TARTU ÜLIKOOL
LOODUS- JA TÄPPISTEADUSTE VALDKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT
ja
MEDITSIINITEADUSTE VALDKOND BIO- JA SIIRDEMEDITSIINI INSTITUUT
FÜSIOLOOGIA OSAKOND
Wfs1 -puuduliku roti suhkurdiabeedi fenotüübi kirjeldamine
Magistritöö 40 EAP Tuuliki Koppel
Juhendajad prof Eero Vasar PhD Mario Plaas MSc Maarja Toots MSc Martin Kärner
TARTU 2017
INFOLEHT
Wfs1 -puuduliku roti suhkurdiabeedi fenotüübi kirjeldamine
Wolframi sündroom (WS) on autosomaalne retsessiivne neurodegeneratiivne haigus, mida põhjustavad mutatsioonid WFS1 geenis. Sündroomi põhisümptomid on magediabeet, suhkurdiabeet, nägemisnärvi atroofia ja sensorineuraalne kurtus. Et uurida WS-i ja võimalikke WS-i vastaseid raviteraapiaid, on praegu disainitud eri laborites kolm Wfs1-puudulikku hiiremudelit. Asjaolu, et nimetatud hiirtel pole seni selgelt näidatud suhkurdiabeedi kujunemist, ajendas Tartu Ülikooli teadlasi konstrueerima Wfs1-mutantse roti. Käesolevas töös uuritiWfs1-mutantselWfs1-ex5-KO232 rotil suhkurdiabeedi fenotüüpi ja selle tekkepõhjuseid. Leiti, et Wfs1-puuduliku roti pankrease beeta-rakkudes on tõusnud ER-i stressitase, mistõttu beeta-rakud hävivad ja 11. elukuul tekib insuliinist sõltuv suhkurdiabeet. Seega võib Wfs1-puudulik rott olla uus mudel suhkurdiabeedi ja võimalike WS-i vastaste ravimite uurimiseks.
Märksõnad: Wfs1-puudulikkusega rott, Wolframi sündroom, Wfs1, wolframiin 1, diabetes mellitus
CERCS kood: B470 Füsioloogia
The diabetic phenotype of Wfs1 -deficient rat
Wolfram syndrome (WS) is a rare autosomal recessive neurodegenerative disorder caused by mutations in the WFS1 gene. The common manifestations of WS are diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy and deafness. To study WS and develop potential therapeutic approaches against WS, threeWfs1-deficient mouse models have been designed in different laboratories. However, to the best of our knowledge, none of those Wfs1-mutant mice show signs of fasting hyperglycemia and development of diabetes mellitus. Therefore, the scientists of University of Tartu constructed a Wfs1-deficient rat. In the current thesis, we studied the diabetic phenotype of Wfs1-mutant rat (Wfs1-ex5-KO232) and found that Wfs1-mutant rat develops insulin-dependent diabetes mellitus and mimics human pathology of WS. Thus, Wfs1-ex5-KO232 rat is a valuable new model to study potential treatments for WS.
Keywords: Wfs1-deficient rat, Wolfram syndrome, Wfs1, wolframin, diabetes mellitus CERCS code: B470 Physiology
SISUKORD
KASUTATUD LÜHENDID 5
SISSEJUHATUS 7
1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 8
1.1 Wolframi sündroom 8
1.2 Wolframiin 1 geen ja valk 9
1.2.1 WFS1 funktsioonid 10
1.2.2 WFS1 roll glükoosi homöostaasi säilitamises 11
1.3 Transgeensed wolframiin 1 mutantsed loommudelid 14
1.3.1 Wfs1-puudulikkusega hiiremudelid 14
1.3.2 Wfs1-puudulikkusega rotimudel 15
2. EKSPERIMENTAALOSA 16
2.1 Töö eesmärk 16
2.2 Materjal ja metoodika 16
2.2.1 Katseloomad 16
2.2.2 Intraperitoneaalne glükoositolerantsi test 16
2.2.3 Insuliinitaseme määramine 17
2.2.4 Insuliinitolerantsi test 17
2.2.5 Uriinianalüüs 17
2.2.6 Langerhansi saarekeste eraldamine 17
2.2.7 RNA eraldamine 18
2.2.8 cDNA süntees 18
2.2.9 Kvantitatiivne reaalaja- polümeraasi ahelreaktsioon 18
2.2.10 Polümeraasi ahelreaktsioon 19
2.2.11 Statistika 19
2.3 Tulemused 20
2.3.1 Kehakaal 20
2.3.2 Veresuhkru baastase 20
2.3.3 Vereseerumi insuliini baastase 21
2.3.4 Uriini glükoositase 22
2.3.5 Glükoositundlikkus 22
2.3.6 Glükoosi stimuleeritud insuliini sekretsioon 22
2.3.7 Insuliinitundlikkus 24
2.3.8 Langerhansi saarekeste geeniekspressioon 24
2.4 Arutelu 27
KOKKUVÕTE 31
SUMMARY 32
TÄNUSÕNAD 35
KASUTATUD KIRJANDUS 36
KASUTATUD VEEBILEHED 43
LISAD 44
LIHTLITSENTS 47
KASUTATUD LÜHENDID
5-HT 5-hüdroksütrüptamiin; 5-hydroxytryptamine ANOVA dispersioonanalüüs; analysis of variance
ATF6-alfa aktiveeriv transkriptsioonifaktor 6 alfa; activating transcription factor 6 alpha BSA veise seerumi albumiin; bovine serum albumin
cAMP tsükliline adenosiinmonofosfaat; cyclic adenosine monophosphate D kurtus; deafness
DIDMOAD magediabeet, suhkurdiabeet, nägemisnärvi atroofia, sensorineuraalne kurtus;
diabetes insipidus, diabetes mellitus, optic atrophy, sensorineural deafness DI magediabeet; diabetes insipidus
DM suhkurdiabeet; diabetes mellitus DTT ditiotreitool; dithiothreitol
Epac cAMP aktiveeritud vahetusvalk; exchange protein activated by cAMP ER endoplasmaatiline retiikulum; endoplasmic reticulum
GABAA gamma-aminovõihappe A; gamma-aminobutyric acid A receptor GLP-1 glükagoonitaoline valk 1; glucagon like peptide 1
GLUT 1/2 glükoosi transporter 1/2; glucose transporter 1/2
HBSS Hanki tasakaalustatud soolalahus; Hank´s Balanced Salt Solution HPRT1 hüpoksantiini fosforibosüül-transferaas 1; hypoxanthine
phosphoribosyltransferase 1
HSPA5 kuumašoki valkude perekonna A (Hsp70) liige 5; heat shock protein family A (Hsp70) member 5
i.p. Intraperitoneaalne; intraperitoneal
IP3 inositool-1,4,5-trisfosfaat; inositol trisphosphate
IP3R inositool-1,4,5-trisfosfaadi retseptor; inositol trisphosphate receptor IPGTT intraperitoneaalne glükoosi tolerantsi test
ITT insuliini tolerantsi test
K+ ATP ATP-tundlik kaaliumikanal; ATP-sensitive potassium channel
KO knock-out
Kv pingetundlik kaaliumikanal; voltage-gated potassium channel
MQ Milli-Q vesi
NLS-LacZ tuuma lokalisatsiooni signaal beeta-galaktosidaas; nuclear location signal beta-galactosidase
OA nägemisnärvi atroofia; optic atrophy
PCR polümeraasi ahelreaktsioon; polymerase chain reaction PI3K fosfatidüülinositool-4,5-bisfosfaat 3-kinaas;
phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase PKA valgu kinaas A; protein kinase A
ROS reaktiivne hapnikuühend; reactive oxygen species
qRT-PCR kvantitatiivne reaalaaja polümeraasi ahelreaktsioon; quantitative real-time polymerase chain reaction
RyR rüanodiini retseptor; ryanodine receptor s.c. subkutaanne; subcutaneous
SEM standardviga; standard error of measurement SERCA sarko/endoplasmaatilise retiikulumi Ca2+-ATPaas SERT serotoniini transporter; serotonin transporter SLC2A2 solute carrier family 2 member 2 SYVN1 sünovioliin 1; synoviolin 1
ZFN tsink- sõrmede tehnoloogia; zinc finger nuclease UPR voltumata valkude vastus; unfolded protein response
VDCC pingetundlik kaltsiumikanal; voltage-dependent calcium channel WFS1 wolframiin 1 geen inimesel
Wfs1 wolframiin 1 geen inimesest erineval liigil
WFS1 wolframiin 1 valk inimesel ja inimesest erineval liigil WS Wolframi sündroom; Wolfram syndrome
WT metsiktüüp; wild type
XBP1 X-box-iga seonduv valk 1; X-box binding protein 1 XBP1 S splaissitud X-box-iga seonduv valk 1
SISSEJUHATUS
Wolframi sündroom (WS/DIDMOAD) on autosomaalne retsessiivne neurodegeneratiivne haigus, mida põhjustavad mutatsioonid wolframiin 1 valku kodeerivas WFS1 geenis.
Sündroomi põhisümptomid on magediabeet, suhkurdiabeet, nägemisnärvi atroofia ja sensorineuraalne kurtus (Wolfram ja Wagener, 1938; Swift jt., 1990). Lisaks esineb umbes 60%-l WS-i patsientidest (homosügootsed mutatsioonikandjad) psühhiaatrilisi häireid, nagu depressioon, psühhoos ja agressiivsus (Swift jt., 1990). Võrreldes tervete indiviididega, on heterosügootsetel WFS1 mutatsiooni kandjatel 26 korda suurem tõenäosus psühhiaatriliste häirete tekkimiseks (Kesner jt., 2009; Swift ja Swift, 2000).
WS-ga kaasnevate patoloogiate, WFS1 geeni funktsiooni ja potentsiaalsete WS-i vastaste ravimite uurimiseks on praeguseks eri laborites disainitud kolm transgeenset Wfs1-puudulikkusega hiiremudelit (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005; Luuk jt., 2009).
Võrreldes metsiktüüpi pesakaaslastega, esinevad neil mutantsetel hiirtel häired glükoosi stimuleeritud insuliini sekretsioonis, kõrgem beeta-rakkude apoptoosimäär, progresseeruv glükoositalumatus ning madalam insuliinitase (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005; Luuk jt., 2009; Noormets jt., 2011; Terasmaa jt., 2011). Samas pole seni selgelt näidatud, et Wfs1-puudulikkus põhjustaks neil hiirtel humaanmeditsiinis WS-i diagnoosimiseks kasutatava sümptomi, suhkurdiabeedi olemasolu. See ajendas Tartu Ülikooli teadlasi konstrueerima Wfs1-puudulikkusega roti (Plaas jt., avaldamisel).
Käesoleva töö eesmärgiks on uurida, kasWfs1- puudulikelWfs1-ex5-KO232 rottidel areneb suhkurdiabeedi-sarnane seisund ning kirjeldada selle tekkepõhjuseid.
Töö koostati Tartu Ülikooli meditsiiniteaduste valdkonna bio- ja siirdemeditsiini instituudi füsioloogia osakonnas.
1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Wolframi sündroom
Wolframi sündroomi kirjeldasid esmakordselt 1938. aastal Don J. Wolfram ja H. P. Wagener.
Wolframi sündroomi põhisümptomid on magediabeet (DI,diabetes insipidus), suhkurdiabeet (DM,diabetes mellitus), nägemisnärvi atroofia (OA,optic atrophy) ja sensorineuraalne kurtus (D, deafness) (Wolfram ja Wagener, 1938; Swift jt., 1990). WS esineb keskeltläbi ühel inimesel 160 000–770 000-st (Barrett jt., 1995; Kinsley jt., 1995). WS-i põhjustavad mutatsioonid wolframiin 1 valku kodeerivas geenis WFS1 (Barrett jt., 1995).
Lisaks põhisümptomitele kaasnevad WS-iga progresseeruv neurodegeneratsioon, perifeerne neuropaatia, ataksia, vaimse arengu peetus ja dementsus. Samuti võivad esineda kusetrakti atoonia, epilepsia, nüstagmid ja lõhnataju vähenemine. WS-i puhul on kirjeldatud ka südamerütmihäireid, kuid nende otsene seos wolframiin 1 ekspressiooniga kardiomüotsüütides on ebaselge (Swift jt., 1990; Swift jt., 1991; Barrett jt., 1995; Kinsley jt., 1995; Strom jt., 1998; Swift ja Swift, 2000; Smith jt., 2004).
Umbes 60%-l WS-i patsientidest (homosügootsed mutatsioonikandjad) esineb psühhiaatrilisi häireid, nagu depressioon, psühhoos ja agressiivsus (Swift jt., 1990). Polümorfismid WFS1 geenis muudavad inimesed vastuvõtlikumaks meeleoluhäiretele (Swift ja Swift, 2000; Koido jt., 2005; Swift ja Swift, 2005), mida seostatakse muutustega serotonergilises, noradrenergilises ja dopamiinergilises süsteemis (Matto jt., 2011; Visnapuu jt., 2013a;
Visnapuu jt., 2013b). Umbes 1%-l kogu inimpopulatsioonist onWFS1geenis eri mutatsioone.
Heterosügootsetel WFS1 mutatsiooni kandjatel on võrreldes tervete indiviididega 26 korda suurem tõenäosus psühhiaatriliste häirete tekkimiseks (Kesner jt., 2009; Swift ja Swift, 2000).
WS on kiirelt arenev progressiivne neurodegeneratiivne haigus (Joonis 1). Esimene sümptom on keskmiselt 6-aastaselt avalduv suhkurdiabeet (Barrett jt., 1995). DM hõlmab endas metaboolseid häireid, mis tulenevad pankrease beeta-rakkude hävimisest või nende ebapiisavast insuliini tootmisest (Urano, 2012; Wiley jt., 2013). Tekkinud hüperglükeemia (Butler jt., 2003; Donath ja Halban, 2004) võib kahjustada südant, veresooni, silmi, neerusid ja närve. Järgneb umbes 11. eluaastal avalduv nägemisnärvi atroofia (Barrett jt., 1995;
Barrett ja Bundey, 1997), mille esmased sümptomid on nägemisteravuse vähenemine ja
värvipimedus (Barrett jt., 1995; Rigoli jt., 2011). Suhkurdiabeedi ja nägemisteravuse või nägemise kaotuse koosesinemine on minimaalne kriteerium võimaliku WS-i diagnoosimiseks (Strom jt., 1998; Rendtorff jt., 2011).
Magediabeet tekib tõrgetest hüpofüüsi vasopressiini tootmises (Wiley jt., 2013) või neerutorukestest vee tagasi-imendumises (Fenske ja Allolio, 2012). See esineb umbes 70%-l WS-i patsientidest ning avaldub ligikaudu 14 aasta vanuselt. Viimane levinud sümptom (65%-l patsientidest) on sensorineuraalne kurtus, mis varieerub oma tõsidusastmelt: alates teismeeas tekkivast progresseeruvast kuulmiskaost kuni täieliku kurtuseni juba sünnil (Barrett jt., 1995; Barrett ja Bundey, 1997; Rigoli jt., 2011).
Joonis 1. Wolframi sündroomi kulg . MutatsioonidWFS1 geenis põhjustavad Wolframi sündroomi, mida iseloomustavad vastavalt umbes 6- ja 11-aastaselt avalduvad suhkurdiabeet ja nägemisnärvi atroofia. Haiguse hilisemas faasis ilmnevad magediabeet ja neuroloogilised häired. Jooniselt puudub WS-i viimane põhisümptom, sensorineuraalne kurtus, kuna see varieerub oma tõsidusastmelt ning võib avalduda täieliku kurtusena juba sünnil või teismeeas tekkiva progresseeruva kuulmiskaona (kohandatud; Fonseca jt., 2010b).
WS-i patsientide keskmine eluiga on 25–49 aastat. Surma põhjus on tavaliselt ajutüve atroofiast tingitud hingamiskeskuse neurodegeneratsioon, mille tõttu hingamine seiskub (Barrett jt., 1995; Barrett ja Bundey, 1997).
1.2 Wolframiin 1 geen ja valk
Inimesel paikneb WFS1 geen neljanda kromosoomi 4p16.1 lookuses, hiirel viienda kromosoomi 5qB3 lookuses ning rotil 14. kromosoomi 14q21 lookuses. Nii hiire kui rotiWfs1 geenidel on inimese WFS1 geeniga 86%-line homoloogia (NCBI, 2017). WFS1 geeni
kogupikkus on 33,4 kb ning see koosneb kaheksast eksonist. Esimene ekson on mittekodeeriv, mistõttu hakkab translatsioon teisest eksonist. Kaheksas ekson on kõige suurem (2,6 kb) ning seal paikneb 60% kogu wolframiin 1 valku kodeerivast järjestusest (Strom jt., 1998; Hofmann jt., 2003). Viimases eksonis paikneb ka valdav osa WS-i tekitavaid mutatsioone (Inoue jt., 1998; Strom jt., 1998).
InimeseWFS1geen kodeerib 890 aminohappe pikkust ja ligikaudu 100 kDa molekulmassiga valku nimega wolframiin 1 (Lisa 1; Hofmann jt., 2003). Tegemist on endoplasmiidse retiikulumi (ER) membraanis paikneva hüdrofoobse glükoproteiiniga (Strom jt. 1998; Takeda jt., 2001; Osman jt., 2003), millel on üheksa transmembraanset segmenti ja otstes pikad hüdrofiilsed piirkonnad (Takeda jt., 2001; Hofmann jt., 2003). Valgu N-terminaalne ots asub tsütoplasmas ja C-terminaalne ots ER-i luumenis (Hofmann jt., 2003). Leitud on, et WFS1 valk lokaliseerub ka pankrease beeta-rakkude sekretoorsetes graanulites (Hatanaka jt., 2011).
1.2.1 WFS1 funktsioonid
WFS1 on kõrgelt ekspresseeritud ajus, südames, maksas ja pankrease beeta-rakkudes ning vähemal määral ka skeletilihastes, neerudes ja põrnas (Ishihara jt., 2004; Philbrook jt., 2005;
Inoue jt., 1998; Strom jt., 1998; Hofmann jt., 2003).
WFS1 täpset funktsiooni ei teata, kuid arvatavasti osaleb see ER-stressi vastuses, valkude post-translatsioonilises modifitseerimises ja pakkimises ning Ca2+ taseme regulatsioonis (Hofmann jt., 2003).
WFS1 on voltumata valkude vastuse (UPR) komponent, olles oluline beeta-rakkude ER-i stressi reguleerimisel. Arvatakse, et wolframiin 1 kontrollib transkriptsioonifaktori 6 alfa (ATF6-alfa) taset ja aktivatsiooni. Normaaltingimustel liidab wolframiin 1 ATF6-alfa ja sünoviaalse apoptoosi inhibiitoriga 1 (SYVN1), mis omakorda märgib ATF6-alfa ubikvitiiniga ja saadab selle proteasoomidesse lagundamisele. ER-i stressi korral vabaneb ATF6-alfa WFS1 küljest ning indutseerib ER-i stressi märklaud-molekulide, näiteks kuumašoki valkude perekonna A (HSP70) liikme 5 (HSPA5) ja X-box-iga seonduva valgu 1 (XBP1), ekspressiooni.
Kui ER-i homöostaas on taastunud, degradeeritakse WFS1 abil ATF6-alfa. WFS1-puudulikkus põhjustab aga ATF6-alfa hüperaktivatsiooni, mistõttu suunatakse beeta-rakud apoptoosi (Fonseca jt., 2010a).
Samuti on näidatud, et Wfs1 geeniekspressiooni vaigistamine roti primaarsetes neuronites põhjustab ER-i stressi, mille tagajärjel häirub inositool-1,4,5-trisfosfaadi (IP3) tundliku kaltsiumikanali IP3-retseptori (IP3R) töö. Väheneb Ca2+ vabanemine IP3R-i kaudu ning rakusisene Ca2+ tasakaal läheb paigast (Cagalinec jt., 2016).
1.2.2 WFS1 roll glükoosi homöostaasi säilitamises
Põhiliselt vastutavad organismi glükoosi homöostaasi eest pankrease Langerhansi saarekestes asuvad alfa- ja beeta-rakud (Röder jt., 2016). Saarekesed ja väikesed veresooned moodustavad tiheda võrgustiku, võimaldades kiirelt tunnetada vere glükoosisisaldust (Fu jt., 2013). Vastavalt sellele toodavad alfa-rakud veresuhkru taset tõstvat glükagooni või beeta-rakud veresuhkru taset langetavat insuliini, hoides inimesel nii vere glükoositaset 4–6 mM juures (Röder jt., 2016).
Põhiliseks insuliini vabastavaks stiimuliks on pärast sööki tõusev vere glükoositase (Komatsu jt., 2013). Beeta-rakkude pinnal paikneb glükoosi transporter 2 (GLUT2), mis transpordib veres oleva glükoosi beeta-rakkude sisse. Seal toimub glükolüüs, mistõttu tekib adenosiin trifosfaat (ATP) ning ATP/ADP suhe kasvab. Muutunud ATP/ADP suhte tõttu sulguvad rakumembraani ATP- tundlikud K+-kanalid, membraan depolariseerub ning avanevad pingetundlikud- kaltsiumikanalid (VDCC). Rakusisese Ca2+ kontsentratsiooni tõus põhjustab insuliini sisaldavate graanulite ja rakumembraani kokkusulamise ning insuliin vabastatakse (Joonis 2; Henquin, 2000). Tegemist on insuliini sekretsiooni esimese faasiga.
Rakku sisenenud kaltsiumi teiseks ülesandeks on indutseerida rakusisestest kaltsiumihoidlatest, ER-ist (Graves ja Hinkle, 2003; Kang ja Holz, 2003) ja sekretoorsetest graanulitest (Nakagaki jt., 2000; Kang ja Holz, 2003) kaltsiumi vabastamist. Raku sees oleva vaba kaltsiumi kontsentratsiooni tõus võimendab insuliini sisaldavate graanulite eksotsütoosi ja seeläbi ka insuliini sekretsiooni. Nii leiab aset insuliini sekretsiooni teine faas (Meloni jt., 2013).
WFS1 on tähtis insuliini biosünteesis ja sekretsioonis. WFS1 ekspresseeritakse glükoosi vahendatud insuliini sekretsiooni ajal (Fonseca jt., 2005; Lipson jt., 2006), mistõttu võib WFS1 osa võtta beeta-rakkude ER-is toimuvast proinsuliini voltimisest ja töötlemisest (Fonseca jt., 2010b). On näidatud, et ER-i stressi aktiveeritud ATF6-alfa vähendab insuliini geeniekspressiooni (Seo jt., 2008). WFS1 kui ATF6-alfa regulaator, saab seega ennetada
insuliini geeni maha surumist (Fonseca jt., 2010b). Wolframiin 1 mängib rolli ka ER-i Ca2+
taseme säilitamisel (Urano, 2016), millest sõltub näiteks insuliini sekretsioon insuliini sisaldavatest graanulitest (Henquin, 2000).
Joonis 2. Skemaatiline ülevaade insuliini sekretsioonist. Glükoos siseneb beeta-rakku läbi glükoositransporterite (GLUT 1/2) ja muudetakse seejärel ATP-ks. Vastusena glükoosile sekreteerivad soolestiku L-rakud glükagoonitaolist valku 1 (GLP-1). Glükoos seondub GLP-1 retseptorile, põhjustades tsüklilise adenosiinmonofosfaadi (cAMP) taseme tõusu ning Epaci (exchange protein activated by cAMP) ja valgu kinaasi A (PKA) aktivatsiooni. Glükoosi metabolism suurendab ATP/ADP suhet, mis inhibeerib ATP-tundlikke kaaliumikanaleid (K+ ATP-kanal). Võimetus beeta-rakkudest K+
välja pumbata põhjustab membraani depolarisatsiooni ja pingetundlike kaltsiumikanalite (VDCC) avanemise. GLP-1 aktiveeritud PKA ja Epac inhibeerivad samuti K+ ATP- ja pingetundlikke (Kv)kanaleid, takistades beeta-raku repolarisatsiooni. PKA ja Epac muudavad endoplasmaatilise retiikulumi (ER) kaltsiumikanalitena töötavaid inositool-1,4,5-trisfosfaadi (IP3) ja rüanodiini retseptoreid (RyR). Seetõttu vabastatakse rakusisestest varudest kaltsiumi, vaba Ca2+
kontsentratsioon tõuseb ning viimane aitab kaasa insuliini eksotsütoosile (kohandatud; Meloni jt., 2013). PI3K, fosfatidüülinositool-4,5 bisfosfaat 3-kinaas
ER-i stress ja krooniliselt kõrge glükoositase vähendavad pankrease beeta-rakkude ER-is oleva Ca2+ taset, põhjustades beeta-rakkude surma (Ishihara jt., 2004; Yamada jt., 2006;
Akiyama jt., 2009; Hara jt., 2014). ER-i kaltsiumitaset reguleerivad kolme tüüpi valgud:
● SERCA (sarko/endoplasmaatilise retiikulumi kaltsiumi-ATPaas), mis pumpab kaltsiumit tsütosoolist ER-i sisse
● ER-i luumenis asuvad kaltsiumit siduvad valgud aitavad kaltsiumitaset säilitada
● IP3R (inositool-1,4,5-trisfosfaadi) ja rüanodiini retseptorid (RyR) on
kaltsiumikanalid, mis vabastavad ER-is oleva Ca2+ tsütosooli (Pozzan jt., 1994).
On näidatud, et WFS1 on beeta-rakkude ER-i Ca2+ homöostaasi eest vastutava SERCA negatiivne regulaator, olles tavatingimustel sellega seotud. ER-stressi korral WFS1 ja SERCA interaktsioon väheneb, mistõttu pumbatakse SERCA abil tsütosoolist ER-i luumenisse rohkem Ca2+ ioone. Nii püütakse taastada kaltsiumi homöostaasi ning vältida rakkude apoptoosi minemist (Zatyka jt., 2015). Samuti on vihjatud, et RyR-kanalid mängivad olulist rolli insuliini sekretsioonis ja glükoosi homöostaasi säilitamisel. Lekked RyR-kanalites (Joonis 3) põhjustavad beeta-rakkude ER-is Ca2+ taseme langust, mistõttu tekivad ER-i stress ja mitokondrite funktsioneerimise häired ning langeb glükoosi vahendatud insuliini vabastamine (Santulli jt., 2015).
Joonis 3. RyR2-kanali lekkimine põhjustab ER-i stressi ja inhibeerib insuliini vabastamist. Krooniline kaltsiumi leke kaltsiumikanali rüanodiini retseptori 2 (RyR2) kaudu vähendab raku Ca2+ taset, mis põhjustab ER-i stressi ja mitokondriaalset düsfunktsiooni. Selle tõttu vähenevad ATP süntees ja glükoosi vahendatud insuliini vabastamine. Häired mitokondrite töös tekitavad reaktiivsete hapnikuühendite (ROS) taseme tõusu, suurendades kaltsiumi lekkimist veelgi (kohandatud; Santulli jt., 2015). GLUT2, glükoosi transporter 2; K ATP, ATP-tundlik kaaliumikanal
Lu jt. (2014) näitasid, et rüanodiini retseptori antagonist dantroleen võib ennetada WFS1-puudulikkusest tingitud rakusurma. Nad uurisid dantroleeni võimalikku terapeutilist mõju vastavalt hiirte ja rottide Wfs1-mutantsetes neuronites ja pankrease beeta-rakkudes.
Selgus, et dantroleen vähendas nii wolframiin 1 puudulikes neuronites kui ka beeta-rakkudes raku tsütoplasma kaltsiumitaset ja kaltsiumist sõltuva proteaasi kalpaiini aktiivsust, taastas tsütosoolis oleva Ca2+ hulga ning surus maha apoptoosi. Lisaks aitas dantroleen vähendada WS-i patsientide indutseeritud pluripotentsetest tüvirakkudest saadud neuraalsetes eellasrakkudes apoptoosi. Seega võib dantroleen olla üks potentsiaalne Wolframi sündroomi teraapias kasutatava ravimi kandidaat (Lu jt., 2014).
1.3 Transgeensed wolframiin 1 mutantsed loommudelid 1.3.1 Wfs1 -puudulikkusega hiiremudelid
Et uurida WS-iga kaasnevaid patoloogiaid, WFS1 geeni funktsiooni ja võimalikke WS-i vastaseid raviteraapiad, on praeguseks eri laborites konstrueeritud kolm transgeenset Wfs1-puudulikkusega hiiremudelit (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005; Luuk jt., 2009).
Ishihara jt. (2004) valmistasid Wfs1knock- out (KO) hiirte liini, deleteerides hiiresWfs1 geeni teise eksoni (Wfs1 null mutant). Leiti, et transgeensetel hiirtel esineb ER-i stressist tingitud progresseeruv beeta-rakkude massi kadu, mille tulemusel areneb neil välja glükoositalumatus (Ishihara jt., 2004).
Riggs jt. (2005) valmistasid konditsionaalse, beeta-raku-spetsiifilise Wfs1-mutantse hiire.
Selleks lülitasid nad välja Langerhansi beeta-rakkudes olevaWfs1 geeni kaheksanda eksoni.
Sarnaselt Ishihara jt. (2004) Wfs1-mutantse hiirega leiti, et hiirel on ER-i stressist tingitult vähenenud beeta-rakkude mass ning elu jooksul välja kujunev glükoositalumatus (Riggs jt., 2005).
Viimase hiiremudeli valmistasid Tartu Ülikooli bio- ja siirdemeditsiini instituudi füsioloogia osakonnas Luuk jt. (2008). Nendel transgeensetel hiirtel on välja lülitatud Wfs1 geeni kaheksas ekson, mis on asendatud NLS- LacZ ekspressioonikassetiga. Võrreldes metsiktüüpi (WT) pesakaaslastega on antud hiirtel väiksem kehakaal, häirunud glükoositolerantsus, madalam insuliini baastase ning esinevad insuliini vabastamise häired (Luuk jt., 2009;
Noormets jt., 2011; Terasmaa jt., 2011).
Tartu Ülikoolis tehtudWfs1-puudulikud hiired on võrreldes metsiktüüpi hiirtega tundlikumad antidepressantide imipramiin ja paroksetiin mõju suhtes. See võib tuleneda 5-hüdroksütrüptofaani (5-HT) metabolismihäiretest ja 5-HT transporteri (SERT) ekspressiooni langemisest (Visnapuu jt., 2013b ). Hiirte dopaminergilise süsteemi uurimisel selgus, et mutantsetel hiirtel on probleeme neurotransmitteri dopamiin vabastamisega. Lisaks näidati, et võrreldes WT-pesakaaslastega on Wfs1-puudulikel hiirtel dopamiini transporterit kodeeriva geeni ekspressioon vähenenud (Visnapuu jt., 2013a).Wfs1-mutantsetel hiirtel on pluss-puuri katses kõrgem ärevuse-sarnane käitumine ning nad on ülitundlikud gamma-aminovõihappe A (GABAA) retseptori agonisti diazepam anksiolüütilise efekti suhtes (Raud jt., 2009).
Kokkuvõtvalt võib öelda, et kõikidel eespool nimetatud Wfs1-mutantsetel hiiremudelitel areneb elu jooksul välja glükoositalumatus, esinevad häired glükoosi stimuleeritud insuliini sekretsioonis ning neil on võrreldes oma WT-pesakaaslastega kõrgem beeta-rakkude apoptoosi- ja madalam insuliinitase (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005; Luuk jt., 2009;
Noormets jt., 2011; Terasmaa jt., 2011). Samas pole seni näidatud, et Wfs1-puudulikkus põhjustaks hiirtel suhkurdiabeeti. Seega ei esine loodud Wfs1-mutantsetel transgeensetel hiirtel ühte WS-i põhisümptomit, mille järgi saaks neil humaanmeditsiinis kasutatavate kriteeriumite alusel WS-i diagnoosida. See ajendas Tartu Ülikooli teadlasi konstrueerima Wfs1-puuduliku roti (Plaas jt., avaldamisel).
1.3.2 Wfs1 -puudulikkusega rotimudel
Plaas jt. (avaldamisel) valmistasid Wfs1-puuduliku transgeense roti, kasutades selleks ZFN-i (tsink-sõrmede) tehnoloogiat, mille tulemusel deleteeriti rotis suur osa Wfs1 geeni 5.
eksonist (Lisa 2).
Rotiliinil Wfs1-ex5-KO232 puudub Wfs1 geenist 184 bp (17 833–18 017), kaasa arvatud enamik viienda eksoni kodeerivast osast. 55 bp kadu Wfs1 geeni viiendast eksonist ei põhjustanud raaminihkemutatsiooni ning neljanda ja kuuenda eksoni vahele tekkis uus, alaniini kodeeriv GCC koodon (Plaas jt., avaldamisel).
Wfs1-mutantse roti (Wfs1-ex5-KO232) konstrueerimisest ja Wolframi sündroomi fenotüübist ilmub artikkel (Plaas jt., avaldamisel).
2. EKSPERIMENTAALOSA 2.1 Töö eesmärk
Antud magistritöö eesmärgiks oli:
● uurida Wfs1-puuduliku Wfs1-ex5-KO232 roti suhkurdiabeedi fenotüüpi
● kirjeldada Wfs1-ex5-KO232 roti suhkurdiabeedi võimalikke tekkepõhjuseid
2.2 Materjal ja metoodika 2.2.1 Katseloomad
Katseloomadena kasutati isaseid Tartu Ülikooli Katseloomakeskuses kasvatatud Wfs1-puudulikkusega homosügootseid ja nende metsiktüüpi pesakonnakaaslasi (Crl: CD (Sprague-Dawley) rats CD® IGS, Charles River Laboratories). Rotid paljundati ja genotüpiseeriti Tartu Ülikooli Katseloomakeskuses. Loomade vanus oli katsete ajal 1–13 kuud. Rotte hoiti puurides 2–4 kaupa standardtingimustel ning 12 h valge ja 12 h pime tsüklis (valge tsükkel algas kell 7 hommikul). Rottidel oli vaba ligipääs toidule ja veele, välja arvatud katse ajal. Eksperimendid tehti ajavahemikus 9.00–17.00. Katsed viidi läbi Põllumajandusministeeriumi loomkatsete loakomisjoni välja antud loa alusel (nr. 54, välja antud 23. veebruar 2015). Kõik loomkatsed viidi läbi magistritöö juhendajate poolt.
2.2.2 Intraperitoneaalne glükoositolerantsi test
Intraperitoneaalse glükoositolerantsi testi (IPGTT) jaoks hoiti katseloomi 2 tundi enne katse algust toiduta. Katse ajal puudus toit, aga vesi oli vabalt kättesaadav. Vere glükoositaset mõõdeti glükomeetri (Accu- Check Performa, Roche) abil sabaveenist saadud vereproovidest. Enne katse algust mõõdeti veresuhkru baastase, misjärel manustati loomadele intraperitoneaalselt (i.p.) füsioloogilises lahuses (0,9% NaCl) lahustatud glükoosi (D-(+)-Glucose; Sigma- Aldrich, kat. G5767-500G) doosiga 2 g/kg kehakaalu kohta ja süstemahus 10 ml/kg. 30, 60, 90, 120 ja 180 minutit pärast glükoosisüsti mõõdeti vere glükoositaset. Vere insuliinitaseme määramiseks võeti sabaveenist vahetult enne ja 30 minutit pärast glükoosi manustamist vereproovid. Seerumi eraldamiseks tsentrifuugiti verd 4
°C juures kiirusel 2000 x g 15 minutit. Seerumit hoiti kuni edasiste analüüsideni –80 °C juures.
2.2.3 Insuliinitaseme määramine
Katseloomade vereseerumi insuliinitaseme kvantitatiivseks määramiseks kasutati komplekti Ultra Sensitive Rat Insulin ELISA Kit (CrystalChem, kat. 90060) vastavalt tootja juhistele.
2.2.4 Insuliinitolerantsi test
Insuliinitolerantsi test (ITT) viidi läbi sarnaselt IPGTT testiga, kuid katseloomadele süstiti subkutaanselt (s.c.) inimese insuliini (1 U/kg; Lantus Solostar). 11-kuulistel Wfs1-ex5-KO232 rottidel sagenevad vananedes hüperglükeemia juhud. Seetõttu viidi insuliinitolerantsi test läbi nende 11-kuuliste loomadega, kellel ei olnud veel hüperglükeemiat tekkinud.
2.2.5 Uriinianalüüs
Uriin koguti mittepaastunud rottidelt valges faasis. Uriini glükoositase määrati Tartu Ülikooli Kliinikumi Ühendlaboris standardiseeritud protseduuridega.
2.2.6 Langerhansi saarekeste eraldamine
Katseloomad surmati ja kohe süstiti ühissapijuha kaudu pankreasesse 4–5 ml kollagenaasi (Collagenase from Clostridium histolyticum; Sigma-Aldrich, kat. C7657-100MG) lahust (lahustatudHank’s Balanced Salt Solution (HBSS; 1 x, Naxo, kat. 2008); lõppkontsentratsioon 1 mg/ml). Seejärel eemaldati kogu lahusega täidetud pankreas, mis asetati jääl olevasse tuubi. Selleks, et vältida lagunenud koe kokkukleepumist katkistest rakkudest pärit DNA tõttu, lisati tuubi Dnaas I (1mg/ml, Appli. Chem., kat. A3778; lõppkontsentratsioon 10mg/ml). Ensüümireaktsioonid tehti 37 °C vesivannis 17 minuti jooksul, mille vältel raputati tuubi kergelt kaks korda. Reaktsioonide peatamiseks lisati tuubi 10 ml Bovine Serum Albumini (BSA-d) lahustatuna HBSS-is (BSA/HBSS; Sigma- Aldrich, kat. A7906;
lõppkontsentratsioon 0,2%) ning proov asetati kohe jääle. Proovi pesti kaks korda BSA/HBSS-i lahusega, lastes pesude vahele jääva 7 minuti jooksul rakkudel tuubi põhja vajuda, misjärel supernatant eemaldati. Tuubi lisati 10 ml BSA/HBSS-i lahust ning proovi hoiti kogu Langerhansi saarte eraldamise aja jääl. Pankrese saarekesed korjati käsitsi valgusmikroskoobi all puhtasse BSA/HBSS-i lahusega Petri tassi. Puhtasse BSA/HBSS-i lahusesse korjamise etappi korrati seni, kuni Langerhansi saarekesed olid ümbritsevast eksokriinsest koest puhtad. Selleks, et saarekesed ensümaatilisest reaktsioonist taastuksid, tõsteti need tassil olevasse 1,5 ml söötmesse (RPMI 1640; Gibco, kat. A10491). Tassi hoiti
16–18 tundi 37 °C 5% CO2 juures. Järgnevalt koguti saarekesed 1,5 ml HBSS-i lahusesse, võttes kaasa võimalikult vähe eelnevat söödet. Seejärel viidi saarekesed 400 µl TRIzol reagenti (Zymo Research, kat. R2052) sisaldavasse tuubi ning hoiti RNA eraldamiseni –20 °C juures.
2.2.7 RNA eraldamine
RNA eraldati Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research, kat. R2052) komplektiga vastavalt tootja juhistele. Proove tsetrifuugiti kiirusel 12 000 x g 1 minut ning RNA elueerimiseks kasutati 40 µl Dnaasi/Rnaasi-vaba vett.
RNA kvaliteeti ja puhtust kontrolliti NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific) spektrofotomeetriga. cDNA sünteesiks vajalik RNA hulk (200 ng) viidi uude puhtasse tuubi.
Nii cDNA sünteesi alikvoot kui ülejäänud puhas RNA hoiustati –80 °C juures.
2.2.8 cDNA süntees
cDNA sünteesimiseks kasutati Superscript III Reverse Transcriptase 10 000U Kit komplekti (Thermo Fisher Scientific; kat. 18080044), mis sisaldas pöördtranskriptaasi SuperScript™ III RT (SuperScript III), puhvrit 5 x First-Strand Buffer (FS x 5)ja 0,1 DTT-d.
Esmalt lisati cDNA alikvoodile (200 ng) MQ vett (lõppmaht 10 µl) ning seejärel 2 µl heksameeri (Applied Biosystems). Proovi hoiti 10 minutit 65 °C, 1 minut jääl ja siis tehti spin-down. Proovile lisati 1,5 µl MQ vett, 1 µl dNTP-d (10µM; Thermo Scientific, kat. R0186), 4 µl FS x 5 puhvrit, 1 µl DTT-d ja 0,5 µl SuperScript III. Pöördtranskriptaasi reaktsioon toimus 10 min toatemperatuuril, 45 min 37 °C, 45 min 42 °C, 10 min 45 °C ja 10 min 75 °C.
Sünteesitud cDNA-d hoiustati –20 °C juures.
2.2.9 Kvantitatiivne reaalaja- polümeraasi ahelreaktsioon
Kvantitatiivse reaalaja PCR-i (qRT-PCR) tehti QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR (Applied Biosystems) masina ja QuantStudio 12K Flex v1.2.2 tarkvara abil. Kasutatud kommertsiaalsed TaqMan-i sondid Wfs1, Hspa5 ja Hprt1 (TaqMan Gex Master Mix-5ML; Applied Biosystems, kat. 4369016) on toodud lisas 3. Kontrollproovi lisati cDNA asemel MQ vett. Referentsina kasutati Hprt1 koduhoidjageeni. Kõik reaktsioonid tehti 3 korduses, lõppmahuga 10 µl.
Wfs1-puudulike ja metsiktüüpi rottide geeniekspressioonianalüüsid tehti samaaegselt.
qRT-PCR-i skeem on toodud lisas 4.
2.2.10 Polümeraasi ahelreaktsioon
Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) tehti 3- ja 7-kuuliste rottide Langerhansi saarekeste cDNA-ga, kasutades Mastercycler gradient (Eppendorf) PCR-i masinat. PCR-i reaktsiooni maht oli 40µl. Segu sisaldas 28,6 µl MQ vett, 8 µl puhvrit (5x HOT FIREPol Blend Master Mix Ready to Load koos 10 mM MgCl2; Solis BioDyne, kat. 04-25-00120), 1 µl cDNA-d, 1,2 µl Forward praimerit ja 1,2 µlReverse praimerit. Kasutatud praimerid on toodud lisas 5 ja PCR-i skeem lisas 6.
PCR-i produktide analüüsimiseks kasutati geelelektroforeesi. Proovid kanti 0,5x TBE (Naxo, kat. 3120) puhvris olevale 3% agaroosgeelile. DNA fragmentide pikkuse määramiseks kasutati 100 bp DNA Ladder Ready to Load markerit (Solis BioDyne, kat. 07-11-00050). On näidatud, et roti splaissimata cDNA annab 480 bp pikkuse ja splaissitud cDNA 454 bp pikkuse produkti (Yusta jt., 2006). Geelelektroforees viidi läbi toatemperatuuril, kuni mainitud DNA bändide eraldumiseni. Geeli pildistati ultraviolettvalguses (UVItec Limited; objektiiv Rainbow TV Zoom Lens H6X8 8-48mm).
WT- ja KO- rottide cDNA-de DNA fragmente analüüsiti tarkvaraga ImageJ. Võrreldi Xbp1 S osakaalu kogu Xbp1-st.
2.2.11 Statistika
Andmed on esitatud kui keskmine ± standardviga (SEM). Statistika tehti Studenti t-testi või kahesuunalise dispersioonanalüüsiga (ANOVA) ning seejärel sooritati Tukey’ post-hoc-test.
Andmete analüüsiks kasutati tarkvara GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc, USA), Statistica 8 (Statistica, USA) ja Image J (NIH, USA). Statistiliselt oluliseks loeti p-väärtust, mis oli väiksem kui 0,05 (p < 0,05).
2.3 Tulemused 2.3.1 Kehakaal
4–10 kuu vanused Wfs1-ex5-KO232 rotid olid oma WT-pesakaaslastest veidi kergemad.
Alates 10. elukuust hakkasidWfs1-ex5-KO232 rotid kaalu kaotama, samal ajal kui WT-rottide kehakaal tõusis edasi (Joonis 4).
Joonis 4. Wfs1-ex5-KO232 rottide kehakaal on metsiktüüpi pesakaaslaste omast väiksem.4–10 kuu vanused KO-rotid on oma WT-pesakaaslastest veidi kergemad. Pärast 10. elukuud hakkab Wfs1-puudulike rottide kehakaal langema, samas kui WT-rottide kaal tõuseb edasi; (F (1, 153) = 197,9, p < 0,001 (genotüüp); F (7, 153) = 114,5, p < 0,001 (vanus); F(7, 153) = 22,07, p < 0,001 (genotüüp × vanus)); # p < 0,05 ja ## p < 0,01 samas vanuses genotüüpide vahel, n = 6.
2.3.2 Veresuhkru baastase
Mõlema genotüübi vere glükoosi baastase oli kuni 11. elukuuni sarnane (Joonis 5). Peale seda tõusisWfs1-ex5-KO232 rottidel vere glükoosi baastase järsult (tekkis hüperglükeemia), olles 13. elukuul üle 20 mM (Joonis 5).
Joonis 5. Wfs1-ex5-KO232 rottide vere glükoositase tõuseb vanuse kasvades.Mõlemal genotüübil on vere glükoosi baastase 11. elukuuni sarnane. 11 kuu vanustel KO-rottidel tekib hüperglükeemia ja 13 kuu vanuselt on nende vere glükoosi baastase üle 20 mM; (F (1, 48) = 8,19, p= 0,006 (genotüüp);
F (3, 48) = 12,88, p< 0,001 (vanus); F (3, 48) = 4,48, p< 0,007 (genotüüp × vanus)); ## p< 0,01 samas vanuses genotüüpide vahel, ** p < 0,01 genotüübisiseselt (vs. 3 kuu vanused loomad), n= 6.
2.3.3 Vereseerumi insuliini baastase
Wfs1-ex5-KO232 ja metsiktüüpi rottide vereseerumi insuliini baastase oli kuni 6. elukuuni sarnane. Alates 6. elukuust oli Wfs1-ex5-KO232 rottidel võrreldes WT-pesakaaslastega madalam insuliini baastase (Joonis 6).
Joonis 6. Wfs1-puudulike rottide vereseerumi insuliini baastase on madalam kui WT-rottidel. 6.
elukuuni on WT- ja KO-rottide insuliini baastase sarnane, seejärel langeb Wfs1-ex5-KO232 rottide insuliini baastase võrreldes WT-rottidega; (F (1, 55) = 9,46, p = 0,003 (genotüüp); F (4, 55) = 11,42, p<
0,001 (vanus); F (4, 55) = 3,53, p = 0,01 (genotüüp × vanus)); # p< 0,05 samas vanuses genotüüpide vahel, n = 6.
2.3.4 Uriini glükoositase
Uriini glükoositase oli kuni 10. elukuuni KO- ja WT-rottidel sarnane. 10 kuu vanustel Wfs1-ex5-KO232 rottidel tekkis glükosuuria, mis süvenes 13. elukuuni (Joonis 7).
Joonis 7 .Wfs1-ex5-KO232 rottidel tekib glükosuuria. Uriini glükoositasemes ei ole kuni 10. elukuuni genotüüpidevahelisi erinevusi, misjärel tekibWfs1-ex5-KO232 rottidel glükosuuria; (F (1, 51) = 9,87, p
= 0,003 (genotüüp); F (3, 51) = 5,34, p = 0,003 (vanus); F (3, 51) = 5,36, p = 0,003 (genotüüp × vanus));
## p < 0,01 samas vanuses genotüüpide vahel, ** p < 0,01 genotüübisiseselt (vs. 3 kuu vanused loomad), n = 6.
2.3.5 Glükoositundlikkus
Juba 2. ja 3. elukuul oli Wfs1-ex5-KO232 rottidel märgata tendentsi glükoosi-talumatuse suunas (Joonised 8B ja 8C). 6-kuu vanustel Wfs1-ex5-KO232 rottidel esines märgatav glükoositalumatus (Joonis 8D). Glükoositolerantsuse testi andmete analüüsimine ROC-kõvera-aluse pindala (AUC) meetodil näitas, et Wfs1-ex5-KO232 rottidel suureneb glükoositalumatus vanuse kasvades, samal ajal kui WT-rottide glükoositalumatus ei olnud vanusega seotud (Joonis 8E).
2.3.6 Glükoosi stimuleeritud insuliini sekretsioon
2–11 kuu vanustel metsiktüüpi rottidel tõuseb vere insuliinitase 30 minutit peale glükoosi manustamist (2g/kg, i.p.; Joonis 8F).Wfs1-ex5-KO232 rottidel tõusis vere insuliinitase ainult 2. elukuul (Joonis 8F), mis viitab sellele, et Wfs1-ex5-KO232 rottidel tekivad alates 3.
elukuust glükoosi stimuleeritud insuliini vabastamise häired (Joonis 8F). 1 kuu vanuste rottide vere glükoositase ei tõusnud (Joonis 8A).
Joonis 8. Glükoositundlikkus ja glükoosi stimuleeritud insuliini sekretsioon. Intraperitoneaalse glükoositolerantsi test (IPGTT) jaoks manustati katseloomadele glükoosi (2g/kg, i.p.) ja seejärel mõõdeti glükomeetriga vere glükoositase. 1 ja 2 kuu vanustel metsiktüüpi ja Wfs1-ex5-KO232 rottidel oli glükoositolerants sarnane (A ja B). 3. elukuul esines Wfs1-ex5-KO232 rottidel kerge glükoositalumatus (C), mis süvenes 6. elukuuks (D). IPGTT-s osalenud eri vanusega rottide ROC-kõvera-alune pindala (AUC); (F (1, 44) = 64,78, p < 0,001 (genotüüp); F (3, 44) = 8,60, p < 0,001 (vanus); F (3, 44) = 3,75, p = 0,017 (genotüüp × vanus)) (E). Glükoosi stimuleeritud vere insuliinitaset (näidatud baastaseme suhtes) mõõdeti 30 minutit pärast glükoosi manustamist.Wfs1-ex5-KO232 rottidel esinevad alates 3. elukuust insuliini sekretsioonis häired (F) ; ## p < 0,01 samas vanuses genotüüpide vahel, * p < 0,05 ja ** p < 0,01 samas vanuses genotüüpide vahel (vs. baastase), n = 6–8.
2.3.7 Insuliinitundlikkus
Inimese insuliini manustamine (1U/kg, s.c.) vähendas vere glükoositaset nii 3 kuu (Joonis 9A;
F (5, 55) = 82,73, p < 0,001 (insuliini manustamine)) kui 11 kuu vanustel rottidel (Joonis 9B; F (5, 55) = 25,47, p < 0,001 (insuliini manustamine)). Olenemata katseloomade vanusest, ei esinenud Wfs1-ex5-KO232 ja WT-rottidel insuliinitundlikkuses erinevusi (Joonis 9A ja 9B).
Joonis 9. WT ja Wfs1-ex5-KO232 rottide insuliinitundlikkus on sarnane.Insuliinitolerantsi testi (ITT) tarvis manustati rottidele inimese insuliini (1U/kg, s.c.), misjärel mõõdeti vere glükoositaset. 3 kuu (A) ja 11 kuu vanustel(B) rottidel ei esinenud insuliinitundlikkuses genotüüpidevahelisi erinevusi; (F (1, 55) = 2,77, p = 0,12 (genotüüp, 3-kuud vana); (F (1, 55) = 0,03, p= 0,86 (genotüüp, 11 kuud vana));
* p < 0,05 ja ** p < 0,01 genotüüpide vahel (vs. baastase), n = 6.
2.3.8 Langerhansi saarekeste geeniekspressioon
3 ja 7 kuu vanuste rottide Langerhansi saarekestes võrreldi kvantitatiivse reaalaja PCR-i (qRT-PCR) meetodil Wfs1 ja Hspa5 geeniekspressiooni (referentsina kasutati Hprt1) ning PCR-i abil splaissitud Xbp1 (Xbp1 S) osakaalu kogu Xbp1-st.
Wfs1 geeniekspressioon oli 3-kuulistel (Joonis 10A) Wfs1-ex5-KO232 rottidel võrreldes WT-rottidega kõrgem, samas kui 7-kuulistel (Joonis 10B) KO- ja WT-rottidel Wfs1 ekspressioonis genotüüpidevaheline erinevus puudus.
Hspa5 ekspressioonitasemes ei olnud 3-kuulistel (Joonis 11A) ja 7-kuulistel (Joonis 11B) WT- ja KO-rottidel genotüüpidevahelist erinevust.
Xbp1 S osakaal kogu Xbp1-st oli 3 kuu vanustel Wfs1-ex5-KO232 rottidel võrreldes oma WT-pesakaaslastega kõrgem (Joonis 12A). 7. elukuuks tõusis KO-rottidel võrreldes metsiktüüpi rottidega Xbp1 S osakaal kogu Xbp1-st veelgi (Joonis 12B).
Joonis 10. 3- ja 7-kuuliste metsiktüüpi ja Wfs1-ex5-KO232 rottide Langerhansi saarekeste Wfs1 geeniekspressiooni võrdlus. 3-kuulistel (A)Wfs1-puudulikel rottidel oli pankrease saarekestesWfs1 geeniekspressioon kõrgem kui WT-pesakaaslastel; (F (1, 8) = 0,64, p = 0,013 (genotüüp)). 7 kuu vanustel (B) rottidel Wfs1 geeniekspressioonis genotüüpidevahelisi erinevusi polnud; (F (1, 0,5) = 0,05, p = 0,49 (genotüüp)); * p < 0,02 samas vanuses genotüüpide vahel (vs. metsiktüüp), n = 7–8.
Joonis 11. 3- ja 7- kuuliste metsiktüüpi ja Wfs1-ex5-KO232 rottide Langerhansi saarekesteHspa5 geeniekspressiooni võrdlus. 3 kuud vanade (A) WT ja Wfs1-ex5-KO232 rottide Hspa5 ekspressioon oli sarnane; (F (1, 2) = 0,18, p = 0,16 (genotüüp)). Ka 7 kuud vanade ( B) rottide Hspa5 geeniekspressioonis polnud genotüüpidevahelisi erinevusi; (F (1, 0,3) = 0,03, p= 0,61 (genotüüp)), n = 7–8.
Joonis 12. 3- ja 7-kuuliste Wfs1-puudulike ja metsiktüüpi rottide Langerhansi saarekeste Xbp1 S osakaal kogu Xbp1-st. 3-kuulistel (A) Wfs1-puudulikel rottidel oli pankrease saarekestes Xbp1 S osakaal kogu Xbp1-st tunduvalt kõrgem kui WT-rottidel; (F (1, 6) = 2,46, p = 0,03 (genotüüp)). 7.
elukuuks (B) tõusis KO-rottideXbp1 S osakaal võrreldes koguXbp1-ga veel ning erinevus WT-rottide Xbp1 S osakaalude suhtega kasvas; (F (1, 11) = 2,01, p = 0,01 (genotüüp)); * p < 0,03 ja ** p < 0,01 samas vanuses genotüüpide vahel (vs. metsiktüüp), n = 5–8.
2.4 Arutelu
Wolframi sündroomi esimesed sümptomid on insuliinist sõltuv suhkurdiabeet ja optilise närvi atroofia (Strom jt., 1998; Rendtorff jt., 2011). Varasemalt kolme erineva töögrupi loodud Wfs1-puudulikel transgeensetel hiirtel esinevad insuliini sekretsiooni häired ja probleemid oma veresuhkru taseme kontrollimisega. Kuna nimetatud hiiremudelitel pole seni näidatud insuliinist sõltuva suhkurdiabeedi väljakujunemist, erineb Wfs1-puudulike hiirte WS-i patoloogia oluliselt inimese WS-i seisundist (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005;
Luuk jt., 2009).
Seetõttu disainisid Tartu Ülikooli teadlased Wfs1-puuduliku roti, eeldades, et rotil võiks erinevalt Wfs1-hiirtest tekkida WS-i patsientidega sarnasemad sümptomid. Selline mudel võimaldaks paremini uurida WFS1 funktsioone ja testida potentsiaalseid WS-i vastaseid ravimeid.
Käesolevas töös uuriti uue Wfs1-mutantse Wfs1-ex5-KO232 roti suhkurdiabeedi fenotüüpi, lootes, et lisaks teistele WS-i sümptomitele kujuneb Wfs1-puudulikul rotil elu jooksul välja insuliinist sõltuv suhkurdiabeet (Plaas jt., avaldamisel).
Leiti, et 1–2 kuud vanad Wfs1-puudulikud isased rotid erinesid metsiktüüpi pesakonnakaaslastest ainut veidi kergema kehakaalu poolest (Joonis 4). Võrreldes WT-hiirtega on madalamat kehakaalu täheldatud ka Wfs1-puudulikel transgeensetel hiirtel (Luuk jt., 2009; Noormets jt., 2011; Terasmaa jt., 2011; Punapart jt., 2014). Ühe kuu vanuste rottidega läbi viidud intraperitoneaalne glükoosi tolerantsi test ei näidanud genotüüpidevahelisi erinevusi ei veresuhkru- (Joonis 8A) ega ka vereseerumi insuliinitasemes, nii enne kui ka peale glükoosi 2g/kg i.p manustamist (Joonis 8F).
Tõenäoliselt on noortel rottidel ülikiire verest glükoosi omastamine ning 30 minuti ajapunkt on liiga hiline hindamaks muutusi nende vere glükoosi- ja insuliinitasemetes, mis 30 minuti peal on juba stabiliseerunud. See näitab, et Wfs1-i ei ole insuliini sekretsiooniks vaja ning hiljem tekkiv insuliini sekretsiooni häire võib olla põhjustatud hoopis Wfs1-puudulikkusest tingitud endoplasmaatilise retiikulumi stressist.
Intraperitoneaalse glükoosi tolerantsi testi abil näidati, et alates kolmandast elukuust tekib Wfs1-puudulikel rottidel glükoositalumatus ja häired insuliini sekretsioonis, mis vananedes süvenevad (Joonised 8C, 8D, 8F). Sarnast fenotüüpi on näidatud ka Wfs1-puudulikel
transgeensetel hiirtel (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005; Luuk jt., 2009). Neid sümptomeid võib põhjustada Wfs1-puudulikkusest tingitud progresseeruv pankrease beeta-rakkude ER-i stress, millega kaasnevad beeta-rakkude proliferatsiooni häired ja beeta-rakkude apoptoos.
Varem on näidatud, et nii WS-i patsientidel kui ka Wfs1-puudulikel hiirtel põhjustab pankrease beeta-rakkude massi vähenemisst ER-i stress (Karasik jt., 1989; Riggs jt., 2005).
Kontrollimaks võimaliku ER-i stressi olemasolu Wfs1-mutantsete rottide beeta-rakkudes, analüüsiti 3 ja 7 kuud vanade rottide pankrease Langerhansi saarekestes erinevate ER-i stressimarkerite geeniekspressiooni. Kolme kuu vanustel Wfs1-puudulikel rottidel on Wfs1 geeniekspressioon tunduvalt kõrgem kui WT-pesakaaslastel (Joonis 10A). Arvatakse, et Wfs1 võtab osa beeta-rakkude ER-is toimuvast proinsuliini voltimisest ja töötlemisest (Fonseca jt., 2010b) ning üha suurenev nõudlus insuliini järele võib seetõttu tõsta Wfs1 ekspressioonitaset. Samuti on Wfs1 oluline pankrease beeta-rakkude ER-i stressivastuses, milles on Wfs1-il oluline roll ER-i homöostaasi taastamises (Fonseca jt., 2010). Seega võib Wfs1-mutantsete rottide pankrease beeta-rakkude kõrgem Wfs1 ekspressioonitase olla üheks esmaseks ER-i stressimarkeriks, mis 7-kuulistel rottidel enam ei avadu (Joonis 10B).
Tõenäoliselt on selleks ajaks käivitatud juba muud ER-i stressirajad.
Selle kontrollimiseks analüüsiti nii 3 kui ka 7 kuu vanuste rottide pankrease saarekestest Xbp1 S ja Hspa5 geeniekspressiooni (Joonis 11 ja Joonis 12). Selgus, et Wfs1-puudulikel rottidel on pea kaks korda kõrgem ER-i stressimarkeri Xbp1 S tase, võrreldes sama vanade metsiktüüpi pesakaaslastega. Kõrgenenud Xbp1 S ekspressiooni on ka varem näidatud Wfs1-puudulike hiirte pankrease saarekestes (Yamada jt., 2006). Xbp1 splaissitakse vastusena ER-i stressile ning aktiivne Xbp1 S aitab kaasa ER-i voltumata valkude vastuse initsieerimisele (Lee jt., 2003). On näidatud, et WFS1 on UPR-i komponent (Fonseca jt., 2010a) ning arvatakse, et WFS1võib osa võtta ka proinsuliini voltimisest (Fonseca jt., 2010b).
Tõenäolselt tekitab Wfs1-puudulikkus nõndanimetatud “surnud ringi efekti”, kus kasvav organism vajab üha rohkem funktsionaalset insuliini, kuid Wfs1-mutantsed beeta-rakud ei suuda organismi vajadusi täita ja piisavalt proinsuliini insuliiniks konventeerida. Püsivalt kõrge veresuhkru tase on beeta-rakkudele signaaliks toota ja sekreteerida rohkem insuliini, mis omakorda süvendab Wfs1-puudulikes rakkudes ER-i stressi ja UPR-i vastust, viies rakud kiiremini apoptoosi.
Huvitaval kombel ei olnud 3 ja 7 kuud vanade rottide Langerhansi saarekestes Hspa5 geeniekspressioonis genotüüpidevahelisi erinevusi (Joonis 11). Tõenäoliselt tuleks edaspidi
uurida ka Hspa5 ekspressioonitaset valgu kujul, kuna mRNA ja transleeritud valgu hulk ei pruugi alati omavahel korreleeruda.
Kuuendaks elukuuks on Wfs1-mutantsete rottide vereseerumi insuliini baastase ligikaudu kaks korda madalam kui pesakaaslastel (Joonis 6) ning alates 10. elukuust tekib Wfs1-puudulikel rottidel glükosuuria (Joonis 7). Madalamat insuliini baastaset ja glükosuuria kujunemist on märgatud ka Wfs1-puudulikel hiirtel (Noormets jt., 2011; Terasmaa jt., 2011).
6-kuuliste Wfs1-rottide insuliini baastaseme languses mängib arvatavasti rolli ER-i stressist tingitud pankrease beeta-rakkude massi vähenemine, mistõttu väheneb beeta-rakkude poolt toodetav insuliini hulk. Seetõttu ei suuda vanad Wfs1-puudulikud rotid oma vere glükoositaset kontrollida ning üleliigset glükoosi üritatakse organismist välja viia renaalse väljutamise teel.
Samaaegselt glükosuuria arenguga hakkab 10 kuu vanuselt Wfs1-mutantsete rottide kehakaal järsult langema, samas kui WT-rottide kehakaal tõuseb edasi (Joonis 4). Huvitaval kombel ei teki vanadel Wfs1-mutantsetel hiirtel järsku kehakaalu langust ning kehakaal püsib läbi elu stabiilsena (Punapart jt., 2014). Diabeetne fenotüüp tipneb isastelWfs1-mutantsetel rottidel keskeltläbi 11–13.elukuul avalduva insuliinist sõltuva suhkurdiabeedi tekkega (Joonis 5). 13 kuu vanustel Wfs1-mutantsetel rottidel on kodupuurist mõõdetud veresuhkru baastase üle 20 mM (Joonis 5), samas kui metsiktüüpi kontroll-loomade veresuhkur on normaaltasemel. Et kontrollida võimalikku insuliiniresistentsust, viidi läbi insuliini tolerantsuse test. Leidsime, et nii noortel kui ka vanadel Wfs1-puudulikel rottidel on säilinud insuliinitundlikkus (Joonis 9A ja 9B). Sama on tähendatud ka Wfs1-puudulikel hiirtel, kellel ei kujune elu jooksul välja insuliiniresistentsust (Terasmaa jt., 2011). Seega ei mõjuta Wfs1-puudulikkus kudede insuliini tundlikkust.
Võib oletada, et rottidel tekkiva insuliinist sõltuva suhkurdiabeedi taga on fakt, et rott on inimesele evolutsiooniliselt lähemal kui hiir ning seetõttu võib rottide WS-i kulg olla võrreldes hiirega raskekujulisem ja inimestel esineva WS-iga sarnasem. Samas võib isaste Wfs1-puudulike rottide insuliinist sõltuva suhkurdiabeedi väljakujunemist põhjustada nende kasvukõver. Nimelt tõuseb Sprague Dawley liini isaste rottide kehakaal kogu elu vältel suhteliselt stabiilselt (Marques jt., 2016), kuid hiirte kasv pidurdub umbes 16. elunädalal (Punapart jt., 2014). Pidevalt suurenev kehakaal tõstab pankrease beeta-rakkude insuliini
tootmise koormust (Ding jt., 2013), mis koosmõjul Wfs1-puudulikkusega võib suurendada beeta-rakkude ER-i stressi ja kiirendada rkkude apoptoosi.
Humaanmeditsiinis levinud praktika järgi diagnoositakse Wolframi sündroom nendel patsientidel, kellel avalduvad koos juveniilne suhkurdiabeet ja nägemisnärvi kahjustus või nägemise häire. Praegu puudub selge arusaam WFS1 geeni funktsioonist ja WS-i ei osata ravida. Erinevate WS-i vastaste ravimite või raviteraapiate prekliiniliseks testimiseks on vaja valiidset, WS-i põhisümptomitega loommudelit. Seni ei ole mitte ühelgi Wfs1-puudulikul transgeensel hiirel kirjeldatud insuliinist sõltuva suhkurdiabeedi teket. Seda enam, on näidatud, et Wfs1-mutantsed hiired on resistentsed streptosototsiini indutseeritud pankrease beeta-rakkude surmale, mistõttu ei saa Wfs1-puudulikes hiirtes esile kutsuda insuliinist sõltuvat suhkurdiabeeti (Terasmaa jt., 2011). See viitab, et WS-i patsientide kliinilise seisundi imiteerimiseks on vaja paremat loommudelit, kellel areneks välja insuliinist sõltuv suhkurdiabeet.
Käesolevas töös näidati, et Wfs1-puudulikul rotil areneb 11-13 kuu vanuselt välja insuliinist sõltuv suhkurdiabeet (Joonis 5) ning nende pankrease Langerhansi saarte beeta-rakkudes on kõrgenenud ER-i stressitase, mis võib viia beeta-rakud apotoosi (Joonis 12A ja 12B). On selge, et võrreldes erievate Wfs1-mutantse hiirega on Wfs1-ex5-KO232 puudulikul rotil avalduv WS-i diabeetne fenotüüp oluliselt sarnasem inimese WS-i diabeetse fenotüübiga. Seega, võib Wfs1-ex5-KO232 rott osutuda uueks ja paremaks loommudeliks WS-i uurimiseks ning WS-i vastaste ravimeetodite väljatöötamiseks. Loodetavasti annab Wfs1-ex5-KO232 rott uut teavet Wfs1 geeni funktsiooni kohta ja võimaldab lõpuks leida WS-i vastase ravi.
KOKKUVÕTE
Wolframi sündroom (WS) on kiirelt arenev progressiivne neurodegeneratiivne haigus, mille põhisümptomid on suhkurdiabeet, magediabeet, nägemisnärvi atroofia ja sensorineuraalne kurtus. WS-i põhjustavad mutatsioonid WFS1 geenis, mis kodeerib endoplasmaatilise retiikulumi (ER) membraanis paiknevat glükoproteiini wolframiin 1. Wolframiin 1 osaleb ER-i stressi vastuses, valkude post-translatsioonilises modifitseerimises ja pakkimises ning kaltsiumitaseme regulatsioonis. Lisaks on näidatud WFS1 rolli insuliini biosünteesis ja sekretsioonis.
Selleks, et uurida WFS1 geeni funktsioone, Wolframi sündroomi ja võimalikke WS-i vastaseid raviteraapiaid, on praegu eri laborites konstrueeritud kolm transgeenset Wfs1-puudulikku hiiremudelit. Kuigi neil hiirtel kujuneb elu jooksul välja glükoositalumatus ning väheneb glükoosi stimuleeritud insuliini sekretsioon, pole seni selgeid suhkurdiabeedi tekke viiteid.
Seetõttu konstrueerisid Tartu Ülikooli teadlasedWfs1-mutantse roti. Käesolevas töös uuriti nimetatud Wfs1-puudulikkusega roti (Wfs1-ex-KO232) suhkurdiabeedi fenotüüpi.
Leiti, et uuritud isastel Wfs1-puudulikel Wfs1-ex5-KO232 rottidel tekib progresseeruv insuliinist sõltuv suhkurdiabeet. 3. elukuul vähenes Wfs1-puudulikel rottidel glükoosi stimuleeritud insuliini sekretsioon ja tekkis progresseeruv glükoositalumatus. Võrreldes oma WT-pesakaaslastega oli nii 3 kui ka 7 kuud vanade Wfs1-puudulike rottide Langerhansi saarekestes ER-stressimarkeri Xbp1 S osakaal võrreldes Xbp1-ga kõrgem. 10. elukuuks kujunes Wfs1-mutantsetel rottidel välja glükosuuria ning nende kehakaal hakkas langema.
11–13 kuu vanustel KO-rottidel tekkis hüperglükeemia ning insuliinist sõltuv suhkurdiabeet.
13. elukuuks oliWfs1-ex5-KO232 rottide paastujärgne glükoositase üle 20 mM ja neil esines polüuuria.
Võrreldes Wfs1-mutantsete hiiremudelitega on Wfs1-ex5-KO232 rottidel tekkivad diabeedi sümptomid sarnasemad WS-i patsientidel kujunevate haigusnähtudega. Seega on nüüd olemas uus Wolframi sündroomi mudel, mille abil WS-i etioloogiat uurida ja võimalikke WS-i vastaseid raviteraapiaid välja arendada.
The diabetic phenotype of Wfs1 -deficient rat
Tuuliki Koppel
SUMMARY
Wolfram syndrome (WS) is a rare autosomal recessive neurodegenerative disorder caused by mutations in the WFS1 gene (Barrett jt., 1995). The common manifestations of WS are diabetes insipidus, juvenile-onset diabetes mellitus, optic atrophy and deafness, hence the acronym DIDMOAD (Swift jt., 1990; Barrett jt., 1995).
WFS1 gene encodes wolframin 1 protein, that resides in the endoplasmic reticulum (ER) membrane (Takeda jt., 2001) and participates in the ER-stress response regulation, protein processing and ER calcium homeostasis (Hofmann jt., 2003). Some data suggests thatWFS1 might be an important component of proinsulin folding and processing in the ER of the pancreatic beta-cell (Fonseca jt., 2010b) and that wolframin 1 plays a role in insulin secretion from insulin-containing granules (Henquin, 2000). Mutant forms of WFS1 predispose insulin-producing beta-cells to ER stress-mediated apoptosis (Ishihara jt., 2004; Yamada jt., 2006; Akiyama jt., 2009).
In order to study different functions of WFS1 and Wolfram syndrome, as well as to develop potential therapeutic approaches against WS, three differentWfs1-deficient mouse models have been developed in different laboratories (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005; Luuk jt., 2009). Mice with disrupted Wfs1 function show increased pancreatic beta-cell death, impaired glucose-stimulated insulin secretion, progressive glucose intolerance and lower insulin levels than their wild-type (WT) littermates (Ishihara jt., 2004; Riggs jt., 2005; Luuk jt., 2009; Noormets jt., 2011; Terasmaa jt., 2011). However, to the best of our knowledge, none of thoseWfs1-mutant mice show development of diabetes mellitus. Therefore the scientists of University of Tartu constructed a Wfs1-deficient rat (Plaas jt., avaldamisel).
In the current thesis we studied the diabetic phenotype of novel Wfs1-mutant rat (Wfs1-ex5-KO232).
We found that Wfs1-ex5-KO23 (KO) rats were lighter than their wild-type littermates between the ages of 4 to 10 months. After that KO rats began to lose weight, while WT rats continued to grow.
In order to measure blood glucose and insulin levels rats were food deprived for 2 hours, thereafter blood samples were drawn from their tail vein. Blood glucose levels were indistinguishable between WT and KO rats up to the age of 11 months, after that Wfs1-ex5-KO232 developed hyperglycemia and insulin-dependent diabetes mellitus. At the age of 13 months blood glucose levels were above 20 mM.
Urine samples were collected from non-fasted rats. There were no differences in urine glucose levels between genotypes up to the age of 10 months, from there on Wfs1-ex5-KO232 rats developed glycosuria.
For the intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) rats were fasted for 2 hours.
Thereafter basal glucose levels were measured and glucose administered (2g/kg, i.p.), following measurement of blood glucose levels at 30, 60, 90, 120 and 180 minutes. Glucose tolerance was similar for WT and KO rats at 1 and 2 months of age. At the age of 3 months KO rats showed first signs of glucose intolerance compared to WT littermates. Glucose intolerance of KO rats increased by the age of 6 months.
In order to analyse glucose-stimulated insulin secretion, blood samples were collected right before and 30 minutes after glucose administration (2g/kg, i.p.) in IPGTT test. Glucose administration increased blood insulin levels of 2 to 11 months old WT rats, while only 2 months oldWfs1-ex5-KO232 rats showed raised insulin levels. This implies that starting from 3 months of age KO rats develop defect in glucose-stimulated insulin secretion.
Insulin tolerance test (ITT) was conducted similarly to IPGTT, only human insulin was administered (1U/kg, s.c.) before measuring blood glucose levels. There were no differences between WT and KO blood insulin levels and human insulin reduced blood glucose levels in both 3 and 11 months old rats. This demonstrates that Wfs1-deficient rats do not develop insulin resistance.
Analysing the gene expression in the islets of Langerhans of 3 and 7 months old rats revealed, thatWfs1-deficient rats had a higher ratio of ER-stress marker Xbp1 S level to Xbp1
