Schindler et al.: Harnstoff-Durchflußsensor zur Prozeßkontrolle der Künstlichen Niere 145 Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem.
Vol. 32, 1994, pp. 145-152
© 1994 Walter de Gruyter & Co.
Berlin · New York
Harnstoff-Durchflußsensor zur
ammoniumselektiv-enzymatischen Prozeßkontrolle der Künstlichen Niere
Von J. G. Schindler \ M. M. Schindler 2, K. Herna \ E. Reisinger l, B. Burk ', U. Kuhlmann 3, J. Knaack 3, B. Schmidt3 und H. Lange 3
1 Institut für Normale und Pathologische Physiologie, Projekt Biomedizinische Technik und Bioelektrochemische Membranelektroden, Philipps-Universität, Marburg/Lahn, Germany
2 Schindler Bio- und Chemosensoren Forschungslabor, Marburg/Lahn
3 Medizinisches Zentrum für Innere Medizin, Abteilung Nephrologie, Philipps-Universitätt Marburg/Lahn
(Eingegangen am 18. Oktober 1993/3. Januar 1994)
Zusammenfassung: Es wird ein Durchfluß-Verfahren zur kontinuierlichen ammoniumselektiv-enzymatischen Pro- zeßkontrolle der Künstlichen Niere mit einer bioelektrochemischen Harnstoff-Elektrode vorgestellt. Die Harnstoff- spaltung erfolgt mittels membranständiger kovalent gebundener Urease, die Detektion der freigesetzten Ammonium- ionen durch eine Nonactin-PVC-Membran. Außer detaillierten Kenndaten des sauerstoffunabhängigen Festkontakt- sensors werden patientendirekte kontinuierlich gewonnene Meßkurven während des Hämodialyseverfahrens demon- striert. Verfahrenstechnische Vorteile sind ausführlich beschrieben. Darüberhinaus gestattet der Harnstoff-Sensor auch Direktmessungen im heparinisierten Blut.
Urea-sensor for the continuous ammonium-selective-enzymatic process control ofthe artificial kidney
Summary: Presented is a flow-through method for continuous ammonium-selective enzymatic monitoring of the artificial kidney by means öf a bioelectrochemical urea electrode. The urea is converted in an enzyme membrane by covalently bound urease and the ämmonium ions are detected by a Nonactin-PVC-membrane. In addition to detailed datä from the oxygenrindeperjident solid-state contact sensor, curves are obtained on-line from the patient during the haempdialysis Session. The advantages of the method are described in detail. Furthermore, the urea sensor can be used for measurements in heparinized blood.
Einführung
Die kontinuierliche Meßwerterfassung von K+, Na+ und über eif B^ramung der «korporieiten Harnstoff- Ca>+ bei chronisch niereninsuffizienten Patienten wäh- men?e besser beurteilen zu können. Darüberhmaus ge- rend der Hämodialyse haben wir in Ivfcrburg 1987/88 stattet die dafiir erforderliche gletchzemge kontmuierh- eingeruhrt und verschiedentiich darüber publiziert che Bestimmung des Harnstoffs im Filtrat des Blutes (1-3). Da das realzeitliche On^tine-Hamstoff-Monito, und im abfließenden Dialysat eine Berechnung der ring als zukünftiger idealer Weg zur Erzielung gleicher Hamstoffclearance der Künstlichen Niere. Schließlich Effektivität dieser Behandlungsfqrrn angesehen wird leistet das Verfahren auch noch einen Beitrag zur Quali- (4-6), wurde von uns die Elektroanalyse der Kationen tätssicherung des hämodialytischen Behandlungsverfah- durch einen Hamstoff-Biosensor (7) erweitert. In diesem rens.
Zusammenhang haben wir kürzlich über die fortlaufende Harnstoff-Messung im abfließenden Dialysat an der
Künstlichen Niere berichtet (8). Material und Methodik
Als zukünftige Perspektive eröffnet sich für den Arzt Das bioelektrochemisehe Meßprinzip (7) der Harnstoff-Elektrode die Möglichkeit, den Eiweißmetabolismus des Patienten (Abb. 1) basiert auf der enzymatischen Spaltung durch membran- Eur. J. Clin. Chem. Clia'Biochem. / Vol. 32,1994 / No. 3
Meßfühler
sauenreftinobhängig
Durchflußkammer —S?
NH«*-selelctiv enzymatisches Membransystem
igiger
Nonacrin-PVC-Membron Didysemembran
Reoktionsfcleichung: Harnstoff + 2 H2O * H* -^ 2 NH/ + HCO,' Abb. l Bioelektrochemische Harnstoff-Membranelektrode.
ständige kovalent gebundene Urease und elektrochemischer Detek- tion der freigesetzten Ammoniumionen hinter der Enzymmembran durch eine Nonactin-Disk-Elektrode (7, 9) mit sauerstoffunabhän- giger Festableitung gemäß der Reaktionsgleichung
Harnstoff + 2 H20 + H+ Urease
+ HCOJ Die Urease-Membran aus quervernetzten Enzymmolekülen ist beidseits durch Dialysemembranen versteift und in dieser mecha- nisch stabilisierten Form durch einen 0-Ring auf einem Membran- träger aus Acrylglas arretiert, der auf die Nonactin-DiskJElektrode aufgeschoben wird; dadurch läßt sich bei nachlassender Aktivität die Enzymmembran leicht auswechsein. Bis zu ihrem Einsatz ist eine Lagerung über mehrere Monate bei + 4 °C im Kühlschrank möglich.
Die aus Harnstoff enzymatisch freigesetzten Ammonrumionen ste- hen einerseits in der Meßlösung pH-abhängig mit NH3 im Gleich- gewicht (9) und werden andererseits unter Abstreifen der Hy- drathülle im Zuge einer Phasentransferkatalyse durch das in die PVC-Membran inkorporierte exolipophile Makrotetrolid-Antibioti- kum Nonactin mit je vier Carbonyl- und Tetrahydrofuransauer- stoffatomen achtfach in geringfügig verzerrter kubischer Koordina- tionssphäre (10) komplexiert. Die NHJ-Ionen finden in diesen Li- gandsauerstoffatomen einen Ersatz für ihre Hydrathülle, so daß sie nun als lipophile Komplexe in der Membranphase vorliegen. Der Chemismus des Komplexierungsvorganges begründet auf der Basis einer Bildung ligandgetrennter lonenpaare die aktivitätsgetriebene Ausbildung der Potentialdifferenz im Grenzflächenbereich von Nonactin-PVC-Membran und hydrophiler Enzymmembran, wobei sich Ammoniumionen-Nonactin-Komplexe und hydratisierte Anio- nen im Sinne zweier Kondensatorplatten gegenüberstehen.
Feine Unterschiede in der räumlichen Ausdehnung der Koordina- tionssphäre des achtzähnigen Liganden lassen bei seinen NHf-, K+- und Na+-Komplexen den Zusammenhang von Struktur und Selektivität erkennen. Während das nicht hydratisierte K+-Ion im endohydrophilen Hohlraum Sfach näherungsweise kubisch (unge- fähr 2,8 X 10~10 m) koordiniert vorliegt (l 1), nähern sich im Falle einer Natriumkomplexierung die Carbonylsauerstoffatome dem Metallkation auf eine Distanz von circa 2,4 X .10~10 m (12), hinge-
gen distanzieren sie sich beim Ammonium-Komplex vom Stickstoffatom auf eine Entfernung von 3,01-3,16 X 10~lorri (10), so daß die Wasserstoffatome von NHtf mit den Tetrahydrofu- ran-Sauerstoffatornen (ungefähr 2,0 ± 0„15 X 10~I0m) in beson- dere Wechselwirkung treten. Der Abstand der Tetrahydrofuran-0- Atome bleibt in den K+-, Na+- und -( .,. ) Komplexen des Nonactins mit circa 2,8 "10 rn ungefähr gleich (10-12). Die exolipophile Peripherie des Moleküls fwird durch Methylengruppen der Tetrahydrofuranringe sowie Methylsubstitueriten repräsentiert (11) und gewährleistet dadurch sein Verbleiben in der hydrophoben Membranphase.
Die Selektivitätsbestimmung des aus Nonactin, Bis(2-ethylhexyl)- sebacat und PVC bestehenden Membransystems erfolgte gemäß lUPAC-Empfehlung (13) entsprechend der fixierten Interferenzme- thode nach dem Prinzip der Veränderung der Meßionenaktivität bei konstant gehaltener Störionenkonzentration (1,9). Die lonenaktivir täten wurden auf der Basis der Debye-Hüekel-Onsager-Theone be- rechnet (l, 9). Da die Meßwerterfassung über Ammoniumionen M2?72,s/-gemäßes Verhalten zeigt, kann für die bioelektrochemische Bestimmung des Harnstoffs formuliert werden:
E = E' + S lg CHamstofr [mV]
E = EMK der Meßkette E1 = Standardmeßkettenpotentiäl S = Elektrodensteilheit
^Harnstoff = Konzentration des Harnstoffs in der Meßlösung Für Durchflußanalysen wird die Harnstoff-Elektrode durch eine Ag-Referenzelektrode mit 3 mol/1 KCl-Bezugslösung und monoka- pillarer Stromschlüsseikontaktzone (9) zur Meßkette mit Überfüh- rung komplettiert.
Die Positionierung der beiden jeweils durch Tropflcarnrnem vom Patienten abgetrennten bioelektrqchemischen Hamstoff^Membrane elektroden zur Prozeßkontrolle an der Künstlichen Niere geht aus Abbildung 2 hervor. Dabei dient der Sensor I der Erfassung der aktuellen Blut-Harnstoffkonzentration des Patienten, die unter An- wendung einer entsprechenden Filtrationseinheit über eine fortlau- fende Messung im Filtrat des Blutes registriert wird. Als wesentli- che Funktion übernimmt der Sensor im Zusammenhang mit einem Volumenmeßgerät die kontinuierliche Detektion der elimi- nierten Harnstoffmenge im abfließenden Dialysat. Über dieses Ver- fahren wird an anderer Stelle detailliert berichtet werden (14).
Die Kalibrierlösungen enthielten 40 und 100 mg/dl (6,67 und 16,67 mmol/i) Harnstoff. Wegen der erheblich differierenden ionalen Zu^
sammensetzung von Filtrat und abfließendem Dialysat kommen auf der Basis von Phosphatpuffersystemen (Nä2HP04 und KH2P04) mit einem pH-Wert von 7,40 zwei unterschiedliche Kalibrierver- fahren zur Anwendung (15). Die geringen Unterschiede in den lo- nenradien von und K+ begründen eine vergleichsweise zu anderen Kationen in der Reihe der Alkali- und Erdalkalimetalle analytisch unerwünscht sehr hohe Querempfindlichkeit der Nqnac- tin-PVC-Membfan gegenüber diesem Störion. Diese und die Anio-
Harristoff-Sensor 1
Harnstoff-Sensor 2 l l
Volumen- meßgerät
Abb. 2 Positionierung der Harnstoff-Sensoren zur Prozeßkon- trolle an der Künstlichen Niere. ' >
Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochera. / Vol. 32,1994 / No. 3
Schindler et al.: Harnstoff-Durchflußsensor zur Prozeßkontrolle der Künstlichen Niere 147 neninterferenz verlangen eine an den Meßlösungen und am photo-
metrischen Referenzverfahren orientierte Angleichung der Kali- brierlösungen bezüglich der Kalium- und Phosphatkonzentrati- onen. Darüberhinaus beeinflußt das Natriumion konzentra- tionsmäßig maßgeblich die lonenstärke und übernimmt auf der Ka- tionenseite die Funktion des Leitelektrolyten. Den verschiedenen Acetatkonzentrationen bei der sog. Bicarbonat- bzw. Acetatdialyse ist bei Messungen im abfließenden Dialysat gesondert Rechnung zu tragen.
Ergebnisse
Die Elektroanalytik des Harnstoffs ist zwischen l und 500 mg/dl (0,17-83,34 mmol/1) ausführbar Jedoch wer- den auch Harnstoffkonzentrationen von 1000 mg/dl (166,69 mmol/1) erfaßt.
Die Gesamt-Selektivität der ammoniumselektiv-enzy- matischen Harnstoffhiembran gliedert sich in die Katio- nenselektivität der Nonactin-PVC-Membran und deren Anioneninterferenz sowie Konkurrenzreaktionen ande- rer Substrate mit Harnstoff um das aktive Zentrum der Urease bzw. deren Inhibition durch Hemmstoffe. Die nach der fixierten Interferenzmethode (l, 9, 13) ermit- telte Kationenselektivität geht aus Tabelle l hervor. Da der Unterschied des lonenradius (rlon nach Panling) von K+ (rjon 1,33 X 10~10 m) gegenüber dem des NHtf (
1,48 X l O"10 m) wesentlich geringer als bezüglich des Na+ (rlon von 0,95 X l O"10 m) ist, wurden zur Quanti- fizierung der Kaliuminterferenz Harnstofftnessungen in Gegenwart anderer im Blut vorkommender Kationen wie Na+ (140,0 mmol/1) und Ca2+ (1,17 mmol/1) unter Variation der Kaliumkonzentrationen zwischen 3,00 und
Tab. l Characteristica der ammoniumselektiven Disk-Elektrode mit der Membran SBC-256-NH^ bei 25 °C.
Selektivität auf der Basis der fixierten Ititerferenzmetbpde Störion
H+
Na+
K+
K
3,67 X 10~—
4*7,12 X 1CT5* 1,68 X Kr3* 1,43 10-l° 6,03 X 10-20
7,92 "30
Störion
s
n+NHJ Mg2+
Ca2+
Sr2* - Ba2+
KNHÜT - sn*
1,00
1,37 '5* 2,03 X 10~5* 1,70 X 10~5* 8,79 X 10~6*
* CNHJ: 10~4 und 10~5 mol/1, csn+: 1,5 X 1CT1 mol/1 bzw. CH+:
l O"1 mol/1
° CNHJ: l (T3 und 1(T4 mol/1, c^+: l (T2 rnol/1 Elektrodensteilheit: 59,2 mV pro Aktivitätsdekade Einstellzeit: < t s
Untere Nachweisgrenze (limit of detection): 1,5 X l (T7 mol/1 NH4C1
Drift: < 0,1 mV/h
Reproduzierbarkeit der EMK: 0,1 mV Funktionsdauer: ca. 6 Monate
7,00 mmol/1 ausgeführt (Tab. 2). Der ionale Erken- nungsmechanismus durch Nonactin erfolgt im Zuge der Phasentransferkatalyse nach dem Prinzip der optimalen Hohlraumanpassung. Aus der Sicht des Selektivitätsme- chanismus erübrigt sich deshalb die Berücksichtigung des Mg2"*" (rion 0,65 X l O"10 m) in diesen Modellunter- suchungen, zumal bereits das Störion Ca2+ (rlon 0,99 X l O""10 m) nur noch einen vernachlässigbaren Beitrag zur Potentialbildung unter diesen Bedingungen leistet;
denn hier wirkt sich bei diesen beiden Kationen noch die höhere Ladungszahl auf ihre Diskriminierung drastisch unterstützend aus.
Nach den Richtlinien der Bundesärztekammer zur Qua- litätssicherung in medizinischen Laboratorien mit Gül- tigkeit vom 1. November 1988 (16) beträgt die jeweilige maximal zulässige relative zufallige Meßabweichung für Harnstoff 8%. Im Hinblick darauf belegen die Ergeb- nisse in Tabelle 2, daß mit diesem Sensor elektroanalyti- sche Harnstoffmessungen im Konzentrationsbereich von 30 bis 300 mg/dl (5,00 bis 50,01 mmol/1) bei einer Schwankung der Kaliumkonzentration zwischen 3,00 und 7,00 mmol/1 keiner kaliumabhängigen Korrektur be- dürfen. Da die Kalibrierlösungen bei diesen auf Tabelle 2 bezogenen Experimenten eine K+-Konzentration von 4,50 mmol/1 aufwiesen, ist in Gegenwart von nur 30 mg/dl (5,00 mmol/1) Harnstoff der Beitrag dieses Stö- rions zur Potentialbildung bei steigender Kaliumkonzen- tration im Sinne einer positiven Meßwertabweichung und umgekehrt bei, sinkender Kaliumkonzentration als negative Meßwertabweichung zu beobachten. Oberhalb 70,0 mg/dl (11,67 mmol/1) Harnstoff sind die zu beob- achtenden Meßwertabweichungen als zufällig einzustu- fen; denn nun vermögen die enzymatisch freigesetzten Ammoniumkonzentrationen die bei niedrigen Harnstoff- konzentrationen beobachteten Kaliuminterferenzerschei- nungen vollständig zu kompensieren. Um generell Kaliumquerempfindlichkeiten drastisch zu minimieren, wurden die Kalibrierlösungen aber auch unter Berück- sichtigung der Anioneninterferenz nach Maßgabe des oben beschriebenen Verfahrens modifiziert. Der Erfolg dieser Vorgehensweise wird in Abbildung 3 bestätigt.
Da einerseits zwischen NH^"-Ionen und NH3 eine pH- abhängige Gleichgewichtseinstellung existiert und ande- rerseits am enzymatisehen Harnstoffumsatz durch die Urease Protonen beteiligt sind, wurde die HMnterfe- renz des Sensors ebenfalls im Harnstoff-Konzentrations- bereich von 30 bis 300 mg/dl (5,00 bis 50,01 mmol/1) unter Variation des pH-Wertes zwischen 7,10 und 7,70 geprüft und auch als nicht korrekturbedürftig befunden (Tab. 3). Von der Nonactin-PVC-Membran ließ der Se- lektivitätskoeffizient KN Hi-H+ (Tab. 1) ohnehin keine Protoneninterferenzen erwarten.
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Tab. 2 Kaliuminterfcrenz des Harnstoff-Sensors auf der Basis der Nonactin-PVC Membran. Angegeben sind die vorgegebenen Harn- stoffkonzentrationcn („Waage")» die mit dem Sensor gemessenen
Harnstoffkonzentrationen (mg/dl) und die Abweichungen gegen- über den vorgegebenen ( , %) sowie die korrespondierenden Kon- zentrationen in mraol/1.
Harnstoff, Waage mg/dl mmol/1
3,00 mmol/l
Harnstoff, Sensor 4,50 mmol/1
Harnstoff, Sensor
mg/dl (%) mmol/1 mg/dl (%) rnmol/1
7,00 mmol/1 Harnstoff, Sensor
rag/dl (%) mmol/1 30,050,0
70,090,0 110,0 150,0 200,0 300,0
5,008,33 11,67 15,00 18,34 25,00 33,34 50,01
27,646,0 69,191,4 109,0 146,0 196,3 298,3
-8,0-8,0 -1,3+ 1,6 -0,9-2,7 -1,9-0,6
4,607,67 11,52 15,24 18,17 24,34 32,72 49,72
29,848,6 71,293,2 111,0 148,4 199,6 300,7
-0,7-2,8 + 1,7 +3,6+0,9
-1,1
-0,2 +0,24,978,10 11,87 15,54 18,50 24,74 33,27 50,12
32,549,1 68,389,3 109,6 151,6 197,9 302,7
+8,3-1,8 -2,4-0,8 -0,4 + U
-1,1
+0,9
5,428,18 11,39 14,89 18,27 25,27 32,99 50,46
Filtrat Dialysat
0 5 10 15 20 25 30
Harnstoff (Photometrie) [mmol/l] 0Harnstoff (Photometrie) [mmol/l]2 4 6 Abb. 3 Korrelation Harnstoff-Sensor/Photometrie
Filtrat: r = 0,997, p < 0,001; Dialysat: r = 0,983, p < 0,001
Tab. 3 Protoneninterferenz des Hanistoff-Sensors auf der Basis der Enzymmembran und der pH-abhängigen Gleichgewichtsein- stellung zwischen NHJ und NH3. Angegeben sind die vorgegebe- nen Harnstoffkonzentrationen („Waage"), die mit dem Sensor ge-
messenen Harnstoffkonzentrationen (mg/dl) und die Abweichun- gen gegenüber den vorgegebenen ( , %) sowie die korrespondie- renden Konzentrationen in mmol/l.
Harnstoff, Waage mg/dl
30,050,0 70,090,0 110,0 150,0 200,0 300,0
mmol/1 5,008,33 11,67 15,00 18,34 25,00 33,34 50,01
H+
pH 7,10 Harnstoff, Sensor mg/dl
29,350,7 67,187,8 112,7 152,0 197,2 296,3
(%) -2,3+ 1,4 -4,1-2,4 +2,5+ 1,3 -1,4-1,2
mmol/1 4,888,45 11,19 14,64 18,79 25,34 32,87 49,39
pH 7,40 Harnstoff, Sensor mg/dl
31,051,6 68,590,6 110,5 147,5 200,5 303,8
(%) +3,3+3,2 -2,1+0,7 +0,5-1,7 +0,3+ 1,3
mmol/l 5,178,60 11,42 15,10 18,42 24,59 33,42 50,64
pH 7,70 Harnstoff, Sensor mg/dl
30,548,5 69,191,5 114,0 148,9 198,8 298,7
(%) + 1,7 -3>0 -1,3+ 1,7 +3,6-0,7 -0,6-0,4
mmol/1 5,088,08 11,52 15,25 19,00 24,82 33,14 49,79
Die Urease erweist sich bei der enzymatischen Spaltung des Harnstoffs als hochselektiv. Suramin und Thioharn- stoff hemmen sie kompetitiv (17). Die inhibitorische Wirkung von Hg2+ auf die Ureaseaktivität konnte unter
Einsätz einer gassensitiven Ammoniak-Elektrode zur Spurenbestimmung freier und komplexierter Quecksil- berionen herangezogen werden (18). Inhibitorinterferen^
zen wurden für Ag+ und Cu2t beobachtet (18). Fluorid- Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 32,19947No. 3
Schindler et al.: Harnstoff-Durchflußsensor zur Prozeßkontrolle der Künstlichen Niere 149 Ionen sind im Meßgut unerwünscht, da sie die Urease
reversibel nichtkompetitiv hemmen (19); dies ließ sich ebenfalls analytisch zur Messung von Fluoridionen mit einer durch immobilisierte Urease sensibilisierten pCO2- Elektrode ausnutzen (20), wenngleich üblicherweise die hochselektive LaF3-Einkristall-Membranelektrode (21) zur Fluoridionenanalyse herangezogen wird.
Die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte für die Ein- stellzeit der bioelektrochemischen Harnstoff-Elektrode sind die Diffusionsvorgänge in der hydrophilen Enzym- membran und die Kinetik der Urease; denn die Nonac- tin-PVC-Membran des ammoniumselektiven Festkon- takt-Sensors hat eine Einstellzeit von < l s. Eine Meß- wertänderung von 40 auf 100 mg/dl (6,67 auf 16,67 mmol/1) Harnstoff wird in 90 s angezeigt (Abb. 4). Die Steilheit des NHjf-selektiven Detektors beträgt in reinen NH4Cl-Lösungen 59,2 mV. Hingegen wurde bei einem lOfachen Konzentrationsanstieg des Harnstoffs in Ge- genwart der im Blut vorkommenden Störionenkonzen- trationen eine Differenz in der elektromotorischen Kraft der elektrochemisch-enzymatischen Meßkette von 42,6 mV gefunden. Ein Wechsel der Enzymmembran wird bei einem Aktivitätsverlust der Urease von 20% vorge- nommen. Dem entspricht gegenwärtig bei kontinuierli- chem Durchflußbetrieb eine Funktionsdauer von durch- schnittlich vier Wochen. In Tabelle 4 sind zwei Harn- stoff-Sensoren hinsichtlich ihrer Präzision in der Serie und von Tag zu Tag vergleichend gegenübergestellt.
Die sehr gute Korrelation der mittels Harnstoff-Sensor und Photometer bestimmten Harnstoffkonzentrationen im Filtrat und Dialysat geht aus Abbildung 3 hervor. Da die bioelektrochemisch erfaßten Filtrat-Harnstoffkon- zentrationen ausgezeichnet mit den photometrisch im Blut ermittelten korrelieren (r = 0,99; p < 0,001), darf die kontinuierliche Registrierung im Filtrat mit der Harnstoff-Membranelektrpde als repräsentativ für das Blut gelten.
Das Ergebnis einer mit zwei bioelektrochemischen Harnstoff-Elektroden durchgeführten Prozeßkontrolle des Behandlungsvorganges mit der Künstlichen Niere ist in Abbildung 5 zusammenfassend dargestellt. In Abbil- dung 5 oben läßt sich die Wirksamkeit der Hämodialyse- behandlung an der Abnahme der Harnstoff-Konzentra- tion im Filtrat des Blutes als Äquivalent zur aktuellen Blutharnstoffkonzentration kontinuierlich verfolgen, parallel dazu zeigt Abbildung 5 Mitte den Verlauf im abfließenden Dialysat. Unter Berücksichtigung des Dia- lysatflusses kann aus beiden Konzentrationen die elimi- nierte Harnstoffmenge gemäß Abbildung 5 unten exakt berechnet werden.
Diskussion
Auf die Bedeutung der bioelektrochemischen Prozeß- kontrolle der Dialysebehandlung haben wir eingangs hingewiesen. Unterschiedliche Verfahrensweisen zur elektrochemisch-enzymatischen Analyse des Harnstoffs wurden über viele Jahre weiterentwickelt (9). Der Nach- weis für die Praktikabilität einer potentiometrisehen Harnstoffmessung läßt sich mit Hilfe einer einfachen stationären Versuchsanordnung erbringen, wenn einer thermostatisierten, gerührten Harnstofflösung Urease zu- gesetzt und aus der dann meßioninduzierten Potentialän- derung auf die Substratkonzentration geschlossen wird (22).
G. G. Guilbault und J. G. MontalvoJi: beschrieben 1969 eine Enzymelektrode zur Messung des Harnstoffs auf der Basis einer auf Ammoniumionen ansprechenden Glasmembranelektrode und aufpolymerisiertem Acryl- amid-Gel mit immobilisierter Urease (23). Durch zu- sätzliche Applikation einer Zellophan-Folie zwecks Ver- hinderung von Auswascheffekten der immobilisierten Urease aus der photopolymerisierten Acrylamidgel-Ma- trix wurde eine Verbesserung erzielt (24). Die Detektion der freigesetzten Ammoniumionen über eine ammoni-
EMK [mV]
90s
t [s]
Abb. 4 Harnstoff-Meßkurve mit drei Analysen in wäßrigen, hin- und 100,0 mg/dl bzw. 3,33 und 16,67 mmol/1). Den unterhalb der sichtlich der Kationenkonzentrationen hämoanälogen Elektrolytlö- Meßkurve angegebenen Harnstoftkonzentrationen zuzuordnende sungen und jeweiliger Zweipunkt-Kalibrierung. (Harnstoff 20,0 EMK-Werte sind jeweils oberhalb der Meßkurve aufgeführt.
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Tab. 4 Vergleich zweier Harnstoff-Sensoren. Präzision in der Se- Meßwerte sowie Qualitätsmerkmale der Hamstoffkonzentrationen ric (Repetierbarkeit) und von Tag zu Tag (Reproduzierbarkeit), in mg/dl und korrespondierend in mmol/1 sowie die Variationskoef- SolI-Wert: 40,0 mg/dl (6,67 mmol/1) Hanistoff. Angegeben sind fizienten in %.
Harnstoff- Messung
Sensor I Sensor II
Tag A Tag B Tag A Tag B
mg/dl mmol mg/dl mmol/1 mg/dl mmol/1 mg/dl mmol/1
2.1.
4.3.
Mittelwert Standard- abweichung s*
Variations- koeffizient VK Mittlerer Fehler
38,2 37,8 37,838,2
38,0 0,23
0,12
6,37 6,30 6,30 6,37 6,33 0,040
0,61%
0,020
40,3 38,3 38,4 37,4 38,6 1,22
0,61
6,72 6,38 6,40 6,23 6,43 0,206
3,16%
0,103
38,4 38,6 38,5 38,5 38,5 0,08
0,04
6,40 6,43 6,42 6,42 6,42 0,013
0,21%
0,006
38,0 37,9 38,4 37,9 38,1 0,24
0,63%
0,12
6,33 6,33 6,40 6,32 6,34 0,039
0,019 des Mittelwertes
95%-Ver- 37,8-38,2 6,29-6,37 37,4-39,8 6,22-6,64 38,4-38,6 6,41-6,43 37,9-38,3 6,30-6,38 trauensberelch
Harnstoffmessung in Filtrat
l
i
ol
180
Harnstoffmessung im Dialysat
180
Eliminierter Harnstoff
90 120
t [min] 180
Abb. 5 Oben: Kontinuierlicher Verlauf im Filtrat des Blutes (Harnstoff-Sensor l in Abb. 2), Mitte: im abfließenden Dialysat (Harnstoff-Sensor II in Abb. 2) und schließlich unten: die daraus unter gleichzeitiger Volumenmessung errechnete Menge des elimi- nierten Harnstoffs während einer Hämodialyse.
urnsensitive, beziehungsweise genauer als kationen- selektiv zu bezeichnenden Glasmembrarielektrode weist eine sehr hohe Querempfmdlichkeit gegenüber anderen Kationen wie K4" und sogar Na* auf (25). Die diesbe- züglich kompensatorische zusätzliche Verwendung einer unbehandelten Kationen-Vergleiehselektrode in einem lonenaustausch^System (26) stellt für die hier zur Dis- kussion stehende Applikation einen unverhältnismäßig hohen, technisch nicht vertretbaren Aufwand dar und birgt eine Reihe von Unsicherheitsfaktoren. Mit dem Ersatz der ammoniumsensitiven Glasmembranen des Detektors durch Nonactin-Silikongummi-Membranen wurde eine genaue Messung bei bekanntem Kaliumge- halt in biologischen Flüssigkeiten möglich (27), wobei Harnstoffanalysen im Serum auch weiterhin zusätzlich Maßnahmen wie eine kontrollierte Verdünnung auf ei- nen konstanten Interferenz-Spiegel im Zusammenhang mit einem Drei^-Elektroden-System verlangten (28). Es ist daher nicht verwunderlich, wenn die Entwicklung von Harnstoff-Sensoren auch unter Anwendung anderer elektrochemischer Detektoren wie für pH (29), CO? (30) oder NH3 (31) weiter betrieben würde und bis in die Gegenwart (7, 8, 32, 33) ein aktuelles Interesse an der Entwicklung von Harnstoff-Sensoren existiert. Auch über Katheter-Elektroden wurde früher bereits berichtet (9, 34). Obwohl polare neutrale Moleküle wie Harnstoff und Thioharnstoff durch acyclische krorienetherartige Neutralliganden komplexiert werden (35), ist gegenwär- tig der Weg über eine harnstoffselektive Carrier-PVC- Membranelektrode nicht realisierbar.
Die Verfahrensweise, den Harnstoff in kontinuierlichem Durchflüßverfahren tanter fcfrilaufendem Zupumpen lös- Eur. J. Clih. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 32,1994/No. 3
Schindler et al,: Harnstoff-Durchflußsensor zur Prozeßkontrolle der Künstlichen Niere 151 lieber Urease zu spalten und die dabei freigesetzten Am-
moniumionen mit einer Nonactin-Disk-Elektrode (36) zu detektieren, haben wir bereits 1977/78 beschrieben (37), die nun zur Entwicklung des hier im Detail vorge- stellten Harnstoff-Sensors geführt hat. Über seinen Erst- Einsatz zur Prozeßkontrolle an der Künstlichen Niere wurde von uns kürzlich berichtet (8). Abgesehen von der wirtschaftlicheren Form der Elektroanalyse mit membranständig immobilisierter Urease liegt der tech-
nologische Fortschritt des Harnstoff-Biosensors in der kompakteren Bauform dieses bedside-analysers und da- mit wesentlich praktikableren Applikationsform sowie schnelleren Verfügbarkeit der Meßdaten. Darüberhinaus besteht kein Bedarf mehr für eine kaliumselektive Kor- rekturmessung. Ferner gestattet der Harnstoff-Durch- flußsensor wegen seines sauerstoffunabhängigen Fest- kontaktes auch Direktmessungen im heparinisierten Blut.
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Prof. Dr. Dr. J. G. Schindler Institut für Normale und Pathologische Physiologie
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Karl-von-Frisch-Straße D-35033 Marburg/Lahn Germäny
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