TARTU ÜLIKOOL
ÖKOLOOGIA JA MAATEADUSTE INSTITUUT ZOOLOOGIA OSAKOND
LOOMAÖKOLOOGIA ÕPPETOOL
Janek Urvik
Oksüdatiivse seisundi markerite varieeruvus kalakajakal (Larus canus): seosed vanuse ja suremusega
Magistritöö
Juhendaja: PhD Tuul Sepp
TARTU 2014
Sisukord
1. Sissejuhatus ... 3
1.1 Oksüdatiivne stress ... 3
1.2 Oksüdatiivne stress ökoloogias ... 3
1.3 Oksüdatiivse stressi roll vananemises ... 4
1.4 Oksüdatiivse stressi seosed kohasusega: ülevaade uuringutest ... 5
1.5 Oksüdatiivse stressi mõõtmine ja sellega seotud probleemid ... 8
1.6 Töö eesmärgid ... 9
2. Materjal ja meetodid ... 10
2.1 Uuritav populatsioon ... 10
2.2 Mõõdetud parameetrid ... 10
2.2.1 Kohasuse parameetrid... 10
2.2.2 Biokeemilised analüüsid ... 11
2.3 Statistilised meetodid ... 13
3. Tulemused ... 15
4. Arutelu ... 23
5. Kokkuvõte ... 28
6. Summary ... 29
7. Tänuavaldused ... 30
8. Kirjandus ... 31
1. Sissejuhatus
1.1 Oksüdatiivne stress
Evolutsiooniline ökoloogia on viimastel aastakümnetel üha enam muutunud
mehhanismipõhiseks – püütakse leida füsioloogilisi mehhanisme, mis vahendavad elukäigu lõivsuhteid. Sellest lähtuvalt on ökoloogide huviorbiiti tõusnud reaktiivsete osakestega seotud protsessid organismis (McGraw et al. 2010). Reaktiivsed osakesed on kas vabad radikaalid (paardumata elektronidega molekulid) või molekulid, mis teiste ainetega reageerides toodavad vabu radikaale. Aeroobse ainevahetuse käigus tekib reaktiivseid osakesi pidevalt. Peamiseks reaktiivsete osakeste tekkekohaks on mitokondrid, kus radikaalid võivad lekkida elektronide transportahelast oksüdatiivsel fosforüleerimisel (Garratt ja Brooks 2012).
Reaktiivsed osakesed on väikeses koguses vajalikud, vahendamaks paljusid bioloogilisi protsesse, nagu immuunkaitse, kasv ja areng, ning apoptoos(Dowling ja Simmons 2009).
Seetõttu toodetakse neid väikeses koguses ka kontrollitult, enamasti spetsiaalsete ensüümide poolt, nagu NADPH oksüdaas (Monaghan et al. 2009). Kui reaktiivsete osakeste tootmist ja neutraliseerimist kontrollivad süsteemid aga oma tööga toime ei tule, viib reaktiivsete osakeste kontrollimatu tootmine biomolekulide kahjustumiseni, mis võib häirida
rakufunktsioone ja põhjustada isegi surma (Halliwell ja Gutteridge 2007). Sellist seisundit nimetatakse oksüdatiivseks stressiks (OS) (Halliwell ja Gutteridge 2007). Seepärast on loomadel mitmeid füsioloogilisi mehhanisme, mis neid reaktiivsete osakeste vastu kaitsevad.
Nende seas on ensüümid nagu superoksiidi dismutaas ja glutatiooni peroksüdaas, aga ka mitte-ensümaatilised antioksüdandid nagu glutatioon ja vitamiin E (Garratt ja Brooks 2012).
1.2 Oksüdatiivne stress ökoloogias
Kuna oksüdatiivse stressi kontrollimine on organismi tervise seisukohalt hädavajalik, võib optimaalne elukäik sõltuda ressursside paigutamisest oksüdatiivse stressi vastu võitlemise ja teiste elukäigutunnuste vahel (Monaghan, et al 2009). Seetõttu peetakse oksüdatiivset stressi üheks peamiseks elukäigu lõivsuhteid tekitavaks füsioloogiliseks mehhanismiks, mis mõjutab paljusid tunnuseid, sealhulgas kasvukiirust, sigimist ja eluiga (von Schantz et al. 1999,
Dowling ja Simmons 2009, Metcalfe ja Alonso-Alvarez 2010, Garratt ja Brooks 2012).
Oksüdatiivne stress võib olla ka vahend sugulise valiku teel välja kujunenud signaalide aususe tagamiseks, ühendades seega sekundaarsed sugutunnused geneetilise varieeruvusega isendite kohasuses (Von Schantz et al 1999). Signaali ausust on võimalik säilitada juhul, kui
kõrge ja madala kohasusega isendid erinevad üksteisest füsioloogilise seisundi poolest.
Madalama kvaliteediga signaliseerija kas ei suuda signaaltunnust tekitada ja säilitada või on signaliseerimisel tema jaoks kõrgem hind (Garratt ja Brooks 2012). Von Schantzi teooria põhineb mitmel eeldusel. Emased isendid võivad parandada järglaste ellujäämust, valides oma partnereid sekundaarsete sugutunnuste alusel, mis signaliseerivad usaldusväärselt nende tervislikku seisundit. Selliste sugutunnuste avaldumine on tundlik oksüdatiivse stressi suhtes.
Organismi vastupanuvõime oksüdatiivsele stressile on aga päritav (Dowling ja Simmons 2009).
Reaktiivsete osakeste tekkes on oluline roll ka immuunsüsteemil. Kaasasündinud immuunsuse tagavad rakud, mis kaitsevad organismi reaktiivsete osakeste abil. Need rakud toodavad reaktiivseid osakesi oksüdatiivse purskena, mis hävitab patogeeni, kahjustades selle
biomolekule (Freitas et al. 2009). Reaktiivsed osakesed pole aga patogeeni-spetsiifilised ning võivad kahjustada ka organismi ennast (Halliwell ja Gutteridge, 2007). Immuunsüsteemi aktiveerimisega kaasneb seega kõrgendatud reaktiivsete osakeste tase, mis mõjub negatiivselt sekundaarsetele sugutunnustele. Sellised tunnused peaksid seega signaliseerima isase head tervist ja võimet kahjutustada reaktiivseid osakesi ning vältida oksüdatiivset stressi
(Monaghan et al 2009).
1.3 Oksüdatiivse stressi roll vananemises
Vananemine on organismi füsioloogilise seisundi järkjärguline halvenemine, mis algab pärast suguküpsuse saavutamist (Nussey et al. 2013). On levinud arvamus, et looduslikes asurkondades sellise definitsiooni kohast vananemist ei toimu, kuna looduslik elukeskkond põhjustab loomade surma enne, kui vananemist põhjustavad geenid jõuavad nende elukäiku mõjutama hakata. Hiljutised uuringud on aga näidanud, et kui vananemist on pikaajaliste longitudinaalsete uuringutega looduslikest linnu- ja imetajapopulatsioonidest otsitud, on seda ka tavaliselt leitud (Nussey et al. 2013).
Vananemise seletamiseks on välja pakutud mitmeid teooriaid (ülevaade Selman et al.
2012, Nussey et al. 2013). Üks nendest, vabade radikaalide vananemisteooria, väidab, et vananemine toimub reaktiivsete osakeste paratamatu tootmise ja nende kahjuliku mõju kuhjumise tõttu (Harman 1956). Sellel teoorial on märkimisväärne toetus. Samas on paljud teooriat testivad uuringud oma olemuselt korrelatiivsed ja hõlmavad vaid piiratud hulka mudelorganisme, seega ei tõesta need selgelt OS rolli vananemises (Costantini et al. 2010).
Vabade radikaalide vananemisteooria on arenenud edasi mitokondriaalseks
vananemisteooriaks ja elukiiruse (rate of living) teooriaks, millest viimast käsitletakse tihti
sünonüümsena vabade radikaalide teooriaga (Costantini et al. 2010). Mitokondriaalne vananemisteooria väidab, et radikaalide poolt on eriti haavatav mitokondriaalne DNA, kuna vabad radikaalid tekivad organismis peamiselt mitokondriaalse energiatootmise
kõrvalproduktina. Mitokondriaalse DNA lagunemise tõttu muutub oksüdatiivse
fosforüleerimise protsess vähem efektiivseks, millest omakorda on tingitud veelgi suurem vabade radikaalide tootmine (Dowling ja Simmons 2009). Ka kromosoomi otstes paiknevad telomeerid on reaktiivsete osakeste poolt kergesti kahjustatavad. Oksüdatiivse stressi poolt põhjustatud telomeeride lühenemine kiirendab omakorda rakkude vananemist (Monaghan et al. 2009). Seega võib telomeeride kiirem lühenemine näidata, et organism koges kõrget oksüdatiivse stressi taset (Salomons et al. 2009).
Elukiiruse teooria (rate of livig theory) kohaselt on kõrgema ainevahetuse baastasemega liikidel lühem eluiga. Selle põhjuseks on suurema energiatarbimisega kaasnev kõrgem
mitokondriaalne aktiivsus, mille tulemusena toodetakse rohkem reaktiivseid osakesi (Dowling ja Simmons 2009). Reaktiivsete osakeste tootmine pole aga alati proportsionaalne
mitokondriaalse aktiivsusega, kuna mitokondrid muutuvad suuremal tootlikkusel efektiivsemaks (Costantini et al. 2010). Siiski on mõistlik oletada, et väiksema hapnikutarbimisega loomaliigid toodavad vähem reaktiivseid osakesi kui suurema hapnikutarbimisega liigid. Pikaealistel liikidel võib olla ka vähem kumulatiivseid OS kahjustusi ning neil võib olla ka teisi omadusi, mis neid oksüdatiivsetele kahjustustele vastupidavamaks teevad (Buttemer et al. 2010). Vastupidavust oksüdatiivsele stressile võib näiteks mõjutada rakumembraani fosfolipiidne koostis: mida rohkem on membraanis polüküllastumata rasvhappeid, seda vastuvõtlikum on see oksüdatiivsetele kahjustustele (Costantini et al. 2010).
Oksüdatiivse stressi mõju vananemisele on taksonite lõikes erinev ning seni ei ole seda paljude loomarühmade puhul uuritud. Keskendutud on peamiselt laboriloomadele,
klassikalistele mudelorganismidele ning eelkõige lühiealistele liikidele. OS-i ja vananemise seoste mõistmiseks on aga vaja uurida erineva eluea, elukäigu ja taksonoomilise kuuluvusega liike.
1.4 Oksüdatiivse stressi seosed kohasusega: ülevaade uuringutest
Oksüdatiivse stressi mõju sigimisedukusele ja ellujäämusele looduses pole kuigi palju uuritud, samas näitavad laboratoorsed uuringud klassikaliste mudelliikide peal selgeid seoseid reaktiivsete osakeste, viljakuse ja suremuse vahel (ülevaade nt (Finkel ja Holbrook 2000).
Oksüdatiivne stress võib sigimisedukust mõjutada kahel viisil: mõjutades otseselt
reproduktiivsüsteemi (nt sugurakkude kvaliteeti või keskkonda, kus embrüo areneb) või halvendades vanemate seisundit ja selle kaudu nende võimet poegade eest hoolitseda (Bize et al. 2008). Oksüdatiivsete kahjustuste kuhjumine võib mõjutada aga eluiga (Beckman ja Ames 1998, Finkel ja Holbrook 2000).
Oksüdatiivse stressi uurimine looduslikes asurkondades annab kindlasti selgema pildi selle seostest kohasusega, kuna viimast saab adekvaatselt hinnata vaid tingimustes, milles asurkond on evolutsioneerunud (Salomons et al. 2009). Tabelis on toodud ülevaade vabalt elavatel lindudel tehtud uuringutest, milles individuaalsed erinevused OS-i parameetrites ennustavad erinevusi kohasuses. Selliseid uuringuid leiab suhteliselt vähe ja reeglina on mõõdetud vaid ühte OS-i parameetrit. Tabelisse ei ole kaasatud uuringuid, milles on näidatud, et suurem investeering mõnda kohasuse komponenti indutseerib oksüdatiivset stressi (vt nt Alonso- Alvarez et al. 2010, Beaulieu et al. 2011), kuna eesmärgiks ei ole uurida oksüdatiivse stressi tekkemehhanisme, vaid selle mõju linnu edaspidisele kohasusele. Oleks ehk liiga
spekulatiivne oletada, et konkreetsete parameetrite väärtused määravad linnu kohasuse. Pigem võib eeldada, et leitud seosed näitavad, kui hästi peegeldab mõõdetud OS-i parameeter linnu üleüldist konditsiooni.
Tabel 1. Oksüdatiivse stressi parameetrite ja kohasuse komponentide vahelised seosed vabalt elavatel lindudel
Liik OS parameeter Kohasuse parameeter
Seos Viide
Suitsupääsuke (Hirundo rustica)
Plasma
antioksüdantiivne mahtuvus (AOC)
Ellujäämus Kõrge AOC tase
ennustas ellujäämust Saino et al 2011 Rasvatihane
(Parus major) Erütrotsüütide vastupanu vabade radikaalide rünnakule linnupoegadel
Lennuvõimestu- mine, ellujäämine järgmise
sigimishooajani
Positiivne seos
lennuvõimestumisega, seos ellujäämisega järgmise
sigimishooajani puudus
Losdat et al 2013
Suitsupääsuke (Hirundo rustica)
Plasma karotenoidide kontsentratsioon
Lennuvõimestunud poegade arv
Suurem karotenoidide taseme langus
sigimishooaja jooksul ennustas
lennuvõimestunud poegade arvu
Safran et al 2010
Karikormoran (Phalacro- corax aristotelis)
Lipiidide
peroksüdatsioon linnupoegadel
Suguküpsuse
saavutamine Suguküpsuseni jõudnud lindudel oli pojana madalam lipiidide peroksüdatsiooni tase
Noguer a et al 2011
Suurpiiritaja (Apus melba)
Erütrotsüütide vastupanu vabade radikaalide rünnakule
Kurna suurus, koorumisedukus, ellujäämus
järgmise hooajani
Emastel positiivne seos kurna suuruse ja
poegade
koorumisedukusega, isastel ellujäämusega
Bize et al 2008
Kaelus- kärbsenäpp (Ficedula albicollis)
Plasma reaktiivsed hapniku
metaboliidid (ROMs test) ja antioksüdatiivne mahtuvus (OXY- test)
Kurna suurus, muna mass
Kurna suurusega seosed puudusid, muna massil positiivne seos
antioksüdatiivse mahtuvusega
Marko et al 2011
1.5 Oksüdatiivse stressi mõõtmine ja sellega seotud probleemid
Ökoloogidel on kalduvus kohelda organismi füsioloogiat kui "musta kasti" ning liigselt lihtsustada seda reguleeritud ja integreeritud süsteemi (Schmid-Hempel 2005). Seepärast on paljud ökoloogilised uurimused mõõtnud vaid ühte oksüdatiivse stressi komponenti (tavaliselt antioksüdantide taset) eeldades, et see annab informatsiooni oksüdatiivse stressi kohta
(Monaghan et al. 2009). Selline lähenemine on vale juba seetõttu, et antioksüdantidel on lisaks oksüdatiivse tasakaalu säilitamisele organismis ka teisi funktsioone. Samuti on antioksüdantide tase reguleeritav vastavalt vajadusele, seega ei pruugi antioksüdantide hulk näidata otseselt oksüdantide taset organismis (Costantini et al. 2010). Kuna ükski kasutuses olev biomarker ei ole OS mõõtmiseks ideaalne, tuleks eelistatult kasutada nende
kombinatsiooni (Hõrak ja Cohen 2010). Isegi entusiastide seas puudub aga praegu üksmeel, millist biomarkerite kombinatsiooni kasutada (McGraw et al. 2010). Seepärast kannatavad paljud siiani avaldatud uurimused metodoloogiliste probleemide käes. Ei nõustuta isegi põhimõttelistes küsimustes, nagu kuidas defineerida oksüdatiivset stressi, oksüdatiivseid kahjustusi ja redokstasakaalu (Meitern et al. 2013).
Oksüdatiivse stressi mõõtmisel on vaja arvestada nelja komponendiga: vabade radikaalide tootmine, antioksüdatiivne kaitse, oksüdatiivsed kahjustused ja raku parandusmehhanismid.
Kahjustatud DNA, lipiidide ja valkude parandamine on vajalik raku funktsioonide ning nendest tulenevalt organismi kohasuse säilitamiseks. Siiski pole ökoloogid oma töödesse selliste mehhanismide mõõtmist alati kaasanud (Monaghan et al. 2009). Mitme OS komponendi mõõtmine on vajalik ka selleks, et kindlaks teha, kas vaadeldavad muutused nendes parameetrites on kontrollitud või kontrollimata. Kontrollitud muutused on organismi poolt füsioloogiliselt reguleeritud ja on tavaliselt organismile kasulikud. Kontrollimata protsessid toimuvad siis, kui regulatoorne süsteem ei funktsioneeri piisava tõhususega.
Sellised muutused on organismile tavaliselt kahjulikud (Hõrak ja Cohen 2010).
Biokeemilised protsessid on osa süsteemist: iga parameetri tõlgendus sõltub sellest, mis toimub ülejäänud süsteemis (Hõrak ja Cohen 2010). Selliste markerite tõlgendamine võib sõltuda samaaegselt teiste sarnaste markerite tasemest, isendi konditsioonist, isendi eelnevast elukäigust, keskkonnafaktoritest ja liigi füsioloogilistest ja biokeemilistest omapäradest (Hõrak ja Cohen 2010). Seepärast tuleb lõpetada liiga lihtsate mudelite kasutamine OS-i kirjeldamisel. OS-i ja kohasuse vaheliste seoste uurimisel oleks ideaalne jälgida isendeid kogu nende eluea jooksul. Selliseid pikaajalisi uuringuid on lühiealiste loomaliikidega lihtne läbi viia. Pikaealiste liikide puhul annavad OS-i ja kohasuse vahelistest seostest andmeid
läbilõikelised uuringud, millel on oma puudused (Hõrak ja Cohen 2010). Selliste uuringutega ei saa eristada isendisiseseid lõivsuhteid isenditevahelisest heterogeensusest. Näiteks pole võimalik eristada kõrgema kvaliteediga isendite vanusega kasvavaid oksüdatiivseid kahjustusi, kuna nende kahjustuste hulk pole märkimisväärselt suurem kui noorematel madalama kvaliteediga isenditel. OS-i ja kohasuse vahelisi lõivsuhteid võib mõjutada ka keskkond, milles isend oma eelneva elu on veetnud (Nussey et al. 2009). Kuna OS-i roll ja reguleerimine võib pika- ja lühiealistel liikidel erineda (Buttemer et al. 2010, Hõrak ja Cohen 2010), on ka pikaealiste liikide puhul vajalik läbi viia longitudinaalseid uuringuid.
1.6 Töö eesmärgid
Käesoleva magistritöö peamiseks eesmärgiks oli erinevate füsioloogilise seisundi (sh redokstasakaalu) ja kohasuse parameetrite mõõtmine pikaealisel linnuliigil, et tuvastada uuritud parameetrite seoseid vanuse ja suremusega. Kitsamateks eesmärkideks oli selgitada kas mõõdetud tunnuste hulgas on (1) vananemise ja (2) surmaeelse pesitsuskorraga seonduva tervise halvenemise kirjeldamiseks sobivaid markereid. Vananemine tähendab organismi funktsioonide järk-järgulist, progressiivset pöördumatut halvenemist vanuse kasvades. Kuna uuritavas kalakajakapopulatsioonis on registreeritud kõrge vanusega kaasnev kohasuse vähenemine (Rattiste 2004, Brommer et al. 2009), siis seati eesmärgiks kontrollida, kas samasugust kõrge vanusega kaasnevat muutust esineb ka erinevate biokeemiliste
konditsiooniindeksite osas. Püstitatud hüpoteesi kohaselt seostuvad uuritud tunnused lindude vanusega kas lineaarselt või paraboolselt (eeldusel, et keskealised, ca 10. korda pesitsevad linnud on parimas füsioloogilises seisundis Rattiste 2004). Kuna uuritava populatsiooni kalakajakate sigimisedukus langeb hüppeliselt surmaeelsel pesitsusaastal (Rattiste 2004), siis püstitati täiendav hüpotees, mille kohaselt on surmaeelsel aastal pesitsejate füsioloogiline konditsioon teistsugune kui lindudel, keda mõõdeti pesitsusperioodil, mis ei jäänud nende jaoks viimaseks.
Lisaks huvitas mind uuritud parameetrite aastatevaheline individuaalne korduvus. Kuna erinevad kohasuse parameetid peegeldavad organismi füsioloogia erinevaid aspekte, võivad mõned neist muutuda kiiresti, samal ajal kui teised peegeldavad indiviidi fenotüübi
pikaajalisemat kohasust (Hõrak et al. 2002). Lühiajaliste ja pikaajaliste konditsiooninäitajate eristamine on seega olulise tähtsusega uurimaks isendite vahelist varieeruvust
elukäigutunnustes ning nende seoseid fenotüübilise kohasusega (Hõrak et al. 2002).
2. Materjal ja meetodid
2.1 Uuritav populatsioonKäesolevas magistritöös on kasutatud Matsalu Rahvuspargis asuval Kakrarahu laiul (58°46' N, 23°26' E) pesitsevast kajakakolooniast kogutud andmeid. Kalakajakad (Larus canus) on monogaamsed kolooniates pesitsevad pikaealised merelinnud. Antud kolooniat on uuritud juba aastast 1962 (Brommer et al. 2009), seega on asurkonna demograafiline struktuur hästi teada. Magistritöös kasutatud andmed koguti kolmel järjestikusel aastal (2008, 2009, 2010).
Selle koloonia ja kahe naaberlaiu (Paljarahu ja Hoorahu) kolooniate uurimisel on leitud, et tavaliselt naaseb 50% isaslindudest ja 10% emaslindudest suguküpsuse saavutamisel
sünnikolooniasse sigima (Rattiste 2004). Hõbekajaka (Larus argentatus) poolt põhjustatud konkurentsi tõttu, Matsalu rahvuspargis on noorlindude sünnikolooniasse naasmise protsent kasvavas trendis (Rattiste ja Tartes 2005). Sigivad linnud on väga paigatruud, vähem kui 3%
lindudest vahetab kahe pesitsuse vahel kolooniat. Sellisel juhul liigutakse peamiselt
naaberkolooniasse (Rattiste 2004). Seega on longitudinaalseteks uuringuteks lihtne koguda täpset indiviidipõhist andmestikku. Kalakajaka kurna suurus ei varieeru ja kurnas on kolm muna. Pesitsusedukus sõltub munemise algusajast: paremas konditsioonis isendid alustavad munemist varem. Umbes kümnest protsendist munadest koorunud pojad elavad
suguküpsuseni. Enamasti alustavad kalakajakad pesitsemist 3.-4. eluaastal ning pesitsevad keskmiselt 5-6 aastat. Pärast kümnendat pesitsusaastat hakkab nende sigimisedukus kahanema. Täiskasvanud lindude aastane ellujäämus on 86-93%, 20% lindudest jätkab pesitsemist ka pärast kümnendat eluaastat (Rattiste 2004). Vanim lind uuritavas koloonias on 33-aastane emaslind (sündinud 1981. aastal Kakrarahul), kes on teadaolevalt ka Eesti vanim kalakajakas (Kalev Rattiste suulised andmed).
2.2 Mõõdetud parameetrid
2.2.1 Kohasuse parameetrid
Sigivad linnud püüti pesalt esimesel pesitsusaastal, määrati nende sugu ning märgistati individuaalset äratundmist võimaldava plastikrõngaga.Kui lind ei olnud märgistatud juba pesapojana, lisati ka Estonia Matsalu signatuuriga metallrõngas. Soo määramiseks mõõdeti kajaka pea pikkus (isaslinnud on suuremad kui emaslinnud) ning vajadusel kontrolliti
määrangut lindude sigimiskäitumise järgi. Järgnevatel pesitsusaastatel identifitseeriti linde ilma neid kinni püüdmata, plastikrõnga järgi.
Kuna paljude uuringus kasutatud lindude (eelkõige emaslindude) sünniaasta ei olnud teada, kasutati analüüsil linnu vanuse iseloomustamiseks tunnust „sigimisaasta“, mis näitab, mitmendat aastat antud lind pesitseb. Tunnus „viimane sigimisaasta“ näitab, et pärast antud aastat pole lindu enam kohatud ning ta on tõenäoliselt surnud.
Munemisaja algus on igapäevastel ringkäikudel koloonias kindlaks tehtud esimese muna munemise aeg ning on väljendatud aprillikuu päevades (1. aprill = päev 1, 1. mai = päev 31) . Kõik munad kurnas märgistati vastavalt nende munemise järjekorrale ja kaaluti. Kurna hävimisel (uppumine, rüüstamine) märgiti uus kurn kas jätkukurnaks (emaslind jätkas munemist uude pessa) või järelkurnaks (hauduma asunud emaslinnul kulus munemistsükli taaskäivitamiseks 8-10 päeva).
2.2.2 Biokeemilised analüüsid
Vereproovid võeti 2008., 2009. ja 2010. aasta kevadel. Plasma ja vererakud eraldati proovi võtmise päeval tsentrifuugimise teel. Proovid säilitati kuni analüüsimiseni -80°C juures.
Vältimaks pesade hülgamist, ei alustatud vanalindude püüki pesadelt enne 10 päeva möödumist viimase muna munemisest (sel ajal püütud linnud ei jäta pesa maha).
Pesitsusstaadiumi iseloomustati esimese muna munemisest kulunud aja järgi (tunnus:
„pesitsusstaadium“). Arvestamaks biokeemiliste markerite ööpäevast varieeruvust, märgiti üles ka linnu püüdmise kellaaeg,. Enne vereproovi võtmist linnud kaaluti.
Antioksüdantidest määrati karotenoidide glutatiooni ja kusihappe tase. Karotenoidid on rasvlahustuvad süsivesinikud, mida loomad de novo sünteesida ei suuda, ning peavad seega toiduga omandama. Oma keemilise struktuuri tõttu neelavad karotenoidid sini-rohelist valgusspektrit (400-500 nm) ning näivad seega inimsilmale kollaste ja punastena. Samuti on neil in vitro antioksüdatiivsed omadused (Svensson ja Wong 2011). Karotenoidne
pigmentatsioon on seega seotud fundamentaalsete redoksradadega, kuid karotenoidsetel pigmentidel põhinevate suguliste signaalide ausust tagavate füsioloogiliste mehhanismide osas pole tänapäeval veel üksmeelele jõutud (Hill ja Johnson 2012). Karotenoidide kontsentratsioon määrati 2008., 2009. ja 2010. aasta proovidest. Kontsentratsioon määrati spektrofotomeetriliselt atsetoonis lahjendatud 15 μl plasmast (metoodika kirjeldus:
Tummeleht et al. 2006). Karotenoidide kontsentratsiooni väljendati μg/ml.
Glutatioon on tripeptiidne tiool, mida esineb peaaegu kõigis loomarakkudes. Glutatiooni funktsioonid rakus on valkude disulfiidsildade redutseerimine, DNA deoksüribonukleotiid
prekursorite sünteesimine ja raku kaitsmine vabade radikaalide eest. Glutatiooni loetakse seepärast tihti kõige tähtsamaks rakusiseseks antioksüdandiks (Galvan ja Alonso-Alvarez 2008). Erütrotsüütide glutatiooni (GSH) tase määrati 2009. ja 2010. aasta proovidest (metoodika kirjeldus: Rahman et al. 2006, Galvan ja Alonso-Alvarez 2008). Tulemused on antud μmol grammi veretombu kohta (veretomp on vere tsentrifuugimisel tekkiv tahke jääk, mis koosneb peamiselt erütrotsüütidest).
Kusihape on lindude peamine lämmastikumetabolismi saadus, mis tekib nii toiduga saadud- kui kehaomaste valkude lagundamisel (Wright 1995). Lindudel on võrreldes teiste selgroogsetega kusihappe ja selle soolade kontsentratsioon eriti kõrge (Tsahar et al. 2006).
Kuna lindudel puudub uraadi oksüdaas, mis kusihappe allantoiiniks oksüdeeriks, peab see protsess toimuma mitteensümaatiliselt teiste oksüdantide, nagu reaktiivsed osakesed, toimel (Tsahar et al. 2006). Kusihappe antioksüdatiivsete omaduste ja selle rohkuse tõttu arvatakse, et see on üks peamisi aineid, mis linde oksüdatiivse stressi eest kaitseb (Tsahar et al. 2006).
Kusihappe kontsentratsioon mõõdeti spektrofotomeetriliselt 5 μl plasmast, standardkomplekti abil (Human GmbH kit, Weisbaden, Germany). Kusihappe kontsentratsioon on arvutatud mg/dl.
Lisaks individuaalsetele antioksüdantidele määrati ka plasma antioksüdantne kogumahtuvus (total antioxidant capacity, TAC). TAC peegeldab koeproovis olevate erinevate veeslahustuvate antioksüdantide koguhulka. Peamised TAC-i komponendid on plasma kusihape ja valkude vabad sulfhüdrüülrühmad (Erel 2004, Sepp et al. 2010). TAC mõõdeti kõigil kolmel aastal 5 μl plasmast (metoodika kirjeldus: Erel 2004, Sepp et al. 2010).
See meetod põhineb plasma antioksüdantide võimel värvitustada 2,2-asinobis(3-
etüülbensotiasoliin-6-sulfonaati) (ABTS+). Tulemused on antud μmol/l troloksi (vesilahustuv vitamiin-E analoog) ekvivalendi järgi. Kuna suure osa TAC-i väärtusest annab kusihape, (Costantini 2011), arvutati ka TAC-i jäägid regressioonist kusihappega.
Lisaks kirjeldati lindude oksüdatiivset seisundit plasma oksüdatiivse staatuse (total oxidant status, TOS) abil. TOS näitab erinevate reaktiivsete osakeste koguhulka koeproovis (Erel 2005). TOS mõõdeti 2009. ja 2010. aastal, kuid kuna 2009 aasta andmed olid suures osas alla meetodi detekteerimispiiri, kasutati ainult 2010 aasta andmeid. Mõõtmisel kasutati meetodit, mida on kirjeldanud Erel (2005) ja mis põhineb Fe²+ oksüdeerimisel Fe³+ iooniks.
Tulemused on arvutatud μmol/l vesinikperoksiidi (H2O2) ekvivalendi järgi.
Oksüdatiivse stressi markerina mõõdeti homotsüsteiini taset. Homotsüsteiin (HCY) on tioolrühma sisaldav aminohape, mis tekkib metioniini rakusisesel demetüleerimisel.
Homotsüsteiini reaktiivne tioolrühm võib hapniku juuresolekul oksüdeeruda disulfiidsillaks.
Selle reaktsiooni kõrvalproduktina võib tekkida palju reaktiivseid hapnikuosakesi, nagu superoksiidi anioon ja vesinikperoksiid (Jacobsen 2000). Homotsüsteiini taset mõõdeti vaid 2009. aastal, kasutades selleks standardkomplekti (Axis Homocysteine EIA, Axis-Shield Diagnostics Ltd.). Tulemused on arvutatud μmol/l.
Oksüdatiivse stressi markeritest mõõdeti ka lipiidide peroksüdatsiooni (LPO), mis on hästituntud loomade rakuvigastuste mehhanism ning mida kasutatakse seepärast ka oksüdatiivse stressi indikaatorina (Niki 2009). Antud markerit mõõdeti vaid 2009. aastal.
Lipiidide peroksüdatsiooni mõõtmiseks kasutati standardkomplekti (Bioxytech LPO-586, Oxisresearch), mis põhineb maloondialdehüüdi (MDA) ja 4-hüdroksüalkenaalide (HAE) koguste spektrofotomeetrilisel määramisel. MDA ja HAE on küllastumata rasvhapete peroksüdatsiooni saadused ning neid on ennegi lipiidide peroksüdatsiooni mõõtmiseks kasutatud (Esterbauer et al. 1991). Tulemused on arvutatud μmol/l.
Lisaks oksüdatiivse staatuse parameetritele mõõdeti ka kaht biokeemilist
konditsiooninäitajat, plasma valkude üldkontsentratsiooni ja triglütseriide, mis peaksid eelkõige peegeldama lindude toitumust ja tervislikku seisundit. Neid näitajaid mõõdeti kõigil kolmel aastal. Seerumi koguvalk mõõdeti spektrofotomeetriliselt 5 μl plasmast,
standardkomplekti abil (Human GmbH kit, Weisbaden, Germany). Plasma koguvalk mõõdeti g/l. Triglütseriidide tase mõõdeti 2,5 μl plasmast standardkomplekti abil (Human GmbH kit, Weisbaden, Germany). Tulemused arvutati mmol/l.
2.3 Statistilised meetodid
Andmeanalüüsiks kasutati üldistatud segamudeleid, milles isendi identiteet määrati juhuslikuks faktoriks ning sõltuvaks tunnuseks uuritav füsioloogiline või sigimisparameeter.
Kirjeldamaks mõõdetud parameetrite seoseid lindude vanusega (mille lähendusena kasutati sigimisaastat) sisestati sigimisaasta mudelisse pideva tunnusena. Kõiki mudeleid testiti ka sigimisaasta ruutliikme olulisuse suhtes, tuvastamaks võimalike paraboolseid seoseid vanusega. Kõigi mudelites testiti potentsiaalsete mürafaktorite (uurimisaasta (faktor) ja pesitsusstaadium (pidev tunnus) ning nende interaktsioon) olulisust. Linnu massi uurivates mudelites võeti mürafaktorina arvesse ka pea pikkus (pea³). Mitteolulised mürafaktorid kõrvaldati lõppmudelist. Kui linnu sugu mõjutas uuritavat tunnust oluliselt, siis analüüsiti emaste ja isaste andmeid eraldi, et vältida keeruliste interaktsioonidega raskestitõlgendatavaid mudeleid. Kurna massi uurivatest mudelitest eemaldati jätku- ja järelkurnad, kuna oli põhjust arvata, et need on oluliselt kergemad. Et testida, kas lindude füsioloogilised või
sigimisparameetrid on viimasel pesitsuskorral teistsugused kui ülejäänud pesitsuskordadel,
kasutati sigimisaasta (ja selle ruutliikme) asemel mudelis tunnust „viimane
sigimisaasta“ (kahe tasemega faktor). Mõõtmaks uuritud parameetrite aastatevahelisi individuaalseid korduvusi kasutati mudeleid, kus sõltuvaks tunnuseks oli uuritav füsioloogiline või sigimisparameeter ning olulisuse korral kaasati mürafaktoritena uurimisaasta ja/või pesitsusstaadium. Tunnuse korduvus arvutati isendi identiteedi arvele langeva varieeruvuse suhtena üldvarieeruvusse (Nakagawa ja Schielzeth 2010). Analüüsiks kasutati programmi SAS versioon 9.2, Glimmix protseduuri. Kõigi mudelite jääkide vastavust normaaljaotusele kontrolliti visuaalselt; lahknevuse korral kümnendlogaritmiti tunnuste väärtused. Aktsepteeritavaks usaldusnivooks oli 0.05.
3. Tulemused
Peaaegu ükski mõõdetud oksüdatiivse seisundi parameetritest lindude vanusega ega vanuse ruutliikmega seotud ei olnud (tabel 2). Vaid emaste triglütseriidide tasemel oli
lineaarne seos vanusega (joonis 2). Vanuse mõju uurivates mudelites varieerusid aastate lõikes karotenoidide, kusihappe, glutatiooni, valkude ja triglütseriidide (ainult isastel)
kontsentratsioon, samuti TAC ja selle jäägid. Lisaks erinesid aastate lõikes lindude mass, kurna mass ning sigimisaja algus. Parameetrite väärtust mõjutas ka see, millises
pesitsustaadiumis linnult vereproov võeti. Pesitsusstaadium mõjutas karotenoidide ja
kusihappe taset, TAC-i, TAC-i jääke, homotsüsteiini kontsentratsiooni, valkude taset (emastel) ning triglütseriidide taset. Aasta ja pesitsusstaadiumi koosmõju avaldus karoetnoidide, TAC-i, TAC-i jääkide ning emastel lindudel ka valkude ja triglütseriidide kontsentratsiooni juures.
Emastel lindudel mõjutasid kurna massi ja sigimisaja algust vanus ning vanuse ruutliige.
Munemisaja algus oli samuti linnu vanusest ja selle ruutliikmest mõjutatud. Munemisaja alguse ja kurna massi sõltuvus vanusest on esitatud joonisel 1.
Seoseid suremusega uuriti lindudel, keda pärast nende viimast sigimisaastat enam koloonias kohatud polnud. Selliseid linde oli valimis 52. Peaaegu ükski mõõdetud oksüdatiivse staatuse parameetritest suremist ette ei ennustanud (tabel 3) . Ainult emaste lindude plasma oksüdatiivse staatuse (total oxidative status, TOS) ja suremust vahel esines statistiliselt oluline seos (joonis 3). Samuti ei ennustanud suremust linnu mass ning emaste sigimisaja algus ning kurna mass. Ka suremuse seoseid uurivates mudelites avaldusid erinevate aastate ning pesitsusstaadiumi mõju mõõdetud vereparameetritele.
Mõõdetud oksüdatiivse seisundi parameetritest esines aastatevaheline individuaalne korduvus karotenoidide ja kusihappe puhul. Biokeemilistest konditsiooninäitajatest kordus individuaalselt ajas plasma koguvalgu kontsentratsioon. Lisaks olid individuaalselt ajas püsivad mass, sigimisaja algus ning kurna mass (tabel 4).
Tabel 2 Sigimis- ja füsioloogiliste parameetrite sõltuvus vanusest (sigimisaasta) Isendite
arv
Vaatluste arv
Df Den. Df F p
Karot* μg/ml 90 214 Sugu:E
Aasta 2 177,2 3,72 0,026
Staadium 1 196,7 25,01 <0,0001
Aasta*Staadium 2 177,2 5,99 0,003
Sigimisaasta 1 114,3 2,07 0,153
Sigimisaasta² 1 115 1,91 0,170
Karot* μg/ml 98 232 Sugu:I
Aasta 2 183,6 3,80 0,024
Staadium 1 207,3 21,10 <0,0001
Aasta*Staadium 2 185,1 6,09 0,003
Sigimisaasta 1 130,1 0,43 0,514
Sigimisaasta² 1 129,9 0,48 0,488
TAC* μmol/l 185 444
Aasta 2 412,9 45,57 <0,0001
Stage 1 420,3 12,25 0,0005
Aasta*Stage 2 415,4 24,60 <0,0001
Sigimisaasta 1 218,1 0,01 0,939
Sigimisaasta² 1 219,1 0,10 0,7573
TAC(URIC)*μM 184 437
Aasta 2 428 61,40 <0,0001
Aasta*Staadium 2 428 31,82 <0,0001
Kusihape 1 428 177,89 <0,0001
Staadium 1 428 35,83 <0,0001
Sigimisaasta 1 428 0,00 0,977
Sigimisaasta² 1 428 0,11 0,745
TOS μmol/l 68 68 Sugu:E
Sigimisaasta 1 65 2,32 0,132
Sigimisaasta² 1 65 0,66 0,418
TOS μmol/l 78 78 Sugu:I
Sigimisaasta 1 75 1,01 0,319
Sigimisaasta² 1 75 0,96 0,329
GSH μmol/g 137 178
Aasta 1 70,38 60,41 <0,0001
Sigimisaasta 1 107,6 1,10 0,297
Sigimisaasta² 1 104,9 0,96 0,330
HCY μmol/l 45 45
Staadium 1 41 6,08 0,018
Sigimisaasta 1 41 0,01 0,918
Sigimisaasta² 1 41 0,03 0,865
Isendite arv
Vaatluste arv
Df Den. Df F p
LPO μmol/l 94 94
Sigimisaasta 1 91 3,21 0,077
Sigimisaasta² 1 91 1,62 0,206
VALK g/l 93 244 Sugu:E
Aasta 2 187,9 17,01 <0,0001
Staadium 1 222,2 11,94 0,001
Aasta*Staadium 2 189,3 16,09 <0,0001
Sigimisaasta 1 130 0,85 0,358
Sigimisaasta² 1 132,3 0,29 0,594
VALK g/l 98 267 Sugu:I
Aasta 2 181,1 10,31 <0,0001
Sigimisaasta 1 127,9 0,07 0,792
Sigimisaasta² 1 129,3 0,02 0,884
TRIGL* mmol/l 93 239 Sugu:E
Aasta 2 215,6 2,58 0,0778
Staadium 1 230,1 11,31 0,001
Aasta*Staadium 2 216,8 3,11 0,047
Sigimisaasta 1 114,5 5,51 0,021
Sigimisaasta² 1 114,7 2,88 0,092
TRIGL* mmol/l 98 258 Sugu:I
Aasta 2 178,9 7,82 0,0006
Staadium 1 237,1 17,37 <0,0001
Sigimisaasta 1 110 0,36 0,549
Sigimisaasta² 1 108,7 1,56 0,215
URIC mg/dl 191 509
Staadium 1 502,1 9,33 0,001
Sigimisaasta 1 244,8 0,06 0,814
Sigimisaasta² 1 240,5 0,08 0,781
Mass g 93 247 Sugu:E
Aasta 2 174,1 15,50 <0,0001
Pea³ 1 91,32 19,39 <0,0001
Sigimisaasta 1 167,8 0,02 0,877
Sigimisaasta² 1 177,2 0,16 0,691
Mass g 98 265 Sugu:I
Aasta 2 187,3 21,05 <0,0001
Pea³ 1 92,05 17,86 <0,0001
Sigimisaasta 1 203,1 1,05 0,361
Sigimisaasta² 1 214,3 0,23 0,634
Kurna mass g 91 194 Sugu:E
Aasta 2 122,7 13,08 <0,0001
Sigimisaasta 1 171,9 18,09 <0,0001
Sigimisaasta² 1 179 16,82 <0,0001
* antud tunnus on normaaljaotuse saavutamiseks kümnendlogaritmitud Karot – karotenoidid
TAC – plasma antioksüdantne kogumahtuvus TAC(URIC) – TAC jäägid kusihappest
TOS – plasma oksüdatiivne staatus GSH – glutatioon
HCY – homotsüsteiin
LPO – lipiidide peroksüdatsioon
VALK – plasma valkude üldkontsentratsioon TRIGL – triglütseriidid
URIC – kusihape
Start – munemisaja algus (A.p. – aprillikuu päevades)
Tabel 3 Sigimis- ja füsioloogiliste parameetrite sõltuvus viimasest sigimisaastast Isendite
arv Vaatluste
arv Df Den. Df F p
Start A.p. 93 221 Sugu:E
Aasta 2 145,5 97,65 <0,0001
Sigimisaasta 1 122,3 35,56 <0,0001
Sigimisaasta² 1 126,1 30,75 <0,0001
Isendite arv
Vaatluste arv
Num. D.f. Den. Df. F p
Karot* μg/ml 90 214 Sugu:E
Aasta 2 180,4 3,25 0,041
Staadium 1 204,5 22,12 <0,0001
Aasta*Staadium 2 179,6 5,29 0,006
Viimane aasta 1 206,9 0,34 0,560
Karot* μg/ml 98 232 Sugu:I
Aasta 2 184 3,69 0,027
Staadium 1 213,7 21,02 <0,0001
Aasta*Staadium 2 185 5,94 0,003
Viimane aasta 1 224,9 0,03 0,868
TAC* μmol/l 185 444
Aasta 2 412,7 45,37 <0,0001
Staadium 1 414,9 14,15 0,0002
Aasta*Staadium 2 415,1 24,59 <0,0001
Viimane aasta 1 437 0,46 0,497
TAC(URIC)*μM 184 437
Aasta 2 429 60,93 <0,0001
Kusihape 1 429 177,60 <0,0001
Staadium 1 429 41,62 <0,0001
Aasta*Staadium 2 429 31,77 <0,0001
Viimane aasta 1 429 0,84 0,359
Isendite arv
Vaatluste arv
Num. D.f. Den. Df. F p
TOS μmol/l 68 68 Sugu:E
Viimane aasta 1 66 4,28 0,042
TOS μmol/l 78 78 Sugu:I
Viimane aasta 1 76 0,08 0,777
GSH μmol/g 137 178
Aasta 1 126 10,03 0,002
Staadium 1 160,6 6,31 0,013
Aasta*Staadium 1 136,9 4,03 0,047
Viimane aasta 1 172,2 0,51 0,478
HCY μmol/l 45 45
Staadium 1 42 7,03 0,011
Viimane aasta 1 42 0,08 0,783
LPO μmol/l 94 94
Staadium 1 91 6,22 0,014
Viimane aasta 1 91 0,03 0,863
VALK g/l 93 244 Sugu:E
Aasta 2 188,1 16,97 <0,0001
Staadium 1 229,6 15,11 0,0001
Aasta*Staadium 2 188,8 15,94 <0,0001
Viimane aasta 1 236,9 0,39 0,532
VALK g/l 98 267 Sugu:I
Aasta 2 176 10,53 <0,0001
Viimane aasta 1 262,8 0,03 0,871
TRIGL* mmol/l 93 239 Sugu:E
Aasta 2 212,8 3,03 0,05
Staadium 1 230 18,66 <0,0001
Aasta*Staadium 2 213,8 3,84 0,023
Viimane aasta 1 232 1,64 0,202
TRIGL* mmol/l 98 258 Sugu:I
Aasta 2 173 8,51 0,0003
Staadium 1 238,4 19,77 <0,0001
Viimane aasta 1 252,9 0,04 0,840
URIC mg/dl 191 509
Staadium 1 493,2 11,12 0,001
Viimane aasta 1 505,9 0,73 0,395
Mass g 93 247 Sugu:E
Aasta 2 163,5 14,4 <0,0001
Pea³ 1 91,69 20,52 <0,0001
Viimane aasta 1 231,8 0,37 0,543
Mass g 98 265 Sugu:I
Aasta 2 171,1 20,91 <0,0001
Pea³ 1 93,48 19,79 <0,0001
Viimane aasta 1 241,1 0,79 0,374
* antud tunnus on normaaljaotuse saavutamiseks kümnendlogaritmitud Karot – karotenoidid
TAC – plasma antioksüdantne kogumahtuvus TAC(URIC) – TAC jäägid kusihappest
TOS – plasma oksüdatiivne staatus GSH – glutatioon
HCY – homotsüsteiin
LPO – lipiidide peroksüdatsioon
VALK – plasma valkude üldkontsentratsioon TRIGL – triglütseriidid
URIC – kusihape
Start – munemisaja algus (A.p. – aprillikuu päevades) Viimane aasta – viimane sigimisaasta
Isendite arv
Vaatluste arv
Num. D.f. Den. Df. F p
Start A.p. 93 221 Sugu:E
Aasta 2 132,5 77,84 <0,0001
Viimane aasta 1 216,8 0,92 0,339
Kurna mass g 91 194 Sugu:E
Aasta 2 106,5 3,07 0,0001
Viimane aasta 1 160,5 0,14 0,708
Tabel 4 Kohasuse parameetrite korduvused
* antud tunnus on normaaljaotuse saavutamiseks kümnendlogaritmitud
** nimetatud tunnust arvestati ainult emastel Karot – karotenoidid
TAC(URIC) – TAC jäägid kusihappest GSH – glutatioon
VALK – plasma valkude üldkontsentratsioon TRIGL – triglütseriidid
URIC – kusihape
Joonis 1. Sigimisaja alguse ja kurna massi sõltuvus linnu vanusest (sigimisaasta).
Kolmnurgad tähistavad kurna massi ja ringid tähistavad munemisaja algust Tunnus Isendite arv Vaatluste arv Korduvus p
karot emased* 90 214 0,3 <0,0001
karot isased* 98 232 0,32 <0,0001
TAC (URIC)* 184 437 0 1
TAC* 185 444 0,04 0,236
GSH 137 178 0,25 0,13
VALK emased 93 244 0,35 <0,0001
VALK isased 98 267 0,33 <0,0001
TRIGL emased* 93 237 0,09 0,138
TRIGL isased* 98 258 0,05 0,234
URIC 191 509 0,12 0,005
Mass emased 93 247 0,7 <0,0001
Mass isased 98 265 0,74 <0,0001
Munemise algus** 93 218 0,49 <0,0001
Kurna mass** 91 191 0,86 <0,0001
Joonis 2. Emaste lindude plasma triglütseriidide kontsentratsiooni sõltuvus vanusest (sigimisaasta)
Joonis 3. Emaste lindude plasma oksüdatiivse staatuse sõltuvus viimasest sigimisaastast (järgmisel aastal elus vs järgmisel aastal surnud). Näidatud on keskmine ja standardvead.
N=68
4. Arutelu
Seosed vanuse ja sigimisedukuse parameetrite vahel näitavad, et vananemine antud valimis esines. Sama asurkonna uurimisel on leitud, et sigimisedukus üldjuhul suureneb kogemuste kasvamise arvelt kuni 10. pesitsusaastani ning hakkab seejärel vähenema, tehes eriti järsu languse surmaeelsel pesitsusaastal (Rattiste 2004). Käesolevas uuringus aga seoseid surmaeelse pesitsusaasta ning sigimisedukuse parameetrite vahel ei leitud. Käesolev uurimus põhineb vaid kolme aasta andmetel, samas, kui Rattiste (2004) uurimuse andmestik oli
kogutud pikema aja vältel (1968-1983 ja 1986-2004), seega on võimalik, et sellised mustrid ei jõua kolme aasta jooksul avalduda. Kuna antud asurkonna isendite ellujäämus on peamiselt mõjutatud talve karmusest (Rattiste ja Lilleleht 1995), on võimalik, et nende aastate talved olid kas erakordselt pehmed, mille tõttu halvasti siginud isendid ei hukkunud, või erakordselt külmad, mille tõttu hukkusid ka paremas konditsioonis isendid. Samas, kuna lindude
surmapõhjused ei olnud üldjuhul teada, võib seose puudumine näidata ka seda, et paljude antud valimi lindude surma võisid põhjustada juhuslikud sündmused (nt. rookulli saagiks langemine, mis K.Rattiste suulistel andmetel sõltub rohkem pesa asupaigast kui linnu konditsioonist).
Kuna mitmeid oksüdatiivse seisundi parameetreid mõõdeti samadel lindudel mitmel aastal, oli võimalik hinnata parameetrite püsivust ajas. Läbi aastate olid individuaalselt korduvad kusihappe tase ja karotenoidide tase. Mulle teadaolevalt ei ole looduslikes linnuasurkondades varem karotenoidide kontsentratsioonil vereplasmas aastatevahelist korduvust uuritud. Samas on Sepp ja teised (2012) leidnud, et laboritingimustes peetud rohevintidel (Cardelius chloris) esines kaheksa päeva jooksul vereplasma karotenoididel märgatav individuaalne korduvus, mis suurema valimi korral oleks tõenäoliselt oluline tulnud ka 16 päevase ajavahemiku raames. Karotenoidid on rasvlahustuvad süsivesinikud, mida loomad de novo sünteesida ei suuda, ning peavad seega toiduga omandama (Svensson ja Wong 2011). Kuigi karotenoidne värvus on seotud fundamentaalsete redoksradadega, ei ole selle seose mehhanismides üksmeelele jõutud. Selge on aga see, et isegi liigisiseselt esineb asurkondade, sugude, indiviidide ja isegi sama indiviidi koetüüpide vahel erinevusi
karotenoidide omastamisel, kasutamisel ja karotenoidsel signaliseerimisel (Svensson ja Wong 2011). Ka käesolevast uuringust tuli välja et vereplasma karotenoidide sisaldus oli linnu soost sõltuv. Üks võimalus on karotenoidide individuaalset aastatevahelist korduvust seletada erinevate toidueelistustega, kuid tuleb arvesse võtta, et ka karotenoidide omastamine toidust võib olla individuaalselt varieeruv. Sõltumata korduvuse füsioloogilisest põhjusest viitab
käesolev uurimus, et karotenoidide kontsentratsioon kalakajaka vereplasmas võib adekvaatselt peegeldada linnu pikaajalist tervislikku seisundit ning karotenoidselt värvunud kehaosad võivad sellest lähtuvalt kalakajakal ausalt signaliseerida linnu kvaliteeti. Karotenoidsete kehaosade värvuse intensiivsuse ja linnu oksüdatiivse seisundi seoste uurimine kalakajakal võib seega olla üks võimalikest käesoleva töö edasiarendustest.
Kusihape on lindude peamine lämmastikumetabolismi saadus, mis on lindudel ka tähtsaks antioksüdandiks (Tsahar et al. 2006). Kuigi kusihappe hulk veres sõltub söögist möödunud ajast (Voss ja Siems 2006), leidis ka hiljutine tehistingimustes peetud sebra- amadiinidel (Taeniopygia guttata) teostatud uuring, milles mõõdeti mitmeid OS parameetreid samadel isenditel neljakuulise vahega, et selle väärtuses esines statistiliselt oluline korduvus (Romero-Haro ja Alonso-Alvarez 2014). Kuna kusihape on lindude lämmastikumetabolismi saadus, on võimalik, et individuaalsed erinevused kusihappe kontsentratsioonis tulenevad lindude erinevatest toidueelistustest. Seda hüpoteesi toetab asjaolu, et ka toiduga omastatavate karotenoidide kontsentratsioon veres oli individuaalselt korduv. Samas on metskalkuni
(Meleagris gallopavo) erinevatel kodustatud liinidel läbiviidud uuring leidnud, et vereplasma kusihappe baastase on ka geneetiliselt määratud (Hartman et al. 2006). Mõistmaks, kas individuaalne korduvus karotenoidide ja kusihappe kontsentratsioonides on geneetiliselt määratud, või sõltub toidueelistusest, tuleks tulevikus uurida kalakajaka toitumiseelistusi.
TAC peegeldab organismis ringluses olevate erinevate vesilahustuvate antioksüdantide koguhulka. TAC ja TAC-i jäägid ei olnud ajas korduvad. See on vastuolus suitsupääsukesel läbiviidud uurimuse tulemustega, mis näitasid, et plasma antioksüdatiivne mahutavus (AOC) oli nii pesitsusperioodi vältel kui aastate vahel isendisiseselt korduv (Saino et al. 2011). Ka tehistingimustes peetud sebra-amadiinidel läbi viidud katse näitas, et TAC on individuaalselt korduv (Romero-Haro ja Alonso-Alvarez 2014). TAC-i peamisteks komponentideks on kusihape ja valkude vabad sulfhüdrüülrühmad (Erel 2004, Sepp et al. 2010). Kuna kusihappe kontsentratsioon plasmas on käesoleva uurimuse andmetel kalakajakal individuaalselt korduv, võib oletada, et vaatamata selle suurele korreleeruvusele TAC-iga moodustab see veres
ringlevatest antioksüdantidest väiksema osa kui valkude vabad sulfhüdrüülrühmad. Käesoleva uurimuse põhjal võib järeldada, et TAC peegeldab kalakajakal pigem linnu hetkeseisundit kui pikemaajalisi (genotüübist tulenevaid) isenditevahelisi erinevusi. Tõenäoliselt on selle
parameetri väärtus seega keskkonnatingimuste poolt rohkem mõjutatud kui kusihappe või karotenoidide taseme väärtused.
Mõõdetud parameetritest vaid kaks olid seotud vanuse või suremusega: emaste lindude TOS oli sõltuv vanusest ning triglütseriidide tase sõltus lineaarselt pesitsusaastast. Kuna
analüüsil kasutati vaid ühe aasta TOS-i andmeid, ei saanud antud parameetri aastatevahelist korduvust mõõta, seega ei ole kindel, kui adekvaatselt see kalakajaka puhul linnu pikaajalist konditsiooni peegeldab. Triglütseriidide tase veres ei olnud ei isaste ega emaste lindude puhul individuaalselt aastate vahel korduv. On ka näidatud, et plasma triglütseriidide tase peegeldab enamasti lühiajalisi kataboolseid protsesse, mitte pikaajalist konditsiooni (Jenni-Eiermann ja Jenni 1999). Seepärast peab olema ettevaatlik nende kahe tulemuse tõlgendamisel. Samas on emastel leitud seos viimase sigimisaasta ja TOS-i vahel ennustatud suunas – aasta enne kolooniast kadumist on TOS-i tase kõrgem kui keskmiselt populatsioonis. Kuna varasemad tööd on näidanud lindude sigimisedukuse järsku langust viimasel sigimisaastal (Rattiste 2004), võib oletada, et langeb ka lindude üleüldine konditsioon, millele viitab TOS-i väärtuse tõus. Kuna leitud seos põhineb vähestel andmetel ning vaid ühel aastal läbi viidud analüüsil, tuleks enne kindlamate järelduste tegemist seda analüüsi korrata.
Enamus uuritud oksüdatiivse seisundi parameetritest ei seostunud lindude vanusega ega ennustanud ka suremust. See tulemus on vastuolus mitmete uuringutega, mis on näidanud vanuse ning suremuse sõltuvust OS parameetritest nii tehistingimustes peetavates- (Devevey et al. 2010) kui vabalt elavates linnuasurkondades (Bize et al. 2008, Saino et al.
2011).Näiteks pikaealisel linnuliigil, heleflamingol (Phoenicopterus ruber roseus) Baseli loomaaias läbiviidud uurimus näitas paraboolset seost oksüdantide poolt indutseeritud vererakkude hemolüüsi aja ning lindude vanuse vahel. Kõrgeim vastupanu oksüdatiivsele stressile oli noortel täiskasvanud lindudel, vanuses 12-20 aastat, mis näitab, et vähemalt antud linnuliigi puhul areneb redokstasakaalu eest vastutav süsteem täielikult välja suguküpsuse saabumisel ning muutub seniliseerumise käigus ebaefektiivsemaks (Devevey et al. 2010).
Kuigi ka käesolev uurimus on läbi viidud pikaealisel linnuliigil, pole selles seoseid vere antioksüdantide hulga ja vanuse vahel leitud. Üks põhjus selle jaoks on uurimuste erinev ülesehitus. Devevey ja teiste (2010) uurimus oli oma ülesehituselt läbilõikeline, mille puudusi longitudinaalanalüüside ees käsitleti juba eespool. Teiseks viidi see uuring läbi kunstlikes tingimustes elutseva asurkonna peal, mis küll minimaliseeris väliskeskkonna heterogeensusest tulenevat indiviidide vahelist varieeruvust (Devevey et al. 2010), samas võivad looduslikes asurkondades olla teistsugused valikusurved. Samuti ei mõõtnud antud uurimus kasutatud OS parameetri korduvust, seega ei saa kindel olla, kas kasutatud marker näitab antud liigi puhul pikaajalist fenotüübi kohasust või on see mõjutatav keskkonna lühiajaliste fluktueerumiste poolt.
Longitudinaalne uuring suitsupääsukestel (Hirundo rustica) näitas, et sellel liigil ei esine seost plasma antioksüdatiivse mahutavuse (plasma antioxidant capacity AOC) ja vanuse
vahel (Saino et al. 2011), küll aga ennustas AOC suremistõenäosust. Kasutatud biokeemilisel parameetril oli ka suur pesitsushooaja sisene ning aastatevaheline korduvus, mis näitab, et kõrgema AOC tasemega indiviidid on seda kogu oma elu vältel. Seega on AOC vähemalt suitsupääsukeste puhul hea pikaajalise kohasuse näitaja. Erinevus käesoleva uurimuse ja Saino ja teiste (2011) uurimuse vahel võib tuleneda uurimisobjektide erinevatest elukäikudest.
Suguküpsuse saavutanud suitsupääsukesel on suguküpsuse saavutanud kalakajakast väiksem keskmine eluiga. Kuna pikaealisemad liigid on reeglina kaitstumad OS suhtes (Buttemer et al.
2010), on võimalik, et kalakajakal pikaealise linnuliigina ei ole isegi surmaeelsel aastal redokstasakaalu säilitamisega probleeme. Samas leidis üks hiljutine uuring, et nii lühielalisel rasvatihasel (Parus major) kui pikemaealisel suurpiiritajal (Tachymarptis melba) vähenes vananedes erütrotsüütide vastupanuvõime oksüdatiivsetele kahjustustele. Suurpiiritaja puhul leiti isegi, et toimub erütrotsüütide vastupanuvõime suurenemisele suunatud looduslik valik (Bize et al. 2014).
On ka võimalus, et mõõdetud redoksparameetrid ei peegelda kalakajaka puhul adekvaatselt isendite konditsiooni. Samas, kuna mitmed mõõdetud parameetritest olid
individuaalselt aastate vahel korduvad, võib siiski eeldada, et mingi seos neil väärtustel linnu oksüdatiivse seisundiga siiski on. Võimalik on ka alternatiivne seletus, mille kohaselt
organismi füsioloogia erinevad komponendid vananevad erineva kiirusega (Nussey et al.
2013), ja et kalakajakal toimub küll reproduktiivne vananemine kuid redokstasakaalu säilitamise mehhanismid ei vanane.
Selle hüpoteesi kinnitamiseks on kindlasti vajalikud täiendavad uuringud. Praeguses uuringus mõõdeti paljude antioksüdantide tasemeid ning reaktiivsete osakeste koguhulka, kuid vaid paari oksüdatiivsete kahjustuste markerit. Paremaks arusaamaks redokstasakaalu säilitamise mehhanismidest on kindlasti tarvis mõõtmistesse kaasata rohkem oksüdatiivsete kahjustuste markereid. Ühe sellise markerina võib näiteks käsitleda kromosoomi otstes asetsevate mittekodeerivate kordusjärjestuste, telomeeride, pikkust. Oksüdatiivsete kahjustuste parandamine neis struktuurides on ebaefektiivsem kui ülejäänud DNAs (von Zglinicki 2002). Seepärast kiirendab oksüdatiivne stress telomeeride lühenemist. Telomeeride lühenemine kriitilise piirini võib põhjustada aga rakkude programmeeritud surma – apoptoosi (Beaulieu et al. 2011). Seega on telomeeride pikkus hea oksüdatiivse stressi kui ka organismi bioloogilise vananemise marker. Samuti on kasulik mõõta ka oksüdatiivse stressi poolt põhjustatud valkude ja lipiidide kahjustusi, kuna ka need rakukomponendid on oksüdatiivse stressi poolt haavatavad (Costantini et al. 2010).
Organismi redoksseisundi adekvaatseks hindamiseks on tarvis ka hinnata oksüdatiivsete
kahjustuste parandamise mehhanisme, kuid kuigi selliste mehhanismide mõõtmiseks on meetodeid välja töötatud (Fracasso et al. 2006), ei ole need ökoloogilistes uurimistöödes suurt kasutust leidnud (Monaghan et al. 2009). Tulevastesse uuringutesse võiks seepärast kaasata lisaks antioksüdantide tasemele, reaktiivsete osakeste hulgale ja oksüdatiivsete kahjustuste markeritele ka mõne oksüdatiivsete kahjustuste parandusmehhanismi mõõdu, alles siis saab kindlusega öelda, et mõõdeti redokstasakaalu säilitamise efektiivsust ning seda, kas see vanusest sõltuvalt halveneb.
Mitmed uuringud on lindudel näidanud seoseid oksüdatiivse stressi biokeemiliste parameetrite ja sigimisedukuse vahel (Safran et al. 2010, Marko et al. 2011). Käesolevas uuringus mõõdeti vaid kahte sigimisedukuse parameetrit (munemise algusaeg ja kurna mass) ning nendegi seoseid oksüdatiivse stressi biokeemiliste parameetritega ei uuritud. Tulevikus saab käesoleva töö raames kogutud andmete põhjal uurida ka selliseid seoseid. Samuti on võimalik võrrelda uuritud lindude ja nende sigimisealiste järglaste vahelist biokeemiliste kohasusemarkerite korduvust, tuvastamaks võimalikku redokstasakaalu säilitamise mehhanismide päritavust.
5. Kokkuvõte
Oksüdatiivne stress tekkib, kui reaktiivse osakeste tootmine ületab nende mõju
neutraliseerivate süsteemide võimekuse. Selline olukord viib biomolekulide kahjustumiseni, mis võib häirida rakufunktsioone ja põhjustada isegi surma (Halliwell ja Gutteridge 2007).
Oksüdatiivse stressi vältimine on seepärast organismi tervise seisukohalt hädavajalik.
Organismi optimaalne elukäik võib seetõttu sõltuda ressursside paigutamisest oksüdatiivse stressi vastu võitlemise ja teiste elukäigutunnuste vahel. Oksüdatiivset stressi peetakse ka organismi vananemise põhjustajaks (Harman 1956). Vaatamata sellele ei ole oksüdativse stressi mõju vananemisele paljude, eriti aga pikaealiste taksonite puhul uuritud (Costantini et al. 2010).
Kalakajakas (Larus canus) on koloniaalne pikaealine lind, kelle puhul on varasemates töödes reproduktiivset vananemist näidatud (Rattiste 2004). Käesoleva uurimistöö eesmärgiks oli leida, kas kalakajakal esineb vananemist ka oksüdatiivse staatuse ja kohasuse
biokeemilistes markerites. Töö teiseks eesmärgiks on valitud markerite individuaalse korduvuse mõõtmise läbi kindlaks teha, kas need on sobilikud pikaajalise konditsiooni kirjeldamiseks.
Uuritud biokeemilistest tervisenäitajatest enamik ei olnud seoses ei vanuse ega suremusega, mis on vastuolus paljude teiste uurimustega (Bize et al. 2008, Devevey et al.
2010, Saino et al. 2011). Leiti vaid seos triglütseriidide taseme ja vanuse ning plasma
oksüdatiivse staatuse ja suremuse vahel, kuid need seoseed on metoodilistel põhjustel raskesti tõlgendatavad. Samas oli valimis märgatav reproduktiivne vananemine.Biokeemilistest markeritest esines individuaalne korduvus karotenoidide ja kusihappe kontsentratsioonides.
Korduvuse täpsete põhjuste väljaselgitamise jaoks on aga tarvilikud täiendavad uuringud.
Kuna biokeemilised kohasusemarkerid vananemist ega suremust ette ei ennustanud, on võimalik, et kalakajaka redokstasakaalu säilitamise eest vastutvad mehhanismid ei vanane.
Antud hüpoteesi kindlamaks tõestamiseks on tarvilik täiendavalt läbi viia rohkemaid biokeemilisi markereid kaasavaid uuringuid.
6. Summary
Variation in the markers of oxidative stress in the common gull (Larus canus):
associations with age and mortality
Oxidative stress arises, when the production of reactive species overwhelms the mechanisms responsible for their neutraalisation. That kind of a situation leads to
biomolecular damage, that could damage cell functions and cause even death (Halliwell and Gutteridge 2007).
For that reason avoiding oxidative stress is crucial for maintaining organismal health.
Optimal life history of an organism can therefore depend upon the allocation of resources between life history traits and fighting oxidative stress. Oxidative stress is also considered to be the cause of senescence (Harman 1956). Despite that notion the effect of oxidative stress on senescence still remains poorly studied, especially on long-living organisms (Costantini et al. 2010).
The common gull (Larus canus) is a colonial long-living seabird, on whom previous studies have shown proof of reproductive senescence (Rattiste 2004). The aim of this thesis was to find out if there are also marks of senescence in the common gulls̕ biochemical
markers of oxidative status and fitness. The second aim of this thesis is to measure individual repeatability of the selected markers to find out if they are suitable for measuring long term fitness of an individual.
None of the biochemical healthmarkers predicted senescence nor death, which contradicts the results of many other studies (Bize et al. 2008, Devevey et al. 2010, Saino et al. 2011).
However there was proof of reproductive senescence in the sample. Individual consistency was found in two of the biochemical condition markers: carotenoids and uric acid. The reasons for this however demand further study.
Because none of the biochemical markers of fitness predicted neither senescence nor death, there is a possibility, that in common gull the mechanisms responsible for maintaining
oxidative balance do not age. For the definitive proof of this hypothesis, however further studies incorporating more biochemical markers of fitness are needed.
7. Tänuavaldused
Soovin tänada oma juhendajat, Tuul Seppa igakülgse abi eest. Samuti oma töörühma juhti, Peeter Hõrakut, Kalev Rattistet Eesti Maaülikoolist. Tänan ka Lauri Saksa, Ulvi Karu ja Elin Silda, kes olid abiks biokeemiliste analüüside teostamisel, Ants Kaasikut ja Richard Meiterni, kes olid abiks andmete analüüsimisel, ja kõiki loomaökoloogia õppetooli liikmeid, kes mind oma konstruktiivse kriitikaga aitasid.
8. Kirjandus
Alonso-Alvarez, C., L. Perez-Rodriguez, J. T. Garcia, J. Vinuela and R. Mateo (2010). "Age and Breeding Effort as Sources of Individual Variability in Oxidative Stress Markers in a Bird Species." Physiological and Biochemical Zoology 83: 110-118.
Beaulieu, M., S. Reichert, Y. Le Maho, A. Ancel and F. Criscuolo (2011). "Oxidative status and telomere length in a long-lived bird facing a costly reproductive event."
Functional Ecology 25: 577-585.
Beckman, K. B. and B. N. Ames (1998). "The free radical theory of aging matures."
Physiological Reviews 78: 547-581.
Bize, P., S. Cotting, G. Devevey, J. van Rooyen, F. Lalubin, O. Glaizot and P. Christe (2014).
"Senescence in cell oxidative status in two bird species with contrasting life expectancy." Oecologia 174: 1097-1105.
Bize, P., G. Devevey, P. Monaghan, B. Doligez and P. Christe (2008). "Fecundity and survival in relation to resistance to oxidative stress in a free-living bird." Ecology 89: 2584- 2593.
Brommer, J. E., K. Rattiste and A. Wilson (2009). "The rate of ageing in a long-lived bird is not heritable." Heredity 104: 363-370.
Buttemer, W. A., D. Abele and D. Costantini (2010). "From bivalves to birds: oxidative stress and longevity." Functional Ecology 24: 971-983.
Carlos Noguera, J., S.-Y. Kim and A. Velando (2012). "Pre-fledgling oxidative damage predicts recruitment in a long-lived bird." Biology Letters 8: 61-63.
Costantini, D. (2011). "On the measurement of circulating antioxidant capacity and the nightmare of uric acid." Methods in Ecology and Evolution 2: 321-325.
Costantini, D., M. Rowe, M. W. Butler and K. J. McGraw (2010). "From molecules to living systems: historical and contemporary issues in oxidative stress and antioxidant ecology." Functional Ecology 24: 950-959.
Devevey, G., N. Bruyndonckx, F. von Houwald, A. Studer-Thiersch and P. Christe (2010).
"Age-specific variation of resistance to oxidative stress in the greater flamingo (Phoenicopterus ruber roseus)." Journal of Ornithology 151: 251-254.
Dowling, D. K. and L. W. Simmons (2009). "Reactive oxygen species as universal constraints in life-history evolution." Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences 276: 1737-1745.
Erel, O. (2004). "A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical cation." Clinical Biochemistry 37:
277-285.
Erel, O. (2005). "A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status."
Clinical Biochemistry 38: 1103-1111.
Esterbauer, H., R. J. Schaur and H. Zollner (1991). "Chemistry and biochemistry of 4- hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes." Free Radical Biology and Medicine 11: 81-128.
Finkel, T. and N. J. Holbrook (2000). "Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing."
Nature 408: 239-247.
Fracasso, M. E., D. Doria, P. Franceschetti, L. Perbellini and L. Romeo (2006). "DNA damage and repair capacity by comet assay in lymphocytes of white-collar active smokers and passive smokers (non- and ex-smokers) at workplace." Toxicology Letters 167: 131- 141.
Freitas, M., J. L. F. C. Lima and E. Fernandes (2009). "Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review." Analytica Chimica Acta 649:
8-23.
Galvan, I. and C. Alonso-Alvarez (2008). "An Intracellular Antioxidant Determines the Expression of a Melanin-Based Signal in a Bird." Plos One 3.
Garratt, M. and R. C. Brooks (2012). "Oxidative stress and condition-dependent sexual signals: more than just seeing red." Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences 279: 3121-3130.
Halliwell, B. and J. M. C. Gutteridge (2007). Free radicals in biology and medicine, Clarendon Press, Oxford.
Harman, D. (1956). "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry." Journal of gerontology 11: 298-300.
Hartman, S., S. A. Taleb, T. Geng, K. Gyenai, X. Guan and E. Smith (2006). "Comparison of plasma uric acid levels in five varieties of the domestic turkey, Meleagris gallopavo."
Poultry Science 85: 1791-1794.
Hill, G. E. and J. D. Johnson (2012). "The Vitamin A-Redox Hypothesis: A Biochemical Basis for Honest Signaling via Carotenoid Pigmentation." American Naturalist 180: E127- E150.
Hõrak, P. and A. Cohen (2010). "How to measure oxidative stress in an ecological context:
methodological and statistical issues." Functional Ecology 24: 960-970.
Hõrak, P., L. Saks, I. Ots and H. Kollist (2002). "Repeatability of condition indices in captive greenfinches (Carduelis chloris)." Canadian Journal of Zoology-Revue Canadienne De Zoologie 80: 636-643.
Jacobsen, D. W. (2000). "Hyperhomocysteinemia and oxidative stress - Time for a reality check?" Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 20: 1182-1184.
Jenni-Eiermann, S. and L. Jenni (1999). "What can plasma metabolites tell us about the metabolism, physiological state and condition of individual birds? An overview."
Biologia e Conservazione della Fauna 102: 312-319.
Losdat, S., F. Helfenstein, J. D. Blount, V. Marri, L. Maronde and H. Richner (2013).
"Nestling erythrocyte resistance to oxidative stress predicts fledging success but not local recruitment in a wild bird." Biology Letters 9.
Marko, G., D. Costantini, G. Michl and J. Toeroek (2011). "Oxidative damage and plasma antioxidant capacity in relation to body size, age, male sexual traits and female reproductive performance in the collared Xycatcher (Ficedula albicollis)." Journal of Comparative Physiology B-Biochemical Systemic and Environmental Physiology 181: 73-81.
McGraw, K. J., A. A. Cohen, D. Costantini and P. Hõrak (2010). "The ecological significance of antioxidants and oxidative stress: a marriage between mechanistic and functional perspectives." Functional Ecology 24: 947-949.
Meitern, R., E. Sild, K. Kilk, R. Porosk and P. Hõrak (2013). "On the methodological
limitations of detecting oxidative stress: effects of paraquat on measures of oxidative status in greenfinches." Journal of Experimental Biology 216: 2713-2721.
Metcalfe, N. B. and C. Alonso-Alvarez (2010). "Oxidative stress as a life-history constraint:
the role of reactive oxygen species in shaping phenotypes from conception to death."
Functional Ecology 24: 984-996.
Monaghan, P., N. B. Metcalfe and R. Torres (2009). "Oxidative stress as a mediator of life history trade-offs: mechanisms, measurements and interpretation." Ecology Letters 12:
75-92.
Nakagawa, S. and H. Schielzeth (2010). "Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists." Biological Reviews 85: 935-956.
Niki, E. (2009). "Lipid peroxidation: Physiological levels and dual biological effects." Free Radical Biology and Medicine 47: 469-484.
Nussey, D. H., H. Froy, J. F. Lemaitre, J. M. Gaillard and S. N. Austad (2013). "Senescence in natural populations of animals: Widespread evidence and its implications for bio- gerontology." Ageing Research Reviews 12: 214-225.
Nussey, D. H., J. M. Pemberton, J. G. Pilkington and J. D. Blount (2009). "Life history correlates of oxidative damage in a free-living mammal population." Functional Ecology 23: 809-817.
Rahman, I., A. Kode and S. K. Biswas (2006). "Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method."
Nature Protocols 1: 3159-3165.
Rattiste, K. (2004). "Reproductive success in presenescent common gulls (Larus canus): the importance of the last year of life." Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences 271: 2059-2064.
Rattiste, K. and V. Lilleleht (1995). "Survival rates of breeding comon gulls in Estonia."
Journal of Applied Statistics 22: 1057-1062.
Rattiste, K. and U. Tartes (2005). "Long-term studies of common gulls (Larus canus) in Estonia: responses to environmental conditions." Acta Zoologica Lituanica 15: 158- 160.
Romero-Haro, A. A. and C. Alonso-Alvarez (2014). "Covariation in oxidative stress markers in the blood of nestling and adult birds." Physiological and biochemical zoology : PBZ 87: 353-362.
Safran, R. J., K. J. McGraw, M. R. Wilkins, J. K. Hubbard and J. Marling (2010). "Positive Carotenoid Balance Correlates with Greater Reproductive Performance in a Wild Bird." Plos One 5.
Saino, N., M. Caprioli, M. Romano, G. Boncoraglio, D. Rubolini, R. Ambrosini, A. Bonisoli- Alquati and A. Romano (2011). "Antioxidant Defenses Predict Long-Term Survival in a Passerine Bird." Plos One 6.
Salomons, H. M., G. A. Mulder, L. van de Zande, M. F. Haussmann, M. H. K. Linskens and S. Verhulst (2009). "Telomere shortening and survival in free-living corvids."
Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences 276: 3157-3165.
Schmid-Hempel, P. (2005). Evolutionary ecology of insect immune defenses. Annual Review of Entomology. Palo Alto, Annual Reviews. 50: 529-551.
Selman, C., J. D. Blount, D. H. Nussey and J. R. Speakman (2012). "Oxidative damage, ageing, and life-history evolution: where now?" Trends in Ecology & Evolution 27:
570-577.
Sepp, T., E. Sild, J. D. Blount, M. Männiste, U. Karu and P. Hõrak (2012). "Individual Consistency and Covariation of Measures of Oxidative Status in Greenfinches."
Physiological and Biochemical Zoology 85: 299-307.
Sepp, T., E. Sild and P. Hõrak (2010). "Hematological Condition Indexes in Greenfinches:
Effects of Captivity and Diurnal Variation." Physiological and Biochemical Zoology 83: 276-282.
Svensson, P. A. and B. B. M. Wong (2011). "Carotenoid-based signals in behavioural ecology:
a review." Behaviour 148: 131-189.
Tsahar, E., Z. Arad, I. Izhaki and C. G. Guglielmo (2006). "The relationship between uric acid and its oxidative product allantoin: a potential indicator for the evaluation of oxidative stress in birds." Journal of Comparative Physiology B-Biochemical Systemic and Environmental Physiology 176: 653-661.
Tummeleht, L., M. Mägi, P. Kilgas, R. Mänd and P. Hõrak (2006). "Antioxidant protection and plasma carotenoids of incubating great tits (Parus major L.) in relation to health state and breeding conditions." Comparative Biochemistry and Physiology C- Toxicology & Pharmacology 144: 166-172.
von Schantz, T., S. Bensch, M. Grahn, D. Hasselquist and H. Wittzell (1999). "Good genes, oxidative stress and condition-dependent sexual signals." Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences 266: 1-12.
von Zglinicki, T. (2002). "Oxidative stress shortens telomeres." Trends in Biochemical Sciences 27: 339-344.
Voss, P. and W. Siems (2006). "Clinical oxidation parameters of aging." Free Radical Research 40: 1339-1349.
Wright, P. A. (1995). "Nitrogen-excretion - 3 end-products, many physiological roles."
Journal of Experimental Biology 198: 273-281.
Lihtlitsents lõputöö reprodutseerimiseks ja lõputöö üldsusele kättesaadavaks tegemiseks
Mina, Janek Urvik
1. annan Tartu Ülikoolile tasuta loa (lihtlitsentsi) enda loodud teose
Oksüdatiivse seisundi markerite varieeruvus kalakajakal (Larus canus): seosed vanuse ja suremusega
mille juhendaja on PhD Tuul Sepp
1.1. reprodutseerimiseks säilitamise ja üldsusele kättesaadavaks tegemise eesmärgil, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace-is lisamise eesmärgil kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni;
1.2. üldsusele kättesaadavaks tegemiseks Tartu Ülikooli veebikeskkonna kaudu, sealhulgas digitaalarhiivi DSpace´i kaudu kuni autoriõiguse kehtivuse tähtaja lõppemiseni.
2. olen teadlik, et punktis 1 nimetatud õigused jäävad alles ka autorile.
3. kinnitan, et lihtlitsentsi andmisega ei rikuta teiste isikute intellektuaalomandi ega isikuandmete kaitse seadusest tulenevaid õigusi.
Tartus 26.05.2014
