Entwicklung von Oligonukleotid-Sonden
für die Mikroarray-basierte Identifizierung von
Plattfisch- und Dorscharten der
südlichen Nordsee
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat –
dem Fachbereich Biologie/Chemie
der Universität Bremen
vorgelegt von
Kristina Kappel
Tag des öffentlichen Kolloquiums: 4. Juni 2009
1. Gutachter: Prof. Dr. D. Blohm 2. Gutachter: Prof. Dr. U. Saint-Paul
Die experimentellen Arbeiten für diese Dissertation wurden von Dezember 2001 bis Mai 2003 und von Februar 2004 bis September 2005 in der Abteilung Biotechnologie und Molekulare Genetik als Teil des Centrums für Angewandte Gensensorik (CAG) der Universität Bremen durchgeführt. Sie stellen die Vorarbeit für das FP6-EU-Projekt „Fish and Chips“ („DNA-Chip-Technologie als analytisches Werkzeug zur Identifizierung mariner Organismen in der Biodiversitäts- und Ökosystemforschung“) dar, das im Januar 2004 startete.
I
Inhaltsverzeichnis
1
ZUSAMMENFASSUNG... 1
2
EINLEITUNG... 3
2.1 DIE DNA-MIKROARRAY-TECHNOLOGIE... 5
2.1.1 Selektion der Sondensequenzen ... 6
2.1.2 LNATM-modifizierte Sonden ... 7
2.1.3 Herstellung von Mikroarrays ... 8
2.1.4 Präparation der Ziel-DNA ... 9
2.1.5 Hybridisierungsreaktion ... 10
2.1.6 Detektionsmethoden... 10
2.1.7 Aktuelle Entwicklungen der Mikroarray-Technologie ... 11
2.1.8 DNA-Mikroarrays zur Identifizierung von Organismen... 12
2.2 MARKERGENE ZUR ORGANISMENIDENTIFIKATION... 13
2.2.1 Genetische Marker für Fische ... 14
2.2.2 Das “Barcoding”-Gen der Untereinheit 1 der Cytochrom Oxidase ... 15
2.2.3 16S rRNA-Gen... 15
2.3 MONITORING VON FISCHARTEN IN ICHTHYOPLANKTONPROBEN... 16
2.3.1 Herkömmliche Identifizierung von Fischeiern... 16
2.3.2 Ziel dieser Arbeit... 17
3
MATERIAL UND METHODEN ... 19
3.1 OLIGONUKLEOTIDE... 19
3.2 PROBENNAHME VON FISCHEN... 19
3.2.1 Fischfang ... 19
3.2.2 Gewebeentnahme und Fixierung... 20
3.3 DNA-TECHNIKEN... 20
3.3.1 DNA-Extraktion aus muskulärem Fischgewebe ... 20
3.3.2 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR... 21
3.3.3 Sequenzierung von mitochondrialen DNA-Fragmenten ... 22
II
3.4.1 Sequenz-Edition und Qualitätsprüfung ... 23
3.4.2 Multiples Alignment ... 23
3.4.3 Phylogenetische Analysen... 24
3.5 SELEKTION VON OLIGONUKLEOTID-SONDEN... 24
3.6 DNA-MIKROARRAY-HYBRIDISIERUNG... 25
3.6.1 Herstellung der DNA-Mikroarrays ... 25
3.6.2 Mikroarray-Hybridisierung und -Prozessierung ... 26
3.6.3 Detektion und Auswertung der Hybridisierungsergebnisse ... 27
3.7 STANDARDLÖSUNGEN UND GERÄTE... 28
4
ERGEBNISSE... 29
4.1 BESTIMMUNG MITOCHONDRIALER DNA-SEQUENZEN... 29
4.1.1 Amplifikation mitochondrialer Genabschnitte mittels PCR... 29
4.1.2 COI-Sequenzen ... 31
4.1.3 16S rDNA-Sequenzen ... 33
4.1.4 Phylogenetische Gruppierung der erhaltenen Sequenzen ... 34
4.1.5 Sequenzvariabilität innerhalb der Arten (intraspezifische Variabilität) ... 36
4.1.6 Sequenzunterschiede zwischen den Arten (interspezifische Variabilität)... 38
4.2 SELEKTION VON OLIGONUKLEOTID-SONDEN... 42
4.3 UNTERSUCHUNG VON HYBRIDISIERUNGSPARAMETERN... 46
4.3.1 Hybridisierungstemperatur... 46
4.3.2 Salzkonzentration der Waschlösung ... 51
4.3.3 Temperatur der Waschlösung... 53
4.4 EVALUIERUNG DER SONDENSÄTZE... 54
4.4.1 Spezifität und Sensitivität der DNA-Sonden... 56
4.4.2 Signalstärke und Bindungsposition der Sonden ... 61
4.4.3 Einfluss von Basenfehlpaarungen auf die Sondenspezifität... 61
4.4.4 Hybridisierung von Ziel-DNA-Gemischen ... 66
4.4.5 LNA-Sonden ... 69
III
5
DISKUSSION ... 78
5.1 EIGNUNG DER COI-UND 16SRDNA-SEQUENZEN FÜR DIE SONDENAUSWAHL.... 79
5.2 OPTIMIERUNG DER MIKROARRAY-HYBRIDISIERUNGSBEDINGUNGEN... 81
5.3 QUALITÄT DER AUSGEWÄHLTEN DNA-SONDEN... 82
5.4 HYBRIDISIERUNG VON KOMPLEXEN PROBEN... 85
5.5 LNA- UND HEG-MODIFIZIERTE SONDEN... 86
5.6 AUSBLICK... 87
6
ABKÜRZUNGEN ... 90
7
LITERATUR ... 91
1. Zusammenfassung 1
1 Zusammenfassung
DNA-Mikroarrays sind seit etwa zehn Jahren eine unverzichtbare Methode der genomischen und biomedizinischen Forschung. Sie werden überwiegend zur Untersuchung von Veränderungen der Genexpression eingesetzt, dienen in zunehmendem Maße aber auch der DNA-Analyse komplexer Umweltproben. Bei der Organismen-Identifikation sind im Unterschied zur Expressionsanalyse zusätzliche Komplikationen zu beachten, da keine Vergleichsmessung zwischen unterschiedlich markierten Hybridisierungsproben, sondern Absolutwerte der Hybridisierungssignale gemessen werden. Außerdem muss bei dieser Analytik nicht nur gegen DNA-Sequenzen des jeweils untersuchten Genoms, sondern auch gegen Sequenzähnlichkeiten in den Genomen verwandter Arten diskriminiert werden.
In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines DNA-Mikroarray-Prototyps vorgestellt, der diese Problematik bei der Identifikation von Dorsch- und Plattfischarten in Planktonproben berücksichtigt. Hierzu wurden von Dorschfischen und Plattfischen der Deutschen Bucht und südlichen Nordsee Teile der mitochondrialen Gene Cytochrom-Oxidase I (COI) und 16S rDNA sequenziert, zur Sondenauswahl genutzt, entsprechende Mikroarrays hergestellt und mit Erfolg an Fischproben getestet.
Die Analyse der erhaltenen Sequenzen zeigte, dass die COI-DNA-Sequenzen genügend Sequenzvariabilität besitzen, um Oligonukleotid-Sonden auch zur Detektion sehr nah verwandter Fischarten wie z.B. der Scholle (Pleuronectes platessa) und der Flunder (Platichthys flesus) entwerfen zu können.
Die DNA-Sequenzen der 16S rRNA-Gene wiesen innerhalb der Familien geringere Variabilitäten auf, so dass es nicht möglich war, für die eng verwandten Arten der Schollen und Flundern (Pleuronectidae) Spezies-spezifische Sonden auszuwählen. Allerdings eignet sich das 16S rRNA Gen gut zur Unterscheidung von Fischarten der Familien Seezungen (Soleidae) und Steinbutte (Scophthalmidae).
Als Ergebnis wurde ein COI-basierter Satz von 34 Sonden zur Identifizierung der Arten Kabeljau (Gadus morhua), Wittling (Merlangius merlangus), Flunder (Platichthys flesus), Kliesche (Limanda limanda), Scholle (Pleuronectes platessa), Doggerscharbe (Hippo-glossoides platessoides), Rotzunge (Microstomus kitt) und Seezunge (Solea solea) sowie ein 16S rDNA-Sondensatz von zehn Sonden zur Detektion der Fischarten Glattbutt (Scoph-thalmus rhombus), Steinbutt (Psetta maxima), Seezunge und Zwergzunge (Buglossidium luteum) ausgewählt. Ihre experimentelle Erprobung in entsprechend hergestellten Mikro-arrays führte bei Festlegung der fünffachen Signalstärke der Negativkontrollsonde als Schwellenwert zu 34 Spezies-spezifischen, sechs falsch-negativen und vier falsch-positiven Sonden, deren Hybridisierungssignale allerdings sehr unterschiedliche Intensitäten aufwiesen. Als Ursachen wurden u.a. die Bindungsposition der Sonden, die Konzentration der Ziel-DNA und die Gegenwart von Fremd-DNA gefunden.
1. Zusammenfassung 2 LNA-modifizierte Sonden, die mit dem Ziel getestet wurden, die Spezifität der Hybridi-sierung zu erhöhen, führten in einigen Fällen zu Verbesserungen von Spezifität und Sen-sitivität, aber erhöhten auch den Anteil von falsch-negativen oder unspezifischen Signalen. Durch eine Verlängerung der LNA-haltigen und der normalen DNA-Sonden mit Hilfe von HEG2-Spacern wurde zwar eine z.T. deutliche Steigerung der Signalintensität erreicht, jedoch traten vermehrt unspezifische Signale auf.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals demonstriert, dass die gleichzeitige DNA-analytische Identifizierung zahlreicher und selbst eng verwanderter Fischarten mit Hilfe eines einzigen „Fisch-Chips“ möglich ist. Ein entsprechender Prototyp wurde hergestellt und seine Funktionalität bestätigt.
Um ihn für den Praxiseinsatz zur Überwachung der Fischbestände und zur Qualitätskontrolle im Fischhandel einsetzen zu können, müssen das Spektrum der DNA-Sondern erweitert, die Quantifizierung der Hybridisierungssignale verbessert und seine Zuverlässigkeit anhand standardisierter Umweltproben unter Praxisbedingungen getestet werden.
2. Einleitung 3
2 Einleitung
Im April 1953 beschrieben James Watson und Francis Crick in der Zeitschrift Nature die Doppelhelixstruktur der Desoxyribonukleinsäure (DNA) mit den spezifischen Basen-paarungen Adenin-Thymin und Guanin-Cytosin (Watson und Crick, 1953a), die die Grundlage für den Kopiermechanismus des genetischen Materials, der DNA-Replikation (siehe Abbildung 2.1), darstellen (Watson und Crick, 1953b).
Die in der DNA-Analytik angewendete Nukleinsäurehybridisierung, die Duplexbildung von Nukleinsäuresträngen aufgrund von komplementären Basenabfolgen („Sequenzen“), stellt gewissermaßen die Umkehr der Replikation dar und nutzt deren in Jahrmillionen optimierte Exaktheit (siehe Abbildung 2.1).
Abb. 2.1: DNA-Replikation
Bei der DNA-Replikation trennen sich die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix. An beiden Strängen werden neue DNA-Stränge synthetisiert, deren Sequenzabfolgen durch Basenpaarung von Desoxy-nukleosidtriphosphaten mit den Matrizenmolekülen gebildet werden. Es entstehen somit zwei identische DNA-Moleküle. Abbildungsquelle: http://www.genome.gov
Basierend auf dem Prinzip der Nukleinsäurehybridisierung sind bis heute eine Vielzahl verschiedener DNA-analytischer Techniken für biomedizinische, ökologische oder foren-sische Fragestellungen entwickelt worden. Dazu zählen z.B. die Blotting-Verfahren, wie z.B. das von Edwin Southern entwickelte Southern Blotting für den Nachweis von DNA
„Die Affinität zwischen einem DNA-Strang und seiner Komplementär-Sequenz ist unter den in der Natur bekannten Wechselwirkungen eine der stärksten und spezifischsten.“
2. Einleitung 4 (Southern, 1975) oder das Northern Blotting für die Analyse von RNA (Thomas, 1980), und die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), die z.B. in der medizinischen Diagnostik verwendet wird, um numerische Chromosomenaberrationen zu erkennen (Stumm et al., 2006). Genutzt wird sie aber auch in der ökologischen Forschung zur Identifizierung von Mikroorganismen in ihrer natürlichen Umgebung (Amann et al., 2001). Ebenso kann mittels in-situ-Hybridisierung die Expression von spezifischen Genen in Gewebeschnitten nach-gewiesen und lokalisiert werden (Cox et al., 1984). Zu nennen ist in diesem Zusammenhang auch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) von Kary Mullis, die wohl zu den wichtigsten auf DNA-Hybridisierung basierenden Methoden zählt, da sie durch die exponentielle Vervielfältigung spezifischer DNA-Fragmente für eine Vielzahl anderer DNA-Techniken Voraussetzung ist (Mullis et al., 1986).
Bedingt durch die Entwicklung von Hochdurchsatz-Sequenziergeräten und dem damit verbundenen enormen Anstieg an Sequenzdaten wurden in den letzten zwanzig Jahren analytische Werkzeuge für die simultane Sequenzanalyse erforderlich, um diese unermess-lichen Sequenzinformationen aufzubereiten und für die biomedizinische Forschung nutzbar zu machen. Saiki et al. führten das Prinzip der reversen Hybridisierung ein, bei dem statt der zu untersuchenden Probenmoleküle die Sondenmoleküle auf einer Trägerfläche (Nylon-membran) immobilisiert und mit der zu analysierenden durch PCR vervielfältigten Ziel-DNA hybridisiert wurden (Saiki et al., 1989). Nachdem das DNA-Mikroarray-Format ursprünglich für das Sequencing by Hybridization (Bains und Smith, 1988) und für das DNA-Mapping (Craig et al., 1990) entwickelt worden war, stellten Schena et al. schließlich eine Methode zur Messung der Genexpression vor, bei der cDNA-Sonden mit einem Roboter auf Glassobjekt-träger in einem Mikroarray-Format aufgebracht wurden und mit fluoreszenzmarkierten RNA-Molekülen hybridisieren konnten (Schena et al., 1995).
Inzwischen sind mehr als zehn Jahre vergangen und die Mikroarray-Technologie hat sich in vielen Gebieten als Hochleistungssystem für die Forschung etabliert und wird zunehmend auch in Routineanwendungen genutzt, wie z.B. das Transcriptional Profiling oder die Single Nucleotide Polymorphism (SNP)-Genotypisierung (siehe Hoheisel, 2006). Es existieren verschiedenste Mikroarray-Plattformen, die z.B. DNA-Sonden, Antikörper, Zelllysate, aufgereinigte Proteine, Kohlenhydrate oder Lipide (Venkatasubbarao, 2004) und sogar Gewebeschnitte und intakte Zellen enthalten (siehe Joos und Kroeger, 2008). Die Fragestel-lungen für Mikroarray-gestützte Studien reichen von der Untersuchung der Genexpressions-profile, der Identifizierung von SNP-Genotypen und der Lokalisation spezifischer genetischer Veränderungen, die für die Krebstherapie von entscheidender Bedeutung sind (siehe Kallioniemi, 2008), bis hin zu Untersuchungen der microRNA (miRNA)-Expression (Liang et al., 2005) oder der Proteomanalyse. Die Identifizierung von Organismen aufgrund ihrer spezifischen DNA-Sequenzen ist eine wichtige Fragestellung, die durch die Anwendung von DNA-Mikroarrays entscheidend vereinfacht und parallelisiert werden kann und Inhalt dieser Arbeit ist.
2. Einleitung 5
2.1 Die DNA-Mikroarray-Technologie
Als DNA-Mikroarrays werden im Allgemeinen kleine Glas-, Kunststoff- oder auch Siliziumträger mit rasterartig immobilisierten DNA-Sonden bezeichnet. Dabei repräsentiert jeder mikroskopisch kleine und in seiner Position definierte „Spot“ auf dem Array ein bestimmtes Sondenmolekül im picomol-Bereich (siehe Abbildung 2.2) und insgesamt können Tausende oder sogar über zwei Millionen (NimbleGen HD2 Arrays, Roche) verschiedene Sonden für den simultanen Nachweis unzähliger Nukleinsäure-Moleküle („Targets“) vorhanden sein.
Abb. 2.2: DNA-Mikroarray-Technologie
Oben links: DNA-Mikroarray-Herstellung. Mitte: Ausschnitt eines DNA-Mikroarrays mit hybri-disierter Ziel-DNA (in blau). Unten rechts: Ausschnitt einer farbkodierten Mikroarray-Scannerauf-nahme.
Die DNA-Technologie beinhaltet im Wesentlichen folgende Schritte, die je nach Art der Fragestellung variieren können:
x Auswahl des Sondentyps und der Sondensequenzen,
x Herstellung der DNA-Mikroarrays durch Aufbringen der Sondenmoleküle (siehe Abbildung 2.2 oben links),
x Präparation der zu analysierenden Ziel-DNA-Moleküle („Targets“), x Prähybridisierungsbehandlung der Mikroarrays (optional),
x Hybridisierungsreaktion (siehe Abbildung 2.2 Mitte), x Posthybridisierungsbehandlung,
2. Einleitung 6 x Detektion der Hybridisierungssignale (siehe Abbildung 2.2 unten rechts) und x Datenanalyse.
Dabei ist die Selektion der Sondensequenzen ein für diese Arbeit besonders wichtiger Bestandteil.
2.1.1 Selektion der Sondensequenzen
DNA-Mikroarrays enthalten in der Regel entweder kurze (ca. zwanzig Nukleotide) oder lange (um die 60 Nukleotide) Oligonukleotide, cDNA-Fragmente oder Genomfragmente. Für die Auswahl des Sondentyps ist die Art der zu untersuchenden Probe von entscheidender Bedeutung. In Analysen zur Organismenidentifikation wird in der Regel auf Extrakte der Gesamt-DNA zurückgegriffen, in denen das gesamte, meistens noch größtenteils unbekannte Genom mit sämtlichen nichtkodierenden DNA-Sequenzen und eventuellen Pseudogenen vorhanden ist. Werden Sonden entwickelt, die auch in Mikroarray-Techniken genutzt werden sollen, die ohne eine initiale Reduktion der Sequenzkomplexität wie z.B. eine PCR-Ampli-fikation auskommen, so muss dieses beachtet werden. Außerdem müssen die Sonden in der Lage sein, sehr ähnliche Ziel-DNAs von verwandten Organismen zu diskriminieren, so dass lange DNA-Sondenmoleküle (z.B. cDNAs oder lange Oligonukleotide) ausscheiden. In Gen-expressionsstudien, bei denen als Ausgangsmaterial cDNA verwendet wird, finden jedoch längere und kürzere Sondenmoleküle Verwendung.
Für Genexpressionsstudien oder SNP-Analysen beim Menschen oder in üblichen Tiermodellen sind ausgewählte Sonden-Bibliotheken in Form von vorgefertigten DNA-Mikroarrays erhältlich, wie z.B. die GeneChip Arrays der Firma Affymetrix. Für die Identi-fizierung verschiedener Organismen in komplexen Proben müssen Oligonukleotid-Sonden jedoch in der Regel eigens ausgewählt werden. Eine manuelle Sondenauswahl basiert z.B. auf Sequenz-Alignments, in denen homologe Sequenzpositionen untereinander stehen und potentielle Kandidatenbereiche mit genügender Variabilität erkannt werden können. Die Auswahl kann heute aber auch mit speziell entwickelten Computerprogrammen in-silico geschehen (z.B. MiCoNet, Universität Bremen), mit denen Oligonukleotid-Bibliotheken generiert werden, die hinsichtlich ihrer Ziel-DNA-Sensitivität und -Spezifität durch aufwän-dige thermodynamische Sequenzabgleiche mit großen Sequenzdatenbanken optimiert sind. Ebenfalls werden andere für die Hybridisierung relevante Eigenschaften wie Sekundär-struktur, Schmelztemperatur und Dimerbildung in Betracht gezogen (Nölte, 2002).
Eine zentrale Herausforderung liegt in der Erfordernis, Sonden zu entwickeln, die gleichzeitig eine hohe Bindungseffizienz und eine hohe Ziel-DNA-Spezifität aufweisen. Hierzu werden verschiedene Ansätze verfolgt. Lockhart et al. veröffentlichten eine Zusammenstellung heuristischer Regeln, z.B. über die Anzahlen von bestimmten Basen, die zu sensitiven und spezifischen Sonden führten (Lockhart et al., 1996). Untersuchungen zum Bindungsverhalten unterschiedlicher Sondensequenzprofile („Pentamerprofile“) wurden von Todt (2005) durchgeführt. Andere WissenschaftlerInnen berechnen die Sekundärstrukturen der
Ziel-DNA-2. Einleitung 7 Fragmente mit speziellen Computerprogrammen, z.B. mit dem von Zuker entwickelten mfold (Zuker, 2003), um die Sondenbindung gezielt in zugänglichen Bereichen (Loops) zu wählen. Außerdem kann die Einführung von Spacer- oder Linkermolekülen (z.B. polyT-Abfolgen oder HEG-Moleküle) eine Steigerung der Sonden-Bindungseffizienz bewirken, indem ste-rische Effekte der Oberfläche vermindert und lösungsähnliche Hybridisierungsbedingungen geschaffen werden (Pirrung, 2002).
Zusätzlich ist in den letzten zwanzig Jahren eine Fülle von DNA- und RNA-Analoga synthe-tisiert worden, um die spezifische Erkennung von Nukleinsäuren zu verbessern (Singh et al., 1998), wie z.B. Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) (Liu et al., 2007). Eine interessante synthe-tische Nukleinsäurevariante stellen die Locked Nucleic Acids (LNAs) dar, auf die im folgenden Abschnitt näher eingegangen werden soll, da sie auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurden.
2.1.2 LNATM-modifizierte Sonden
Bei den Locked Nucleic Acids (LNAs) handelt es sich um eine neue Klasse von bizyklischen RNA-Analoga, die eine besondere Affinität und Spezifität für komplementäre DNA- und RNA-Moleküle aufweisen (Singh et al., 1998). In LNA-Molekülen (siehe Abbildung 2.3) ist das 2’-Sauerstoffatom des Ribosezuckers mit dem 4’-Kohlenstoffatom über eine Methylen-brücke verbunden, die das Molekül in einer Konformation fixiert („locked“), die eine effizientere Stapelung der Basen in LNA/DNA-Duplexen bewirkt und die Hybridisierungs-effizienz steigert (Nielsen et al., 1999).
Abb. 2.3: Chemische Struktur eines LNA-Monomers
Der Ribosering des Nukleinsäuremoleküls ist in LNA-Molekülen durch eine Methylenbrücke zwischen dem Sauerstoffatom an der 2’-Position mit dem Kohlenstoffatom an der 4’-Position ver-bunden. Somit wird das Molekül in einer RNA-artigen Konformation fixiert („locked“) (abgebildet auf der rechten Seite). Abbildung aus Kauppinen et al. (2005).
Oligonukleotide, die an einigen Positionen LNA-Moleküle enthalten, besitzen nicht nur stärkere Affinitäten zu komplementären Ziel-DNA-Sequenzen, sondern können auch besser Ziel-DNAs mit Basenfehlpaarungen diskriminieren. Außerdem kann durch die selektive
2. Einleitung 8 Einführung von LNA-Basen die Schmelztemperatur der Hybridisierungsreaktion gezielt eingestellt werden (Mouritzen et al., 2003).
LNA-modifizierte Oligonukleotide wurden in einer Reihe von Studien für die gezielte Beeinflussung von zellulären RNA-Molekülen genutzt, wie z.B. in antisense-vermittelten Gen-silencing-Studien (Kauppinen et al., 2005). Es werden auch LNA-modifizierte small interfering RNAs ausgetestet (Elmén et al., 2005). Eine besondere Rolle spielen LNA-modifizierte Oligonukleotide für die Identifizierung von MicroRNAs (miRNAs), die z.B. in der Krebsdiagnose von Bedeutung sind (Kauppinen et al., 2005) und mit Mikroarray-Plattformen (miCURY LNA) der Firma Exiqon (Dänemark) untersucht und quantifiziert werden können (siehe z.B. Castoldi et al., 2007).
Aber auch bei der Identifizierung von Ziel-DNA-Sequenzen finden LNA-modifizierte Oligonukleotide Anwendung, wie z.B. in Real-Time-PCRs (Johnson et al., 2004), in Mikroarray-Experimenten (Choleva et al., 2001) oder in der Fluoreszenz-in-situ-Hybri-disierung (FISH) (Silahtaroglu et al., 2003 und 2004).
2.1.3 Herstellung von Mikroarrays
Im wesentlichen existieren zwei verschiedene Herstellungsverfahren für DNA-Mikroarrays. Der Transfer von vorab gefertigten DNA-Lösungen durch spezielle Robotersysteme („Spotting“ oder „Printing“) wird entweder über kontaktfreie Verfahren vermittelt, wie z.B. das für Tintenstrahldrucker entwickelte Inkjet-Verfahren (Okamoto et al., 2000), Piezo-kristall-gesteuerte Mikropipettier-Roboter und druckgesteuerte Nanoliter-Dispenser (TopSpot-Technologie) (Gutmann et al., 2004), oder über Kontaktverfahren mit speziellen Nadeln („Pins“) (Auburn et al., 2005). Diese Verfahren bieten den Anwendern durch individuelle Gestaltung des Mikroarray-Designs große Flexibilität. Nach dem Aufbringen der Sonden-moleküle erlauben verschiedenste chemische Prozesse die kovalente Bindung der Oligo-nukleotide an die funktionalisierte Trägeroberfläche (siehe z.B. Todt und Blohm, 2009). Eine Deaktivierung nicht gebundener funktioneller Gruppen muss nach der Anbindung der Sondenmoleküle stattfinden, um eine unspezifische Reaktion der Ziel-DNA-Fragmente mit der Trägeroberfläche zu verhindern. Alternativ werden jedoch auch Mikroarrays verwendet, deren Sondenmoleküle auf der Trägeroberfläche nicht kovalent gebunden sind (Call et al., 2001).
Für die kommerzielle Herstellung von High-Density-Mikroarrays ist die photolithographische in-situ-Synthese geeignet, die von der Firma Affymetrix in den frühen 1990er Jahren entwickelt wurde, da hier die Anzahl verschiedener Sonden deutlich größer sein kann (Pease et al., 1994). Durch die Verwendung von Mikrospiegeln statt unflexibler Belichtungsmasken kann auch hier Flexibilität des Mikroarray-Designs erreicht werden (z.B. Maskless Array Synthesizer (MAS)-Technologie, Roche NimbleGen).
Eine Erhöhung der Dichte funktioneller Gruppen zur Anbindung der DNA-Sonden kann z.B. durch die Beschichtung der Trägeroberfläche mit Dendrimeren (Le Berre et al., 2003) oder
2. Einleitung 9 einem Epoxysilan-Aminosilan-Gemisch erreicht werden (Auburn et al., 2005) und die Sensitivität der Hybridisierungsreaktion steigern. Auch werden neue Trägersubstrate verwen-det, die die Sensitivität der Mikroarray-Analyse erhöhen, wie z.B. die Beschichtung der Objektträger mit Silber (Sabanayagam und Lakowicz, 2007) oder einer Optical Interference (OI)-Beschichtung (Redkar et al., 2006). Die Umsetzung genomischer Mikroarrays in planaren Hohlleiter-Plattformen mit evaneszenten Feldern erlaubt z.B. die direkte Detektion von gering exprimierten Genen (Duveneck et al., 2002). Ebenfalls nutzen Evanescent Resonator Chips (ER chips) die Signalamplifikation von Fluorophoren, die in einem evaneszenten Feld an die Oberfläche des Trägers gebunden sind (Neuschäfer et al., 2003). Neben planaren Trägersubstanzen werden inzwischen auch nicht-planare Mikroarray-Formate entwickelt und angeboten, wie z.B. Mikroarrays aus Netzwerken von Mikrokanälen, cyto-metrische Bead-Arrays, Mikropartikel mit integrierten Barcodes, Mikroarrays, deren Kompo-nenten kleine Kügelchen sind, die als Mikrosender fungieren (zur Übersicht siehe Venkatasubbarao, 2004) oder die Illumina Bead-Arrays (Fan et al., 2006), deren Herstellung auf der zufälligen Anordnung von Mikrokügelchen in winzigen Vertiefungen an den Enden von Glasfaserbündeln basiert (Michael et al., 1998), und die z.B. auch für Next Generation-Sequenzierungstechniken eingesetzt werden.
2.1.4 Präparation der Ziel-DNA
Während in Expressionsstudien die zu untersuchende fluoreszenzmarkierte cDNA-Probe in der Regel in einer kompetitiven Reaktion zusammen mit einer Referenzprobe mit einer weiteren Fluoreszenzmarkierung hybridisiert wird und aus den Mischungsverhältnissen der Fluoreszenzfarbstoffe an den unterschiedlichen Positionen Steigerungen oder Senkungen der Genexpression bestimmt werden, so ist dies für die Identifizierung von Organismen ohne weiteres nicht möglich. (Allerdings wurde eine quantitative Analyse von Bakterien des menschlichen Darms mit Hilfe eines künstlichen Gemischs markierter DNA-Fragmente als Referenzprobe beschrieben (Palmer et al., 2006)). Eine weit verbreitete Methode für die Analyse von Organismen ist die Markierung der Ziel-DNA mit einem einzelnen Fluoreszenz-farbstoff, wie z.B. Cy3 oder Cy5, die z.B. durch eine PCR mit endständig markierten Primern oder durch den Einbau von markierten Nukleotiden erfolgt.
Vor der Hybridisierung werden die markierten Ziel-DNA-Fragmente in geeignete Puffer überführt, mit denen die Stringenz der Hybridisierung beeinflusst werden kann. Die Ziel-DNA-Doppelstränge werden schließlich, z.B. durch die Zufuhr von Wärme, in Einzelstränge überführt, um die Sondenbindungsbereiche für die immobilisierten Sonden zugänglich zu machen.
2. Einleitung 10
2.1.5 Hybridisierungsreaktion
Die Hybridisierung, der oftmals eine Vorbehandlung der Mikroarrays ohne Ziel-DNA vorangeht (Prähybridisierung), dauert typischerweise eine bis zehn Stunden (Graves, 1999) und wird häufig über Nacht durchgeführt, obwohl längere Hybridisierungszeiten durchaus die Hybridisierungseffizienzen steigern können (siehe Todt, 2005). Es sind auch Mikroarrays mit Mikroelektroden unter den Spots entwickelt worden, um die Hybridisierung zu beschleunigen (Graves, 1999). In anderen Plattformen werden Mikroarrays mit Komponenten der Mikro-fluidik-Technologie versehen (z.B. in der Geniom-Technologie von febit), was neben der Automatisierung der Hybridisierungsprozeduren zu einer beschleunigten Hybridisierungs-reaktion bei deutlich reduzierter Ziel-DNA-Menge führen kann (z.B. Peytavi et al., 2005; Wei et al., 2005).
Die Spezifität der Hybridisierungsreaktion wird durch die Stringenz der Reaktions-bedingungen gewährleistet. Hierfür sind kritische Faktoren u.a. der Salzgehalt in der Hybri-disierungslösung, Formamidzusätze, die Hybridisierungstemperatur und die Art der Post-hybridisierungsbehandlung. Inzwischen sind sogar Geräte entwickelt worden, die alle Schritte von der Probenbeladung bis zur Signaldetektion in einem einzigen Gerät vereinen (Geniom RT Analyzer der Firma febit).
2.1.6 Detektionsmethoden
Das wohl üblichste Detektionsverfahren in der Mikroarray-Technologie ist das Auslesen der Fluoreszenzsignale mit speziellen Mikroarray-Scannern oder CCD-Kameras (Cheung et al., 1999). Zwei häufig verwendete Fluoreszenzfarbstoffe sind die Cyanin-Farbstoffe Cy5 (Emission bei 570 nm) und Cy3 (Emission bei 670 nm). Während in Expressionsanalysen meist Zweikanalmessungen vorgenommen und die Intensitäten einer Testprobe mit einer Referenzprobe verglichen werden (s.o.), wird bei der Identifizierung von Organismen in der Regel nur mit einem Fluoreszenzfarbstoff gearbeitet.
Neben der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen können weitere Reportersysteme zum Einsatz kommen, wie z.B. Chemolumineszenz-Reaktionen im Expression Array System der Firma Applied Biosystems oder die Bindung von Streptavidin-Quantum Dot-Konjugaten an biotinylierte DNA-Moleküle (Liang et al., 2005). Kostengünstigere Methoden stellen kolorimetrische Detektionsverfahren dar, wie z.B. das Silverquant-System (Eppendorf). Auch Goldpartikel werden verwendet, weil sie sehr effizient Licht streuen (Resonance Light Scattering (RLS) Particles) und dadurch die Hybridisierungssignale verstärken, deren Detektion mit CCD-Kameras erfolgt (Bao et al., 2002).
In den meisten Mikroarray-Versuchen wird die Hybridisierungsreaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebrochen, worauf die Hybridisierungssignale als Endergebnis zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden. Es gibt aber Bestrebungen, die Hybridisierungsreaktion online zu verfolgen und Hybridisierungssignale konstant zu messen. In on-chip-Hybridisierungs-experimenten, z.B. unter Verwendung eines Optical Scanning Array (OSA) Readers mit
2. Einleitung 11 integrierter Hybridisierungskammer oder Mikroarrays, die auf der Oberflächenplasmonen-resonanz-Bildgebung basieren (Mannelli et al., 2007), ist es möglich, Hybridisierungs-reaktionen in Echtzeit zu verfolgen und Hybridisierungskinetiken oder Schmelzkurven von Duplexen zu untersuchen (Khomyakova et al., 2007).
Verschiedene optische, mechanische und elektrische Technologien versprechen die Entwick-lung von Mikroarray-Plattformen, die ohne eine Markierung der Ziel-DNA auskommen, wie z.B. die Reflektometrische Interferenzspektroskopie (RIfS) (Pröll et al., 2005), Nanoscale Optofluidic Sensor Arrays (NOSA) (Mandal und Erickson, 2008) oder Oberflächenplasmo-nenresonanz-Sensoren (Mannelli et al., 2007). Eine weitere sich in der Entwicklung befin-dende Methode zur Detektion von unmarkierten Ziel-DNA-Molekülen auf DNA- oder PNA-Biosensorchips ist z.B. die Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry (TOF-SIMS) (Arlinghaus et al., 2004). Ein Artikel beschreibt sogar die Entwicklung eines DNA-Mikro-arrays, der mit verschiedenen Analysetechnologien kompatibel ist und durch Massenspek-troskopie (MALDI-TOF/MS), optische Methoden (Fluoreszenzmessung und enzyminduzierte Metallablagerung) und mikroskopische Techniken (Rasterkraftmikroskopie) ausgelesen wer-den kann (Ibáñez et al., 2008).
In der Regel liegen die Ziel-DNA-Fragmente in geringen Konzentrationen vor, so dass sie vor der Hybridisierung durch eine PCR vervielfältigt werden müssen. Die enzymatische Reaktion führt jedoch nicht zu linearen Vervielfältigungen, so dass gerade Moleküle, die in geringen Kopiezahlen vorliegen, nach der Amplifikation unterrepräsentiert sind. Um diesen DNA-Amplifikationsschritt zu umgehen, sind viele Methoden entwickelt worden, die eine Amplifikation der Signale bewirken. Dazu zählen z.B. die Tyramid-Signalamplifikation (Karsten et al., 2002), die Rolling Circle-Amplifikation (Nallur et al., 2001) oder die Signalsteigerung durch eine zweite Hybridisierung mit fluoreszenzmarkierten Dendrimer-molekülen (Stears et al., 2000).
2.1.7 Aktuelle Entwicklungen der Mikroarray-Technologie
Das Feld der Mikroarray-Technologie hat sich in den letzten Jahren noch einmal dramatisch verändert, indem traditionelle Mikroarray-Methoden mit anderen molekularbiologischen Techniken vereint und fortgeschrittene Mikroarray-Plattformen für vielfältige Anwendungen entwickelt worden sind.
Der GoldenGate-Assay von Illumina erlaubt z.B. Gentypisierungs-Untersuchungen durch die Hybridisierung mit SNP-spezifischen Oligonukleotiden gefolgt von Allel-spezifischen Primerextensions- und Ligationsreaktionen, deren Produkte über PCR vervielfältigt und auf Illumina Bead-Arrays analysiert werden (Fan et al., 2003; 2004). Weitere Möglichkeiten für Genotypisierungsanalysen bieten z.B. Single Base Extension-Tag Array on Glass Slides (SBE-TAGS) (Hirschhorn et al., 2000) oder das Solid Phase Minisequencing (Pastinen et al., 1997; Lindroos et al., 2002; Klitø et al., 2007). Ein interessanter Ansatz besteht in der Verwendung von zirkulären DNA-Sonden, sogenannten Molecular Inversion Probes oder
2. Einleitung 12 Padlock Probes (Hardenbol et al., 2003; 2005; Rühle et al., 2009) wie z.B. im Molecular Inversion Probe Assay der Firma ParAlelle BioScience.
Durch die Möglichkeit, SNP-Genotypisierungen in großem Maßstab durchzuführen, können in genomweiten Assoziations-Studien (GWAS) z.B. SNPs identifiziert werden, die mit Prädispositionen gegenüber komplexen Erkrankungen assoziiert sind (siehe Syvänen, 2005). Außerdem versprechen sie die Verwirklichung der Vision einer personalisierten Medizin (Fan et al., 2005).
Weitere Anwendungen von fortgeschrittenen Mikroarray-Systemen sind z.B. Comparative Genomic Hybridization (CGH)-Analysen, in denen Unterschiede in der Anzahl von genomischen Kopiezahlen, z.B. für die Krebsdiagnostik, ermittelt werden (Kallioniemi, 2008), DNA-Methylierungsuntersuchungen (Fan et al., 2005), Identifizierungen von alter-nativen Splicevarianten (Blencowe, 2006; Yeakley et al., 2002), genomische Tiling-Arrays, die das Auffinden von exprimierten DNA-Sequenzen ermöglichen (Bertone et al., 2004) oder die On-Chip Chromatin Immunprecipitation (ChIP-on-chip) (Ren et al., 2000). Die Firma febit bietet zudem ein DNA-Mikroarray-System (HybSelect) zur Anreicherung von spezifischen Genomregionen für die gezielte Sequenzierung mit Next Generation-Sequenziergeräten an.
2.1.8 DNA-Mikroarrays zur Identifizierung von Organismen
Die meisten Mikroarray-basierten Arbeiten zur Organismen-Identifizierung beschreiben die Untersuchung von humanpathogenen Mikroorganismen (z.B. Kumar et al., 2008) oder Mikroorganismen in Umweltproben wie z.B. in Erdbodenextrakten (Small et al., 2001), Flusssedimenten (Peplies et al., 2006) oder im marinen Plankton (Peplies et al., 2004).
Für Biodiversitätsstudien höherer Organismen stellten Pfunder et al. 2004 einen DNA-Mikroarray vor, mit dem Spitzmaus- und Wühlmausarten identifiziert werden können, und plädierten für die Entwicklung eines „Mammalia-Chips“ für die Überwachung aller europäischer Säugetierarten oder sogar eines „Biodiversitäts-Chips“ für Schlüsselarten verschiedener Taxa von Bakterien bis hin zu Säugetieren.
DNA-Mikroarrays können jedoch nicht nur für Biodiversitätsstudien, sondern auch in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln (z.B. zur Detektion von gentechnisch modifizierten Organismen (Leimnis et al., 2006) oder Fischpathogenen (Warsen et al., 2004)) oder für die Fischereibiologie genutzt werden. So wurde z.B. ein DNA-Mikroarray für die Identifizierung von genetischen Fischbeständen von Ketalachsen (Moriya et al., 2005) erfolgreich in der Beringsee und dem nördlichen Pazifischen Ozean angewendet (Moriya et al., 2007). Auch für die marine Biodiversitäts- und Ökosystemforschung sind DNA-Mikroarrays für Fische (Kochzius et al., 2008), Invertebraten (Chitipothu, 2008) und Phytoplankton (Metfies und Medlin, 2008) im Rahmen des EU-Projekts „Fish and Chips“ (http://www.fish-and-chips.uni-bremen.de) entwickelt worden.
2. Einleitung 13 Fischbestandsabschätzungen, die nicht nur aufgrund von Fischfängen, sondern auch durch Ichthyoplanktonanalysen (Fox et al., 2008) berechnet werden, können durch die Entwicklung von DNA-Mikroarrays für fischereiwirtschaftliche Fischarten enorm vereinfacht werden, die zudem auch in Qualitätskontrollen von Fischprodukten eingesetzt werden können. Zusätzlich kann die Herkunft von Fischprodukten verfolgt werden, indem DNA-Mikroarrays mit Sonden für einzelne Fischpopulationen bestückt werden, ein Prinzip, das das FP7-EU-Projekt FishPopTrace zum Ziel hat (https://fishpoptrace.jrc.ec.europa.eu).
Kürzlich wurde die Entwicklung eines Oligonukleotid-Arrays basierend auf Cytochrome b-Sequenzen zur Identifizierung von 71 Wirbeltierarten, u.a. auch Fischarten, beschrieben (Teletchea et al., 2008), der die korrekte Identifizierung von mindestens fünf Arten in Mischproben erlaubte und bei Mischproben zweier Arten im Verhältnis von 1 zu 10 semiquantitative Aussagen zuließ.
Ein entscheidendes Kriterium für die Entwicklung von Mikroarrays zur Identifizierung von Organismen ist die Bestimmung sinnvoller Markergene mit geeigneten Variabilitäten zwischen bzw. innerhalb der Arten, die im nächsten Abschnitt behandelt werden.
2.2 Markergene zur Organismenidentifikation
Die Sequenzierung von geeigneten Genfragmenten oder auch nicht-kodierender DNA ermöglicht die Zuordnung von Individuen zu taxonomischen Einheiten. Mit Hilfe von bestimmten Gensequenzen kann z.B. die Art eines Individuums bestimmt werden, aber auch die Zuordnung auf höheren taxonomischen Ebenen oder zu bestimmten Populationen innerhalb einer Spezies erfolgen.
In der Mikrobiologie hat sich die Identifizierung von Organismen aufgrund ihrer DNA-Sequenzen schon seit geraumer Zeit durchgesetzt und geschieht in der Regel durch die Bestimmung der 16S rRNA- oder DNA-Sequenzen (Ludwig et al., 2004) oder mit Hilfe von FISH-Analysen (Peplies et al., 2003). Aber auch in höheren Lebewesen werden DNA-Sequenzen für phylogenetische Studien und zunehmend zur Identifizierung von Lebewesen genutzt.
Geeignete Markergene für die Organismenidentifizierung müssen zum einen innerhalb einer Art konserviert sein, sollten also möglichst keine oder nur wenige Polymorphismen zwischen den Individuen einer Art aufweisen, und zum anderen müssen sie im Vergleich zu verwandten Arten ausreichende Sequenzunterschiede besitzen, um die Diskriminierung dieser Arten zu gewährleisten. Verfechter des Barcoding of Life-Ansatzes (s.u.) sprechen hier von einer Lücke (Barcoding gap) zwischen der intraspezifischen und der interspezifischen Sequenz-variabilität, die die Artzugehörigkeit von Individuen durch die Sequenzierung eines bestimmten Genfragments ermöglicht (Wiemers und Fiedler, 2007). Für die Selektion von Mikroarray-Sonden ist es zusätzlich wichtig, dass in den Markergenen Abschnitte von ca. zwanzig Nukleotiden mit genügender interspezifischer Variabilität vorkommen. Diese Bereiche sollten idealerweise mehrere in der Mitte gelegene für eine bestimmte Spezies
2. Einleitung 14 einzigartige Nukleotidpositionen aufweisen, um unspezifische Hybridisierungsreaktionen mit DNA-Fragmenten anderer Arten zu vermeiden.
2.2.1 Genetische Marker für Fische
Zu Beginn dieser Arbeit waren die gebräuchlichsten genetischen Marker für Fische die mitochondrialen Gene Cytochrom b, Cytochrom-Oxidase I, 16S rDNA und 12S rDNA (Meyer, 1993). Es wurden aber auch nukleäre Gene, wie z.B. die 28S rDNA (Wiley et al., 2000) oder unbekanntere Loci wie Tmo-4C4 (Lovejoy, 2000) verwendet. In der Tabelle 2.1 sind die noch relativ geringen Anzahlen der GenBank-Einträge für die in dieser Arbeit untersuchten Arten und verschiedene Gene aufgelistet, die im November 2001 gefunden wurden.
Für die Schollen und Flundern gab es besonders wenige Datenbankeinträge und bei den Dorschfischen dominierten Sequenzeinträge für die fischereiwirtschaftlich besonders wichtige Art Kabeljau. Hier lagen allein 90 Cytochrom b-Sequenzen vor, so dass dieses Gen aufgrund der intraspezifischen Variabilität für die Mikroarray-gestützte Artidentifizierung ausge-schlossen wurde. Die publizierten COI-Sequenzen des Kabeljaus (NC_002081) und des Wittlings (AF081702) unterschieden sich bei einer Fragmentlänge von 495 Nukleotiden an 28 Sequenzpositionen. Dies schien geeignet, um Spezies-spezifische Oligonukleotid-Sonden selektieren zu können, so dass das Cytochrom Oxidase I-Gen für diese Arbeit als molekularer Marker ausgesucht wurde. Zusätzlich ist das mitochondriale 16S rRNA-Gen für die Untersuchung der unterschiedlichen Eignung von Protein- und rRNA-kodierenden Genen interessant, die in der Verteilung der variablen Positionen variieren.
Mito 16S 12S cyt b COI ATPase 6 ATPase 8 28S 18S 5,8S Tmo-4C4
Gadidae 1 7 7 107 15 1 1 11 6 1 0
Kabeljau (Gadus morhua) 1 1 1 90 2 1 1 1 5 1 0
Wittling (Merlangius merlangus) 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
Pleuronectidae 1 1 0 27 0 0 0 3 0 0 0
Kliesche (Limanda limanda) 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0
Flunder (Platichthys flesus) 0 1 0 2 0 0 0 0 0 0 0
Scholle (Pleuronectes platessa) 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
Tab. 2.1 Menge an GenBank-Einträgen für verschiedene Gene von unterschiedlichen Fischen
In der Tabelle sind die Anzahlen an Einträgen in der GenBank-Sequenzdatenbank des National Center
for Biotechnology Information (NCBI) aufgelistet, die zu Beginn dieser Arbeit (Stand: 29.11.2001) für
verschiedene in der Phylogenetik von Fischen verwendete Markergene identifiziert worden waren. Aufgeführt sind die Werte für die Familien der Dorschfische (Gadidae), der Schollen und Flundern (Pleuronectidae) und für die einzelnen Arten Kabeljau und Wittling sowie Kliesche, Flunder und Scholle. Mito: komplette mitochondriale Sequenz. 16S: 16S rDNA. 12S: 12S rDNA. cyt b: Cytochrom b-Gen. 28S: 28S rDNA. 18S: 18S rDNA. 5,8S: 5,8S rDNA.
2. Einleitung 15
2.2.2 Das “Barcoding”-Gen der Untereinheit 1 der Cytochrom Oxidase
Das Cytochrom Oxidase I-Gen wird in einer Vielzahl von phylogenetischen Studien eingesetzt und z.B. für die Klärung stammesgeschichtlicher Verhältnisse bei Fischen oder anderen marinen Organismen verwendet. Radchenko et al. nutzten DNA-Fragmente des COI-Gens zusammen mit Cytochrom b-DNA-Sequenzen für phylogenetische Untersuchungen von Gymnelinae, einer Unterfamilie der Aalmuttern (Zoarcidae) (Radchenko et al., 2008) und Teletchea die gleiche Genkombination für die phylogenetische Untersuchung von Dorscharten (Gadidae) (Teletchea et al., 2006). Zusammen mit den Cytochrom Oxidase II- und Cytochrom b-Genen wurde das COI-Gen auch schon 1991 für die Analyse tieferer phylogenetischer Verhältnisse der Neuflosser (Neopterygii) verwendet (Normak et al., 1991). Allerdings ist die COI-Variabilität in Krebsen der Gattung Austropotamobius wiederum so groß, dass das Gen hier für phylogeographische Analysen verwendet wird (Trontelj et al., 2005).
Das COI-Gen wird indes nicht nur für phylogenetische Untersuchungen sondern zunehmend auch als diagnostischer Marker für die Identifizierung und Diskriminierung von Arten wie z.B. Copepoden (Bucklin et al., 2003) verwendet. Im Jahr 2003 schlugen Hebert et al. schließlich die Einführung eines allgemeinen Barcoding-Systems vor, das die molekulare Identifizierung aller lebenden Organismen durch die Bestimmung eines 648-bp-langen Fragments des COI-Gens ermöglichen soll (Hebert et al., 2003a, b). Trotz einiger Kritik gegenüber diesem Ansatz (siehe z.B. Wiemers und Fiedler, 2007) sind inzwischen einige Artikel erschienen, die das Potenzial dieser Methode zeigen. Diese betreffen z.B. das Barcoding von Vögeln (Hebert et al., 2004), Spinnen (Barret und Hebert, 2005), Fischen (Ward et al., 2005) oder sogar geräucherten Fischprodukten (Smith et al., 2008). Mittlerweile werden auch kürzere Fragmente des COI-Gens, sogenannte Minimalist Barcodes, für die Identifizierung von Arten verwendet (Hajibabaei et al., 2007). Die aus einem internationalen Konsortium bestehende Fish Barcode of Life-Initiative (Fish-BOL, www.fishbol.org) verfolgt das Ziel, die COI-Barcodes sämtlicher bekannter Fischarten zu bestimmen und in einer Datenbank zu verwalten.
2.2.3 16S rRNA-Gen
Das Gen für die größere mitochondriale RNA, die 16S rDNA, zählt zu den konservierteren mitochondrialen Genen (Meyer, 1993). Es wird in einer Vielzahl von ökologischen und phylogenetischen Studien untersucht und für die Aufklärung der stammesgeschichtlichen Verwandschaftsverhältnisse zwischen entfernt und eng verwandten Arten genutzt. In der marinen Biologie diente es z.B. zur Aufklärung der Stammesgeschichte von Sägesalmler-Arten (Serralsaminae), zu denen die bekannten Piranhas zählen (Ortí et al., 1996), Feuerfischen (Pteroinae) (Kochzius et al., 2003), Kugelfischen (Tetraodontidae) (Song et al., 2001) oder Plattfischen (Pleuronectiformes) (Tinti et al., 2000; Berendzen und Dimmick, 2002; Pardo et al., 2005; Azevedo et al., 2008).
2. Einleitung 16 Die Identifizierung von Fischarten, wie z.B. die Identifizierung von Flussaalen (Anguilla) (Aoyama et al., 1999) oder der Nachweis von Kabeljau (Gadus morhua) im Mageninhalt von Raubfischen, wird ebenfalls häufig mit Hilfe der 16S rDNA-Sequenzen durchgeführt (Rosel und Kocher, 2002). Auch Eier von Fischen der zu den Schleimköpfen zählenden Gattung Beryx konnten durch die Sequenzierung eines 16S rDNA-Fragments den einzelnen Spezies zugeordnet werden (Akimoto et al., 2002).
Kochzius et al. konnten 2003 in der Studie mit Feuerfischen (Pteroinae) zeigen, dass das 16S rRNA-Gen keine Variabilität zwischen den Individuen innerhalb einer Art aufwies, obwohl die Proben aus weit entfernten Regionen stammten. Gleichzeitig zeigte das Gen genügend Polymorphismen zwischen den verschiedenen Arten, um eine eindeutige Artzuordnung zu gewährleisten.
2.3 Monitoring von Fischarten in Ichthyoplanktonproben
In der Fischereiforschung werden für Fischbestandsabschätzungen zum Zweck der Festlegung von empfohlenen maximal zulässigen Fangmengen nicht nur Proben von kommerziellen Fischfängen untersucht oder normierte Fischfänge auf Forschungsreisen durchgeführt (Stransky et al., 2008). Es finden auch Untersuchungen der Artenzusammensetzung im Ichthyoplankton statt, um durch diese Daten Rückschlüsse auf den Bestand der laichfähigen Fische zu ziehen (Armstrong et al., 2001; von Westernhagen et al., 2002; Fox et al., 2008). Standardverfahren wie normierte Eierfänge ermöglichen jedoch nur eine Kurzzeitüber-wachung, aber keine Erfassung außergewöhnlicher Ereignisse, die eine immense Rolle in der Entwicklung von Fischbeständen spielen können. Mit Hilfe von automatischen Beprobungs-geräten wie dem von Sir Alister Hardy schon 1931 entwickelten Continuous Plankton Recorder (siehe Richardson et al., 2006) oder dem Continuous, Underway Fish Egg Sampler (CUFES) (Checkley et al., 1997) werden Planktonorganismen zwar kontinuierlich gesammelt, müssen aber dennoch in der Regel einzeln identifiziert werden. Gerade hier sind automatisierte Verfahren nötig und DNA-Mikroarrays können von großem Nutzen sein, um Planktonfänge simultan auf das Vorkommen verschiedener Fischarten zu untersuchen.
2.3.1 Herkömmliche Identifizierung von Fischeiern
Seit 1984 werden jährlich Ichthyoplanktonstudien in der südlichen Nordsee durchgeführt (von Westernhagen et al., 2002) und Planktonorganismen an vielen Stationen mit Planktonnetzen gefangen. Die Fischeier werden mit Hilfe einer Weithalspipette aussortiert und unter einem Binokular nach morphologischen Kriterien auf ihre Spezieszugehörigkeit untersucht. Diese Methode ist nicht nur sehr zeitaufwändig, sondern auch anspruchsvoll und muss von erfahrenen WissenschaftlerInnen durchgeführt werden. Gerade bei den frühen Stadien der Fischeier ist es schwierig, die Arten aufgrund morphologischer Kriterien zu identifizieren und Kabeljauarten oder Schollen und Flundern voneinander zu unterscheiden (Russell, 1976). Mit Hilfe eines TaqMan-Assays mit Spezies-spezifischen ATPase 6-Sonden für die drei Arten
2. Einleitung 17 Kabeljau, Schellfisch und Wittling (Taylor et al., 2002) konnten Fox et al. (2005) zeigen, dass von allen als „Kabeljauartige“ identifizierten Fischeiern der frühen Stadien nur 34% tatsächlich von Kabeljau-Individuen stammten, 58% jedoch Wittling- und 8% Heilbutteier waren. Dieses könnte ein Grund dafür gewesen sein, dass die im Jahr 1995 mit Hilfe der Annual Egg Production-Methode (AEPM) geschätze Laicherbestandsbiomasse des Kabeljaus (Armstrong et al., 2001) deutlich größer ausfiel als konventionelle Fischbestandsschätzungen. Die Identifizierung von Fischeiern mittels der TaqMan-Technologie ist jedoch durch die begrenzte Anzahl an TaqMan-Farbstoffen limitiert (Fox et al., 2005). Außerdem wird auch in diesen Studien jedes Fischei einzeln untersucht, was wiederum einen enormen Sortier- und Analyseaufwand beansprucht.
2.3.2 Ziel dieser Arbeit
Aufgrund der Bedeutung der genauen Artidentifizierung von Fischeiern und -larven für Fischbestandsabschätzungen (Kochzius, 2009) ist das Ziel dieser Arbeit, derartige Prozesse durch die Entwicklung von Fischspezies-spezifischen DNA-Oligonukleotid-Sonden für die Mikroarray-Diagnostik zu erleichtern und zu vereinfachen. Ebenso können DNA-Mikroarrays zur Qualitätsüberprüfung von Fischprodukten verwendet werden, wenn verarbeitete Produkte durch visuelle Überprüfung keine Rückschlüsse auf die Art der Ursprungsorganismen zulassen.
Diese Arbeit unterteilt sich in die Fragen,
– ob die Sequenzen der ausgewählten genetischen Marker bei verwandten Fischen geeignete interspezifische und intraspezifische Variation aufweisen,
– ob die experimentellen Bedingungen der Mikroarray-Technologie für die Spezies-spezifische Detektion von Fischarten optimiert werden können,
– ob die ermittelten Oligonnukleotid-Sonden im Mikroarray-Experiment die erforderlichen Hybridisierungssignalintensitäten ergeben,
– ob Voraussetzungen für hohe Hybridisierungssignalintensitäten ermittelt werden können, die die Sonden erfüllen müssen,
– ob die entwickelten Oligonukleotid-Sonden im Mikroarray-Experiment hinreichend Spezies-spezifisch sind und unter optimierten experimentellen Bedingungen auch geringe Sequenz-Unterschiede detektieren können,
– ob sie sich bei Mehrfach-Hybridisierungen genauso wie bei Einzel-Hybridisierungen verhalten und
– ob die für Fischbestandsabschätzungen wichtigen Ichthyoplanktonanalysen und die Qualitätskontrolle von Fischprodukten somit auf diesem Wege möglich sind.
Für die Entwicklung von Sonden für einen „Fisch-Chip“ wurde ein geeignetes Modellsystem benötigt, das die Fischarten und das Fanggebiet sowie die geeigneten Markergene umfasst.
2. Einleitung 18 Weil es für die Prüfung der Tauglichkeit eines Fisch-Chips wichtig war, eng verwandte Fischarten auszuwählen, wurden Plattfische (Pleuronectiformes) der südlichen Nordsee in das Modellsystem aufgenommen, von denen in der Nordsee vier Familien mit teilweise sehr eng verwandten Arten wie z.B. Flunder (Platichthys flesus) und Scholle (Pleuronectes platessa) vorkommen. Aufgrund der großen fischereiwirtschaftlichen Bedeutung des Kabeljaus (Gadus morhua) wurden auch zwei Dorscharten (Gadidae) in das Modellsystem integriert.
Aus Zeitgründen kam die Prüfung von nur zwei Markergenen in Betracht. Hier fiel die Wahl auf Fragmente des Cytochrom-Oxidase I (COI)-Gens und der 16S rDNA, da diese mito-chondrialen Gene im Vergleich zu nukleären Genen hohe Mutationsraten aufweisen, im Vergleich mit anderen mitochondrialen Genen jedoch niedrige Variabilitäten innerhalb einer Spezies zeigen und es bereits eine Reihe von Literaturangaben zu diesen Markergenen gibt. Die Schrittfolge der Arbeiten umfasste zunächst die Sequenzierung der COI- und 16S rDNA-Fragmente für die ausgewählten Fischarten und andere in der südlichen Nordsee vorkom-mende eng verwandte Arten. Die Sequenzgrundlage diente zunächst der theoretischen Auswahl von Spezies-spezifischen Oligonukleotid-Sonden. Diese Sonden wurden synthetisch hergestellt und auf Mikroarrays gespottet, so dass sie durch Hybridisierungen mit den verschiedenen Zielsequenzen auf ihre Spezifität und Sensitivität hin überprüft werden konnten. Dabei musste ein geeignetes Mikroarray-Protokoll etabliert und Versuchs-bedingungen optimiert werden. Um die Bindungseffizienz und die Diskriminierungsfähigkeit der Sonden zu steigern, wurden zwei Sondenmodifikationen getestet: zum einen der Einbau von LNA-modifizierten Nukleotiden und zum anderen die Verwendung von HEG-Linkermolekülen (siehe Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2).
Die wesentlichen Arbeitsschritte sind in Abbildung 2.4 schematisch dargestellt.
MikroarrayMikroarray-Hybridisierung-Hybridisierung
Probennahme von adulten Fischen DNA-Extraktion PCR Alignment Selektion spezies -spezifischer Sonden Mikroarray -Herstellung
Evaluierung der Sonden Sequenzierung
GenBank-Sequenzen
Mikroarray-Hybridisierung
MikroarrayMikroarray-Hybridisierung-Hybridisierung
Probennahme von adulten Fischen DNA-Extraktion PCR Alignment Selektion Spezies -spezifischer Sonden Mikroarray -Herstellung
Evaluierung der Sonden Sequenzierung
GenBank-Sequenzen
Mikroarray-Hybridisierung
3. Material und Methoden 19
3 Material und Methoden
Für alle Lösungen wurde entsalztes und über eine Ultra Clear UV-Reinstwasseranlage (SG Wasseraufbereitung und Regenerierung, Barsbüttel) gereinigtes Wasser mit einem Leitwert < 0,5 mS/cm3 verwendet (im folgenden bezeichnet als Reinstwasser). Die Chemikalien wurden, soweit nicht anders beschrieben, in reinster Form pro analysi von den Firmen Roth, Sigma, Merck oder Fluka bezogen. Reaktionsgefäße für die Volumina 0,25 ml bis 2,0 ml sowie Pipettenspitzen stammten von der Firma Biozym (Hessisch Oldendorf).
3.1 Oligonukleotide
Die Synthese der verwendeten DNA-Oligonukleotide wurde bei der Firma Thermo Electron (Ulm) in Auftrag gegeben. Die Mikroarray-Sonden waren am 5’-Ende mit einem Spacer von sechs Kohlenstoffatomen und einer Aminomodifizierung zur kovalenten Bindung an 1,4-Phenylendiisothiocyanat (PDITC)-beschichtete Objektträger versehen. Die Primer zur Mar-kierung der Hybridisierungs-Ziel- oder Kontroll-DNAs trugen an ihren 5’-Enden den Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 5 (Cy5). Das Kontrolloligonukleotid Am war am 5’-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cyanin 3 (Cy3) versehen.
Die Sequenzen der PCR-Primer sind im Abschnitt 3.3.2. angegeben und die Sequenzen der Mikroarray-Sonden in Tabelle 4.7 und 4.8 (Ergebnisteil). Kontrollsonden sind in Tabelle 3.1 aufgeführt.
Die LNA- und HEG2-modifizierten Oligonukleotide (siehe Tabelle 4.9 bzw. 4.13 im Ergeb-nisteil) wurden freundlicherweise von der Firma Exiqon (Vedbaek, Dänemark) zur Verfügung gestellt.
3.2 Probennahme von Fischen
3.2.1 Fischfang
Adulte Fische wurden auf einer Forschungsfahrt auf dem Fischereiforschungsschiff Walther Herwig III der Bundesforschungsanstalt für Fischerei im Frühjahr 2002 in freundlicher Zusammenarbeit mit Dr. Hein von Westernhagen vom Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung (AWI) unter der Leitung von Dr. Michael Vobach sowie einer weiteren Forschungsfahrt im darauffolgenden Sommer auf dem Forschungsschiff Heincke des AWI unter der Leitung von Dr. Rainer Knust in der Deutschen Bucht und der südlichen Nordsee von Südjütland bis zur Rheinmündung mit Hilfe von Schleppnetzen und Baumkurren gefangen. Zusätzlich wurden zwei Köhlerproben, zwei Heilbuttproben und zwei Proben des Schwarzen Heilbutts von lokalen Fischhändlern erworben. Außerdem wurden Seezungen, Rotzungen und Doggerscharben sowie je ein Glattbutt und ein Zwergbutt verwendet, von
3. Material und Methoden 20 denen Nina Silkenbeumer im Juli 2003 im Rahmen einer Nordsee-Forschungsfahrt Proben genommen hatte. Die Artbestimmung erfolgte nach äußeren erkennbaren Merkmalen der Fische (siehe Muus und Nielsen, 1999; Knijn et al., 1993) und wurde durch erfahrene Meeresbiologen wie z.B. Dr. Hein von Westernhagen und Dr. Eva Brodte vom AWI verifiziert bzw. vom Fischhändler angegeben.
3.2.2 Gewebeentnahme und Fixierung
Direkt nach dem Fischfang wurden die Fische auf Eis gelagert, um die Degradierung der DNA zu verlangsamen. Unmittelbar nach der Artbestimmung, die i.d.R. nach 30 Minuten abgeschlossen war, wurden etwa münzgroße Stücke muskulären Gewebes aus der Seite der Fische herausgetrennt, von der Fischhaut getrennt und in 100%igem Ethanol in 30 ml-Polyethylenweithalsflaschen (VWR International, Darmstadt) fixiert. Bis zur weiteren Verwendung wurden die Gewebeproben bei 4 °C gelagert. Zur Vermeidung von Material-übertragungen wurde das Messer nach jeder Gewebeentnahme sehr gründlich mit Wasser gereinigt.
3.3 DNA-Techniken
3.3.1 DNA-Extraktion aus muskulärem Fischgewebe
Die Extraktion von Gesamt-DNA aus ethanolfixiertem muskulären Fischgewebe (ca. reiskorngroß) wurde mit Hilfe des DNeasy Tissue Kits (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers in einer Sterilbank durchgeführt. Die an die Säulchen gebundene DNA wurde in 200 μl Reinstwasser eluiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert. Zusätzlich wurde nach jeder Extraktionsreihe eine Extraktionsprozedur ohne Gewebe durchgeführt. Diese Negativkontrolle wurde anschließend mit den anderen Extraktionen in einer PCR eingesetzt und auf Kontaminationen untersucht, um Materialübertragungen auszuschließen. Zur Qualitätsüberprüfung der DNA-Extrakte wurden die DNA-Fragmente in horizontalen 1 - 2%igen Agarosegelen (peqGOLD Universal Agarose, Peqlab, Erlangen) bei 80 V in 100 ml-Gelkammern für ungefähr eine Stunde gelelektrophoretisch aufgetrennt. Hierzu wurden 10 μl der Extraktionseluate mit 2 μl 6x Probenpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,03% Bromphenolblau, 0,3% Xylencyanol, 60% Glycerol, 60 mM EDTA) versetzt. Zur Ab-schätzung der Bandengröße wurden zusätzlich 0,5 μg eines molekularen Markers aufgetrennt (1 Kb DNA Ladder, Gibco BRL, USA). Nach der Elektrophorese wurde das Agarosegel für ca. 20 min in TBE-Puffer mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid inkubiert und die DNA schließlich mit einem UV-Transilluminator bei einer Wellenlänge von 302 nm sichtbar gemacht.
3. Material und Methoden 21
3.3.2 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels PCR
Es wurden gewöhnlich pro Reaktion 50 μl Reaktionslösung angesetzt, die sich aus 1x PCR-Puffer, 2 mM MgCl2, 1 U Taq-DNA-Polymerase (jeweils Biomaster, Windeck), 200 μM aller
vier dNTPs (Peqlab, Erlangen), je 400 nM forward-Primer und reverse-Primer sowie 1 μl Matrizen-DNA (Gesamt-DNA aus DNA-Extraktion) zusammensetzte. Das Standard-Temperaturprofil bestand aus einem initialen Denaturierungsschritt von 5 min bei 95 °C, gefolgt von bis zu 35 Zyklen der Abfolge 30 s Denaturierung bei 95 °C, 30 s Primer-anlagerung bei einer für das Primerpaar geeigneten Temperatur und 45 s Elongation bei 72 °C. Beendet wurde das Protokoll mit einer zehnminütigen Auffüllphase bei 72 °C, wonach die Reaktionsgefäße auf 4 °C abgekühlt wurden. Um Kontaminationen auszuschließen wurde grundsätzlich eine Negativkontrollreaktion mit Reinstwasser mitgeführt und sämtliche Pipettierschritte in einer Sterilbank durchgeführt. Im Anschluss wurden je 10 μl der Reaktionslösungen in einer Agarosegelelektrophorese (s.o.) überprüft, um die Längen und die Qualität der Amplifikate abzuschätzen. Die PCR-Amplifikate wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) nach Herstellerangeben aufgereinigt, in 50 μl Reinstwasser eluiert und bei -20 °C gelagert.
Für die Mikroarray-Hybridisierung wurden Cy5-endmarkierte Ziel-DNA-Fragmente mit 5’-Cy5-modifizierten H-Primern (s.u.) bzw. 5’-5’-Cy5-modifizierten pUC57rev-Primern herge-stellt. Für jede Hybridisierungs-Ziel-DNA wurden mehrere 100 μl-PCR-Ansätze (üblicher-weise drei) nach der Reaktion zusammengeführt und zusammen aufgereinigt (s.o.). Die Konzentrationsbestimmung erfolgte in einem Photometer in einer wässrigen Verdünnung von 1:50.
Amplifikation eines COI-Abschnitts nach Palumbi:
Für die Vervielfältigung eines 542 bp-langen COI-Fragment wurden die von Palumbi et al. (1991) beschriebenen universellen Primer COIf-L und COIe-H nach Vergleichen von Fisch-COI-Sequenzen aus der GenBank-Datenbank (NCBI, USA) wie folgt modifiziert: L6586m2: 5’-CCTGCWGGAGGRGGWGAYCC-3’ (modifiziert nach COIf-L) und H7086m: 5’-CCTGTAAATAGYGGRAATCARTG-3’ (modifiziert nach COIe-H). Die verwendete Primeranlagerungstemperatur betrug 60 °C, die Zyklenzahl maximal 35. Üblicherweise wurde als Matrizen-DNA 1 μl DNA-Extrakt verwendet.
Für die Sequenzierung von DNA-Fragmenten der Fischarten Steinbutt (Psetta maxima), Glattbutt (Scophthalmus rhombus) und Seezunge (Solea solea), bei denen mit der Standard-PCR-Reaktion keine Amplifikate erzielt werden konnten, wurde eine Standard-PCR-Reaktion mit einer reduzierten Primeranlagerungstemperatur durchgeführt. Diese führte zu verschiedenen Amplifikaten mit mehreren Banden im Agarosegel. Die DNA-Banden mit der erwarteten Länge wurden unter UV-Licht aus dem Agarosegel ausgeschnitten, mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) nach Herstellerangaben aufgereinigt und in Reinstwasser aufge-fangen. Die eluierte DNA wurde anschließend erneut als Matrizen-DNA in einer zweiten
3. Material und Methoden 22 COI-PCR eingesetzt, wodurch ein PCR-Produkt hergestellt wurde, das sich zur Sequen-zierung eignete.
Amplifikation eines COI-Abschnitts der Seezungen-DNA:
Für die Vervielfältigung eines COI-Fragments der Seezungen (Solea solea) wurde ein zweites Primerpaar verwendet (Sol-CO1L: 5’-CGTCCTCTACCAGCACCTATT-3’ und Sol-CO1H: 5’-TTGCAAAGACTGCTCCCATGG-3’, entwickelt von N. Silkenbeumer), das zu einem PCR-Produkt der Länge 482 bp führte, welches innerhalb des Palumbi-Fragments (s.o.) liegt. Als Primeranlagerungstemperatur wurden ebenfalls 60 °C verwendet und maximal 35 Zyklen gewählt. Auch hier diente 1 μl DNA-Extrakt als Matrize.
16S rDNA-PCR nach Palumbi:
Ein ca. 600 bp-langes 16S rDNA-Fragment wurde mit den von Palumbi et al. (1991) beschriebenen universellen Primern 16sar-L (5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’) und 16sbr-H (5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’) vervielfältigt. 50 °C diente als Primer-anlagerungstemperatur und bis zu 35 Zyklen wurden durchgeführt. Standardmäßig wurde 1 μl DNA-Extrakt als Matrizen-DNA eingesetzt.
Herstellung eines PCR-Kontrollfragments (pUC57-PCR):
Zum Zweck der Normalisierung zwischen verschiedenen Mikroarrays sowie innerhalb eines Mikroarrays wurde ein 542 bp-langes pUC57-Kontrollfragment mit den Primern pUC57forw (5’-GATACGGGAGGGCTTACCAT-3’) und pUC57rev (5’-GCGCGGTATTATCCCGTA TT-3’) amplifiziert. Als Matrizen-DNA diente pUC57-DNA der Firma Fermentas (St. Leon-Rot). Die Primeranlagerungstemperatur betrug 56 °C, als Zyklenzahl wurden 35 Zyklen gewählt.
3.3.3 Sequenzierung von mitochondrialen DNA-Fragmenten
Die Sequenzierung der aufgereingten PCR-Produkte wurde unter Verwendung des BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kits und durch anschließende Kapillar-Elektrophorese mit einem ABI Prism 310 Genetic Analyzer (beides Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Die Sequenzier-PCR-Reaktionen von jeweils beiden Strängen fanden in Volumina von 10 μl statt. Hierzu wurden 6 μl der aufgereinigten PCR-Produkte sowie 10 pmol der jeweiligen Primer (identisch mit den in 3.3.2 beschriebenen Primern) eingesetzt. Das Temperaturprofil bestand aus 26 Zyklen der Abfolge Denaturierung bei 95 °C für 15 s, Primeranlagerung bei der für den Primer geeigneten Temperatur (s. 3.4.2) für 15 s und Elongationsphase bei 60 °C für 4 min. Anschließend wurden die Produkte auf 4 °C abgekühlt.
3. Material und Methoden 23 Im Anschluss an die Sequenzier-PCR wurden die Produkte mit einer Natriumacetat-Ethanol-Präzipitation (Sambrook et al., 1989) aufgereinigt. Dazu wurden die Volumina der Sequenzier-PCR-Lösungen mit Reinstwasser auf 40 μl aufgefüllt, mit 1/10 Volumenteil Natriumacetat (3 M, pH 5,3) sowie 2,5 Volumenteilen Ethanol (100%) vermischt und für 15 min bei 13 200 U/min in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Anschließend wurden die Präzipitate noch einmal mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen, nach zehnminütiger Zentrifugation (13 200 U/min) getrocknet und schließlich in 30 μl Reinstwasser resuspendiert. Die Auftrennung der Fragmente im Kapillarsequenziergerät erfolgte nach Herstellerangaben unter Verwendung einer 30 cm langen POP4 gefüllten Kapillare (Applied Biosystems) mit einem Durchmesser von 50 μm. Die Injektionszeit der Proben betrug durchschnittlich 8 s. Die Zuordnung der Nukleotidbasen zu den resultierenden Chromatogrammpeaks (Base Calling) erfolgte mit dem Programm Sequencing Analysis 3.4.1 (Applied Biosystems).
3.4 Sequenzanalysen
3.4.1 Sequenz-Edition und Qualitätsprüfung
Für jedes zu analysierende DNA-Fragment wurden die beiden Stränge der mitochondrialen DNA (L- und H-Strang) sequenziert und die komplementären Sequenzen mit Hilfe der beiden Chromatogramme im Programm Chromas 1.45 (http://www.technelysium.com.au/chromas 14x.html) verglichen, um uneindeutige Positionen zu klären.
Zusätzlich wurden die Sequenzen des COI-Gens mit dem graphischen Analysewerkzeug Open Reading Frame Finder (ORF Finder) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) des NCBIs unter Verwendung des mitochondrialen Codes von Vertebraten (translation table 2) auf das Vorhandensein von Stop-Codons untersucht, die das Leseraster unterbrechen und die Amplifizierung von nukleären mitochondrialen Pseudogenen anzeigen.
3.4.2 Multiples Alignment
Die ermittelten COI- sowie 16S rDNA-Sequenzen wurden zusammen mit ausgewählten GenBank-Datenbanksequenzen (NCBI) mit dem Multiplen-Alignment-Programm ClustalX 2.0 (Thompson et al., 1997) mit vorgegebenen Alignment-Parametern (gap open penalty = 15; gap extension penalty = 6,66) derart ausgerichtet, dass phylogenetisch verwandte Positionen untereinander standen („Alignment“). Vor der Weiterverwendung für phylo-genetische Analysen und der Auswahl von Mikroarray-Sonden wurden die Sequenzen im Multiplen-Sequenz-Alignment-Editor GeneDoc (Nicholas und Nicholas, 1997) visualisiert und auf eine gemeinsame Länge gestutzt. Identische Haplotypen wurden in den Alignments nur einmal dargestellt. Eine Translation der Nukleotid-Sequenzen in Proteinsequenzen wurde
3. Material und Methoden 24 im GeneDoc-Editor (unter Verwendung des mitochondrialen Codes von Vertebraten) durchgeführt.
3.4.3 Phylogenetische Analysen
Mit Hilfe des Phylogenie-Programms MEGA Version 4 (Tamura et al., 2007) wurden die COI- und 16S rDNA-Haplotypsequenzen phylogenetisch gruppiert. Es wurden Neighbor-joining (NJ)-Bäume unter Verwendung der p-Distanz (uncorrected „p“) berechnet. Als Außengruppe wurde die monophyletische Gruppe der Gadidae definiert. Für Bootstrap-Analysen wurden jeweils 1000 Replikate, ebenfalls mit Hilfe der p-Distanz, durchgeführt. Die mit MEGA berechneten Stammbäume wurden schließlich in Microsoft Word nachbearbeitet. Ausgehend von den Sequenzalignments wurden mit Hilfe des Sequenzalignment-Editors BioEdit 7.0.9.0 (Hall, 1999) paarweise Sequenzidentitäten berechnet. Hierbei wurden Positionen mit Lücken in beiden Sequenzen als nicht existent gewertet. Positionen, in denen eine der beiden Sequenzen eine Lücke aufwies, wurden als nicht identisch („Mismatch“) gewertet.
3.5 Selektion von Oligonukleotid-Sonden
Die Auswahl Spezies-spezifischer Mikroarray-Sonden erfolgte manuell durch genaue Musterung der COI- und 16S rDNA-Alignments. Wichtigstes Kriterium bei der Sonden-auswahl war die Anzahl an vorzugsweise in der Mitte liegenden einzigartigen Sequenz-positionen. Alle ausgewählten Sonden besaßen die Sequenz des L-Strangs, so dass DNA-Fragmente mit der Sequenz des H-Strangs gebunden werden.
Nach einer ersten Auswahl wurden die Sondenvorschläge durch eine Nukleotid-BLAST-Analyse (Altschul et al., 1990; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) auf mögliche Kreuzhybridisierungen mit bekannten GenBank-DNA-Sequenzen von Fischen oder anderen Organismen aus der Nordsee überprüft und gegebenenfalls ausgeschlossen. Auch wurden Sondensequenzen mit thermodynamisch ungünstigen Eigenschaftenen (z.B. Haarnadel-Formation, Selbst-Komplementarität) verworfen. Thermodynamische Eigenschaften wurden mit dem Internet-Werkzeug Oligonucleotide Properties Calculator berechnet (Kibbe, 2007; http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html). Die Schmelztemperatur wurde mit dem im Oligonucleotide Properties Calculator implementierten Nearest Neighbor-Algorithmus (Breslauer et al., 1986) ermittelt. Die Sequenzen der ausgewählten Sonden sind in den Tabellen 4.7 (COI-Sonden) und 4.8 (16S rDNA-Sonden) im Ergebnisteil aufgeführt. Als Positivkontrolle wurde eine Sonde cAm verwendet (modifiziert nach cA, Niemeyer et al., 1999), die mit dem Zieloligonukleotid Am (s.u.) hybridisiert. Außerdem wurde eine Sonde (pUC57-2) für die Bindung eines pUC57-PCR-Kontrollprodukts (542mer) festgelegt sowie drei verschiedene Negativkontrollsonden aus verschiedenen Projekten der Arbeitsgruppe verwendet (siehe Tabelle 3.1).
3. Material und Methoden 25
Kontrolltyp Sonde Sequenz (5' - 3')
Länge [nt] GC [%] Tm [°C] Ziel-DNA
Positivkontrolle cAm GCGGATAACAATTTCACACAGG 22 45 53 Oligonukleotid Am (22-mer) Positivkontrolle pUC57-2 AAGTTGGCCGCAGTGTTATC 20 50 53
pUC57-PCR-Produkt (542-mer) Negativkontrolle 1a22 TACCAACTTCGCTAACTCAGAT 22 41 53 - Negativkontrolle LT149_T2 ATATTCTGCCCGCAGTTACATA 22 41 53 - Negativkontrolle casm TTGTGCCATTCTTGAAAGATCC 22 41 52 -
Tab. 3.1: Kontroll-Sonden
3.6 DNA-Mikroarray-Hybridisierung
3.6.1 Herstellung der DNA-Mikroarrays
Für die Herstellung der DNA-Mikroarrays wurden entweder 1,4-Phenylendiisothiocyanat (PDITC)-beschichtete Objektträger des Centrum für Angewandte Gensensorik (CAG, Universität Bremen) oder Genorama SAL-1-Objektträger (Beschichtung mit 3-Aminopropyl-trimethoxysilan + 1,4-Phenylendiisothiocyanat) von der Firma Asper Biotech (Tartu, Estland) verwendet. Die aminomodifizierten Oligonukleotid-Sonden wurden vor der Belegung der Objektträger in einer Konzentration von 10 μM in Reinstwasser durch Mikrofiltration mit Hilfe von Zentrifugen-Filtereinheiten (Ultrafree-DA centrifugal devices, Millipore, Schwal-bach) von Partikeln gereinigt. Die Belegung der Objektträger mit den Sonden („Spotting“) erfolgte kontaktlos mit einem im Rahmen des CAG entwickelten Piezokristall-gesteuerten Ultramikro-Pipettierroboter „Robodrop 1“ (Bremer Institut für Angewandte Strahltechnik, Bremen) oder einem automatisierten TopSpot-System (HSG-IMIT, Villingen-Schwenningen) inklusive visueller Spoterkennung (bi’ber Bilderkennungssysteme, Berlin). Für die Experi-mente zur Optimierung der Hybridisierungsbedingungen (außer der Hybridisierungs-temperaturreihe mit LNA-modifizierten Sonden) wurden die Sonden jeweils in 16facher Redundanz auf einem Mikroarray aufgebracht und je drei Mikroarrays auf einen Objektträger gespottet. Für die Versuche zur Evaluierung der Sondensätze sowie die Untersuchung verschiedener Hybridisierungstemperaturen mit LNA-modifizierten Sonden wurden die Sonden innerhalb eines Mikroarrays dreifach gespottet. Hier wurden zu Normalisierungs-zwecken jeweils zehn Sonden um zwei verschiedene Positivkontrollsonden (cAm und pUC57-2) gruppiert (Mikroarray-Konfiguration 1, siehe Anhang A.3, S. 120). Eine dritte Arraykonfiguration enthielt ausschließlich 16S rDNA-Sonden und wurde für den Versuch zur Nachweisgrenze der Hybridisierung und für die Hybridisierungen von Ziel-DNA-Gemischen verwendet. Hier wurde jede Sonde insgesamt zwanzigmal aufgebracht und dabei auf zwei Feldern aufgeteilt, in denen je zehn Spots einer bestimmten Sonde um zwei Positivkontroll-spots (cAm und pUC57-2) angeordnet waren (Mikroarray-Konfiguration 2, siehe Anhang A.3, S. 121).
