Generierung eines onkolytischen Adenovirus mit optimierter p53-abhängiger Selbstinaktivierungsfunktion

Aus der Klinik für Gastroenterologie, Hepatologie und Endokrinologie der Medizinischen Hochschule Hannover

Generierung eines onkolytischen Adenovirus mit optimierter p53-abhängiger

Selbstinaktivierungsfunktion

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

vorgelegt von

Anneliese Goez

aus Erlangen

Hannover, 2012

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 20.11.2012

Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover Präsident: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann

Betreuer der Arbeit: PD Dr. rer. nat. Florian Kühnel Co-Betreuer der Arbeit: Prof. Dr. med. Stefan Kubicka

Referent: Prof. Dr. rer. nat. Martin Messerle Korreferent: PD Dr. med. Albert Heim

Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2012

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. med. Thomas Werfel Prof. Dr. med. Georg Scheumann Prof. Dr. med. Torsten Witte

Lieber Giftzwerg, danke für deine Unterstützung.

Dies ist für dich.

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung

1.1 Maligne Neoplasien……… 1

1.1.1 Klinische Bedeutung und Therapieoptionen………... 1

1.1.2 Molekulare Mechanismen der Tumorentstehung……… 2

1.2 Onkolytische Virotherapie……… 5

1.2.1 Adenoviren………... ……... 5

1.2.2 Selektivitäts-Mechanismen………... 7

1.2.3 I-Sce I und DNA-Reparatur……… 9

1.3 Verbindungssequenzen zur Expression mehrerer Proteine unter der Kontrolle desselben Promotors………... 10

1.3.1 IRES-Sequenzen………... 11

1.3.2 2A-Sequenzen………... 11

II. Zielsetzung des Projektes

III. Materialien und Methoden

3.1 Materialien……….………… 14

3.1.1 Eukaryotische Zellinien……….……….. 14

3.1.2 Bakterienstämme………. 14

3.1.3 Plasmide………... 14

3.1.4 Im Rahmen dieser Arbeit klonierte Plasmide………... 16

3.1.5 2A- und IRES-Sequenzen……… 18

3.1.6 Adenoviren………... ……... 19

3.1.7 Im Rahmen dieser Arbeit konstruierte Adenoviren………. 20

3.1.8 Oligonukleotide (Primer)………. 20

3.1.9 Enzyme……….………... 22

3.1.10 Molekulargewichtsstandards……….……….. 22

3.1.11 Antikörper……… 23

3.1.12 Rekombinante Proteine……… 23

3.1.13 Kits………... 23

3.1.14 Chemikalien und Reagenzien……….. 24

3.1.15 Medien und Pufferlösungen………. 26

3.1.16 Sonstige Materialien und Geräte………... 28

3.2 Methoden……… 30

3.2.1 Molekularbiologische Methoden……….…………. 30

3.2.1.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR: polymerase chain reaction)………...30

3.2.1.2 PCR unter Verwendung degenerierter Primer (primer-directed mutagenesis)………. 30

3.2.1.3 PCR mit zwei Primer-Paaren zur Generierung von 2A-Sequenzen……….……….. 31

3.2.1.4 PCR zum Nachweis der adenoviralen DNA-Fragmente nach I-Sce I-Schnitt………... 32

3.2.1.5 Real time quantitative PCR (qPCR)………. 33

3.2.1.6 Agarose-Gelelektrophorese……….. 34

3.2.1.7 Spaltung von DNA mittels Restriktionsenzymen………. 35

3.2.1.8 Aufreinigung von DNA-Fragmenten nach PCR/ Restriktionsspaltung……….. 35

3.2.1.9 Dephosphorylierung offener DNA-Enden……….. 36

3.2.1.10 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen………. 36

3.2.1.11 Ligation von DNA-Enden………. ……... 36

3.2.1.12 Vermehrung und Aufreinigung von Plasmid-DNA……….. ……... 37

3.2.1.13 Herstellung chemo- und elektrokompetenter Bakterien………... 37

3.2.1.14 Transformation von chemisch kompetenten Bakterien/ Transformation durch Elektroporation……… 38

3.2.1.15 Vermehrung transformierter Bakterien, analytische Plasmid-Präparation (Mini-Präp) und Kontrollspaltung………... 39

3.2.1.16 Herstellung größerer Plasmid-Mengen mit höherem Reinheitsgrad (Midi-Präp)………... 40

3.2.1.17 DNA-Konzentrationsmessung am Photometer……… 40

3.2.1.18 Sequenzierung……….. 41

3.2.2 Zellbiologische Methoden………. 41

3.2.2.1 Zellkultur……….. 41

3.2.2.2 Einfrieren und Auftauen von Zellen………. 42

3.2.2.3 Aussäen definierter Zellzahlen………. 42

3.2.2.4 Transiente Transfektion mittels Polyethylenimin (PEI)………... 42

3.2.2.5 Fluoreszenzmikroskopie……….……….. 43

3.2.2.6 FACS-Analyse………... 43

3.2.3 Proteinbiochemische Methoden………... 44

3.2.3.1 Vorbereitung von Zellen/ Zellextrakten für proteinchemische Analysen………. 44

3.2.3.2 Bradford-Assay zur quantitativen Proteinbestimmung……… 44

3.2.3.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)…………. ……... 44

3.2.3.4 Western Blot-Analyse……….. 45

3.2.3.5 Luciferase-Assay/ Repressions-Test... 46

3.2.3.6 Dualer Luciferase-Assay (Renilla/Firefly)………... 47

3.2.3.7 β-Gal-Assay………...………... 47

3.2.4 Virologische Methoden………... 48

3.2.4.1 Einklonierung von Plasmid-Sequenzen in adenovirale Vektoren………... 48

3.2.4.2 Aufreinigung adenoviraler Plasmide (Phenol-Chloroform-Extraktion)………... 49

3.2.4.3 Transfektion von Zellen mit adenoviralen Plasmiden…………... 49

3.2.4.4 Vermehrung und Präparation infektiöser Adenoviren….……… 49

3.2.4.5 Photometrische Bestimmung der Gesamt-Partikel-Zahl von Viren………... 50

3.2.4.6 Bestimmung der infektiösen Partikelzahl von Viren (rapid titer)………...51

3.2.4.7 Onkolyse-Assay und Kristallviolett-Färbung………... 52

3.2.4.8 CARex/TAT-coating von Adenoviren zur Infektion CAR-negativer Zellen………... 52

3.2.5 Statistische Auswertung……… 52

IV. Ergebnisse

4.1 Quantitative und qualitative Analyse der 2A-Expressionssysteme…………...55

4.1.1 Generierung………..……... 55

4.1.2 Fluoreszenzmikroskopischer Vergleich der GFP-Expression von 2A- und IRES-Konstrukten………..……... 57

4.1.3 GFP-Western Blot-Analyse………. 58

4.1.4 FACS-Analyse………. 59

4.1.5 Messung der I-Sce I-Aktivität im Luciferase-Assay………... 61

4.1.6 Gal4-KRAB-Repressions-Assay………... 63

4.2 Generierung der 2A-E1A∆24-Adenoviren und Charakterisierung hinsichtlich Proteinexpression und Regulation...66

4.2.1 Generierung………... 66

4.2.2 Kontrolle der Transgen-Expression im Virussystem………... 69

4.2.3 Effektivität der Gal4-KRAB-vermittelten Repression im Virussystem………….. 71

4.2.4 Kontrolle der I-Sce I-Funktion mittels Nachweis-PCR für zirkularisierte Fragmente………. 72

4.2.5 PCR zum Nachweis einer verkürzten E1A-Mutante………... 75

4.3 Charakterisierung der 2A- E1A∆24-Viren hinsichtlich onkolytischer Effizienz, p53-Selektivität und Replikationsverhalten……… 77

4.3.1 Onkolyse-Assays………..……... 77

4.3.2 Replikations-Kinetik……… 79

4.3.3 Replikation und lytischer Effekt der 2A-E1A ∆24-Viren in nicht-transformierten Zellen (Fibroblasten)……… 80

V. Diskussion

5.1 Regulation onkolytischer Adenoviren: Targeting-Ansätze……… 84

5.2 Expression mehrerer regulatorischer Proteine unter der Kontrolle desselben Promotors……… 86

5.3 p53-abhängige Regulation der 2A-E1A ∆24-Viren……… 90

5.4 I-Sce I-Regulation und Positionierung der Schnittstellen……….. 93

5.5 Anzucht von Adenoviren in geeigneten Zelllinien……….. 96

5.6 Ausblick Virotherapie……….……….. 97

VI. Zusammenfassung

VII. Literaturverzeichnis

VIII. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

IX. Abkürzungsverzeichnis

X. Danksagung

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I. Einleitung

1.1 Maligne Neoplasien

1.1.1 Klinische Bedeutung und Therapieoptionen

Maligne Erkrankungen gehören weltweit zu den häufigsten Todesursachen. In Industrie- nationen rangieren sie derzeit an zweiter Stelle hinter den Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Laut Prognose der World Health Organisation von 2007 wird sich die Zahl krebsbedingter Todesfälle bis zum Jahr 2030 um weitere 45 % erhöhen. Zu den anerkannten Risikofaktoren zählen genetische Vorbelastung, ionisierende Strahlung, Exposition gegenüber Schadstoffen inklusive Tabak und Alkohol, chronische Infektionen und ungesunde Lebensweise mit Überernährung und Bewegungsmangel. Seit einigen Jahren wird auch die Hypothese der Existenz von Tumorstammzellen diskutiert [1]. Bei 95 % aller malignen Neoplasien handelt es sich um solide Tumoren, welche lokal in einem Organ entstehen und erst sekundär durch Metastasierung in eine Systemerkrankung übergehen. Bezüglich des Ansprechens auf Standardtherapien (chirurgische Entfernung, Chemo-, Radiotherapie sowie ggf. Immun-, Hormontherapie) gibt es große Unterschiede je nach Ursprungsgewebe und Ausdehnung der Erkrankung zum Zeitpunkt der Diagnosestellung. Insbesondere systemisch metastasierte Tumoren, für die eine kurative chirurgische Resektion als Therapie ausscheidet, sind mit einer schlechten Prognose verknüpft und können oftmals nur noch palliativ behandelt werden.

Das Hauptproblem derzeitiger systemischer Krebstherapien liegt in ihrer fehlenden Selektivität. Sowohl Zytostatika als auch ionisierende Strahlung ziehen alle Organsysteme, die natürlicherweise eine hohe Zellteilungsrate aufweisen, wie Knochenmark, Haut und Schleimhäute, dosisabhängig in Mitleidenschaft. Je besser die Wirksamkeit auf die Tumorzellen, desto höher ist entsprechend das Nebenwirkungspotential. Im Rahmen der onkologischen Forschung wird deshalb verstärkt nach so genannten zielgerichteten Therapien („targeted therapies“) gesucht. Hierbei sollen selektive zelluläre Merkmale des Tumor- gewebes als Zielstruktur einer für gesunde Körperzellen relativ unbedenklichen Therapie herangezogen werden [2]. Für einige Tumorentitäten existieren bereits solche maß- geschneiderten Therapien, die in Kombination mit bzw. im Anschluss an eine Chemo- und ggf. Radiotherapie eingesetzt werden können. Meist ist eine vermehrte oder ausschließliche Expression bestimmter Moleküle auf den Tumorzellen Voraussetzung für eine erfolgreiche Therapie. Ein Beispiel stellt Trastuzumab als Antikörper gegen den Her2/neu-Rezeptor dar, welcher bei bestimmten Formen des Mammakarzinoms überexprimiert wird [3]. Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, welche in aller Regel Tyrosinkinase-Aktivität besitzen, bieten sich

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hierbei als besonders geeignete molekulare Angriffspunkte an, weil auf diesem Wege die Stimulation der Tumorzellen zur Teilung gebremst oder aufgehoben werden kann [4]. Der Einsatz von Antikörpern gegen den Wachstumsfaktor VEGF bzw. die Blockierung seines Rezeptors ist mittlerweile Bestandteil einer Reihe von Therapiekonzepten gegen Lungen-, Nieren- und Darmtumore. Es kommt zur Inhibition der Angiogenese, welche für schnell wachsende solide Tumore essentiell ist [5]. Die grundsätzliche Limitation der targeted therapies besteht bislang darin, dass sie meist nur zu einer Verlängerung des progressions- freien Intervalls im Rahmen der Erkrankung führen. Sie sind kaum in der Lage, den Tumor in seiner Gesamtheit zu eliminieren. Dennoch hat die Kombination der neuen Strategien mit bewährten Standardtherapien (Operation, Chemo- und Radiotherapie) zu einer signifikanten Verlängerung der Überlebenszeit bei einer Reihe von Tumorentitäten geführt [6]. Im Gegensatz dazu handelt es sich bei der onkolytischen Virotherapie (siehe 1.2.1) um einen möglicherweise kurativen Ansatz auch für fortgeschrittene Tumorerkrankungen. Das Virus stellt hierbei selbst das therapeutische Agens dar und zerstört die befallenen Zellen direkt.

Diese derzeit noch überwiegend in Studien angewandte Methode [7] verfügt über das Potential, effizient und zielgerichtet Tumore zu eradizieren, wofür es ein maßgebliches Ziel ist, Viren mit günstigem Wirkungs- und Sicherheitsprofil zu generieren.

1.1.2 Molekulare Mechanismen der Tumorentstehung

Allen malignen Erkrankungen ist gemeinsam, dass es über die Akkumulation von Mutationen in der DNA letztlich zum Verlust der normalen Zellzyklus-Kontrolle kommt und infolge dessen ein ungebremstes Zellwachstum stattfinden kann. Von einigen Proteinen ist bekannt, dass diese im Rahmen der Karzinogenese überdurchschnittlich häufig von Mutationen und Dysregulationen betroffen sind, da sie Schlüsselfunktionen in der Zellzyklus-Kontrolle einnehmen. Entsprechende Gene werden in Protoonkogene und Tumorsuppressorgene unterteilt [8]. Protoonkogene codieren für Proteine, die an promitotischen Signalwegen beteiligt sind, z.B. Ras [9]. Eine Mutation in solchen Genen führt über erhöhte Expression, größere Stabilität, verändertes Bindungsverhalten oder konstitutive Aktivierung des entsprechenden Proteins zu einer verstärkten Stimulation der Zellteilung. Tumorsuppressor- gene codieren für Proteine, die an den Kontrollpunkten des Zellzyklus, an antimitotischen Signalwegen oder Apoptose-Schaltstellen beteiligt sind (z.B. p53, Rb). Die Modifikation dieser Gene führt zum Verlust wichtiger Kontrollfunktionen der Zelle wie z.B. der Inaktivierung der Apoptose, wodurch sich die Zelle trotz geschädigter DNA teilen kann [10].

Veränderungen der DNA treten in Körperzellen regelmäßig als spontane oder exogen

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induzierte Mutationen bzw. Replikationsfehler auf, wobei nur ein geringer Anteil der auftretenden Alterationen überhaupt biologisch relevante Veränderungen bewirkt. Normaler- weise werden DNA-Schäden in Körperzellen rasch erkannt und beseitigt. Zellen verfügen über Reparaturmechanismen für einzelne alterierte Basen, Einzelstrangschäden sowie Doppelstrangbrüche [11]. Um sicher zu gehen, dass eine Zelle mit beschädigtem Genom sich nicht weiter teilt, gibt es zudem im Zellzyklus eine Reihe von Kontrollpunkten. Zunächst hängt der Eintritt einer Zelle in die S-Phase (Verdopplung der DNA, Synthese von DNA- assoziierten Proteinen) davon ab, dass eine ausreichende Stimulation durch externe Wachstumsfaktoren erfolgt. Diese Wachstumsfaktoren können an entsprechende Rezeptoren auf der Zellmembran binden, welche meist intrazellulär als Tyrosinkinasen fungieren. Die wichtigste Zielstruktur dieser Kinasen ist das Ras-Protein, welches eine Schlüsselrolle bei der Initiation der S-Phase besitzt. 30 % aller humanen Tumore weisen Veränderungen des Ras- Signalweges auf, worüber permanent Teilungssignale an den Zellkern gesendet werden [12].

Bevor es zum Übergang in die S-Phase kommt, muss eine Zelle den so genannten G1- Checkpoint passieren. Hierbei spielt das Retinoblastoma-Protein (Rb), welches im Zellkern vorliegt, eine zentrale Rolle [13]. In unphosphoryliertem Zustand ist es an den E2- Transkriptionsfaktor (E2F) gebunden. Rb dient als Zielstruktur einer Reihe von antimitoti- schen Signalwegen, welche über Proliferationsstopp-Faktoren aktiviert werden (z.B. TGF-β).

Überwiegen jedoch die promitotischen Signale wie z.B. Wachstumsfaktoren, die zur Bildung von Cyclin/ CDK-Komplexen führen, wird Rb schrittweise phosphoryliert. Schließlich kommt es zur Freisetzung von E2F, was über die Expression entsprechender Proteine den Eintritt in die S-Phase initiiert. In malignen Tumoren ist Rb in der Regel deletiert, mutiert oder liegt in funktionell inaktivierter Form vor [14].

Als Schlüsselprotein der G2-Phase im Anschluss an die S-Phase fungiert der tetramere Transkriptionsfaktor p53, welcher gleichzeitig als allgemeiner Stresssensor wirkt [15]. Seine Konzentration wird streng reguliert, indem er, markiert durch die Ubiquitin-Ligase Mdm2, normalerweise einer schnellen proteasomalen Degradation zugeführt wird. Die Phosphory- lierung von p53 und Mdm2 über verschiedene, durch zelluläre Stressfaktoren aktivierte Kinasen führt zur Dissoziation des Komplexes, wodurch sich die Menge an p53 innerhalb kürzester Zeit um ein Vielfaches erhöht. Auslöser können z.B. DNA-Schäden, Hypoxie, virale Infektionen oder der Verlust von Zell-Zell-Kontakten, aber auch eine abnormale promitotische Stimulation darstellen. p53 bewirkt zunächst einen Zellzyklus-Arrest.

Anschließend versuchen zelluläre Reparaturmechanismen, die vorhandenen Schäden zu beheben. Gelingt dies nicht, weil beispielsweise die Schädigung der DNA zu schwerwiegend

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ist, wird – ebenfalls über p53 vermittelt – der programmierte Zelltod eingeleitet. Wichtige Funktionen als Transkriptionsfaktor erfüllt p53 außerdem im Zusammenhang mit der terminalen Ausdifferenzierung von Gewebe sowie dem Übergang einer Zelle in die G0-Phase (Wachstumsarrest) [16]. Häufig führen Mutationen in diesem Gen zur Expression eines Proteins mit defekter DNA-Bindedomäne, wodurch es nicht mehr an die spezifischen Zielstrukturen des normalen p53-Proteins auf der DNA, insbesondere Promotorbereiche, binden kann. Zusätzlich kann bei dominant-negativen Mutanten noch funktionsfähiges p53 durch das veränderte Protein inaktiviert werden. p53-Mutanten akquirieren außerdem häufig neue, onkogene Fähigkeiten (gain-of-function-hypothesis), welche sich auf Wachstums- geschwindigkeit, Metastasierungspotenzial und Resistenz des Tumors gegenüber Chemo- therapeutika auswirken können [17]. Das für p53 codierende Gen ist in über 50 % aller soliden Tumore mutiert, deletiert, durch epigenetische Modifikation funktionell inaktiviert oder das Protein wird, beispielsweise infolge einer verstärkten Expression von Mdm2, beschleunigt abgebaut. All diese Veränderungen sind mit einer schlechteren Prognose bezüglich des Ansprechens auf etablierte Standardtherapien assoziiert [18, 19]. Hieraus resultiert, dass p53 einen besonders geeigneten molekularen Marker zur Unterscheidung zwischen gesunder und maligner Zelle dar stellt. Die Resistenz gegenüber konventionellen Behandlungsschemata wirft eine zusätzliche klinische Dringlichkeit in Bezug auf die Entwicklung einer gezielten Therapie für p53-dysfunktionale Tumore auf.

Einzelne Mutationen können in Anbetracht der komplexen zellulären Kontrollsysteme nicht zur Entstehung eines malignen Tumors führen. Vielmehr muss eine Zelle nach und nach ein umfangreiches Spektrum an Eigenschaften erwerben, was erst über die Alterierung verschiedener Signalwege möglich wird [20]. Hierzu zählen der Erwerb einer gesteigerten Empfindlichkeit bzw. Unabhängigkeit gegenüber Wachstumsfaktoren, Resistenz gegenüber Zellzyklusarrest- sowie Apoptose-Signalen, Förderung der Angiogenese zur Versorgung des wachsenden Tumors, Erwerb unbegrenzter Teilungsfähigkeit und Herauslösung aus dem Zellverband mit Absiedelung von Tochtergeschwüren (Metastasierung) [21]. Zudem besteht ein Tumor nicht nur aus entarteten Zellen, sondern rekrutiert über para- und endokrine Signale eine Reihe von Zelltypen wie Fibroblasten und Endothelzellen, mit deren Hilfe er eine eigene Architektur ausbildet [22]. Veränderungen der Rezeptorexpression der extrazellulären Matrix (ECM) sowie die Alteration von Zell-Zell-Kontakten zwischen Tumorzellen und ECM spielen eine wichtige Rolle im Hinblick auf Migrations- und Teilungsfähigkeit der Tumorzellen [23]. Für den Erwerb unbegrenzter Teilungsfähigkeit ist in erster Linie die Reaktivierung des in Körperzellen normalerweise stillgelegten Telomerase-

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Gens verantwortlich. Unter physiologischen Bedingungen wird es nur in Keimzellen, Stammzellen und proliferierenden Lymphozyten transkribiert. Während sich Zellen ohne Telomerase-Aktivität 40-60 Mal teilen können (Hayflick-Grenze [24]), bevor es zum Verlust genetischer Information an den chromosomalen Enden kommt, ermöglicht die Telomerase durch Verlängerung der Enden eine nahezu unbegrenzte Teilungskapazität. In über 90 % aller humanen soliden Tumore findet sich Telomerase-Aktivität [25].

1.2 Onkolytische Virotherapie

Der Einsatz von Viren als Vektoren für eine gezielte antineoplastische Therapie bietet strategische Vorteile gegenüber konventionellen Therapien. Konditionell, d.h. in diesem Falle tumorspezifisch replizierende Viren ermöglichen im Vergleich zu Chemotherapie und Radiatio eine bessere Schonung gesunder Zellen aufgrund ihrer im Idealfall hohen Selektivität für entartetes Gewebe. Weiterhin resultiert die Replikation des Virus in der direkten Zerstörung der Wirtszelle, wobei neue virale Partikel in situ freigesetzt werden.

Somit multipliziert sich die Wirkung der Therapie in Abhängigkeit von der Anzahl der befallenen Zellen, was bei selektiv replizierenden Viren zumindest vorübergehend einen maximalen Effekt im Bereich der größten Tumormasse bedeuten sollte. Dieser wird allerdings durch intratumorale Barrieren [26], Abtransport der freigesetzten Viren über die Blutbahn, Komplexierung zirkulierender Viren durch Bindung des Blutgerinnungsfaktors X an das adenovirale Hexon-Epitop [27], sowie die einsetzende Immunantwort gegen das Virus limitiert [28]. Eine Vielzahl verschiedener Viren, darunter Herpes-, Parvo-, Influenza-, Masern-, Retro- und Rhabdoviren werden aktuell im Rahmen experimenteller Ansätze genutzt [29]. Auch Adenoviren werden bereits seit einiger Zeit als Vektor für targeted therapies eingesetzt. Die besondere Eignung von Adenoviren für virotherapeutische Konzepte beruht auf der relativen Sicherheit etablierter Konstrukte [30, 31, 32], der einfachen Handhabung bzgl. Konstruktion und Propagation sowie ihrer hohen Transduktions- und lytischen Effizienz [33].

1.2.1 Adenoviren

Adenoviren vom Serotyp 5 gehören zu den humanpathogenen Adenoviren (Mastadenoviri- dae), von denen mittlerweile über 50 Subtypen bekannt sind. Adenoviren (Abb. 1.1) weisen eine ikosaedrische Struktur mit angelagerten fiber-Proteinen auf, sind unbehüllt und besitzen ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom zwischen 26 und 45 kb (Typ 5: 36 kb), welches an beiden Enden von repetitiven Sequenzen, den sogenannten ITR (inverted terminal repeats)

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flankiert wird. Beim Menschen sind sie in der Regel für harmlose Atemwegsinfektionen verantwortlich, die Zahl der okkulten Infektionen ist hoch. Einige Subtypen können auch Auslöser einer Keratokonjunktivitis oder Gastroenteritis sein. Wirklich bedrohlich sind adenovirale Infektionen allerdings für immunkompromittierte Patienten; hier kann es zur Ausbildung von häufig letalen Pneumonien, Bronchitiden und Hepatitiden kommen [34].

Adenoviren benötigen für ihren Replikationszyklus von der Rezeptorbindung bis zur ersten Freisetzung neuer Viruspartikel ungefähr 35 Stunden. Die Infektion der Wirtszelle erfolgt beim in dieser Arbeit verwendeten humanen Subtyp 5 über die Anlagerung des adenoviralen fiber-Proteins an den CAR-Rezeptor (Coxsackievirus-Adenovirus-Rezeptor). Hierbei handelt es sich um einen Bestandteil von tight junctions, der von einer Vielzahl verschiedener epithelialer Gewebetypen mit Ausnahme von Stammzellen und Keimzellen exprimiert wird [35]. Durch Bindung des adenoviralen Penton-Proteins an Integrine kommt es zur Endozytose des Viruspartikels [36], zur Freisetzung ins Zytoplasma und zum Transport der viralen DNA in den Zellkern. Es gibt Hinweise, dass eine Infektion CAR-negativer Zellen über verschiede- ne andere Wege auch möglich ist, jedoch scheint dies weniger effektiv zu sein als die CAR- vermittelte Aufnahme in die Zelle und ist bislang nicht vollständig untersucht [37]. Eine Reihe von Tumorentitäten weist eine verminderte CAR-Expression auf, was zur Instabilität von Zell-Zell-Kontakten führt und somit die metastatische Absiedlung von Tumorzellen erleichtert [38].

fiber-spike

lineares ds-DNA-Genom

core-Proteine

terminales Protein Penton-Kapsomer

Hexon-Kapsomer

Abb. 1.1: Schematische Darstellung eines Adenovirus-Partikels.

Die adenovirale Genexpression wird in eine frühe und eine späte Phase unterteilt. In der frühen Phase erfolgt die Transkription der E-Gene („early“ Gene) E1-E4. Es handelt sich hierbei um regulatorische Proteine, welche die Wirtszelle transformieren. Das erste Protein,

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welches exprimiert wird, ist E1A. Es bindet unter anderem an Rb, wodurch es zur Freisetzung von E2F kommt (s. 1.1.2), und initiiert damit den Eintritt der Zelle in die S-Phase. E1B-19k lagert sich an die aktivierte Form der zellulären Proteine BAK und BAX an und verhindert so die Aktivierung von Caspasen, welche zur Apoptose der Wirtszelle führen würde [39]. E1B- 55k bindet an p53 und trägt unter anderem über die Rekrutierung des E4orf6-Komplexes, welcher als Ubiquitin-Ligase fungiert, zur Degradation von p53 bei. Über diese Mechanismen verhindert das Virus die Apoptose der Wirtszelle, die normalerweise als Reaktion auf die virale Invasion eingeleitet würde. E1B-55k stellt zusätzlich (in Zusammenarbeit mit E4) einen wichtigen Faktor für die korrekte Synthese der späten viralen Proteine dar, bei denen es sich hauptsächlich um Strukturproteine handelt. E2 erfüllt Funktionen im Zusammenhang mit der Replikation der viralen DNA [40], während E3 an der Umgehung der T-Zell-vermittelten Immunantwort beteiligt ist [41].

1.2.2 Selektivitäts-Mechanismen

Zunächst stellt die Fähigkeit von Adenoviren, ein breites Spektrum an Zellen infizieren zu können, einen prinzipiellen Vorteil für ihre Nutzung als therapeutische Vektoren dar, denn sie kommen damit als therapeutischer Vektor für eine Vielzahl von Tumorentitäten in Frage.

Um mit ausreichender Unbedenklichkeit eingesetzt werden zu können, sollten sie jedoch möglichst selektiv nur entartetes Gewebe zerstören und für gesunde Zellen weitgehend unschädlich sein. Um diesem Ziel näher zu kommen, können verschiedene Ansätze verfolgt werden.

Die Strategie des transductional targeting beruht darauf, die Infizierbarkeit von Zellen durch das therapeutische Virus an einen bestimmten molekularen Oberflächenmarker zu koppeln.

Bei Tumorzellen, die einen spezifischen Marker exprimieren, lässt sich durch Ausstattung des Virus mit einer entsprechenden Adapterfunktion eine hohe Selektivität auf der Ebene der Infektion erreichen [42]. Beim transcriptional targeting hingegen wird das primäre Infektionsspektrum des Virus, d.h. die Infizierbarkeit von Tumorzellen, in Relation zu gesunden Zellen nicht verändert. Stattdessen wird das Replikationsverhalten der Viren moduliert. Hierfür sind intrazelluläre molekulare Marker als Aktivatoren konditionell transkribierbarer DNA-Abschnitte des Virus ausschlaggebend [43]. Je nach Art der integrierten Regulation kann hierüber eine Replikationsblockade des Virus unter Schonung gesunder Wirtszellen (rescue-Mechanismus) oder auch eine Verstärkung der Replikation mit konsekutiver Lyse transformierter Wirtszellen (feed-forward-Mechanismus) erreicht werden.

Der erste Bericht über ein tumorselektiv replikationsfähiges onkolytisches Adenovirus wurde

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1996 publiziert. Bei Onyx-015 handelt es sich um eine E1B-55k-deletierte Adenovirus- Mutante, von der postuliert wurde, sie sei aufgrund ihrer fehlenden Fähigkeit, p53 auszu- schalten, nur in p53-dysfunktionalen Zellen replikationsfähig [44]. Die Stringenz dieser Selektivität wurde mehrfach angezweifelt bzw. widerlegt [45]. Dennoch wurden einige klinische Studien durchgeführt, in denen Onyx-015 allein oder in Kombination mit etablierten Therapien an Patienten getestet wurde [46]. Das Virus H101, welches mit Onyx-015 funktionsidentisch ist und sich nur im Bereich der E3-Region unwesentlich von diesem unterscheidet, erhielt 2005 als erstes therapeutisches Virus eine Zulassung für die Behandlung von Kopf-Hals-Tumoren in China [47].

Ein anderer Selektivitäts-Ansatz besteht darin, die Expression der frühen viralen Proteine, welche für die Initiation des viralen Vermehrungszyklus entscheidend sind, unter die Kontrolle eines tumorspezifisch aktivierbaren Promotors zu stellen. Hierzu wurde beispiels- weise der Promotor, welcher die Transkription der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase reguliert (hTert: humane Telomerase-reverse Transkriptase), als Promotor für den E1A-Genlokus eingesetzt. Ausgehend von der Tatsache, dass die meisten malignen Tumoren Telomerase exprimieren, die Mehrheit der gesunden Körperzellen aber nicht (s. 1.1.2), sollte eine selektive Replikation der Viren im Tumorgewebe erreicht werden. Zumindest bei niedriger Infektionsdosis konnte eine im Vergleich zu Onyx-015 erhöhte Selektivität für Tumorgewebe gezeigt werden [48]. Weiterhin wurden andere tumorspezifische Promotoren wie der E2F-1-Promotor, der PSA-Promotor, der CEA-Promotor, der AFP-Promotor und hypoxie-responsive Elemente experimentell erprobt [49].

Im Rahmen der bisherigen Arbeiten der Arbeitsgruppe Kubicka/ Kühnel wurde das Prinzip der p53-abhängigen transkriptionellen E1A-Repression durch Gal4-KRAB etabliert. Bei Gal4-KRAB handelt es sich um ein Fusionsprotein, bestehend aus der DNA-bindenden Domäne des Hefe-Transkriptionsfaktors Gal4, welche an spezifische Zielsequenzen bindet [50], und einer KRAB-Domäne (Krüppel-associated box), einem Motiv aus Zinkfinger- Proteinen, welches bei Bindung an DNA als starker transkriptioneller Repressor fungiert [51].

Die Kombination der beiden Motive ergibt ein hoch effektives silencing-Element mit Bindungsspezifität für die entsprechenden Gal4-Bindesequenzen [52]. Das Virus Ad-p53- Sensor enthält eine regulatorische Kassette, welche aus dem transkriptionellen Repressor- Fusionsprotein Gal4-KRAB unter der Kontrolle von prMin-RGC, einem p53-abhängig aktivierbaren Promotor, besteht [53]. Mithilfe dieses Regulationsweges konnte eine erhöhte Selektivität der Viren für p53-dysfunktionale Zellen erreicht werden [54].

9 1.2.3 I-Sce I und DNA-Reparatur

Ein wesentlicher Nachteil aller bis hierher beschriebenen Mechanismen liegt darin, dass sie lediglich zu einer Attenuierung bzw. im besten Fall zu einer deutlichen Inhibition der Virusreplikation in nicht-transformierten Zellen führen. Die adenovirale DNA befindet sich jedoch weiterhin in intaktem Zustand in der Zelle. Prinzipiell ist eine Reaktivierung transkriptionell inaktiver Bereiche durch Veränderung der Bedingungen innerhalb der Zelle oder äußere Stimuli jederzeit möglich [55]. Zudem besteht selbst bei spezifisch aktivierbaren Promotoren das Problem der leakiness, woraus eine basale Aktivität des Promotors und somit über einen längeren Zeitraum eine Akkumulation darüber kontrollierter Proteine, in diesem Falle E1A, resultieren kann [56]. Wird hierbei ein kritisches E1A-Niveau erreicht, kann eine Selbstverstärkungsschleife der Replikation unter Umgehung der Regulationsmechanismen die Folge sein [57].

Ein neuartiges Konzept zur direkten Destruktion viraler DNA stellt der Einsatz von Restriktionsenzymen mit definierter, nur an bekannter Stelle innerhalb des viralen Genoms vorkommender Erkennungssequenz dar. Sehr spezifische Nukleasen sind beispielsweise Zinkfinger-Nukleasen, welche durch Fusion der katalytischen Domäne des Restriktionsen- zyms Fok I (Fn) und eines als Ligand für die gewünschte Zielsequenz modifizierten Zinkfinger-Proteins generiert werden können [58], und Meganukleasen, die DNA- Erkennungs- und Restriktionsaktivität in einem Molekül vereinen [59]. Als bekanntes Beispiel unter den Meganukleasen gilt I-Sce I. Hierbei handelt es sich um ein Intron- codiertes Enzym aus der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae), welches an seiner spezifischen, 18 bp langen Erkennungssequenz einen DNA-Doppelstrangschnitt setzt (Abb.

1.2). Diese Sequenz taucht, statistisch gesehen, alle 4¹⁸ (≈ 69 Mrd.) Basenpaare auf, was ein zufälliges Vorkommen innerhalb des humanen Genoms sehr unwahrscheinlich macht [60].

Aufgrund dieser Spezifität ist I-Sce I in einer Reihe von Experimenten zur Generierung definierter ds-DNA-Brüche eingesetzt worden [61, 62].

Abb. 1.2: I-Sce I-Erkennungssequenz [63]. Die Pfeile kennzeichnen die enzymatisch induzierten DNA-Einzelstrangbrüche. Es resultiert ein Doppelstrangbruch unter Belassung von Einzelstrang-DNA- Überhängen (sticky ends) an beiden Fragmenten.

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Intrazelluläre ds-DNA-Brüche können durch zelluläre Reparaturmechanismen auf zwei Arten beseitigt werden. Entweder erfolgt die Reparatur anhand der Vorlage einer anderen Plasmidkopie (homology-directed repair), was insbesondere für gentherapeutische Ansätze interessant ist, da auf diese Weise fehlerhafte Gensequenzen durch Integration artifiziell eingebrachter DNA-Abschnitte korrigiert werden können [64]. Alternativ kommt es zur Zusammenfügung zweier offener DNA-Doppelstrang-Enden. Dieser Vorgang wird als non- homologous end joining (NHEJ) bezeichnet. Hierbei können verschiedene Endkonfiguratio- nen auftreten. Nach Restriktion einer einzelnen I-Sce I-Schnittstelle kommt es in etwa der Hälfte der Fälle zur direkten Religation der Schnittstelle, welche weiterhin funktionell bleibt.

Im Falle nicht-komplementärer Überhänge, welche nach Exzision eines von Schnittstellen flankierten DNA-Fragmentes auftreten, resultiert eine Destruktion der I-Sce I- Erkennungssequenz durch Deletion oder Insertion von Basenpaaren [65]. Das herausgelöste Fragment zwischen den beiden Schnittstellen wird dabei meist nicht wieder ins ursprüngliche Genom eingebaut. Um auch die beiden freien DNA-Enden des exzidierten Bezirkes zu beseitigen, kann es auf diese Weise zur Zirkularisierung des freien Fragmentes kommen [66].

Im Rahmen von Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass sowohl die I-Sce I-vermittelte DNA-Restriktion als auch die Reparatur in vitro effektiv stattfinden (proof of principle).

1.3 Verbindungssequenzen zur Expression mehrerer Proteine unter der Kontrolle desselben Promotors

Bei der Generierung multimodal regulierter Adenoviren erscheint es aus verschiedenen Gründen sinnvoll, mehrere regulatorische Gene unter die Kontrolle desselben Promotors zu stellen. Zum einen ermöglicht dies die Einsparung von Promotorbereichen, was insofern anzustreben ist, als sich Effizienz der viralen Replikation und Stabilität der entstehenden Virionen verändern, je weiter die Größe des Genoms von der Wildtyp-adenoviralen Genomgröße abweicht [67]. Zum anderen lässt sich bei Verwendung verschiedener Promotoren nur schwer eine balancierte oder zumindest quantitativ ähnliche Expression der darüber kontrollierten regulatorischen Proteine erreichen. Insbesondere die Transkriptionsrate unter in vivo-Bedingungen kann in Abhängigkeit von Umgebungsvariablen stark differieren.

Weiterhin können sich die Promotoren benachbarter Gene z.B. durch Konkurrenz um gleiche Transkriptionsfaktoren gegenseitig inhibieren, ein Phänomen, das als Promotorinterferenz bezeichnet wird [68]. Die gleichzeitige Initiation mehrerer Regulationsmechanismen über den gleichen Promotor führt hingegen zu einer ausgewogeneren und effektiveren Regulation und sollte somit die Selektivität des Virus steigern. Die hierfür denkbare Alternative der mehrfachen Verwendung des gleichen Promotors birgt hingegen das Risiko einer Rekombina-

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tion der homologen Bereiche, wobei eine Deletion von für die Regulation essentiellen Zwischenabschnitten auftreten kann [69].

1.3.1 IRES-Sequenzen

IRES-Sequenzen (IRES: internal ribosome entry site) werden schon länger als transkriptio- nelles Steuerelement bei der Konstruktion von Vektorsystemen verwendet. Sie wurden erstmals im Genom von Picornaviren gefunden [70]. Diese zwischen 600 und 1200 bp langen Sequenzen fungieren als Anlagerungspunkt für Ribosomen und ermöglichen somit die Translation von mRNA. Dies geschieht unabhängig von einer Cap-Struktur, welche für die Translation eukaryotischer mRNA normalerweise erforderlich ist. Mittlerweile wird aber davon ausgegangen, dass auch bis zu 10 % aller eukaryotischen mRNA-Stränge solche alternativen Translationsstartpunkte besitzen, vor allem Transkripte von Genen, welche mit Zellwachstum und Zelltod assoziiert sind, wie beispielsweise das Myc-Gen [71]. Die mRNA bildet im Bereich der IRES ein Motiv aus, welches vom Translations-Initiationskomplex erkannt wird, woraufhin es zur Bindung der ribosomalen Untereinheiten und konsekutiver Translation bis zum Stop-Codon kommt (Abb. 1.3). Problematisch dabei ist, dass sich die Expression der beiden mittels IRES verbundenen Gene quantitativ stark unterscheiden kann, wobei eine Reihe von Faktoren wie z.B. Zelltyp und zellulärer Stress eine Rolle spielen, worunter insbesondere die Translation des nachgeschalteten Proteins leiden kann [72].

Gen 1 Gen 2

CAP

poly A

mRNA

Protein

Protein 1 Protein 2

40 S

60 S

Ω

60 S

40 S IRES

Abb. 1.3: Funktionsweise von IRES-Sequenzen. Unabhängig von der Translation am 5’-Ende (Cap- Struktur) der mRNA können Ribosomen das IRES-Motiv als Einstiegspunkt zur Proteinsynthese verwenden. Die Mengen der entstehenden Proteine sind quantitativ nicht äquivalent.

1.3.2 2A-Sequenzen

Ein neueres Konzept stellen die ebenfalls zunächst im Genom von Picornaviren entdeckten 2A-Sequenzen dar [73]. Dabei handelt es sich um kurze, 50-70 bp umfassende Bereiche. Sie enthalten als gemeinsames Erkennungsmotiv die Aminosäure-Abfolge Asp - Val/ Ile – Glu –

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X – Asn – Pro – Gly – Pro. Zunächst wird hierbei eine bi- oder polycistronische mRNA vom Start-Codon aus translatiert, als Bindestelle für das Ribosom dient die Cap-Struktur bzw. bei den Picornaviridae das IRES-Motiv. Nach Fertigstellung des ersten Proteins – an welches sich kein Stop-Codon anschließt – wird die 2A-Verbindungssequenz bis zum Erreichen des Erkennungsmotivs translatiert. Zwischen Glycin und dem terminalen Prolin kommt es zur Interaktion mit dem Peptidyltransferase-Zentrum des Ribosoms, wodurch die Entstehung einer Peptidbindung verhindert wird. Der bereits synthetisierte Abschnitt dissoziiert, ohne jedoch die Translation der nachfolgenden mRNA-Bereiche zu inhibieren. Die translatierte 2A-Sequenz verbleibt als Anhang am zuerst synthetisierten Protein, mit Ausnahme des terminalen Prolins, welches das N-terminale Ende des zweiten Proteins bildet (Abb. 1.4) [74].

Im Unterschied zu den IRES-Sequenzen existieren hier also nicht mehrere Startpunkte für die Translation. Beim Ablesen kommt es in der überwiegenden Anzahl der Fälle zur Übersetzung der gesamten mRNA unter Herstellung aller auf dem Transkript codierten Proteine, woraus zumeist quantitativ äquivalente Mengen der verbundenen Proteine resultieren [75]. In Abhängigkeit von der jeweiligen 2A-Sequenz kann jedoch auch hier eine quantitative Differenz auftreten im Sinne einer Favorisierung des ersten Proteins mit Translationsstop nach Synthese der 2A-Sequenz [76].

poly A

Gen 1 Gen 2

CAP 2A

60 S

40 S

mRNA

Protein

Protein 1 2A Protein 2

Abb. 1.4: Funktionsweise von 2A-Sequenzen. Die Proteinsynthese beginnt immer am 5’-Ende (Cap-Struktur) der mRNA. Im Bereich der Erkennungssequenz kommt es zur Interaktion mit dem aktiven Zentrum des Ribosoms, wodurch sich das zuerst synthetisierte Protein mit translatiertem 2A- Anhang ablöst. Die Synthese des zweiten Proteins (mit vorgeschalteter letzter Aminosäure des 2A- Bereiches) läuft je nach 2A-Sequenz in unterschiedlichem Ausmaß ab. Es entstehen vergleichbare Mengen der beiden verbundenen Proteine, sofern die verwendete 2A-Sequenz nicht zum Synthese- Abbruch im Anschluss an den 2A-Bereich prädisponiert. In letzterem Fall überwiegt quantitativ die Expression des vorgeschalteten Proteins.

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II. Zielsetzung des Projektes

Im Rahmen dieser Arbeit sollten multimodal regulierte Adenoviren zur Therapie p53-dysfunktionaler Tumore generiert werden. Der Fokus lag dabei auf einer Erhöhung der

p53-Selektivität der Viren, um eine Optimierung der onkolytischen Effizienz bei gleichzeiti- ger Reduktion der Nebenwirkungen in gesunden Zellen zu erreichen.

Die Generierung der regulatorischen Kassette zum Einbau in adenovirale Vektoren stellte den ersten Teil dieses Projektes dar. Unter der Kontrolle des p53-abhängigen Promotors prMin- RGC sollten die Sequenzen für Gal4-KRAB (Prinzip der transkriptionellen Repression des E1A-Lokus) und I-Sce I (Prinzip der Selbstinaktivierung durch gezielte enzymatische DNA- Destruktion) hintereinander geschaltet werden. Um die Verbindungssequenz mit dem günstigsten Profil bezüglich einer balancierten Expression der beiden Proteine zu identifizieren, sollten hierfür mehrere 2A-Sequenzen mit einem etablierten IRES-Konstrukt verglichen werden.

Weiterhin sollten zwei I-Sce I-Schnittstellen an geeigneter Position in die Region der frühen viralen Gene inseriert werden, wofür als Ausgangsvektor ein Konstrukt mit deletierter Rb- Bindedomäne, E1A∆24, verwendet wurde. Die Schnittstellen sollten so platziert werden, dass es durch Exzision des flankierten Fragmentes zum Verlust der N-terminalen Hälfte des E1A- Gens kommen würde. Aufgrund der Bedeutung der N-terminalen E1A-Hälfte für die zelluläre Transformation entstünde so nach Reparatur des viralen Genoms unter Verlust des herausgelösten Bezirkes ein in gesunden Zellen replikationsdefizientes Virus.

Im zweiten Teil der Arbeit sollten zwei verschiedene Virus-Konstrukte aufgebaut werden, welche sich hinsichtlich ihres der E1A-Region vorgeschalteten Promotors unterschieden. Für das erste Virus-Konstrukt sollte ein trunkierter CMV230-Promotor, für das zweite ein modifizierter hTert-Promotor eingesetzt werden (analog Wirth et al. 2003 [48]). Beide Promotoren sollten mit Gal4-KRAB-Bindestellen flankiert werden, um eine entsprechende transkriptionelle Repression zu ermöglichen. Zusätzlich sollten zur isolierten Testung des Effektes der I-Sce I-Restriktion Kontrollviren generiert werden, welche an der Position des I-Sce I-Gens das Gen für GFP enthielten.

Im letzten Teil der Arbeit sollten die auf diese Weise generierten Adenoviren hinsichtlich ihrer p53-Selektivität und ihrer onkolytischen Effizienz in Zellen mit unterschiedlichem p53-Status charakterisiert werden.

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III. Materialien und Methoden 3.1. Materialien

3.1.1 Eukaryotische Zelllinien

Zelllinie Quelle Beschreibung

A549 ATCC (CCL-185) Humane Lungenkarzinom-Zelllinie mit intaktem p53-Status.

HepG2 ATCC (HB-8065) Hochdifferenzierte humane Hepatom-Zelllinie mit intaktem p53-Status.

Huh-7 Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)

Humane Hepatom-Zelllinie, welche eine trans- kriptionell inaktive p53-Mutante exprimiert (220 C).

H1299 ATCC (CRL-5803) Humane nicht-kleinzellige Lungenkarzinom- Zelllinie mit homozygoter p53-Deletion.

HEK-293 ATCC (CRL-1573) Humane embryonale Nierenkarzinom-Zelllinie mit genetisch intaktem p53-Status. Die adeno- virale E1A-E1B-Region ist stabil ins Genom integriert, weshalb sich diese Zellen auch zur Anzucht replikationsdefizienter Adenoviren eignen [77]. Durch E1B wird p53 funktionell inaktiviert.

IMR-90 ATCC (CCL-186) Humane Lungenfibroblasten.

3.1.2 Bakterienstämme

Stamm Quelle Beschreibung

JM109 Gibco Modifizierter E.coli-Stamm zur effizienten Ver- mehrung von Plasmiden. Es wurden sowohl chemo- als auch elektrokompetente Bakterien daraus hergestellt.

XL1-blue Stratagene Modifizierter E.coli-Stamm zur Plasmid- vermehrung. Es erfolgte die Verarbeitung zu elektrokompetenten Bakterien.

3.1.3 Plasmide

Plasmid Quelle Beschreibung

pBlueScript (pBS)

Stratagene Klonierungsvektor zur Sequenzierung

generierter PCR-Produkte ausgehend von den Promotoren T3 bzw. T7. Auch als Ausgangs- konstrukt für Expressionsvektoren zur Testung der Proteinexpression und als nonsense-DNA zum quantitativen Ausgleich bei Transfektionen verwendet. Enthält ein Ampicillin-Resistenzgen.

CMV-lacZ Florian Kühnel Vektor mit einem lacZ-Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promotors, verwendet zum Abgleich

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der Transfektionseffizienz mittels β-Gal-Assay.

CMV-GFP Florian Kühnel Vektor mit einem GFP-Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promotors, verwendet als Positiv- kontrolle für fluoreszenzmikroskopische Experimente.

prMin-G4K Florian Kühnel Vektor mit dem Gal4-KRAB-Repressorprotein unter der Kontrolle des prMin-RGC-Promotors.

pAdHM4 Mark A. Kay Plasmidvektor für die Adenovirus-Generierung.

Enthält das Genom des humanen Adenovirus Typ 5 ohne die E1-Region (bp 342-3523 deletiert) und die E3-Region (bp 28133-30818 deletiert).

K92 Thomas Wirth pHM3-basiertes Konstrukt, enthält die adeno- virale E1A-E1B-Region und im Anhang an den E1B-Bereich ein IRES-GFP-Modul.

K92 ∆ IRES- GFP (PS 584)

Peter Schache K92 ohne IRES-GFP-Modul. Vektor zur Konstruktion der regulatorischen Kassette für die späteren Adenoviren.

pRK5.LHA- Sce1

Toni Cathomen (Institut für Virologie, Charité Berlin)

Vektor mit dem Gen für I-Sce I unter der Kontrolle eines CMV-Promotors sowie einem HA-tag.

p1212 Florian Kühnel Vektor mit einem firefly-Luciferase-Gen unter der Kontrolle eines von Gal4-KRAB-

Bindestellen flankierten trunkierten CMV- Promotors (CMV230).

FK 6456 Peter Schache pGL2-Vektor mit einem von invers ange- ordneten I-Sce I-Schnittstellen (forward-

reverse*) flankierten GFP-Gen und einem nach- geschalteten firefly-Luciferase-Gen unter der Kontrolle eines CMV₃₅₀-Promotors.

prMin-Sce (PS 570)

Peter Schache pBS-basierter Vektor mit dem Gen für I-Sce I unter der Kontrolle des prMin-RGC-Promotors und distaler polyA-Sequenz.

IRES-Sce (PS 725)

Peter Schache pBS-basierter Vektor mit den Genen für Gal4- KRAB und I-Sce I, verbunden durch eine IRES, unter der Kontrolle des prMin-RGC-Promotors und mit distaler polyA-Sequenz.

IRES-GFP (PS 3208)

Peter Schache pBS-basierter Vektor mit den Genen für Gal4- KRAB und GFP, verbunden durch eine IRES, unter der Kontrolle des prMin-RGC-Promotors und mit distaler polyA-Sequenz.

PS 3251 Peter Schache pBS-basierter Vektor mit einem von Gal4- KRAB-Bindestellen flankierten CMV₂₃₀-

Promotor und einer 3‘-terminal angefügten I-Sce I-Erkennungssequenz in forward*-Orientierung.

PS 3628 Peter Schache pBS-basierter Vektor mit einem CMV₂₃₀-

Promotor und einer 3‘-terminal angefügten I-Sce I-Erkennungssequenz in forward*-Orientierung.

PS 3399 Peter Schache pBS-basierter Vektor mit einem von Gal4- KRAB-Bindestellen flankierten hTert-Promotor

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und einer 3‘-terminal angefügten I-Sce I- Erkennungssequenz in forward*-Orientierung.

SV40-Ko Florian Kühnel Vektor mit einem Gal4-KRAB-Gen unter der Kontrolle eines SV40-Promotors.

EF1α-Luc Peter Schache Vektor mit einem Renilla-Luciferase-Gen unter der Kontrolle eines EF1α-Promotors.

E1A∆24 Dirk M. Nettelbeck (Universität Heidel- berg)

Vektor mit einem E1A-Gen, dessen Rb-

Bindedomäne (Position 364-387) deletiert wurde.

*I-Sce I-Schittstelle in forward-Orientierung: TAGGGATAACAGGGTAAT

I-Sce I-Schittstelle in reverse-Orientierung: ATTACCCTGTTATCCCTA

3.1.4 Im Rahmen dieser Arbeit klonierte Plasmide

Plasmid Beschreibung prMin-GFP

(AG 86)

pBS-basierter Vektor mit einem GFP-Gen unter der Kontrolle des prMin- RGC-Promotors und polyA-Sequenz.

pB-TAV (AG 356)

pBS-Vektor mit dem Gal4-KRAB-Gen und 3‘-terminal angefügter thosea asigna virus-2A-Sequenz.

pB-PTV (AG 372)

pBS-Vektor mit dem Gal4-KRAB-Gen und 3‘-terminal angefügter porcine Teschovirus-2A-Sequenz.

pB-FMDV (AG 760)

pBS-Vektor mit dem Gal4-KRAB-Gen und 3‘-terminal angefügter foot-and-mouth-disease virus-2A-Sequenz.

TAV-Sce (AG 439)

In prMin-Sce einkloniertes Gal4-KRAB-Gen mit TAV-2A-Anhang:

prMin-RGC – Gal4-KRAB – TAV – I-Sce I – polyA.

PTV-Sce (AG 449)

In prMin-Sce einkloniertes Gal4-KRAB-Gen mit PTV-2A-Anhang:

prMin-RGC – Gal4-KRAB – PTV – I-Sce I – polyA.

FMDV-Sce (AG 803)

In prMin-Sce einkloniertes Gal4-KRAB-Gen mit FMDV-2A-Anhang:

prMin-RGC – Gal4-KRAB – FMDV – I-Sce I – polyA.

TAV-GFP (AG 458)

In prMin-GFP einkloniertes Gal4-KRAB-Gen mit TAV-2A-Anhang:

prMin-RGC – Gal4-KRAB – TAV – GFP – polyA.

PTV-GFP (AG 473)

In prMin-GFP einkloniertes Gal4-KRAB-Gen mit PTV-2A-Anhang:

prMin-RGC – Gal4-KRAB – PTV – GFP – polyA.

FMDV-GFP (AG 824)

In prMin-GFP einkloniertes Gal4-KRAB-Gen mit FMDV-2A-Anhang:

prMin-RGC – Gal4-KRAB – FMDV – GFP – polyA.

AG 206 (E1A-1)

In pBlueScript einklonierte N-terminale Hälfte des E1A-Gens bis zur Rb- Bindedomäne mit 3‘-terminal angefügter I-Sce I-Schnittstelle in forward- Orientierung.

AG 202 (E1A-2)

In pBlueScript einklonierte C-terminale Hälfte des E1A-Gens bis zur Rb- Bindedomäne mit 5‘-terminal angefügter I-Sce I-Schnittstelle in forward- Orientierung.

E1A ∆ 24-Sce (AG 704)

Einklonierung von AG 202 in AG 206: Vektor mit E1A-Gen mit dele- tierter Rb-Bindedomäne und an dieser Stelle eingefügter forward-I-Sce I- Schnittstelle.

AG 910 Einklonierung von E1A ∆24-Sce in K92 ∆ IRES-GFP: Vektor mit adeno- viraler E1A-E1B-Region, wobei im E1A die Rb-Bindedomäne (Position 364-387) deletiert und an dieser Position eine I-Sce I-Schnittstelle in forward-Orientierung eingefügt ist.

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AG 865 CMV230-Promotor mit 3’-terminal angefügter I-Sce I-Schnittstelle in reverse-Orientierung, einkloniert in PS 3251 im Austausch gegen den Promotor mit angefügter forward-I-Sce I-Schnittstelle.

AG 872 hTertTATA-Promotor mit 3’-terminal angefügter I-Sce I-Schnittstelle in reverse-Orientierung, einkloniert in PS 3399 im Austausch gegen den Promotor mit angefügter forward-I-Sce I-Schnittstelle.

AG 977 Einklonierung von AG 865 in AG 910: CMV230-Sce-rev als Promotor 5’-terminal vor E1A∆24-Sce in K92 ∆ IRES-GFP.

AG 979 Einklonierung von AG 872 in AG 910: hTertTATA-Sce-rev als Promotor 5’-terminal vor E1A∆24-Sce in K92 ∆ IRES-GFP.

AG 1065 Einklonierung von AG 449 in AG 977: prMin-RGC – Gal4-KRAB – 2A(PTV) – I-Sce I – polyA/ CMV230-Sce-rev – E1A∆24-Sce in K92 ∆ IRES-GFP. Shuttle-Plasmid für Adenovirus CMV-2A-Sce.

AG 1073 Einklonierung von AG 473 in AG 977: prMin-RGC – Gal4-KRAB – 2A(PTV) – GFP – polyA/ CMV230-Sce-rev – E1A∆24-Sce in K92 ∆ IRES-GFP. Shuttle-Plasmid für Adenovirus CMV-2A-GFP.

AG 1076 Einklonierung von AG 449 in AG 979: prMin-RGC – Gal4-KRAB – 2A(PTV) – I-Sce I – polyA/ hTert_TATA-Sce-rev – E1A∆24-Sce in K92 ∆ IRES-GFP. Shuttle-Plasmid für Adenovirus Tert-2A-Sce.

AG 1092 Einklonierung von AG 473 in AG 979: prMin-RGC – Gal4-KRAB – 2A(PTV) – GFP – polyA/ hTert_TATA-Sce-rev – E1A∆24-Sce in K92 ∆ IRES-GFP. Shuttle-Plasmid für Adenovirus Tert-2A-GFP.

AG 1419 Einklonierung von AG 1065 in pAdHM4: Adenovirus-Plasmid für CMV-2A-Sce.

AG 1505 Einklonierung von AG 1073 in pAdHM4: Adenovirus-Plasmid für CMV-2A-GFP.

AG 1541 Einklonierung von AG 1076 in pAdHM4: Adenovirus-Plasmid für Tert-2A-Sce.

AG 1285 Einklonierung von AG 1092 in pAdHM4: Adenovirus-Plasmid für Tert-2A-GFP.

Klonierungen:

Generierung der prMin-RGC-Kassette:

Die Gal4-KRAB-Sequenzen mit 2A-Anhang wurden mittels Doppel-PCR (s. 3.2.1.3) gene- riert und über Hind III/ Xba I in pBlueScript einkloniert (pB-TAV, pB-PTV, pB-FMDV).

Nach der Sequenzierung erfolgte die Umklonierung in prMin-Sce und prMin-GFP über Nco I/

Stu I (TAV-Sce, PTV-Sce, FMDV-Sce/ TAV-GFP, PTV-GFP, FMDV-GFP). PrMin-GFP (AG 86) wurde zuvor generiert, indem das GFP-Gen aus PS 3208 über Nco I/ Eco R V ausge- schnitten und in prMin-Sce im Austausch gegen das I-Sce I-Gen eingebracht wurde.

Generierung von E1A∆24-Sce:

Die beiden E1A-Fragmente mit vor- bzw. nachgeschalteter I-Sce I-Schnittstelle wurden mittels PCR generiert und über Xho I/ Hind III in pBlueScript einkloniert (E1A-1, E1A-2).

Nach der Sequenzierung erfolgte die Umklonierung von E1A-2 in E1A-1 über I-Sce I/ Hind

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III (E1A∆24-Sce). Nach erneuter Sequenzierung wurde E1A∆24-Sce über Xho I/ Xba I in K92 ∆ IRES-GFP eingebracht (AG 910).

Generierung der Promotoren zur E1A-Kontrolle:

CMV₂₃₀-Sce-rev: Mittels PCR wurde das CMV-I-Sce-rev-Fragment generiert. Die Einklonie- rung in PS 3251 erfolgte über Nco I/ Nhe I (AG 865), die anschließende Umklonierung in AG 910 über Bam H I/ Xho I (AG 977). hTertTATA-Sce-rev: Nach Generierung des hTERTTATA- I-Sce-rev-Fragmentes mittels PCR erfolgte die Einklonierung in PS 3399 über Nco I/ Nhe I (AG 872). Im Anschluss an die Sequenzierung wurde das Fragment über Bam H I/ Xho I in AG 910 umkloniert (AG 979).

Umklonierung der prMin-RGC-Kassette in K92 ∆ IRES-GFP/ E1A∆24-Sce/ Prom-Sce:

Über Mlu I/ Eco RV wurden PTV-Sce und PTV-GFP in AG 977 und AG 979 einkloniert (AG 1065, AG 1073, AG 1076, AG 1092).

Einklonierung der vollständigen regulatorischen Kassette in pAdHM4:

Über PI-Sce I/ I-Ceu I wurden die vier shuttle-Konstrukte in pAdHM4 einkloniert (AG 1419, AG 1505, AG 1541, AG 1285). Eine genaue Beschreibung findet sich unter 3.2.4.1.

3.1.5 2A- und IRES-Sequenzen

Name Sequenz (5‘-3‘) Beschreibung

TAV ^GGATCAGGT

GAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGT GGAGGAAAATCCCGGCCCCATG

Glycin-Serin-Glycin-linker- Thosea asigna virus-2A-Sequenz

PTV ^GGATCAGGT

GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGAT GTTGAAGAAAACCCCGGGCCCATG

Glycin-Serin-Glycin-linker- Porcine Teschovirus-2A-Sequenz FMDV ^GGATCAGGT

TTATTGAACTTCGACCTGCTCAAGTTGGCAGGGGAC GTTGAGTCCAACCCTGGGCCCATG

Glycin-Serin-Glycin-linker- Foot-and-mouth-disease virus-2A- Sequenz

IRES CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCC GAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTC TATATGTGATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCA ATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTG ACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAA GGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGC AGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTC TGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCAC CTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGT GTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCA GTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGT CAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCT GAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGAT CTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTG TTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGA ACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGAT GATAAGCTTGCCACAACC

ECMV(encephalomyelitis virus)- R+12 mut-IRES aus dem Vektor pIRES (BD Biosciences)

19 3.1.6 Adenoviren

Virus Quelle Beschreibung

Ad-Wildtyp Florian Kühnel Humanes Adenovirus Serotyp 5

ONYX-015 Frank McCormick Adenovirus Serotyp 5 mit deletierter E1B-Region und teildeletierter E3-Region.

(ONYX Pharmaceuticals, Inc.)

Ad-p53-Sensor Florian Kühnel P53-abhängig über Gal4-KRAB reprimierbares Ad5-Virus. Enthält das Gal4-KRAB-Gen unter der Kontrolle des prMin-RGC-Promotors, einen der E1A-Region vorgeschalteten von Gal4-KRAB- Bindestellen flankierten CMV-Promotor und ein der E1B-Region nachgeschaltetes IRES-GFP- Modul.

Ad-GFP Florian Kühnel Replikationsdefizitäres Ad5-Virus mit Deletion der E1-Region, welches ein GFP-Gen unter der Kontrolle eines CMV-Promotors enthält.

CMV-IRES-Sce (PS Ad4303)

Peter Schache P53-abhängig dual reguliertes Virus: Die Gene für Gal4-KRAB und I-Sce I unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine IRES verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4- KRAB-Bindestellen flankierter CMV₂₃₀-Promotor.

Die I-Sce I-Schnittstellen befinden sich 3‘-terminal des E1A-Promotors und distal von E1B.

CMV-IRES-GFP (PS Ad4356)

Peter Schache Kontrollvirus zu CMV-IRES-Sce mit p53- abhängiger Gal4-KRAB-Regulation und GFP- Expression. Die Gene für Gal4-KRAB und GFP unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine IRES verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4-KRAB-Bindestellen flankierter CMV₂₃₀-Promotor.

Tert-IRES-Sce PS Ad4315)

Peter Schache P53-abhängig dual reguliertes Virus: Die Gene für Gal4-KRAB und I-Sce I unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine IRES verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4- KRAB-Bindestellen flankierter hTert-Promotor.

Die I-Sce I-Schnittstellen befinden sich 3‘-terminal des E1A-Promotors und distal von E1B.

Tert-IRES-GFP (PS Ad4372)

Peter Schache Kontrollvirus zu Tert-IRES-Sce mit p53- abhängiger Gal4-KRAB-Regulation und GFP- Expression. Die Gene für Gal4-KRAB und GFP unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine IRES verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4-KRAB-Bindestellen flankierter hTert-Promotor.

CMV-Sce (PS Ad4226)

Peter Schache P53-abhängig I-Sce I-exprimierendes Virus. Als Promotor der E1A-Region dient ein CMV230- Promotor. Die I-Sce I-Schnittstellen befinden sich 3‘-terminal des E1A-Promotors und distal von E1B.

20 CMV-GFP

(PS Ad4532)

Peter Schache Kontrollvirus zu CMV-Sce mit p53-abhängiger GFP- Expression. Als Promotor der E1A-Region dient ein CMV₂₃₀-Promotor.

Tert-Sce (PS Ad4233)

Peter Schache P53-abhängig I-Sce I-exprimierendes Virus. Als Promotor der E1A-Region dient ein hTert-

Promotor. Die I-Sce I-Schnittstellen befinden sich 3‘-terminal des E1A-Promotors und distal von E1B.

Tert-GFP (PS Ad4565)

Peter Schache Kontrollvirus zu Tert-Sce mit p53-abhängiger GFP-Expression. Als Promotor der E1A-Region dient ein hTert-Promotor.

3.1.7 Im Rahmen dieser Arbeit konstruierte Adenoviren

Virus Beschreibung

CMV-2A-Sce P53-abhängig dual reguliertes Virus: Die Gene für Gal4-KRAB und I-Sce I unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine 2A-Sequenz (PTV) verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4- KRAB-Bindestellen flankierter CMV230-Promotor. Die I-Sce I-

Schnittstellen befinden sich 3‘-terminal des E1A-Promotors und anstelle der deletierten Rb-Bindedomäne im E1A-Gen (E1A∆24-Sce).

CMV-2A-GFP Kontrollvirus zu CMV-2A-Sce mit p53-abhängiger Gal4-KRAB- Regulation und GFP-Expression. Die Gene für Gal4-KRAB und GFP unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine 2A-Sequenz (PTV) verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4-KRAB- Bindestellen flankierter CMV₂₃₀-Promotor. Das Virus enthält ein E1A- Gen mit deletierter Rb-Bindedomäne und stattdessen eingefügter I-Sce I- Schnittstelle (E1A∆24-Sce).

Tert-2A-Sce P53-abhängig dual reguliertes Virus: Die Gene für Gal4-KRAB und I-Sce I unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine 2A-Sequenz (PTV) verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4- KRAB-Bindestellen flankierter hTert-Promotor, an den 3‘-terminal eine TATA-Box zur Verstärkung angefügt wurde (hTertTATA). Die I-Sce I- Schnittstellen befinden sich 3‘-terminal des E1A-Promotors und anstelle der deletierten Rb-Bindedomäne im E1A-Gen (E1A∆24-Sce).

Tert-2A-GFP Kontrollvirus zu Tert-2A-Sce mit p53-abhängiger Gal4-KRAB- Regulation und GFP-Expression. Die Gene für Gal4-KRAB und GFP unter der Kontrolle von prMin-RGC sind über eine 2A-Sequenz (PTV) verbunden. Als Promotor der E1A-Region dient ein von Gal4-KRAB- Bindestellen flankierter hTert-Promotor, an den 3‘-terminal eine TATA- Box zur Verstärkung angefügt wurde (hTert_TATA). Das Virus enthält ein E1A-Gen mit deletierter Rb-Bindedomäne und stattdessen eingefügter I-Sce I-Schnittstelle (E1A∆24-Sce).

3.1.8 Oligonukleotide (Primer)

Name Sequenz (5‘ – 3‘) Beschreibung

G4K_fw1 GGCAAAGGCCTATGAAGCTA

CTGTCTTCTATCGAACAAGC Insertion einer Stu I-Schnittstelle 5‘- terminal des Gal4-KRAB-Gens.

21

G4K_fw2 AAATCGGGAGAGGAGACCAA

GCTTGGCAAAGGCCTATGAA GCTACTGTCTTCTATCG

Insertion einer Hind III-Schnittstelle 5‘- terminal der Stu I-Schnittstelle und des Gal4-KRAB-Gens.

G4K_TaV_rev1 GCATGTTAGAAGACTTCCCCT GCCCTCACCTGATCCACCCT GGGAGTTTATGAGTGCAAAG TTCTGC

Eliminierung des Stop-Codons vom Gal4-KRAB-Gen, Insertion eines Glycin-Serin-Glycin-linker, Anfügung des ersten Teils der TAV-2A-Sequenz.

G4K_TaV_rev2 TTTCTAGACCATGGGGCCGG GATTTTCCTCCACGTCCCCG CATGTTAGAAGACTTCCCCTG CCCTCACCTGATCC

Anfügung des zweiten Teils der TAV- 2A-Sequenz, Insertion einer Nco I- und einer Xba I-Schnittstelle.

G4K_PTV_rev1 TGCTTGCTTTAACAGAGAGAA GTTCGTGGCACCTGATCCAC CCTGGGAGTTTATGAGTGCA AAGTTCTGC

Eliminierung des Stop-Codons vom Gal4-KRAB-Gen, Insertion eines Glycin-Serin-Glycin-linker, Anfügung des ersten Teils der PTV-2A-Sequenz.

G4K_PTV_rev2 TTTCTAGACCATGGGCCCGG GGTTTTCTTCAACATCTCCTG CTTGCTTTAACAGAGAGAAGT TCGTGGCACCTGATCC

Anfügung des zweiten Teils der PTV- 2A-Sequenz, Insertion einer Nco I- und einer Xba I-Schnittstelle.

G4K_FMDV_rev1 TGCCAACTTGAGCAGGTCGA AGTTCAATAAACCTGATCCAC CCTGGGAGTTTATGAGTGCA AAGTTCTGC

Eliminierung des Stop-Codons vom Gal4-KRAB-Gen, Insertion eines Gly- cin-Serin-Glycin-linker, Anfügung des ersten Teils der FMDV-2A-Sequenz.

G4K_FMDV_rev2 TTTCTAGACCATGGGCCCAG GGTTGGACTCAACGTCCCCT GCCAACTTGAGCAGGTCGAA GTTCAATAAACCTGATCC

Anfügung des zweiten Teils der FMDV-2A-Sequenz, Insertion einer Nco I- und einer Xba I-Schnittstelle.

E1A_Xho_fw AACTCGAGATGAGACATATTA

TCTGCCACGGAGG Insertion einer Xho I-Schnittstelle 5‘- terminal des E1A-Gens.

E1A_ISce_rev TTAAGCTTGATTACCCTGTTA TCCCTAACATCGATCACCTCC GGTACAAGG

Anfügung einer I-Sce I- und einer Hind III-Schnittstelle 3‘-terminal an den E1A-Bereich proximal der zu deletierenden Rb-Bindedomäne.

E1A_ISce2_fw AACTCGAGGTTAGGGATAAC AGGGTAATCCCACCCAGTGA CGACGAGG

Insertion einer Xho I- und distal davon einer I-Sce I-Schnittstelle 5‘-terminal des E1A-Bereiches, distal der zu deletierenden Rb-Bindedomäne.

E1A_Xba_rev TTAAGCTTTCTAGACACAGGT

GATGTCGGGCGTCTC Insertion einer Hind III-Schnittstelle 3‘-terminal der im E1A-Gen

enthaltenen Xba I-Schnittstelle.

sceCMV230_fw AAGGATCACAGGGTAATCCA TGGTGATGCGGTTTTGGCAG TACATCAATGG

Insertion einer Nco I-Schnittstelle 5‘- terminal des CMV230-Promotors.

CMV230_ISce _rev

TTGCTAGCTCTAGATAGGGAT AACAGGGTAATTAGCGGATC TGACGGTTCACTAAACCAGC

Anfügung einer I-Sce I-Schnittstelle in reverse-Orientierung und einer Nhe I- Schnittstelle.

(sce)hTERT_fw AAGCGCCAGGGTACTCCATG

GATGCTGCGCTGTCGGGGCC Insertion einer Nco I-Schnittstelle 5‘-terminal des hTert-Promotors.

hTert_TATA Isce_rev

TTGCTAGCTCTAGATAGGGAT AACAGGGTAATCCGGGTATA AATACACTACACGAGCCCGC TGCCTGAAACTCGC

Anfügung einer TATA-Box 3‘-terminal des hTert-Promotors sowie distal davon einer I-Sce I-Schnittstelle in reverse- Orientierung und einer Nhe I-

22

Schnittstelle.

Kringel_AG_fw TTCTATGCCAAACCTTGTACC

GGAGG Amplifikation des E1A-Gens ab

Position 330 in 5‘-3‘-Richtung.

Kringel_AG_rev AAAGGTGAGGCGGCTCCGG Amplifikation des E1A-Gens ab Position 286 in 3‘-5‘-Richtung.

Primer und Sonde für die qPCR (Hexon-Nachweis): Sequenz nach [78].

Name Primer (5‘-3‘) Beschreibung

Hex-fw TGCCTTTACGCCACCTTCTTC Amplifikation des adenoviralen Hexon- Gens in 5‘-3‘-Richtung

Hex-rev CGGGTATAGGGTAGAGCATG

TTG Amplifikation des adenoviralen Hexon-

Gens in 3‘-5‘-Richtung Hex-Sonde

(FAM/BHQ)

CCACAACACCGCCTCCACGC

TTGA FAM-BHQ-Sonde, die sich an DNA-

Einzelstränge im Bereich zwischen den beiden Primer-Bindestellen anlagert. In intaktem Zustand kommt es aufgrund der Verbindung zwischen Fluoreszenz- Pol (FAM) und quencher (BHQ) nicht zur Aussendung eines Fluoreszenz- Signals. Beim Abbau der Sonde durch die DNA-Polymerase kommt es zur Trennung dieser Verbindung und nach- folgend zum Signalanstieg.

Die Synthese aller Primer sowie der Hexon-Sonde erfolgte bei MWG Biotech.

3.1.9 Enzyme

Enzym Quelle

Restriktionsendonukleasen New England Biolabs Herculase^TM Hotstart DNA Polymerase Stratagene

T4-DNA-Ligase New England Biolabs

RNAse A, DNAse-frei Boehringer

Lysozym Sigma-Aldrich

Proteinase K Roche

SAP (shrimp alkaline phosphatase) Pharmacia

Antarktische Phosphatase New England Biolabs 3.1.10 Molekulargewichtsstandards

Standard Quelle

1 kb+ DNA-Leiter Invitrogen

SDS-PAGE Molecular Weight Standard Low Range

Biorad PeqGold prestained protein marker III PeqLab