Tierärztliche Hochschule Hannover
Quantifizierung unterschiedlicher Fettdepots mittels Ultrasonographie und deren Entwicklung in der Transitperiode unter dem Einfluss von Niacin bei
Milchkühen
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Claudia Raschka
Stuttgart
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Jürgen Rehage Klinik für Rinder,
Tierärztliche Hochschule Hannover Prof. Dr. Dr. Sven Dänicke
Institut für Tierernährung, Friedrich Loeffler Institut Braunschweig
1. Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Rehage
Klinik für Rinder,
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Gutachter: Prof. Dr. Gerhard Breves
Physiologisches Institut,
Tierärztliche Hochschule Hannover Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2015
Für meine Familie und Freunde
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ... 1
2. Einleitende Literaturübersicht ... 2
2.1. Lipomobilisationssyndrom ... 2
2.2 Niacin ... 4
2.3. Bedeutung unterschiedlicher Fettdepots für die Lipomobilisation ... 5
2.3.1. Differenzierung und Erfassung von Fettdepots ... 5
2.3.2. Funktionelle Unterschiede zwischen Fettdepots ... 7
2.4. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit ... 8
3. Material und Methoden... 10
3.1. Studientiere ... 10
3.2. Methodik der ersten Studie ... 10
3.2.1. Vorbereitung der Tiere ... 10
3.2.2. Ultrasonographische Messpunkte ... 10
3.2.3. Messungen der Körpermaße ... 11
3.2.4. Schlachtung ... 11
3.2.5. Statistische Auswertung ... 12
3.3. Methodik der zweiten Studie ... 12
3.3.1. Studiendesign ... 12
3.3.2. Fütterung ... 12
3.3.3. Blutproben ... 13
3.3.4. Statistische Auswertung ... 13
4. Study 1: An in vivo method for quantitative determination of the amount of subcutaneous and abdominal adipose tissue depots in German Holstein dairy cattle 15 4.1. Abstract ... 16
4.2. Background ... 16
4.3. Material and methods ... 18
4.3.1. Animals ... 18
4.3.2. Ultrasonography ... 18
4.3.3. Body size measurement ... 19
4.3.4. Slaughter... 19
4.3.5. Statistical analysis ... 19
4.4. Results... 20
4.4.1. Preliminary validation of measuring points: ... 20
4.4.2. Results from the study group: ... 20
4.4.2.1. Ultrasonography ... 20
4.4.2.2. Slaughter ... 20
4.4.2.3. Estimation of adipose depot amounts and relationship with actual slaughter
weight: ... 20
4.5. Discussion ... 21
4.5.1. Accuracy of ultrasonography... 21
4.5.2. Bias originating from the slaughter protocol ... 21
4.5.3. Associations between measuring points and amounts of individual fat depots ... 21
4.5.4. Applicability ... 23
4.6. Conclusion ... 24
4.7. List of abbreviations ... 24
4.8. References ... 25
4.9. Tables ... 28
4.10. Figures... 34
5. Study 2: Dynamics of subcutaneous and abdominal fat depots throughout transition period and early lactation in German Holsteins ... 42
5.1. Abstract ... 43
5.2. Introduction ... 43
5.3. Material and Methods ... 44
5.3.1. Animals ... 44
5.3.2. Feeding regime ... 45
5.3.3. Ultrasound and body size measurements ... 45
5.3.4. Blood samples and parameters of clinical chemistry ... 46
5.3.5. Data analysis ... 46
5.3.5.1. Estimation of weights of adipose tissue depots and further data processing ... 46
5.3.5.2. Feeding effects on a single adipose tissue depot ... 46
5.3.5.3. Dynamics within one adipose tissue depot ... 47
5.3.5.4. Comparison of absolute amount and dynamic changes between adipose tissue depots ... 47
5.3.5.5. Connection of adipose tissue depots and parameters of clinical chemistry 47 5.4. Results... 47
5.4.1. Feeding effects ... 47
5.4.2. Effects of parity ... 47
5.4.3. Dynamics within one adipose tissue depot... 48
5.4.4. Dynamics in the AAT depot in comparison to SCAT ... 48
5.4.5. Dynamics in the subdivisions of AAT depot in comparison to SCAT depot .... 48
5.4.6. Association of adipose tissue depots and parameters of clinical chemistry .. 49
5.5. Discussion ... 50
5.5.1. Feeding regime and niacin ... 50
5.5.2. Parity ... 51
5.5.3. Absolute quantity and dynamics of mobilization within one depot ... 51
5.5.4. Dynamics in the AAT depot and its subdivisions in comparison to SCAT... 53
5.5.5. Impact of adipose tissue dynamics on parameters of clinical chemistry in FC and EL ... 54
5.6. Conclusion ... 55
5.7. References ... 56
5.8. Tables ... 60
5.9. Figures... 65
6. Übergreifende Diskussion... 68
6.1. Methodik zur Quantifizierung der Fettdepots ... 68
6.2. Anwendung der Methode zur Quantifizierung von Fettdepots ... 71
6.2.1. Fütterungsregime und Niacin ... 72
6.2.2. Parität... 74
6.2.3. Absolute Menge und Dynamik der Mobilisierung innerhalb eines Fettdepots 74 6.2.4. Dynamik im AAT und seinen Unterabteilungen im Vergleich zum SCAT ... 76
6.2.5. Einfluss der Menge und der Dynamik der Fettdepots auf Parameter der klinischen Chemie in FC und EL ... 77
7. Zusammenfassung ... 79
8. Summary ... 83
9. Literatur ... 86
Abkürzungsverzeichnis
AAT gesamtabdominales Fettdepot (engl. abdominal adipose tissue depot)
abs absolute Differenz
abspD absolute Differenz pro Tag (engl. absolute difference per day) absW absolutes Gewicht (engl. absolute weight)
ANOVA Varianzanalyse (engl. analysis of variance)
ap antepartum
ATD Fettdepot (engl. adipose tissue depot) BCS body condition score
BFT Rückenfettdicke (engl. backfatthickness) BHB -Hydroxybutyrat
BL Körperlänge (engl. body length)
BMI body mass Index
cm Zentimeter
DP Trockenstehperiode (engl. dry period) EL Frühlaktation (engl. early lactation) FC Frischmelker (engl. fresh cows) Fig. Abbildung (engl. figure)
FLI Friedrich- Loeffler- Institut HCC high concentrate control group HCN high concentrate niacin group HG Brustumfang (engl. heart girth)
HH Hüfthöhe
HW Hüftbreite (engl. Hip width)
IAT Darmfettdepot (engl. intestinal adipose tissue depot) IFAT total internal fat
kg Kilogramm
LCC low concentrate control group LCN low concentrate niacin group
MAT mesenteriales Fettdepot (engl. mesenteric adipose tissue depot)
MHz Megahertz
mm Millimeter
mmol/l Millimol pro Liter
MRT Magnet-Resonanz-Tomographie NA Nicotinsäure (engl. nicotinacid) NAD Nicotinamidadenindinuklotid
NADP Nicotinamidadenindinuklotidphosphat
NAM Nicitinamid
NEB negative Energiebilanz
NEFA nichtveresterte Fettsäuren (engl. non – esterified fatty acids) NRC National research council
OMAT omentales Fettdepot (engl. omental adipose tissue depot) PCAT Beckenhöhlenfett (engl. adipose tissue in the pelvic cavity)
pp postpartum
R12 Dicke des SCAT auf Höhe der 12. Rippe rel relative Differenz
relpD relative Differenz pro Tag (engl. relative difference per day) RMSE root mean square error
RPAT retroperitoneales Fettdepot (engl. retroperitoneal adipose tissue depot)
SCAT subkutanes Fettdepot (engl. subcutaneous adipose tissue depot)
SH Sternumhöhe
SLE Entry Level
SLS Stay Level
TAG Triglyceride
WH Widerristhöhe
WHR Waist to hip ratio
1 1. Einleitung
Im Zeitraum von etwa drei Wochen ante partum bis etwa drei Wochen post partum, der sogenannten Transitperiode, entsteht durch den Energiebedarf des immer größer werdenden Kalbes und der beginnenden Laktation ein Energiedefizit für die Milchkuh (GRUMMER 1995; DRACKLEY 1999). Um dieses Energiedefizit zu kompensieren, werden körpereigene Reserven, vornehmlich aus dem Fettgewebe, zur Energiegewinnung mobilisiert. Im Falle der übermäßigen Lipomobilisation resultieren hieraus jedoch Stoffwechselstörungen, wie Ketose und Leberverfettung, welche häufig mit anderen Erkrankungen, verminderter Fruchtbarkeit und Leistungseinbußen vergesellschaftet sind (DRACKLEY 1999).
Fettgewebe lässt sich anatomisch nach seiner Lokalisation in subkutanes, intermuskuläres sowie inneres Fettgewebe unterteilen. Letzteres wird wiederum nach thorakalem und abdominalem Fettgewebe unterschieden. Zum abdominalen Fettgewebe zählen retroperitoneales, inklusive perirenales, omentales und mesenteriales Fettgewebe (ROBELIN 1985).
Beim Menschen können mittels bildgebender Verfahren, insbesondere der Magnet- Resonanz-Tomographie (MRT), die Menge und Verteilung von Fettgeweben im Körper dargestellt werden. Es ist bekannt, dass vor allem die Menge an gespeichertem viszeralen Fettgewebe das Auftreten von Stoffwechselstörungen begünstigt (WAJCHENBERG 2000; LEE et al. 2013).
Bislang ist beim Rind wenig über die quantitativen Beiträge der einzelnen Fettdepots zum mobilisierten Fett im Rahmen der Lipolyse während der Transitperiode bekannt.
Es scheint aber auch hier Unterschiede in der lipolytischen Aktivität des subkutanen im Vergleich zum retroperitonealen Fettdepot zu geben (LOCHER et al. 2011;
LOCHER et al. 2012). VON SOOSTEN et al. (2011) konnten ferner in Untersuchungen an Schlachtkühen zeigen, dass das retroperitoneale Depot im Vergleich zu übrigen oben genannten Depots während der peripartalen Phase die größten katabolen und anabolen Veränderungen durchläuft.
Die Körpergröße von Milchkühen beschränkt die Möglichkeiten mittels MRT die Körperfettverteilung sowie deren Dynamik in der Transitperiode zu untersuchen.
Deshalb war es Ziel der vorliegenden Arbeit, eine sonographische
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Untersuchungsmethode zu entwickeln, die es erlaubt, in vivo das Gewicht als Maß für die Größe abdominaler und subkutaner Fettdepots wiederholt an Milchkühen zu ermitteln.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte in einem Fütterungsversuch an Milchkühen geprüft werden, ob eine Futtersupplementation mit Niacin, dem eine antilipolytische Wirkung zugeschrieben wird (NIEHOFF et al. 2009), die Dynamik der Veränderungen subkutaner und abdominaler Fettdepots in der Transitperiode beeinflusst.
2. Einleitende Literaturübersicht 2.1. Lipomobilisationssyndrom
Mit Beginn der Laktation, deren Energiebedarf in der Mehrzahl nicht durch die Futteraufnahme gedeckt werden kann, entwickeln Kühe eine negative Energiebilanz (NEB). Zum Ausgleich der NEB mobilisieren Kühe Körperreserven. Dies ist vornehmlich Fett aus den Fettgeweben, aber auch Protein aus der Muskulatur. Im Rahmen der Lipolyse werden aus den Fettgeweben unveresterte Fettsäuren (NEFA) freigesetzt (ARNER et al. 1990; BIRNBAUM 2003; VON ENGELHARDT u. BREVES 2005; LOCHER et al. 2011), die für das Milchfett und zur Energiegewinnung in der Leber sowie peripheren Geweben genutzt werden. In der Leber werden NEFA entweder vollständig im Citratcyclus oder unvollständig zu Ketonkörpern, wie z.B.
Betahydroxybutyrat (BHB), oxidiert. Teilweise werden NEFA aber auch mit Glycerin zu Triglyceriden (TAG) reverestert und als Lipidtröpfchen im Leberparenchym gespeichert oder in Form von Lipoproteinen aus der Leber ausgeschleust (GRUMMER 1993; HERDT 2000; PIRES et al. 2007b). Ab 50 mg TAG / g Leberfrischgewicht handelt es sich um eine moderate, ab 100 mg/g um eine hochgradige Leberverfettung. In den ersten Wochen postpartum sind knapp die Hälfte der hochleistenden Milchkühe in Folge übermäßiger Fettmobilisation von einer mittel- bis hochgradigen Leberverfettung sowie subklinischen Ketose betroffen (FORD 1959; GRUMMER 1995; DRACKLEY 1999; REYNOLDS et al. 2003; VAN KNEGSEL et al. 2005; GRUMMER 2008). Neben Ketosen und Leberverfettungen (DUFFIELD 2000; DIRKSEN et al. 2012; ITLE et al. 2014) hat eine übermäßige Lipomobilisation nicht selten weitere negative Effekte auf Gesundheit und
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Produktivität. Diese werden zum Teil mit depressiven Effekten auf die zelluläre und humorale Immunabwehr (DRACKLEY 1999, HERDT 2000; LEBLANC 2010; OSPINA et al. 2010; CONTRERAS u. SORDILLO 2011; MCART et al. 2012; BERGE u.
VERTENTEN 2014) sowie auf die Ovarfunktion (LEROY et al. 2005; VANHOLDER et al. 2005; HOECK et al. 2011) erklärt. Da exzessive Lipomobilisation häufig entsprechend nicht nur mit Ketosen und Leberverfettungen assoziiert ist, sondern auch mit Milchleistungsdepression, Neigung zu Infektionskrankheiten, wie Mastitis und Metritis, Labmagenverlagerungen und verminderter Fruchtbarkeit, wird dieser Komplex von Gesundheits- und Produktionsstörungen auch als Lipomobilisationssyndrom bezeichnet (ROBERTS et al. 1981; GRUMMER 1993;
VEERKAMP et al. 2001; HERINGSTAD et al. 2003 LEBLANC 2010; OSPINA et al.
2010; MCART et al. 2012; BERGE u. VERTENTEN 2014).
Die Dauer und Stärke der NEB und damit das Ausmaß der Lipolyse und assoziierter Gesundheitsstörungen sind von Tier zu Tier sehr variabel (LEBLANC 2010) und von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Dazu zählen naturgemäß die Höhe der Milchleistung zu Beginn der Laktation sowie der Trockenmasseverzehr (HOOVEN et al. 1972; MCNAMARA u. HILLERS 1986a; MCNAMARA u. HILLERS 1986b;
ARENDONK et al. 1991; VEERKAMP u. EMMANS 1995; DRACKLEY 1999, HERDT 2000; DECHOW et al. 2002; CHAGAS et al. 2009; KAY et al. 2009; VALLIMONT et al. 2010; VANHOLDER et al. 2015). Auch die prae- und postpartale Rationsgestaltung, d.h. beispielhaft die Energiedichte und der Strukturgehalt der Ration, die Qualität und Akzeptanz der Futterkomponenten sowie die Technik der Rationsherstellung und Präsentation, haben für die Entwicklung exzessiver Lipomobilisation erhebliche Bedeutung (GILLUND et al. 2001; FRIGGENS et al.
2004; DANN et al. 2006; GOLDHAWK et al. 2009; JANOVICK et al. 2011; VICKERS et al. 2013; BERGE u. VERTENTEN 2014; SCHULZ et al. 2014; BJERRE- HARPØTH et al. 2014; AKBAR et al. 2014). Erstkalbige Kühe sind zumeist stärker als mehrkalbige Kühe betroffen (BERRY et al. 2006; ROCHE et al. 2009; JANOVICK u. DRACKLEY 2010; JANOVICK et al. 2011). Stress, hervorgerufen beispielsweise durch inadaequate Haltungsbedingungen, schlechtes Stallklima, soziale Rangordnungsauseinandersetzungen zwischen Herdenmitgliedern oder betreuendes Personal, begünstigt vermehrte Lipomobilisation über die katecholamin-induzierte Lipolyse (JASTER u. WEGNER 1981; DRACKLEY 1999; ELKINS u. SPURLOCK
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2009; KOLTES u. SPURLOCK 2011; LOCHER et al. 2011) sowie Entwicklung einer Insulinresistenz (BELL u. BAUMAN 1997; KOSTER u. OPSOMER. 2013). Ein wesentlicher Faktor, der die Fettmobilisation mit einsetzender Laktation begünstigt, ist die Körperkondition der Kühe zum Zeitpunkt des Partus. Kühe in sehr guter im Vergleich zu Kühen in moderater Körperkondition neigen besonders zum Lipomobilisationssyndrom (INGVARTSEN et al. 1996; FRIGGENS et al. 2004; DE SMET et al. 2004; ROCHE 2006; ROCHE et al. 2007; ROCHE et al. 2009;
JANOVICK u. DRACKLEY 2010; KOSTER u. OPSOMER. 2013; LOCHER et al.
2014; DRACKLEY et al. 2014). Zudem ist eine genetische Disposition für oben beschriebene Störungen des Energiestoffwechsels bekannt (LOKER et al. 2012;
VAN DER DRIFT et al. 2012; SPURLOCK et al. 2012).
2.2 Niacin
Niacin ist ein Vitamin aus dem B - Komplex, dem in der Literatur als Futterzusatz eine antilipolytische Wirkung zugesprochen wird. Es kommt in zwei chemisch ähnlichen Formen vor, der Nicotinsäure (NA) sowie dem Nicotinamid (NAM). NAM ist als reaktive Komponente im Coenzym Nicotinamidadenindinuklotid (NAD) und Nicotinamidadenindinuklotidphosphat (NADP) vorhanden. NAD und NADP sind wichtige Coenzyme des zellulären Energiestoffwechsels, wie zum Beispiel in der anaeroben Glykolyse, im Citratzyklus und auch in der Fettsäuresynthese. Niacin wird über die Nahrung aufgenommen und beim Wiederkäuer auch durch die Mikroorganismen im Pansen synthetisiert. (VON ENGELHARDT u. BREVES 2005;
NIEHOFF et al. 2009).
KENEZ et al. (2014) konnten zeigen, dass NA in vitro ein höheres antilipolytisches Potential auf das bovine Fettgewebe als NAM besitzt. Durch Bindung an einen inhibitorischen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, antagonisiert es die β-adrenerge Aktivierung der Lipolyse und hemmt damit die Ausschüttung von NEFA aus Fettgewebe (KARPE u. FRAYN 2004) ähnlich wie auch BHB (TAGGART et al.
2005). Bei peripartalen Milchkühen ist die β-adrenerge Aktivierung ein wichtiger Weg die Lipolyse zu triggern (JASTER u. WEGNER 1981; ELKINS u. SPURLOCK 2009;
KOLTES u. SPURLOCK 2011; LOCHER et al. 2011).
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Bisherige Studien zeigten jedoch teils widersprüchliche Ergebnisse zur antilipolytischen Wirkung von Niacinsupplementen bei Milchkühen. So zeigte sich in den Studien von PIRES u. GRUMMER (2007) sowie PIRES et al. (2007a) eine Senkung der Blut-NEFA-Spiegel bei Kühen unter Niacinbehandlung, was von den Autoren als antilipolytischer Effekt des Niacins interpretiert wurde. Andere Autoren konnten diese Beobachtung jedoch in Versuchen mit Kühen nicht bestätigen (CHAMBERLAIN u. FRENCH 2006; NIEHOFF et al. 2009). Auch beim Menschen führt die orale Aufnahme von Niacin zur Senkung der Plasma – NEFA – Spiegel (CARLSON u. ORLO 1962; CARLSON 1965 2005). Als Ursache ausbleibender antilipolytischer Effekte bei Verfütterung von Niacin an Milchkühe wird eine Degradierung in den Vormägen im Zuge der mikrobiellen Fermentation bei unzureichendem Schutz vermutet (CAMPBELL et al. 1994; SANTSCHI et al. 2005;
NIEHOFF et al. 2009).
2.3. Bedeutung unterschiedlicher Fettdepots für die Lipomobilisation 2.3.1. Differenzierung und Erfassung von Fettdepots
Fettgewebe besteht zum Großteil aus Adipozyten, die mesenchymalen Ursprungs sind. Es lässt sich in zwei Arten unterteilen. Das braune Fettgewebe dient bei Neugeborenen, Vögeln und Nagern der Thermoregulation und Energiespeicherung.
Das weiße Fettgewebe des adulten Tieres lässt sich wiederum unterteilen in Speicher- oder auch Depotfett und Baufett. Das Speicherfett ist für den Fettstoffwechsel verantwortlich, während das Baufett eher mechanische Aufgaben oder auch Wärmeisolierung übernimmt (LIEBICH 2004). Die Kapazität der Einlagerung im Fettgewebe wird durch die Anzahl und Größe der Adipozyten bestimmt. Bei einer Abnahme des Fettgewebes verringert sich nur die Größe nicht aber die Anzahl der Adipozyten. Umgekehrtes gilt auch für die Zunahme.
Unterscheidet man die unterschiedlichen Fettgewebe nach ihrer Lokalisation, so wird beim Menschen das Fettgewebe in subkutanes und abdominales Fett differenziert.
Das abdominale Fett lässt sich weiter unterteilen in abdominal subkutanes und intraabdominales Fett. Im intraabdominalen Fett sind das intraperitoneale Fett, auch viszerales Fett genannt, und das retroperitoneale Fett enthalten. Das viszerale Fett schließt das omentale und das mesenteriale Fett ein (WAJCHENBERG 2000).
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Beim Rind teilt ROBELIN (1985) ähnlich wie beim Menschen Fettgewebe anatomisch nach Lage in subkutanes, intermuskuläres, internes (Becken - und Thoraxfett), perirenales, omentales und mesenteriales Fett ein.
Es gibt verschiedene Ansätze, die versuchen, die Körperkondition bei Rindern zu ermitteln. Weite Verbreitung hat die subjektive Erfassung der Körperkondition mittels Scores (BCS) nach definierten Schemata gefunden (EDMONSON et al. 1989). Etwas aufwändiger ist die sonographische Bestimmung der Rückenfettdicke (BFT;
STAUFENBIEL 1992; STAUFENBIEL 1997; SCHRÖDER u. STAUFENBIEL 2006).
Zwischen den Untersuchungstechniken besteht ein linearer Zusammenhang (eine BCS Einheit mehr bedeutet einen Anstieg der BFT um 10 mm), und sie sind gut geeignet, subkutane Fettgewebsdepots bei Milchkühen zu beurteilen (HUSSEIN et al. 2013).
Während in der Humanmedizin die Menge und Ausdehnung abdominaler Fettgewebe leicht mit bildgebenden Verfahren wie Magnetresonanztomographie und Sonographie dargestellt werden können (SHEN et al. 2003), sind diese Möglichkeiten bei Milchkühen auf Grund ihrer Körpergröße begrenzt. Zuverlässig ist die Quantifizierung von Fettdepots nach der Schlachtung (VON SOOSTEN et al 2011), welches jedoch wiederholte Messungen naturgemäß nicht erlaubt. KABARA et al. (2014) bestimmten die Dicke des retroperitonealen Fettdepots (RPAT) ultrasonographisch, um diese mit metabolischen Parametern im peripartalen Zeitraum in Verbindung zu setzen. Diese Technik ließ jedoch andere abdominale Fettdepots unberücksichtigt und quantifizierte die Menge eingelagerten Fettes nicht.
Eine Arbeit von RIBEIRO et al. (2008) dagegen zeigte, dass sich die Menge von abdominalen Fettdepots (total internal fat: IFAT) von Fleischrindern, das bei der Schlachtung gemessen wurde, über die Messung der Dicke des perirenalen Fetts im ultrasonographischen Bild schätzen ließ. Mit dieser Methode ließen sich Veränderungen des IFAT wiederholt mit hinreichender Genauigkeit messen, allerdings wurde nicht zwischen den unterschiedlichen Depots in der Bauchhöhle differenziert. In einer Studie von HÄRTER et al. (2014), die sich mit der Körperkondition von Ziegen im Verlauf der Trächtigkeit beschäftigte, wurde ebenfalls die Dicke des Nierenfettdepots erfasst sowie die Ausdehnung des Longissimusmuskels ultrasonographisch bestimmt. Hier wurde neben dem Gesamtgehalt an Körperfett auch die Menge des Nierenfettdepots und des
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Omentalfettdepots berechnet. Damit konnten nicht nur die Menge des Gesamtfettgehalts, sondern auch die einzelner Depots im Verlauf der Trächtigkeit erfasst werden (HÄRTER et al. 2014).
2.3.2. Funktionelle Unterschiede zwischen Fettdepots
Das humane viszerale und subkutane Fettgewebe unterscheiden sich in ihrer Insulinsensitivitat (ZIERATH et al. 1998) und ihrer Sensitivität gegenüber lipolytischen Stimuli voneinander (HELLMÉR et al. 1992). Im viszeralen Fettgewebe des Menschen ist die katecholamin-induzierte Lipolyse im Vergleich zum subkutanen Fettgewebe gesteigert. Die Anzahl der adrenergen Rezeptoren ist im viszeralen Fettgewebe höher als die der antilipolytischenadrenergen Rezeptoren (YANG u.
SMITH 2007). Beim Menschen und auch bei Nagern wurde gezeigt, dass verschiedene Fettgewebsdepots unterschiedlich auf metabolische Stimuli reagieren (SMITH u. ZACHWIEJA 1999; YANG u. SMITH 2007). Zum Beispiel wird die Stammfettsucht des Menschen enger mit Stoffwechselstörungen in Verbindung gebracht als subkutane Verfettung (LEE et al. 2013). Eine viszerale Verfettung führt beim Menschen häufiger zu Diabetes und dem sogenannten metabolischen Syndrom (WAJCHENBERG 2000). Das metabolische Syndrom des Menschen resultiert in einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen. Ferner sind, wie beim Lipomobilisationssyndrom des Rindes, Insulinresistenz, Adipositas und Dyslipidämie von großer Bedeutung (MONTAGUE u. O’RAHILLY 2000; DESPRÉS u. LEMIEUX 2006; DESPRÉS et al. 2008; KAESS et al. 2012; PATEL u. ABATE 2013a, b; BAYS 2014).
Obwohl überkonditionierte Tiere mit einem BCS von über 4,0 (auf eine Skala von 1 (mager) bis 5 (verfettet)) während der Frühlaktation höhere Konzentrationen von NEFA und BHB im Plasma aufweisen, haben sie den gleichen Verlust an BCS Punkten wie schlanke Tiere. Dies könnte auf eine vermehrte Mobilisation von inneren Fettdepots zusätzlich zur Mobilisation des subkutanen Depots hinweisen (RASTANI et al. 2001; PIRES et al. 2013).
Es gibt auch bei Milchkühen einige Studien, die verschiedene metabolische Funktionen von subkutanen und inneren Fettdepots aufzeigen (LOCHER et al. 2011;
HOSTENS et al. 2012; LOCHER et al. 2012; HÄUSSLER et al. 2013; JI et al. 2014;
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SAREMI et al. 2014). VON SOOSTEN et al. (2011) konnten zeigen, dass das retroperitoneale Fettdepot (RPAT), als eines der inneren Fettdepots, während des peripartalen Zeitraums die größten katabolen und anabolen Veränderungen durchläuft, wenn man die absolute Größe des Depots und damit die metabolische Aktivität betrachtet. Auch andere Arbeiten konnten Unterschiede in der Mobilisation und Akkumulation einzelner Fettdepots demonstrieren (DRACKLEY et al. 2014;
KABARA et al. 2014). HOSTENS et al. (2012) zeigten, dass das Fettsäureprofil des abdominalen Fettdepots bei Tieren mit einer Labmagenverlagerung nach links dem der Plasma-NEFA ähnlicher war als das des subkutanen Fettdepots. Daraus folgerten sie, dass eine Mobilisierung von Fettgewebe bei Rindern bevorzugt aus dem abdominalen Fettdepot erfolgt (HOSTENS et al. 2012). Ähnlich wie zuvor ARNER et al. (1990) am Menschen zeigten KABARA et al. (2014) eine erhöhte lipolytische Aktivität des retroperitonealen Fettgewebes im Vergleich zum subkutanen bei Rindern.
WRIGHT u. RUSSEL et al. (1984) stellten fest, dass Milchkühe im Vergleich zu Fleischrindern mehr Fett intraabdominal einlagern als subkutan. GIBB et al. (1992) zeigten, dass Kühe kurz nach der Kalbung 20 % des Gesamtfettgehalts omental und mesenterial aufweisen und auch mehr aus diesen Depots in den ersten acht Wochen nach der Kalbung mobilisiert wird als aus anderen Fettdepots. Auch DRACKLEY et al. (2014) fanden, dass Milchkühe bei Überfütterung überproportional Fett in die mesenterialen Fettdepots im Vergleich zu subkutanen einlagern.
2.4. Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit
Es ist anzunehmen ist, dass abdominale Fettdepots im Vergleich zu subkutanen Fettdepots auch bei Milchkühen ähnlich wie beim Menschen und Versuchsnagern lipolytisch aktiver sind. Da dies möglicherweise in der Pathogenese des Lipomobilisationssyndroms bedeutsam ist, waren Hauptziele der Arbeit:
(1) Die Entwicklung einer Methode zur Schätzung der Masse des subkutanen, gesamtabdominalen, retroperitonealen, omentalen und mesenterialen Fettdepots mit Hilfe von ultrasonographischen Fettdickenmessungen.
9 (2) Die Anwendung dieser Methode,
um die antilipolytische Wirkung von Niacin anhand der Entwicklung der genannten Fettdepots aufzudecken,
die dynamischen Unterschiede während der Transitphase von Milchkühen im subkutanen und gesamtabdominalen Fettdepot zu erfassen und
mögliche Zusammenhänge zwischen den verschiedenen Fettdepots und den Werten von NEFA und BHB im Blut zu erkennen.
Dazu wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Studien durchgeführt.
In der ersten Studie wurde die Methode zur Quantifizierung der Masse unterschiedlicher Fettdepots mittels Schätzgleichungen, deren Ursprung in der Bestimmung verschiedener Körpermaße und ultrasonographischer Dickenmessungen von subkutanem, retriperitonealem, perirenalem Fett sowie der Bauchwanddicke lag, entwickelt. Die Tiere wurden dazu nach der ultrasonographischen Untersuchung und Bestimmung der Körpermaße geschlachtet und die entsprechenden Fettdepots einzeln gewogen. Aus den Daten wurden Schätzgleichungen entwickelt, um das jeweilige Gewicht des Fettdepots berechnen zu können.
In der zweiten Studie erfolgte die Anwendung dieser Methode in einem Fütterungsversuch mit Milchkühen mit insgesamt vier Fütterungsgruppen. Hierbei wurde die Wirkungen verschiedener Konzentratanteile in der Trockensteherfütterung sowie der Supplementierung von Niacin auf Ansatz und Mobilisierung der einzelnen Fettdepots untersucht.
10 3. Material und Methoden
Im Folgenden werden Material und Methoden oberflächlich zusammengefasst. Eine detailliertere Darstellung erfolgt in den Kapiteln zu den beiden Studien (4. Study 1 und 5. Study 2).
3.1. Studientiere
Die Versuchstiere für beide Studien wurden im Institut für Tierernährung des Friedrich – Loeffler - Instituts (FLI) in Braunschweig gehalten. Es handelte sich um HF/SB Kühe in der ersten bis vierten Laktation. In der ersten Studie waren insgesamt 29 Tiere von denen 7 trocken standen, 7 in der Frühlaktation waren und 15 in der Mitte bzw. am Ende der Laktation waren.
In der zweiten Studie waren 47 Tiere, 18 Färsen und 29 Kühe, die vom Tag 42 vor der Kalbung bis Tag 100 nach der Kalbung untersucht wurden. Die Tiere befanden sich in der ersten bis vierten Laktation.
3.2. Methodik der ersten Studie 3.2.1. Vorbereitung der Tiere
Die Tiere wurden in einem Texas head gate squeeze chute (PRIEFERT Fang- und Behandlungsstand) fixiert. Für eine bessere Ankopplung, wurden die Tiere an den entsprechenden Stellen geschoren und Ultraschallgel verwendet. Die transkutane ultrasonographische Untersuchung wurde mit einem SSA 370 A Toshiba Version K Power Vision 6000 durchgeführt, mit einer 6 bis 12 Megahertz (MHz) (PLN-805AT) Linearsonde und einer Konvexsonde mit 2 bis 7 MHz (PVM–375AT). Die Messung der Fettdicke erfolgte in Millimeter (mm).
3.2.2. Ultrasonographische Messpunkte
Alle Messpunkte sind auf der rechten Seite des Tieres lokalisiert. Die Messpunkte für das subkutane Fettgewebe wurden an gut erkennbaren Knochenpunkten oder Faszien orientiert, um eine klare Trennung vom darunterliegenden Gewebe zu erhalten. Zur Vermeidung von Messfehlern, wurde das subkutane Fettgewebe (SCAT) mit möglichst wenig Druck auf das Gewebe gemessen. RPAT wurde an drei unterschiedlichen Punkten an der lateralen Bauchwand gemessen, aber auch am
11
perirenalen Fettgewebe und über der Leber. Alle ultrasonographischen Messpunkte wurden im bewegten Bild untersucht, um zum Beispiel den sich bewegenden Darm als Orientierungshilfe nutzen zu können. Die Dicke der Fettschicht wurde anschließend in Millimeter im Standbild gemessen. Für SCAT und RPAT an der Bauchwand wurde die Linearsonde mit 6 MHz und 5 Zentimeter (cm) Eindringtiefe genutzt, für RPAT an der Nierenfettkapsel und über der Leber die Konvexsonde mit 3 MHz und 23,2 cm Eindringtiefe.
Eine genauere Beschreibung der Lokalisation der einzelnen Messpunkte und eine schematische Darstellung liefern die Tabellen und Abbildungen in 4. Study 1 (table 1, figure 1 – 8). Die Dicke der Nierenfettkapsel wurde ähnlich RIBEIRO et al (2008) gemessen und durch eine weitere Messung in dorsoventraler Richtung erweitert.
3.2.3. Messungen der Körpermaße
Zusätzlich zu den Messungen der Fettdicke mittels Ultrasonographie wurden verschiedene Körpermaße nach WILDMAN et al. (1982) und HEINRICHS et al.
(1992) gemessen. Sternumhöhe (SH), Hüfthöhe (HH) und Widerristhöhe (WH) wurden zur Bestimmung der Rahmengröße gemessen. Außerdem wurden die Hüftbreite (HW), Brustumfang (HG) auf Höhe des Herzens und Körperlänge (BL) bestimmt. Alle diese Größen wurden in Zentimeter gemessen. Letztlich wurde das Lebendgewicht in Kilogramm (kg) bestimmt.
3.2.4. Schlachtung
Nach Durchführung der ultrasonographischen Untersuchung und Bestimmung der Körpermaße wurden die Tiere geschlachtet. Die einzelnen Fettdepots wurden mit einem Schlachtermesser vom Schlachtkörper entfernt und einzeln in kg gewogen.
Bei den Fettdepots handelte es sich um das omentale Fett (OMAT), das retroperitoneale Fett inklusive Nierenfett (RPAT), Darmfett, das im Mesenterium zu finden ist (IAT), Fett in der Beckenhöhle (PCAT) und subkutanes Fett (SCAT) auf der Außenseite des Schlachtkörpers. Weil IAT und PCAT aufgrund technischer Parameter des Schlachtprotokolls nicht klar zu unterscheiden waren, wurden sie als mesenteriales Fett (MAT) zusammengefasst. Alle Fettdepots um und in der Bauchhöhle wurden als Gesamtabdominales Fett (OMAT + MAT + RPAT = AAT) zusammengefasst.
12 3.2.5. Statistische Auswertung
Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der ultrasonographischen Messpunkte wurde durch wiederholte Messungen evaluiert. Hierzu wurden die ultrasosographischen Messungen an 2 Tieren an 2 Tagen jeweils 5 Mal gemessen.
Daraus wurden die Variationskoeffizienten für den jeweiligen Messpunkt errechnet.
Alle ultrasonographischen Messungen erfolgten als Doppelmessungen, woraus der Mittelwert gebildet wurde. Anschließend wurde zur weiteren statistischen Auswertung mit dem Mittelwert gerechnet. Mit SAS 9.3 wurde eine schrittweise, multivariate lineare Regressionsanalyse mit den Ultraschallmesspunkten und den Körpermaßen durchgeführt, um die Menge der einzelnen Fettdepots (in kg), die während der Schlachtung gewogen wurden, bestimmen zu können. Das Entry (SLE) und Stay level (SLS) wurden bei p = 0,05 gesetzt und die Anzahl der Variablen in der Gleichung auf fünf begrenzt. Berechnet wurden SCAT, AAT, OMAT, MAT und RPAT.
Für die Berechnung der Depots wurden alle Ultraschallparameter und Körpermaße verwendet. Um die Genauigkeit der Gleichungen darstellen zu können wurde außerdem der root mean square error (RMSE) berechnet und die errechneten Werte mit den tatsächlichen Werten korreliert.
3.3. Methodik der zweiten Studie 3.3.1. Studiendesign
Die ultrasonographische Messung zur Bestimmung der Fettdepotmassen erfolgte wie in der ersten Studie beschrieben. Bestimmt wurden das subkutane, das gesamtabdominale, das retroperitoneale, das omentale und das mesenteriale Fett an Tag 42 vor der Kalbung, Tag 3, 21 und 100 nach der Kalbung.
3.3.2. Fütterung
Die Tiere wurden in zwei grundlegende Fütterungsgruppen eingeteilt. Die Niedrigkonzentrat Gruppe (low concentrate group, LC, n = 22) wurde praxisnah gefüttert und fing an Tag 42 ap mit 30 % Konzentrat und 70 % Raufutter an und wurde von Tag 1 bis 16 nach der Kalbung auf 50 % Konzentrat und 50 % Raufutter in der Trockenmasse gesteigert. Die Hochkonzentratgruppe (high concentrate group,
13
HC, n = 25) fing mit 60 % Konzentrat und 40 % Raufutter an, wurde nach der Kalbung auf 30 % Konzentrat und 70 % Raufutter gesenkt und dann langsam bis Tag 24 post partum (pp) auf 50 % Konzentrat und 50 % Raufutter im Trockenmasseanteil gesteigert. Dieser Konzentratanteil wurde bis zum Ende des Versuchs an Tag 100 pp beibehalten. Das Raufutter bestand aus 50 % Maissilage und 50 % Grassilage und wurde über Wiegetröge (Typ RIC, Insentec B.V., Merknese, The Netherlands) gefüttert. Diese beiden Basisfütterungsgruppen wurden wiederum jeweils in zwei Gruppen aufgeteilt, von denen jeweils eine als Kotrollgruppe diente (LCC, n = 12, HCC, n = 13) und die andere mit 24 g nicht pansengeschützter Nicotinsäure (NA, Mianyang Vanetta Pharmaceutical Technology Co., Ltd, Sichuan, 119 China) pro Tag supplementiert wurde (LCN, n = 10, HCN, n = 12). Diese 24 g NA wurden in 1 kg pelletiertes Kraftfutter eingearbeitet und täglich von Tag 42 ap bis 24 pp gefüttert. In jeder dieser insgesamt 4 Fütterungsgruppen waren sowohl Färsen als auch mehrkalbige Kühe (LCC: n = 5 Färsen, 7 Kühe; LCN: n = 4 Färsen, 6 Kühe; HCC: n = 4 Färsen, 9 Kühe; HCN: n = 5 Färsen, 7 Kühe) (TIENKEN mündliche Aussage).
3.3.3. Blutproben
Zusätzlich zu den Messungen der Mengen der Fettdepots wurden durch Mitarbeiter des FLI Braunschweig Blutproben der Tiere genommen. Die Entnahme der Blutproben erfolgte an den Tagen 2, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 63, 84 und 98 nach der Kalbung. Im FLI Braunschweig wurden die BHB und NEFA Gehalte in den Blutproben bestimmt.
3.3.4. Statistische Auswertung
Die Masse der subkutanen und abdominalen Fettdepots wurde sonographisch an Tag 42 ap, Tag 3, 21 und 100 pp ermittelt. Die Berechnung der Depots erfolgte wie in der ersten Studie beschrieben für SCAT, AAT, RPAT, OMAT und MAT als absolute Gewichte (absW). Außerdem wurden zur genaueren Erfassung der Mobilisation der Fettdepots in den einzelnen Laktationsstadien Differenzen berechnet, als Mobilisation der Frischmelker (FC) zwischen Tag 3 und 21 und in der frühen Laktation (EL) zwischen Tag 21 und 100 und außerdem die Zunahme vor der Kalbung in der Trockenstehperiode (DP) zwischen Tag 42 ap und 3 pp. Diese Differenzen wurden sowohl als Gesamtmenge über den ganzen Zeitraum berechnet (abs) als auch als Zu- bzw. Abnahme pro Tag (abspD), wobei dabei davon
14
ausgegangen wird, dass es sich um lineare Zusammenhänge in den Zeiträumen handelt. Die Zu- und Abnahmen wurden zusätzlich in Prozent mit dem jeweiligen Vorgängerwert als 100 % berechnet (rel, relpD).
Die statistische Auswertung erfolgte als mehrfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) im linearen Modell mit den Faktoren Fütterung, Laktationsnummer und Zeit. Auch hier wurde mit den Fettmassen am jeweiligen Messtag und den verschiedenen Differenzen gerechnet. Dabei wurde die Prozedur PROC GLM von SAS 9.3 verwendet. Anschließend wurde eine ANOVA mit den Faktoren Zeit, Fettdepot und deren Interaktion gerechnet, um die Dynamik der Fettdepots im Vergleich miteinander zu bestimmen. Hier wurde zunächst AAT mit SCAT verglichen und anschließend SCAT mit den einzelnen Unterabteilungen von AAT. Zusätzlich wurde die Dynamik des einzelnen Fettdepots mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Faktor Zeit betrachtet.
Abschließend erfolgte die Untersuchung eines möglichen Zusammenhangs zwischen den BHB und NEFA Werten im Blut mit den täglichen Zu – und Abnahmen in den Fettdepots ap und pp (abspD) und den absW der Fettdepots. Dazu wurde mit PROC CORR von SAS 9.3 eine mögliche Korrelation der NEFA und BHB Werte an Tag 2, 7, 14, 21, 28 und 35 pp mit den absW und den abspD der Fettdepots in der DP und bei den FC überprüft.
15
4. Study 1: An in vivo method for quantitative determination of the amount of subcutaneous and abdominal adipose tissue depots in German Holstein dairy cattle
An in vivo method for quantitative determination of the amount of subcutaneous and abdominal adipose tissue depots in German
Holstein dairy cattle
ClaudiaRaschka1, Lena Locher1, Caren-Imme von Stemm3, Peter Wenning 1, Ulrich Meyer2, Sven Dänicke², Korinna Huber4, Jürgen Rehage1
1Clinic for Cattle, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, 30171 Hannover, Germany
2Institute of Animal Nutrition, Friedrich-Loeffler-Institute (FLI) Federal Research Institute for Animal Health, 38116 Braunschweig, Germany
3Institute for Anatomy, University of Veterinary Medicine Hannover Foundation, 30171 Hannover, Germany
4Department of Physiology, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, 30171 Hannover, Germany
Corresponding author: Lena Locher, present adress l.locher@lmu.de, Klinik für Wiederkäuer, LMU München, Sonnenstraße 16, 85764 Oberschleißheim
16 4.1. Abstract
Background: A non-invasive method for the quantitative estimation of subcutaneous and abdominal adipose tissue depots in dairy cattle by imaging ultrasonography was established. Altogether 16 different points for the transcutaneous assessment of the thickness of subcutaneous and retroperitoneal adipose tissue fat layer were selected.
Ultrasonography of fat depots was carried out with 29 individual German Holsteins (heifers n= 5; cows n= 24). Seven of them were non-lactating, 15 in late lactation and seven in early to mid-lactation. After ultrasonography animals were slaughtered and adipose depots were weighed separately. A stepwise multivariate regression analysis of ultrasonographic parameters was performed determining the mass of the different fat depots weighed at slaughter.
Results: Actual weight of adipose depots ranged from 5.0 to 43.0 kg in subcutaneous adipose tissue (SCAT) from 13.7 to 98.8 kg for abdominal adipose tissue (AAT), from 3.4 to 30.3 kg in retroperitoneal adipose tissue (RPAT), from 5.2 to 39.6 kg in omental adipose tissue (OMAT) and from 4.0 to 35.8 kg for mesenterial adipose tissue (MAT). Multiple regression analysis in turn provided equations with a root mean square error (RMSE) of 3.67 kg for SCAT, 5.48 kg for AAT, 1.73 kg for RPAT, 3.00 kg for OMAT and 2.48 for MAT.
Conclusions: The results of the present study show that the calculation of the different fat tissue depots by measuring fat layer thickness ultrasonographically is possible. This method provides a possibility to detect the changes of the different fat depots over a certain period of time.
Keywords: ultrasonography, quantitative estimation, internal adipose tissue depots, dairy cows, not invasive
4.2. Background
Mobilization of endogenous lipid stores naturally occurs in early lactation when energy requirements exceed energy supply provided by voluntary feed intake.
Several factors influence the intensity of lipolysis, that if turning to pathology, might culminate into lipid mobilization syndrome (LMS), still a major concern in modern milk production [1]. One risk factor for LMS clearly identified is a very good or over- condition at calving [2]. However, overconditioned cows with a body condition score
17
(BCS) over 4.0 [3] show higher non esterified fatty acids (NEFA) and β- hydroxybutyrate (BHBA) concentrations in plasma in early lactation but display the same loss in BCS points in comparison to lean cows. This might indicate mobilization of internal adipose depots in addition to mobilization of subcutaneous depots [4, 5]. It is proven for humans and rodents that different adipose tissue depots react differently on metabolic stimuli [6]. Thus the involvement of a certain adipose depot in pathogenesis of LMS might differ, due to absolute amount, anatomical localization, variation in cellularity, expression of functional proteins and secretion of adipokines and metabolites. For example central obesity as measured by waist to hip ratio (WHR) and especially visceral fat mass assessed by magnet resonance imaging (MRI) scans of the abdominal cavity in humans were more closely related to metabolic disorders than subcutaneous obesity [7]. Also in dairy cows, there are some studies indicating different metabolic properties of subcutaneous and internal adipose tissue depots [8-11]. Furthermore, von Soosten et al. 2011 could show that retroperitoneal adipose tissue, an internal fat depot, underwent the biggest increase and decrease in the periparturient period thereby possibly indicating a high metabolic activity of this depot [12]. Whereas in human medicine adipose tissue quantity and distribution can be easily measured by several imaging methods like MRI or computerized axial tomography (CT) [13], these options are naturally limited in the bovine due to body size and weight of adult dairy cattle and the comparatively too small size of the applicable technical devices. Beneath quantification of adipose depots after slaughter, several methods assessing body condition and estimating total body fat of cattle have been established in the last decades. Body condition scoring according to Edmonson et al. [3] or, more objective and precise, ultrasonographic determination of back fat thickness (BFT) can be used [14-16].
Kabara et al., (2014) also used ultrasonography to measure thickness of the retroperitoneal adipose tissue layer and linked the results to metabolic variables at different stages of the periparturient period [17]. Several studies on beef cattle could show, that the amount of internal adipose depots, as weighed at slaughter, could be estimated by ultrasonographic measurement of the thickness of the perirenal adipose tissue depot and rib fat thickness [18, 19].
Therefore a non-invasive method allowing repeated quantitative estimation of subcutaneous and overall abdominal adipose tissue depot including its subdivisions
18
like retroperitoneal, mesenterial or omental fat in vivo might provide a valuable tool to study adipose tissue size and dynamics of changes in size in dairy cattle.
4.3. Material and methods 4.3.1. Animals
The study comprised 29 non-pregnant German Holstein between first and fourth lactation (n = 5 heifers, n = 24 cows). The body weight of the animals was 547 – 903 kg at slaughter. Seven of them were non-lactating, 15 in late lactation and seven in early to mid-lactation. The study was conducted at the experimental station of the Institute of Animal Nutrition, Friedrich–Loeffler–Institute (FLI), Brunswick, Germany.
4.3.2. Ultrasonography
Animals were fixed in a Texas head gate squeeze chute (PRIEFERT Fang- und Behandlungsstand). To ameliorate coupling hair was locally clipped and skin covered with ultrasound gel. Transcutaneous ultrasonography was performed using SSA 370 A Toshiba Version K Power Vision 6000 equipped with a 6 to 12 MHz (PLN-805AT) linear probe and a convex array transducer of 2 to 7 MHz (PVM–375AT). Thickness of respective tissue layers was measured in millimeters. All measuring points were located on the right side of the animal. Measuring points for subcutaneous fat layer were associated with prominent structures of the skeleton or fascia, providing a clearly distinguishable demarcation of underlying tissue. To avoid bias subcutaneous adipose tissue (SCAT) had to be measured without putting any pressure onto tissue.
The dimensions of retroperitoneal adipose tissue (RPAT) were assessed at three different points located at the lateral abdominal wall, around the right kidney and at the liver. Fat layer thickness was determined in freezed images using integrated measuring software of the ultrasound unit. At the abdominal wall SCAT and RPAT were measured using a linear probe with 6 MHz and 5 cm of penetration depth whereas for RPAT surrounding the kidney a convex probe with 3 MHz and 23.2 cm of penetration depth was used, respectively. For concrete description and schematic illustration of each measuring point see tables and figures below (Tables 1 and 2, Figure 1 – 8). The adipose capsule surrounding the kidney was determined as described by Ribeiro et al. 2008 [19] modified by an additional measurement in dorsoventral direction. To determine accuracy and reproducibility of the ultrasonographic measuring points coefficient of variation (CV, %) ± standard
19
deviation (SD) were calculated as follows. A five times repetition of measurement at each ultrasonographic measuring point was performed in two cows, not being part of the study group. This was repeated the consecutive day thus resulting in four CVs per measuring point. Out of these four CVs again mean ± SD were calculated (table 2).
4.3.3. Body size measurement
Body sizes were determined as described by Wildman et al. (1982) and Heinrichs et al. (1992) [20, 21] . Sternum height (SH), hook height (HH) and wither height (WH) as frame sizes and additionally hip width (HW), heart girth (HG) and body length (BL) were measured in cm. Finally the body weight in kg (BW) was taken. [22, 23]
4.3.4. Slaughter
Animals were slaughtered directly after ultrasonographic examination. Omental adipose tissue (OMAT), retroperitoneal adipose tissue, including kidney adipose tissue (RPAT), intestinal adipose tissue (IAT), stored in the mesentery, adipose tissue in the pelvic cavity (PCAT) and subcutaneous adipose tissue (SCAT) on the outside of the carcass were removed from the carcass and weighed separately in kg.
For IAT and PCAT were not clearly distinguishable due to the technical procedure of the slaughter protocol, they were summed up as mesenteric fat (IAT + PCAT = MAT). Fat depots around and in the abdominal cavity were added up as total abdominal fat depot (OMAT + MAT + RPAT= AAT).
4.3.5. Statistical analysis
All ultrasonographic measurements were done in duplicate and again mean was calculated for further analysis. With SAS 9.3 a stepwise, multivariate linear regression analysis of the ultrasonographic and body size parameters was accomplished in order to determine the mass in kg of the different fat depots weighed at slaughter.
Entry level (SLE) and stay level (SLS) were set to P = 0.05 and number of variables used limited to no more than five. SCAT, AAT, OMAT, MAT and RPAT were calculated. To verify the accuracy of the equations R2 and root mean square error (RMSE) was determined and a linear regression of predicted values correlation with actual values was calculated.
20 4.4. Results
4.4.1. Preliminary validation of measuring points:
Figure 1 and table 1 illustrate the finally used measuring points in their distribution over the animal’s body. Calculated CV ± SD of each measuring point is given in table 2. Representative freeze images with exemplary distance lines and explanatory schemes are shown in figures 2 to 8.
4.4.2. Results from the study group:
4.4.2.1. Ultrasonography
Mean and range of ultrasonographic tissue layer measurement in the study group are given in table 3. Further parameters of body size are given in table 4.
4.4.2.2. Slaughter
Body weight and actual slaughter weight of different fat depots and BW as well as the individual share of one depot of BW and AAT respectively are shown in table 5. Table 6 additionally gives interrelationships expressed as linear correlation between adipose tissue depots. It becomes obvious that the depot of AAT is approximately twice as big as the SCAT depot and that OMAT, RPAT and MAT account for about one third each of AAT. However OMAT seems to be the biggest with almost 40% of AAT (table 5). There is a high correlation between entire AAT and its three subdivisions as well as between SCAT and AAT (table 6).
4.4.2.3. Estimation of adipose depot amounts and relationship with actual slaughter weight:
Equations for the quantitative estimation of adipose tissue depots in dairy cows as resulting from stepwise multivariate regression are given in tables 7 (SCAT) and 8 (abdominal depots). Linear regressions of the actual values with the predicted values and the degree of over- or underestimation in % are shown in figures 9 and 10. The lowest R2 was obtained for SCAT with 0.89, whereas AAT could be determined with the highest R2 of 0.96.
21 4.5. Discussion
Data depicted here present a non invasive method that allows the estimation of actual mass of subcutaneous and abdominal adipose depots. Several factors influencing accuracy and applicability of this approach however require a critical discussion.
4.5.1. Accuracy of ultrasonography
Except the AW1-3d, KD2d and KD3d repeated measures at all measuring points had a mean CV of less than 5 %. None of these highly varying points were selected during the stepwise regression analysis into equations predicting fat depot sizes, probably for this very reason (tables 7 and 8). However, to minimize methodological bias from ultrasonography again all measurements were done in duplicate at one measuring point and means were used for assessments of fat depot masses.
Therefore it can be assumed, that inaccuracy of ultrasonography is a less important factor influencing RMSE.
4.5.2. Bias originating from the slaughter protocol
Yet a major factor in this respect was the slaughter protocol itself. For skin was dissected manually from the carcass with a butcher`s knife, especially in thin individuals a significant share of SCAT might have been removed with the hide. For RPAT in several parts has a broad contact face with musculature and ribs also for this depot a certain bias by carcass residuals cannot be excluded. In contrast as an empirical knowledge all components of AAT can be more easily dissected from the gastrointestinal tract and the carcass with less residuals remaining at the gut. This probably provides an explanation for the lower coefficients of determination for the estimation of SCAT in comparison to AAT and its subdivision (Figures 9 and 10).
4.5.3. Associations between measuring points and amounts of individual fat depots
Except for OMAT, all equations include R12, a point where subcutaneous fat layer was measured (position 3, figure 1; R 12, table 1). Measurement of BFT in the region around the 12th rib is also used and validated for the assessment of body composition and expectable carcass quality in beef cattle [24, 25]. However in dairy cows, BFT is measured in the sacrotuberal region [15]. Besides high correlation with total body fat (r = 0.9) the sacral examination site for BFT in dairy cows was also
22
chosen to ensure comparability with BCS, that does not include the region around the 12th rib [14]. In the present study, BFT as measured in the sacrotuberal region was not as strong associated with SCAT as was R12. This implicates, that subcutaneous fat layer at R12 might even be more precisely reflecting SCAT and further provides additional information about dimensions of abdominal adipose tissue depots. For a most accurate estimation of MAT and OMAT, it was attempted to identify points for a direct ultrasonographic assessment of adipose depots in the abdominal cavity. Even though promising points like the insertion of the omentum maius in the longitudinal groove of the rumen were tested, organ movement induced by breathing and gastrointestinal motility rendered the measurements not repeatable and inaccurate. Therefore direct measurement of abdominal adipose depots was only possible for RPAT, whereas OMAT and MAT could not be measured in that way.
Nevertheless, multiple regression analysis led to equations that determine MAT and OMAT indirectly, using measurements of tissue layer thickness at the abdominal wall and RPAT. At first glance this seems feasible and reasonable due to the high correlation between RPAT and the other abdominal depots (table 6). But on second sight it becomes obvious, that parameters used to determine MAT and OMAT differ from those for RPAT and also for AAT. Apart from subcutaneous fat layer at the 12th rib (R12) the total amount of RPAT seems to be represented by the fat layer closely adjacent to the peritoneum at AW1 and the fat pad between the kidney and the long back muscles (AW1c and d, KD2b, table 4). On the contrary OMAT was largely associated with the thickness of the abdominal wall from skin to the end of the musculature at the middle of the right flank (AW1b, table4) and between the posterior ribs above the liver (ICLa, table 4 and figure 8). These distances also include skin, subcutaneous fat and the layer of back muscles respectively thoracic muscles at these points. For thickness of subcutaneous adipose layer at R12 and IC12 was not chosen by multiple regression analysis for accurate description of OMAT depot one might conclude, that the thickness of back and thoracic muscles is positively associated with the amount of this depot. The thickness of a muscle layer depends amongst others on the activity of the respective muscle group present at the chosen measuring point. For animals were housed in a free stall before slaughter, physical activity was supposed to be mainly determined by individual behavior. This might lead to the conclusion, that the amount of OMAT in an individual animal is also positively related to its individual activity. Likewise for MAT, distances including
23
musculature, AW3b and KD2b where included into the equations, possibly leading to similar conclusions. However the length of the used distances is influenced by the inter- and intramuscular fat depots. Due to technical reasons the assessment of intramuscular fat layer during the slaughter process unfortunately was not possible in the present study. Carcasses entered the food chain after measurements were finished and therefore could not be completely dissected to quantify also intermuscular fat. Thus intermuscular fat as a decisive factor influencing distances included into the equations cannot be ruled out here. In fattening steers of beef and dairy breed a high energy diet led to a remarkable increase in intramuscular fat deposition [26, 27]. Ectopic fat deposition especially in muscles is extensively discussed in human medicine as a symptom occurring with reduced insulin effects in diabetic individuals [28]. In this context an ultrasound based texture analysis to measure intramuscular fat as described by Kim et al. (1998) [29] would have provided more detailed information. If linked to metabolic data, such an analysis might even be helpful in the risk assessment for the individual cow with regard to reduced insulin effects and the development of lipid mobilization syndrome. No parameter of body size was included into equations for the quantitative estimation of different adipose tissue depots. As displayed in table 4 parameters of body size, except HG and BW, are rather similar. This means that body measures like HH and BL, that in contrast to HG and BW, per se are less influenced by the extent of body mass accumulation, have rather a marginal impact on absolute fat mass of adult dairy cows older than two years at least in HF/SB-breed. It is self-evident, that this cannot be assumed, when a suckler calf is compared to a mature cow.
4.5.4. Applicability
The method presented in this study was developed in only 29 individuals. At present equations resulting from multiple regression analysis are self-evaluating by P-value <
0.001 and a coefficient of determination R2 > 0.88. For further confirmation of their accuracy they need to be verified in an independent study cohort. Thus this study provides a proof of principle rather than an evaluated tool for science or dairy cow risk assessment. Moreover the study was performed with female, adult German Holsteins older than two years and therefore should be only applied to this breed and age, especially because fat distribution seems to vary with age and to differ between different breeds and production types [30, 31]. Nevertheless, Ribeiro et al. [18, 19]
24
presented equations for the estimation of abdominal fat depot applicable also to different breeds of beef cattle. Thus the differences between production types might be of higher importance than the individual breed.
As shown in figures 9 and 10 estimation of adipose tissue amount becomes the more precise the bigger the depots are. Therefore, if applied to lean cows with small amounts of body fat results might become relatively more inaccurate which needs to be considered when the technique is used for further studies.
The method introduced in the present study allows a differentiation between subcutaneous and abdominal adipose tissue and further a differentiation between abdominal subdivisions. Its repeatability further enables the examiner to detect changes of a specific depot over time. After further evaluation it possibly might be applied to cows in the transition period to provide information on the quantity and chronology of gain and mobilization of the different adipose depots in dairy cattle. In addition to BFT as described by Schröder and Staufenbiel (2006) and the method of Karbara et al. (2014) the whole dimension of a respective adipose depot can be recorded by using several different measuring points [14-17].
4.6. Conclusion
The quantitative estimation of SCAT, AAT, RPAT, OMAT and MAT by means of ultrasonographic measurement of subcutaneous and retroperitoneal fat layers is feasible with sufficient accuracy. For it allows repeated measurements, it might provide a tool not only to estimate the actual amount of a certain depot but also to get more detailed information about adipose tissue distribution and dynamics over a certain period of time. This might be of particular importance to gain more insight into the pathogenetic role of visceral adipose tissue depots in development of LMS in dairy cows.
4.7. List of abbreviations
SCAT: subcutaneous adipose tissue, AAT: total abdominal adipose tissue, RPAT:
retroperitoneal adipose tissue, OMAT: omental adipose tissue, MAT: mesenteric adipose tissue, RMSE: root mean square error, LMS: lipid mobilization syndrome,
25
BCS: Body Condition Score, NEFA: non esterified fatty acids, BHBA: β- hydroxybutyrate, WHR: waist to hip ratio, MRI: magnet resonance imaging, CT:
computerized axial tomography, BFT: back fat thickness, CV: coefficient of variation, SD: standard deviation, SH: sternum height, HH: hook height, WH: wither height, HW: hip width, HG: heart girth, BL: body length, BW: body weight, IAT: intestinal adipose tissue, PCAT: adipose tissue in the pelvic cavity, SLE: entry level, SLS: stay level.
4.8. References
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