von dem Membranpotential deutlich vergrößert wird. Bei extrem hohen intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen werden die BK-Kanäle schon bei normalen Ruhemembranpotentialen aktiviert (BUTLER et al. 1993). Zwei auf dem C-Terminus gelegene Regionen konnten als Bindungsstellen für Ca²⁺ identifiziert werden: Zum einen der sogenannte „Calcium-bowl“, welcher kurz vor dem S10-Segment liegt, und zum anderen die Regulatorenregion „RCK“ (regulator of conductance for K⁺), die zwischen S6 und S7 lokalisiert wurde. Diese Region dient neben Ca²⁺ noch weiteren Liganden (z.B.

Kationen, Nucleotiden) als Bindungsstelle (XIA et al. 2002). Durch PISKOROWSKI u.

ALDRICH (2002) werden diese Lokalisationen jedoch sehr kontrovers diskutiert, da sie in ihren Experimenten zeigen konnten, dass auch nach Entfernung dieser beiden Regionen, die Ca²⁺-Sensitivität des Kanals nicht verändert war, sondern nur das Schaltverhalten modifiziert wurde.

Blockade

Die BK-Kanäle lassen sich von den anderen Mitgliedern der Familie der Ca²⁺-aktivierten K⁺-Kanäle aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften differenzieren. So sind sie im Gegensatz zu den IK-Kanälen durch Iberiotoxin hemmbar. Die Unterscheidung der β- Untereinheiten ist pharmakologisch aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber Iberiotoxin möglich (MEERA et al. 2000). Zusätzlich blockieren Charybdotoxin, Tetraethylammonium und Tertrapentylammonium (CARL et al. 1993, GARCIA et al.

1997) und, wie neueste Untersuchungen zeigten, auch das Skorpiongift Slotoxin (GARCIA-VALDES et al. 2001) die BK-Kanäle. Im Gegensatz zu den SK-Kanälen verhalten sich die BK-Kanäle jedoch insensitiv gegenüber Apamin.

Modulation

Wie bereits unter dem Abschnitt „Vorkommen und Funktion“ (Seite 29) aufgeführt, sind die BK-Kanäle in den verschiedensten Geweben an zahlreichen Funktionen beteiligt. Diese gewebespezifische Funktionalität des Kanals wird durch diverse Modulatoren gewährleistet, welche die Eigenschaften der BK-Kanäle verändern. Neben den zahlreichen Splicevarianten tragen, wie vorher beschrieben, die β-Untereinheiten in überragender Weise zu dieser gewebespezifischen Diversität der BK-Kanäle bei. Zusätzlich werden jedoch die Aktivität und Aktivierbarkeit der Kanäle durch zahlreiche körpereigene Substanzen und Second messenger Systeme maßgeblich beeinflusst und somit die Zellfunktion an akute Stoffwechselbedürfnisse und spezifische Leistungen angepasst (TORO et al. 1998).

So konnte in den letzten Jahren durch zahlreiche Arbeitsgruppen nachgewiesen werden, dass die Aktivität der BK-Kanäle durch die Phosphorylierung der α- und β-Untereinheiten mittels Proteinkinasen verändert wird (SCHUBERT u. NELSON 2001). In Abhängigkeit von der Lokalisation und der Proteinkinase erfolgt eine Aktivierung bzw. Inhibierung der Kanäle. An der Aktivierung der Proteinkinasen sind wiederum zahlreiche Substanzen als Second messenger beteiligt.

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PKA

Die cAMP-abhängige Proteinkinase A aktiviert die BK-Kanäle in glatten Muskelzellen und Neuronen, inhibiert sie jedoch in endokrinen Zellen und in der Hypophyse (TIAN et al.

1998 u. 2001). Die PKA induziert v.a. eine N-terminale Phosphorylierung der β- Untereinheit. Die aktivierende Wirkung unterschiedlichster Substanzen wird über PKA durch Second messenger vermittelt. So zeigten SCORNIK et al. bereits 1993, dass durch β- adrenerge Substanzen wie Isoproterenol eine Aktivierung der BK-Kanäle über PKA vermittelt werden kann. Ebenso ist die Relaxation von Gefäßen infolge einer Behandlung mit dem PGI2-Analogon Beraprost unter anderem cAMP vermittelt (YAMAKI et al. 2001).

Auch die vasodilatorische Wirkung von VIP wird neben anderen Mechanismen durch eine Aktivierung von cAMP und nachfolgender Aktivierung der PKA erzielt (TANAKA et al.

1999).

PKG

ROBERTSON et al. (1993) zeigten in Patch clamp Untersuchungen an glatten Muskelzellen von Cerebralarterien der Ratte eine Aktivierung der BK-Kanäle durch die cGMP-abhängige Proteinkinase G. Sie konnten weiterhin nachweisen, dass durch NO und Nitroprussid eine Aktivierung der PKG erfolgt, wodurch eine Vasodilatation der Gefäße vermittelt wird.

ALIOUA et al. (1998) konnten in heterologen Expressionsexperimenten in Xenopus Oozyten nachweisen, dass die PKG aktivierend auf humane BK-Kanäle wirkt. Die Befunde ergaben, dass durch die Phosphorylierung der α-Untereinheit die Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle signifikant erhöht wird. Infolgedessen erfolgt eine längere und stärkere Hyperpolarisation der Zellen und der myogene Tonus der Gefäße wird reduziert. So ist eine Aktivierung der BK-Kanäle mittels PKG ebenfalls entscheidend an der Vasorelaxation durch das atriale natriuretische Peptid beteiligt (TANAKA et al. 1998).

PKC

Die Ca²⁺-abhängige Proteinkinase C führt in glatten Muskelzellen zu einer verminderten Aktivität der BK-Kanäle unter der Voraussetzung einer Koexpression der α- und β1- Untereinheit. So zeigten HAGEN et al. (2003) in elektrophysiologischen Untersuchungen

an Myozyten des Kolons von Mäusen, dass die Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle sowie die Amplitude und die Frequenz des Kaliumauswärtsstroms durch eine Aktivierung der PKC reduziert werden konnten. Die Aktivierung der PKC erfolgt sowohl über den Einstrom von Ca²⁺ durch nichtselektive Ca²⁺-Kanäle, als auch über die Bindung von Acetylcholin an muskarinerge Rezeptoren und ATP mit nachgeschalteter Aktivierung des Phosphatidylinositolmechanismus und direkter Wirkung des freigesetzten Diacylglycerols auf die Aktivität der Proteinkinase C (BAYGUINOV et al. 2001). Als Ergänzung zu diesen Befunden zeigten BAYGUINOV et al. (2003) eine Aktivierung der BK-Kanäle durch Substanz P, welche ebenfalls indirekt über eine Aktivierung der PKC vermittelt wird. In diesem Fall ist die aktivierende Wirkung der PKC auf L-Typ Calciumkanäle jedoch von entscheidender Bedeutung, und erst sekundär erfolgt eine Aktivierung der BK-Kanäle durch einen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration.

Andere körpereigene Botenstoffe modulieren die Aktivität der BK-Kanäle direkt durch Interaktion mit der α- und/oder β-Untereinheit ohne die Zwischenschaltung eines Second messengers. So erhöhen Östrogene und Tamoxifen (ein Östrogenantagonist) die Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle und bewirken eine Steigerung der Spannungssensitivität der Kanäle, infolgedessen die Einzelkanäle bei geringeren Membranpotentialen aktiviert werden. Diese Wirkung wird jedoch nur in Anwesenheit der β-Untereinheit beobachtet, wobei die Östrogene und Tamoxifen von der extrazellulären Seite mit den BK-Kanälen interagieren (VALVERDE et al. 1999, DICK u. SANDERS 2001, DICK et al. 2002). Zusätzlich wird durch Östrogene die Einzelkanalleitfähigkeit reduziert, was jedoch unabhängig von der β-Untereinheit geschieht und somit auf eine direkte Interaktion mit der α-Untereinheit hinweist (DICK u. SANDERS 2001).

Die Aktivität der BK-Kanäle wird weiterhin durch H2O2 (SOTO et al. 2002), Angiotensin II (TORO et al. 1990, ABOULAFIA et al. 2002) und durch einen Anstieg des intrazellulären Magnesiumgehalts in Anwesenheit der β-Untereinheit moduliert. In Abwesenheit der β- Untereinheit wirkt Magnesium aktivierend auf die BK-Kanäle (SHI et al. 2002, QIAN u.

MAGLEBY 2003).

Literaturübersicht

2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle auf die Blutdruckregulation

Wie bereits beschrieben, werden BK-Kanäle mit der regulatorischen β1-Untereinheit (BKβ1) in hohem Maße in glatten Muskelzellen verschiedener Organe einschließlich Blutgefäßen exprimiert (PEREZ et al. 1993, GARCIA-CALVO et al. 1994, GIANGIACOMO et al. 1995, PETKOV et al. 2001). Glatte Muskulatur ist an der Funktion vieler Organe einschließlich Magen, Darm, Uterus und Blase beteiligt. In Blutgefäßen tragen glatte Muskelzellen wesentlich zur Regulation des peripheren Widerstands bei, indem sie den Durchmesser der Gefäße mittels Kontraktion oder Relaxation verändern.

Gesteuert wird das Kontraktionsverhalten glatter Muskelzellen über Membranpotentialänderungen, die durch die Transmitter Acetylcholin und Noradrenalin sowie durch diverse Hormone induziert werden (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).

Das Membranpotential glatter Muskelzellen wird hauptsächlich durch den Kaliumgradienten bestimmt. So werden in glatten Muskelzellen neben BK-Kanälen noch weitere Kaliumkanäle (Kv-Kanäle, Kir, KATP-Kanäle) exprimiert (NELSON u. QUAYLE 1995). Die durch Transmitter oder mechanischen Druck induzierte Depolarisation des Membranpotentials führt zu einer Öffnung spannungsabhängiger L-Typ Calciumkanäle.

Durch das einströmende Calcium wird eine Muskelkontraktion ausgelöst (KLINKE u.

SILBERNAGEL 1996). In der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) werden durch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration Ryanodin-sensitive Calciumkanäle aktiviert, durch die aus diesem intrazellulären Calciumspeicher lokal begrenzt Calcium freigesetzt wird. Diese spontanen und lokal begrenzten Calciumausstösse aus dem SR werden Calcium-Sparks genannt (NELSON et al. 1995). Durch diese Sparks werden die in der benachbarten Plasmamembran lokalisierten calciumabhängigen BK- Kanäle aktiviert. Der dadurch entstehende spontane transiente Kaliumauswärtsstrom wird auch als STOC (spontaneus transient outward current) bezeichnet (NELSON et al. 1995).

Die Membrandepolarisation hat ebenfalls eine Öffnung von spannungsabhängigen und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanälen zur Folge. Der durch diese Kanäle vermittelte Kaliumausstrom aus den Zellen führt zu einer Membranhyperpolarisation und nachfolgend zum Schließen der spannungsabhängigen Calciumkanäle. Die intrazelluläre Ca²⁺- Konzentration nimmt wieder ab und die Zellen relaxieren.

In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass die Aktivierung der BK-Kanäle durch einen lokalen Anstieg der intrazellulären Ca²⁺-Konzentration eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielt, indem sie einen negativen Feedback Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermittelt (BRAYDEN u. NELSON 1992). Die regulatorische β1-Untereinheit erhöht, wie bereits beschrieben, die Ca²⁺- Sensitivität der BK-Kanäle maßgeblich und trägt somit fundamental zu einer Funktionssteigerung der BK-Kanäle und damit auch des negativen Feedback zur Limitierung der Vasokonstriktion bei. Diese Hypothese wurde durch verschiedene Arbeitsgruppen vor allem in pharmakologischen Experimenten an isolierten Gefäßen bestätigt. In diesen Untersuchungen wurde durch die Gabe von Iberiotoxin eine ausgeprägte Membrandepolarisation ausgelöst, die zu einer Vasokonstriktion führte (JAGGAR et al.

2000, LÖHN et al. 2001).

Druck und Vasokonstriktoren

Membrandepolarisation

Öffnung spannungsabhängiger L-Typ Calciumkanäle

Anstieg des intrazellulären Calciums +

Zunahme des arteriellen Tonus

SR Ryanodin Rezeptor Öffnung von BK-Kanälen

- Iberiotoxin

Charybdotoxin TEA

+ +

+

+

+ +

Calciumkanal- blocker

Abbildung 6: Modell für die Rolle der BK-Kanäle als Teil des negativen Feedback Mechanismus bei der Regulation des arteriellen Tonus. Modifiziert nach NELSON u. QUAYLE (1995).

Diese Ergebnisse wurden durch den Phänotyp von Mäusen, bei denen die β1-Untereinheit genetisch inaktiviert wurde, grundlegend bestätigt (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et

Literaturübersicht

al. 2000). Die BKβ1-/- Mäuse zeigten einen erhöhten arteriellen Tonus in isolierten Gefäßen, welcher mit einer verminderten Ca²⁺-Sensitivität der BK-Kanäle und einer gestörten Kopplung von Calcium-Sparks und STOC`s vergesellschaftet war. Diese molekularen und zellulären Störungen gingen mit einem erhöhten systemischen Blutdruck und einer Herzhypertrophie einher. Eine verminderte Expression der β1-Untereinheit, verbunden mit einer geringeren Ca²⁺-Sensitivität der BK-Kanäle, wurde auch in glatten Gefäßmuskelzellen von Ratten mit einer genetisch bedingten Hypertonie beobachtet (WELLMANN et al. 2001, AMBERG et al. 2003, AMBBERG u. SANTANA 2003). Im Widerspruch zu diesen Ergebnissen stehen allerdings die Befunde von LIU et al. (1997, 1998), die in Cerebralarterien von spontan hypertensiven Ratten einen Anstieg der BK- Kanal Expression nachweisen konnten, welche einen verstärkten Kaliumauswärtsstrom durch die BK-Kanäle verursachte. Die Autoren interpretieren dies als Versuch des Körpers, die Ausprägung einer Hypertonie einzuschränken.

Auf der Basis der beschriebenen Beobachtungen wurde geschlussfolgert, dass die arterielle Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz des erhöhten Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b, STANDEN 2000, PATTERSON et al.

2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher Mechanismus ist von größtem wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich hierbei um den erstmaligen Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie handeln würde.

2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung

Der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen könnte im Gegensatz zu der im vorherigen Abschnitt beschriebenen Hypothese eine alternative Erklärung finden. In Anbetracht der starken Expression von BK-Kanälen in Zona glomerulosa-Zellen ist es sehr gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der β1-Untereinheit zu einer gestörten Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen, dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind.

Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten ausgeprägten linksventrikulären Hypertrophie beitragen.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob die BKβ1-/- Mäuse tatsächlich pathologisch erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut aufweisen, die für die Entstehung der Hypertonie ursächlich verantwortlich sind. Weiterhin soll untersucht werden, ob es durch pharmakologische Blockierung des zirkulierenden Plasmaaldosterons mit Hilfe des Aldosteronantagonisten Spironolacton möglich ist, bei BKβ1-/- Mäusen eine Normalisierung des arteriellen Blutdrucks und eine Beeinflussung der linksventrikulären Hypertrophie zu bewirken.

Sollte sich die Hypothese eines Hyperaldosteronismus bestätigen, soll im Rahmen dieser Arbeit des Weiteren an Nebennieren von BKβ1-/- Mäusen untersucht werden, ob der Hyperaldosteronismus durch eine veränderte Regulation der Aldosteronsekretion in den Nebennieren unter Beteiligung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle verursacht wird.