Untersuchungen
zum Vorkommen und
zur Tenazität von
Cronobacter
spp.
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades „Doktor der Naturwissenschaften“
der Universität Hamburg Fachbereich Chemie
vorgelegt von
Marcel Fiegen
aus Essen
1. Gutachter: Prof. Dr. P. Heisig 2. Gutachter: Prof. Dr. B. Bisping
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Hat jemand einen Traum erzählt. Ein Dichter schuf daraus Dichtung. Ein Maler hat die als Sujet gewählt Für ein Bild in grotesker Belichtung. Viel Tausende haben darüber gelacht. Ein Wissenschaftler hat nachgedacht,
Hat anderen eine Idee vertraut. Ein Praktiker experimentierte. Und wieder ein Andrer hat zugeschaut,
Hat anderwärts etwas fertiggebaut, Was dann nicht funktionierte. Und wieder lachten Tausende laut. Nachdem noch viel gut, böse geschah,
Rief eines Tages das Volk: „Hurra!“ Denn die Erfindung war da. Millionen Menschen benutzten sie froh.
Es steht ein Denkmal irgendwo, Preist einen glücklichen Namen. Hat jede Frucht ihren Samen.
Danksagung
Nach über fünf Jahren nebenberuflicher Arbeit an meiner Promotion kann ich nicht verhehlen, dass mir in dieser Zeit, in der ich dies schreibe, so kurz vor der Ziellinie, eine gewisse Erleichterung bewusst wird. Rückblickend war es nicht immer einfach, daher erfüllt mich dieser Moment auch mit großer Dankbarkeit all jenen gegenüber, die immer Verständnis zeigten, wenn ich schon wieder keine Zeit hatte, gegenüber jenen, die die gesamte Zeit über zu mir standen und mich in meinem Bestreben nach Kräften unterstützt haben und gegenüber jenen, die meinen Lebensweg in diesen Jahren fachlich, menschlich und seelisch bereichert haben. Auch wenn der Kreis der Menschen, bei denen ich mich bedanken möchte, deutlich größer ist, als ich ihn in dieser Danksagung einzirkeln kann, möchte ich doch einige persönliche Worte des Dankes zu Papier bringen.
Prof. Dr. Peter Heisig, Ihnen danke ich herzlich für die Übernahme der Vaterschaft meiner Doktorarbeit, Ihre wertvollen fachlichen Anregungen, die diese Arbeit sehr bereichert haben, und Ihre menschliche Art, die es sehr einfach macht, sich in Ihrem Doktorandenkreise daheim und wohl zu fühlen.
Dr. Anselm Lehmacher, Dir danke ich ebenso herzlich für Deinen immer verfügbaren fachlichen Rat, Dein Engagement und Deine uneingeschränkte Hilfsbereitschaft. Besonders die vielen Stunden anregender Diskussion und gemeinsamen Lachens werde ich in Erinnerung behalten.
Prof. Dr. Bernward Bisping, Ihnen möchte ich für die Übernahme des Korreferats danken. Besonders schön finde ich, dass Ihre Zusage für die Übernahme bereits fünf Jahre alt ist.
Auch ich habe festgestellt, dass Forschung keiner Geradlinigkeit unterliegt, dass bei der Erarbeitung einer Antwort auf eine wissenschaftliche Fragestellung man des öfteren in Bereiche abdriftet oder vorstößt, die man mit der Frage am Anfang nicht in Verbindung gebracht hätte.
So ist es mir auch gelungen, beim Experimentieren mit kleinen Bakterien die große Liebe zu entdecken. Liebe Ulrike Rensch! Dir danke ich von ganzem Herzen, besonders in den letzten Monaten für das sanftmütige Ertragen meiner Stimmungen, wenn es mal nicht so gut zu laufen schien, besonders aber für das Gefühl, dass, egal was war, es immer etwas viel Bedeutenderes in meinem Leben gibt. Glücklich denke ich immer wieder an unsere schönen Freitagnachmittage im Labor zurück, an denen Dein Wochenwerk zu Ende ging und mein Wochenendwerk gerade erst begann. Ulrike, Dir ist diese Arbeit gewidmet.
Auch Dir, Matthias Freund, spreche ich meinen innigsten Dank aus, was immer noch zu förmlich klingt für das, was ich empfinde. In all unseren Jahren der Freundschaft gab es für mich keinen magischeren Moment, als unser Treffen, an dem sich unser angesammeltes Wissen aus so konträren Bereichen wie Wirtschaftswissenschaften auf der einen und Lebensmittelchemie und Mikrobiologie auf der anderen Seite so wunderbar ergänzte. Für Deine Anregungen und Ideen bin ich Dir sehr dankbar. Diese Inspirationen und Erkenntnisgewinne aus der Mélange des Schaffens der Menschen haben wohl schon Ringelnatz inspiriert.
So hoffe ich, dass auch diese Frucht wieder Samen wird.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ...
1
1.1 Cronobacter spp. ... 1
1.1.1 Historischer Überblick ... 1
1.1.2 Taxonomie und Nomenklatur ... 2
1.1.3 Physiologische und biochemische Eigenschaften ... 3
1.1.4 Vorkommen in Umwelt und Lebensmitteln ... 4
1.1.5 Virulenzfaktoren und klinische Bedeutung ... 5
1.1.6 Nachweisverfahren ... 5
1.1.7 Rechtliche Einordnung ... 7
1.2 Säuglingsanfangsnahrung ... 7
1.3 GFP – Grün fluoreszierendes Protein ... 8
1.4 Lineare multiple Regression ... 9
1.5 Zielsetzung der Arbeit ……….. 11
2 Material und Methoden
... 12
2.1 Kultureller Nachweis von Cronobacter ... 12
2.1.1 Kultureller Nachweis von Cronobacter nach FDA (2002) ……… 12
2.1.2 Kultureller Nachweis von Cronobacter nachKANDHAI et al. (2004) 13 2.1.3 Kultureller Nachweis von Cronobacter nach LEHMACHER ……… 13
2.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von Cronobacter ……… 13
2.1.5 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) von Cronobacter-Isolaten … 14 2.2 Wachstum von Cronobacter sakazakii in Maiskeimlingen ………... 15
2.2.1 Entkeimung der Maiskörner ... 15
2.2.2 Gewinnung GFPUV-tranformierter Stämme ... 16
2.2.2.1 Gewinnung kompetenter Bakterien ... 16
2.2.2.2 Transformation der kompetenten Bakterien ... 17
2.2.2.3 PCR zur Überprüfung der Transformation mit GFPUV .. 17
2.2.3 Anzüchtung der Maiskörner (mit GFPUV-produzierenden Stämmen) ………. 17
2.2.4 Fluoreszenzmikroskopie der Maiskeimlinge ... 17
2.3 Untersuchungen zu möglichen Wechselwirkungen zwischen Maiskeimlingen und Cronobacter ………... 18
2.4 Trocknungsmodell ……... 19
2.4.1 Auswahl der untersuchten Enterobacteriaceae-Stämme ... 19
2.4.2 Versuchsbedingungen ... 20
2.4.3 Versuchsdurchführung der Keimzählung der untersuchten Enterobacteriaceae nach Trocknung ... 21
3 Ergebnisse ... 23
3.1 Vorkommen von Cronobacter in Lebensmitteln ... 23
3.1.1 Vorkommen von Cronobacter in Säuglingsanfangsnahrung ... 23
3.1.2 Vorkommen von Cronobacter in Lebensmittelrohstoffen ……… 25
3.1.3 Vergleich der eingesetzten Nachweisverfahren ……... 27
3.1.4 Differenzierung der Cronobacter-Isolate ………... 29
3.2 Wachstum von Cronobacter in Maiskeimlingen ………... 29
3.2.1 Mikroskopische Analyse der Negativkontrollen ... 30
3.2.1.1 Mikroskopische Analyse unbeimpfter Maiskeimlinge .. 30
3.2.1.2 Mikroskopische Analyse von mit Cronobacter sakazakii DSM 4485 beimpften Maiskeimlingen ... 30
3.2.1.3 Mikroskopische Analyse von mit GFPUV- produzieren- den Escherichia coli DH5α beimpften Maiskeimlingen 31 3.2.2 Mikroskopische Analyse von mit GFPUV-produzierenden Cronobacter-Stämmen beimpften Maiskeimlingen ... 31
3.2.3 Zusammenfassung ... 34
3.3 Untersuchungen zu möglichen Wechselwirkungen zwischen Maiskeimlingen und Cronobacter sakazakii ... 35
3.3.1 Gewichtszunahme von Maiskeimlingen in Abhängigkeit von der Beimpfung mit Cronobacter ………... 35
3.3.2 Trockenmassezunahme von Maiskeimlingswurzeln in Abhäng- igkeit von der Beimpfung mit Cronobacter ... 36
3.3.3 Wurzellängenwachstum von Maiskeimlingen in Abhängigkeit von
der Beimpfung mit Cronobacter ... 36
3.3.4 Sprosslängenwachstum von Maiskeimlingen in Abhängigkeit von der Beimpfung mit Cronobacter ………... 37
3.3.5 Zusammenfassung ... 38
3.4 Überleben von Cronobacter sakazakii und anderen Enterobacteriaceae in Trockenheit ………... 38
3.4.1 Überleben von Enterobacteriaceae in trockener Säuglings- anfangsnahrung ... 38
3.4.2 Überleben von Enterobacteriaceae in Trockenheit ohne Zusatz von trockener Säuglingsanfangsnahrung ... 39
3.4.3 Überleben von Patienten- und Lebensmittelisolaten der Art Cronobacter sakazakii in Trockenheit ... 40
3.4.4 Überleben von Cronobacter sakazakii in Trockenheit in Abhängigkeit von der Temperatur ... 40
3.4.5 Überleben von Cronobacter sakazakii in Trockenheit in Abhängigkeit von der relativen Luftfeuchtigkeit ... 41
3.4.6 Entwicklung eines Modells zur Vorhersage des Absterbever-haltens von Enterobacteriaceae mittels linearer multipler Regression ... 42
3.4.6.1 Beschreibung des durch Trocknungsversuche gewonnenen Datenmaterials ... 42
3.4.6.2 Modellierung des Überlebens von Enterobacteriaceae in Trockenheit und Auswertung des Modells ... 43
3.4.6.3 Überprüfung der Modellannahmen für das Überleben von Enterobacteriaceae in Trockenheit …... 50
3.4.6.3.1 Unabhängigkeit der Variablen ... 51
3.4.6.3.2 Normalverteilung ... 51
3.4.6.3.3 Homoskedastizität ... 52
3.4.6.3.4 Stabilität bei der Betrachtung von Teildaten- mengen ………... 53
4 Diskussion ... 54
4.1 Untersuchung von pulverförmiger Säuglingsanfangsnahrung und Rohstoffen auf Cronobacter ... 54
4.2 Wachstum von Cronobacter sakazakii in Maiskeimlingen und mögliche Wechselwirkungen zwischen diesen Organismen ... 59
4.3 Trocknungsresistenz von Cronobacter und dessen mathematische Modellierung ... 62
5 Zusammenfassung ... 68
6 Summary …... 69
7 Literaturverzeichnis ... 70
8 Anhang …... 80
8.1 Nährmedienverzeichnis ……… 808.2 Daten der linearen multiplen Regression ………. 82
Abkürzungsverzeichnis
°C Grad Celsius
µL Mikroliter µM Mikromolarität Abb. Abbildung
AFLP Amplified Fragment-Length Polymorphism API Analytical Profile Index
ATCC American Type Culture Collection
aw Activity of Water
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin
bp Basenpaar(e)
BÜp Bundesweiter Überwachungsplan
BVL Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit bzw. beziehungsweise
C. Cronobacter
DFI Druggan-Forsythe-Iversen
DNS Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphate
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
E. Enterobacter EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EE Enterobacteriaceae enrichment EFSA European Food Safety Authority
EG Europäische Gemeinschaft
ESIA Enterobacter sakazakii Isolation Agar FAO Food and Agriculture Organization FDA U.S. Food and Drug Administration g Gramm
GFP Grün fluoreszierendes Protein h Stunde(n) HA hypoallergen
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid ISO Internationale Organisation für Normung kb Kilobase
KBE Kolonie bildende Einheit(en) kg Kilogramm L Liter
LB Luria Bertani
LMKV Lebensmittelkennzeichnungsverordnung log Logarithmus
LST lauryl sulphate tryptose M Molarität mA Milliamper mg Milligramm min Minute(n) mL Milliliter
mM Millimolarität mm Millimeter MPa Mega-Pascal
MPN Most Probable Number
MU-α-Glc 4-Methylumbelliferyl-α-glucosid N Anzahl
n.b. nicht bestimmt
Nr. Nummer
OD Optischen Dichte
OLS Ordinary Least Squares
OmpA Outer membrane protein A p(...) plasmid(...) P. Pantoea
PC Plate Count
PCR Polymerase Chain Reaction
PFGE Pulsfeldgelelektrophorese
pH potentia Hydrogenii
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PP2MB Proteosepepton 2, 4-Methylumbelliferyl-α-glucosid, Bile Salt Nr. 3
qs quantum satis
R² Bestimmtheitsmaß rDNS ribosomale Desoxyribonukleinsäure Rel relativ
rel. L. relative Luftfeuchtigkeit
rRNS ribosomale Ribonukleinsäure RZB relative Zentrifugalbeschleunigung s Sekunde sog. sogenannt(e) spp. species pluralis subsp. subspecies Tab. Tabelle Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan tRNS transfer Ribonukleinsäure TS Technical Specification
TSA Tryptic Soy Agar
TSB Tryptic Soy Broth
UV ultraviolett V Volt VO Verordnung
VRB Violet Red Bile
VRBG Violet Red Bile Glucose
WHO World Health Organisation
z.B. zum Beispiel
ZVerkV Zusatzstoffverkehrsverordnung ZZulV Zusatzstoffzulassungsverordnung
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Versuchsbedingungen der Trocknungsuntersuchungen ..……. 20 Abbildung 2: Einflussgrößen des Trocknungsmodells ………... 21
Abbildung 3: PFGE-Gel der Chargen 3, 4 und 5 ……… 24
Abbildung 4: Wurzelquerschnitt eines unbeimpften Maiskeimlings, 100-fache Vergrößerung; links: Betrachtung unter Durchlicht, rechts:
Betrachtung unter Fluoreszenzlicht) ………...……. 30 Abbildung 5: Wurzelquerschnitt eines Maiskeimlings beimpft mit Cronobacter
sakazakii DSM 4485, 100-fache Vergrößerung; links: Betrach-tung unter Durchlicht, rechts: BetrachBetrach-tung unter Fluoreszenz-
licht ………...………..……… 30
Abbildung 6: Wurzelquerschnitt eines Maiskeimlings beimpft mit GFPUV-produzierenden Escherichia coli DH5α, 100-fache Vergrößer-ung; links: Betrachtung unter Durchlicht, rechts: Betrachtung
unter Fluoreszenzlicht ………..……… 31
Abbildung 7: Querschnitt der Wurzel eines mit GFPUV-produzierenden Crono-bacter sakazakii DSM 4485 beimpften Maiskeimlings, 100-fache Vergrößerung; links: Betrachtung unter Durchlicht, rechts: Be-
trachtung unter Fluoreszenzlicht ………. 31
Abbildung 8: Wurzelquerschnitt eines mit GFPUV-produzierenden Cronobacter muytjensii ATCC 51329 beimpften Maiskeimlings nahe einer Verzweigungszone, 100-fache Vergrößerung; links: Betrachtung unter Durchlicht; rechts: Betrachtung unter Fluoreszenzlicht ... 32 Abbildung 9: Ausschnitt des äußeren Wurzelrandes eines mit
GFPUV-produzierendenen Cronobacter sakazakii DSM 4485 beimpften Maiskeimlings, 400-fache Vergrößerung; links: Betrachtung unter Durchlicht, rechts: Betrachtung unter Fluoreszenzlicht ………. 32 Abbildung 10: Ausschnitt des Zentralzylinders eines mit GFPUV-produzierenden
Cronobacter sakazakii DSM 4485 beimpften Maiskeimlings, 400-fache Vergrößerung; links: Betrachtung unter Durchlicht, rechts: Betrachtung unter Fluoreszenzlicht ………... 33
Abbildung 11: Wurzelquerschnitt eines mit GFPUV-produzierenden Cronobacter muytjensii ATCC 51329 beimpften Maiskeimlings, 100-fache Vergrößerung, Schnitt im Bereich der Wurzelstreckungszone; links: Betrachtung unter Durchlicht, rechts: Betrachtung unter
Fluoreszenzlicht ………….………... 33
Abbildung 12: Wurzelquerschnitt eines unbeimpften Maiskeimlings mit Phloro- glucin-Färbung, Durchlicht, 100-fache Vergrößerung …….……. 34 Abbildung 13: Überleben der luftgetrockneter Enterobacteriaceae unter Zusatz
von Säuglingsanfangsnahrung bei 20°C und 50% relativer
Luftfeuchtigkeit ………... 38
Abbildung 14: Überleben der luftgetrockneter Enterobacteriaceae ohne Zusatz von Säuglingsanfangsnahrung bei 20 °C und 50 % relativer
Luftfeuchtigkeit ………... 39
Abbildung 15: Überleben luftgetrockneter Isolate von Cronobacter sakazakii verschiedener Herkunft mit und ohne Zusatz trockener Säuglingsanfangsnahrung bei 20 °C und 50 % relativer
Luftfeuchtigkeit ………... 40
Abbildung 16: Überleben eines luftgetrockneten Cronobacter sakazakii-Isolats aus pulverförmiger Säuglingsanfangsnahrung bei Temperaturen von 20 °C bis 50 °C und konstanter relativer Luftfeuchtigkeit von 50 % mit dem Zusatz von trockener Säuglingsanfangsnahrung …40 Abbildung 17: Überleben von Cronobacter sakazakii bei verschiedenen
relativen Luftfeuchtigkeiten und konstanter Temperatur von 20 °C mit dem Zusatz von Säuglingsanfangsnahrung ………... 41 Abbildung 18: Verteilung der Residuen des Trocknungsmodells ……… 51 Abbildung 19: Verteilung der Residuen des Trocknungsmodells in
Fallunter-scheidungen (agg = P. agglomerans; ecl = E.cloacae; esa = Cronobacter; n = ohne Zusatz Säuglingsanfangsnahrung; y = mit Zusatz Säuglingsanfangsnahrung; bab = Herkunft Säuglingsan-fangsnahrung; kli = Herkunft hospitalisierter Patient; pfe =
Herkunft Pfeffer; typ = Typstamm DSM 4485) ………... 52
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Stammauswahl für das Trocknungsmodell ... 19 Tabelle 2: Vorkommen und Keimgehalt von Cronobacter in Säuglingsan-
fangsnahrung ……….. 23
Tabelle 3: Vorkommen von Cronobacter-Befund in verschiedenen Chargen
einer Marke von Säuglingsanfangsnahrung ...… 24 Tabelle 4: Vorkommen von Cronobacter in Lebensmittelrohstoffen ……….. 25 Tabelle 5: Vorkommen von Cronobacter in nativer Stärke in Abhängigkeit
von der Herkunft der Stärke ………..………... 27
Tabelle 6: Vergleich der Nachweisverfahren hinsichtlich der Nachweisraten
für Cronobacter und coliforme Bakterien ………..……….. 28 Tabelle 7: Differenzierung der Cronobacter-Isolate ………. 29 Tabelle 8: Gewichtszunahme von Maiskeimlingen in Abhängigkeit von der
Beimpfung mit Cronobacter-Stämmen ……….. 35
Tabelle 9: Trockenmassezunahme von Maiskeimlingen in Abhängigkeit von
der Beimpfung mit Cronobacter-Stämmen …..……….….. 36 Tabelle 10: Wurzellängenwachstum von Maiskeimlingen in Abhängigkeit von
der Beimpfung mit Cronobacter-Stämmen …….…………..…….. 36 Tabelle 11: Sprosslängenwachstum von Maiskeimlingen in Abhängigkeit von
der Beimpfung mit Cronobacter-Stämmen ………..……….. 37
Tabelle 12: Anzahl der Untersuchungsdaten des Überlebens von Entero-bacteriaceae in Trockenheit, kategorisiert nach Enterobacter-
iaceae-Spezies und Herkunft des Isolats ……..………... 42 Tabelle 13: Anzahl der Untersuchungsdaten für das Überleben von
Entero-bacteriaceae in Trockenheit, kategorisiert nach Temperatur und
relativer Luftfeuchtigkeit ………... 43
Tabelle 14: Auswertung des Überlebens von Enterobacteriaceae in Trocken-
heit mittels STATA 8.2 ……….. 45
Tabelle 15: Berechnung der beta-Werte der graduellen Variablen mittels
STATA 8.2 ………... 50
Tabelle 16: Auswertung der Daten des Überlebens der Gattung Cronobacter
1 Einleitung
Der Beginn der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit dem Vorkommen von Cronobacter in pulverförmiger Säuglingsanfangsnahrung und den dafür zur Herstellung verwendeten Rohstoffen. Nach der Untersuchung der Säuglings-anfangsnahrung sollten mit Stärke, Lecithinen, Milchpulver und pflanzlichen Ölen mehrere mögliche Quellen als Ursache einer Kontamination untersucht werden. Bei Cronobacter handelt es sich um einen seltenen, opportunistischen Erreger, der vor allem für Säuglinge eine Gefahr darstellt. Auch wenn über Ökologie und Virulenz des Erregers wenig bekannt ist, so ist „seine kausale Rolle bei schweren Infektionen von Neugeborenen“ (FRIEDEMANN, 2008) und damit der Zusammenhang zwischen
der Kontamination von pulverförmiger Säuglingsanfangsnahrung und Erkrankungen bei Säuglingen allgemein anerkannt.
1.1 Cronobacter spp.
1.1.1 Historischer Überblick
Bereits im Jahr 1929 wird in der Literatur ein aus einer Blutkultur isolierter gelb pigmentierter Enterobacter cloaceae (E. cloacae) beschrieben (PANGALOS,1929). Ein
Zusammenhang mit Erkrankungen wird erst wenige Jahrzehnte später wissenschaftlich diskutiert. So wurden entsprechende Keime bei zwei schweren Fällen von neonataler Meningitis mit Todesfolge aus dem Jahr 1958 (URMENYI &
FRANKLIN, 1961) und bei einem weiteren Säugling, der die Erkrankung mit mentalen
Schädigungen überlebt, beschrieben (JØKER et al., 1965).
Im Jahr 1980 veröffentlichten FARMER et al. ihre Untersuchungen, die anhand von
genetischen und biochemischen Unterschieden sowie einer eigenen Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika die gelb pigmentierten E. cloaceae zu Ehren des japanischen Mikrobiologen Riichi Sakazaki in der Art Enterobacter sakazakii (E. sakazakii) zusammenfassten.
Im Jahr 2007 wurde aufgrund neuer genetischer und biochemischer Erkenntnisse ein Vorschlag zur Etablierung der Gattung Cronobacter spp. unterbreitet, in die die Art E. sakazakii aufgehen sollte (IVERSEN et al., 2007b). Mittlerweile hat sich diese
Taxonomie etabliert, die Gattung Cronobacter spp. ist in fünf Spezies mit weiterer Diffenzierung in Subspezies aufgeteilt (IVERSEN et al., 2008).
1.1.2 Taxonomie und Nomenklatur
Die im Jahr 1980 durch FARMER et al. vorgenommene Beschreibung der „gelb
pigmentierten E. cloaceae“ als E. sakazakii basierte auf biochemischen und molekularen Untersuchungen der Verwandschaftverhältnisse innerhalb der Familie der Enterobacteriaceae. Durch den Vergleich der Typstämme mittels DNS-DNS-Hybridisierung konnte gezeigt werden, dass die DNS von E. sakazakii zu 51 % mit der von E. cloaceae, zu 41 % mit der von Citrobacter freundii und zu 30 % mit der von Erwinia amylovora übereinstimmt. Dies führte zur Platzierung der Art E. sakazakii in die Gattung Enterobacter. Untereinander zeigten die 57 untersuchten Stämme eine DNS-Identität von 83-91 %. Aufgrund dieser Untersuchungen und der biochemischen Reaktionen wurde eine Einteilung in 15 Biotypen vorgenommen. Basierend auf partieller 16S rDNS Sequenzanalyse (~500 bp) wurden unter Einbeziehung von 189 Stämmen die 15 Biotypen durch Geno- und Biotypisierung weiter diversifiziert und ein weiterer Biotyp eingeführt (IVERSEN et al., 2006b).
Der Erkenntnisgewinn durch eine größere Zahl untersuchter Isolate (210 Stämme), fast vollständige Sequenzierung der 16S rDNS (>1300 bp) und die Anwendung moderner molekularbiologischer Methoden (Ribotypisierung, AFLP-Typisierung) führte zu einer Reklassifizierung und zur Einführung der Gattung Cronobacter spp. (IVERSEN et al., 2007b). Im Jahr 2008 folgte eine verfeinerte Reklassifizierung von
IVERSEN et al. Danach wurden die Biotypen 1 bis 4, 7, 8, 11 und 13 zur Art
Cronobacter sakazakii (C. sakazakii) zusammengefasst, die Biotypen 5, 9 und 14 zur Art Cronobacter malonaticus und der Biotyp 15 wird zur Art Cronobacter muytjensii. Der neue Biotyp 16 bildet die Art Cronobacter turicensis, wobei zwei Stämme dieser Gruppe separiert als Cronobacter genomospecies 1 geführt werden. Die Biotypen 6, 10 und 12 zählen zur Art Cronobacter dublinensis, wobei Biotyp 12 als Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis, Biotyp 10 als Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis und Biotyp 6 als Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi geführt wird. Diese Umbenennung bringt eine Zusammenfassung aller potenziell pathogener Stämme als Cronobacter mit sich, was eine rechtliche Handhabung von Kontaminationen erleichtern soll. Sämtliche Gruppierungen innerhalb der Gattung Cronobacter enthalten Isolate hospitalisierter Patienten.
Das gelbe Pigment, das anfänglich zur Differenzierung genutzt wurde und mit zur Beschreibung der Art E. sakazakii führte (FARMER et al., 1980; STEIGERWALD et al.,
1976), ist aus taxonomischer Sicht mittlerweile zweitrangig, da nicht alle Stämme der heutigen Gattung Cronobacter das Pigment ausbilden (IVERSEN et al., 2006a).
1.1.3 Physiologische und biochemische Eigenschaften
Bei Cronobacter handelt es sich um ein gramnegatives, bewegliches, stäbchenförmiges Bakterium, das zur Verkapselung befähigt ist. Die meisten Stämme sind in der Lage ein gelbes Pigment zu bilden (FARMER et al., 1985). Die
Fähigkeiten zur Bildung von Cellulose (LEHNER et al., 2005), Biofilmen (IVERSEN et al.,
2004b; KIM et al., 2006; ZOGAJ et al., 2003) und Siderophoren (MOKRACKA et al.,
2004) sind beschrieben. Die Biofilmbildung ermöglicht eine Anheftung an verschiedene Oberflächen wie z.B. Latex, Silikon, Polykarbonat, Stahl (IVERSEN et al.,
2004b) und Glas (LEHNER et al., 2005). Cronobacter ist eine der wenigen Arten der
Enterobacteriaceae, die in der Lage sind das Enzym α-Glucosidase zu produzieren (MUYTJENS et al., 1984).
Das Bakterium zeichnet sich durch eine hohe Resistenz gegenüber Trockenheit (CAUBILLA-BARRON & FORSYTHE, 2007) und osmotischem Stress (RIEDEL & LEHNER,
2007) aus. In trockener Säuglingsanfangsnahrung ist eine Überlebensdauer von 2,5 Jahren dokumentiert (CAUBILLA -BARRON &FORSYTHE, 2007).
Minimale und maximale Wachstumstemperaturen werden mit 2,2 °C und 48,9 °C angegeben (KANDHAI et al., 2006). Dezimale Reduktionszeiten (D-Wert) für
Hitzebehandlungen werden mit D54 °C von minimal 10,2 min (IVERSEN et al., 2004a)
bis 23,7 min (NAZAROWEC-WHITE & FARBER, 1997a) angegeben, im höheren
Temperaturbereich fällt der D-Wert schnell ab (D60 °C = 2,5 min (NAZAROWEC-WHITE &
FARBER, 1997a); D60 °C = 3,52 bis 3,79 min (JUNG &PARK, 2006); D62 °C = 0,2 bis 0,4
min (IVERSEN et al., 2004b)). Die z-Werte variieren im Bereich 5 °C bis 7 °C
(NAZAROWEC-WHITE & FARBER, 1997a; IVERSEN et al., 2004b).
Eine Druckbehandlung von rekonstituierter Säuglingsnahrung mit bis zu 600 MPa führt zu deutlichen Zellreduktionen bis zu 10-7 KBE/g , allerdings gibt es Stämme, die deutlich druckresistenter sind und lediglich um 10-3 KBE/g reduziert werden (GONZÁLEZ et al., 2006).
1.1.4 Vorkommen in Umwelt und Lebensmitteln
Die Gattung Cronobacter kommt beinahe ubiquitär in der Umwelt vor. Vorgenommene Untersuchungen zeigten, dass der Keim in Trinkwasser (SCHINDLER
& METZ, 1991), Abwasser (DUDLEY et al., 1980) und Oberflächenwasser (ALONSO et
al., 1999) gefunden werden kann, zudem in hyperthermalen Mineralwasserquellen (MOSSO et al., 1994). Auch in Bodenproben (KHAN et al., 1998) und in Stäuben
(KANDHAI et al. 2004a) wurde Cronobacter nachgewiesen.
Im Tierreich wurden erfolgreich Isolierungen bei Ratten (GAKUYA et al., 2001), Vögeln
(GOULLET & PICARD, 1986) und Insekten (HAMILTON et al., 2003; KUZINA et al., 2001;
MRAMBA et al., 2006) durchgeführt. Im pflanzlichen Bereich (Soja) wurde sowohl
endo- als auch epiphytisch Cronobacter nachgewiesen (GARDNER et al., 1982;
KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004).
Kontaminationen von Bedarfsgegenständen zur Lebensmittelbereitung wurden im Zuge von Untersuchungen zur Aufklärung von nosokomialen Infektionen aufgedeckt (BAR-OZ et al., 2001; VAN ACKER et al., 2001). So wurde Cronobacter auf Geschirr,
Küchenutensilien (MUYTJENS et al., 1983; NORIEGA et al., 1990; SIMMONS et al., 1989)
und gespülten Bierkrügen (SCHINDLER &METZ,1990) nachgewiesen.
Entsprechend der Befunde lebender Tiere und Pflanzen fallen die Nachweise von Cronobacter im Bereich der Lebensmittel aus. Sowohl bei rohen als auch bei zubereiteten Lebensmitteln tierischer und pflanzlicher Herkunft wurde Cronobacter isoliert (ASAKURA et al., 2007; FRIEDEMANN, 2007). Dabei waren sowohl Blattsalate
und verschiedene Gemüsesorten (KIM &BEUCHAT, 2005), aber auch Hackfleisch und
Fleischbrät (LECLERCQ et al., 2002) sowie Käse (CHAVES-LÓPEZ, 2006) betroffen.
Als ein Bakterium mit hoher Resistenz gegenüber Trockenheit findet sich Cronobacter häufig in Lebensmitteln mit niedrigen aw-Werten wie Milchpulver (BREEUWER et al., 2003; LEHNER et al., 2004) Schokolade, Cerealien, Gewürzen und
Nudelerzeugnissen (KHANDAI et al., 2004a).
Ein besonderer Fokus liegt bei den Untersuchungen aufgrund der besonders prekären Umstände auf Säuglings(anfangs)nahrung, seit der Zusammenhang zwischen den Infektionen bei Säuglingen und der Kontamination der Pulvernahrung hergestellt ist (CLARK et al., 1990; MUYTJENS & KOLLEE, 1990; NORIEGA et al., 1990;
SIMMONS et al., 1989). Die positiven Befunde sind dabei im Rahmen von 2,9 %
(IVERSEN & FORSYTHE, 2004a) bis 14 % (MUYTJENS et al., 1988) der untersuchten
1.1.5 Virulenzfaktoren und klinische Bedeutung
Cronobacter stellt einen seltenen, opportunistischen Erreger dar, der speziell bei Säuglingen Infektionen mit hoher Mortalitätsrate verursachen kann. Das Bakterium ruft Meningitis (BIERING et al., 1989; KLEIMAN et al., 1981; NORIEGA et al., 1990),
Sepsis (STOLL, 2004) und nekrotisierende Enterokolitis (SIMMONS et al., 1989; VAN
ACKER et al., 2001) hervor. Die häufigste Erkrankung ist die Meningitis (BOWEN et al.,
2006). Auch wenn die Gruppe der Säuglinge, besonders der Frühgeborenen am meisten gefährdet ist (BAR-OZ et al., 2001; BLOCK et al., 2002; BURDETTE & SANTOS,
2000; CONDE et al., 2007; HIMELRIGHT et al., 2002; MONROE &TIFT, 1979; STOLL et al.,
2004; WEIR, 2002), so können auch Kinder (LAI, 2001), Erwachsene (CORTI et al.,
2007; HAWKINS et al., 1991; LAI, 2001; RAY et al., 2007) und Senioren (DENNISON &
MORRIS, 2002; LAI, 2001; SEE et al., 2007) von einer Infektion betroffen sein.
Interessanterweise finden sich in der Literatur auch Berichte über Isolate von Cronobacter bei Neugeborenen, die keinerlei Symptome aufwiesen (BIERING et al.,
1989).
Über die Virulenzfaktoren von Cronobacter ist insgesamt sehr wenig bekannt. Cronobacter zeigt an humanen Epithel- und zerebralen Endothelzellen adhäsive Eigenschaften (MANGE et al., 2006). Es ist wie viele andere Bakterien auch in der
Lage ein Membranprotein (OmpA = Outer membrane protein A) zu produzieren, dieses kann an zerebrale Fibronektinstrukturen des Wirtes binden (NAIR &
VENKTIANARAYANAN, 2007). Einige Stämme sind zur Enterotoxinbildung befähigt
(PAGOTTO et al., 2003). Eine Persistenz von Cronobacter in humanen Makrophagen
ist beschrieben (TOWNSEND et al., 2007).
Die minimale Infektionsdosis von Cronobacter ist unbekannt. Experten von FAO und WHO gehen davon aus, dass bereits eine Kontamination mit 0,03 KBE Cronobacter/g Säuglingsanfangsnahrung zu einer Infektion führen kann (ANONYMUS,
2004), was durch Untersuchungen von Säuglingsnahrung gestützt wird. MUYTENS et
al. fanden 1988 in mit Cronobacter kontaminierter Nahrung Keimgehalte von 4.10-3 bis 6.10-3 KBE/g und NAZAROWEC & FARBER (1997b) Keimgehalte von 3,6.10-3 KBE/g.
1.1.6 Nachweisverfahren
Die sehr heterogene und komplexe Zusammensetzung der Gattung Cronobacter bringt eine aufwändige Nachweisführung mit sich. So ist eine Kombination aus
kulturellen und molekularbiologischen Verfahren mittlerweile Standard, neben der fehlerfreien Bestimmung ist hierbei auch ein kurzer Zeitansatz ein wichtiger Faktor. Die allgemeine Durchführung besteht normalerweise aus einer Voranreicherung, der eine selektive Anreicherung folgt. Aus der selektiven Anreicherung wird sowohl der kulturelle, wie auch der molekularbiologische Nachweis, häufig parallel, geführt. Zur Anreicherung werden steriles Wasser (BIERING et al., 1989; FDA, 2002),
gepuffertes Peptonwasser (LEUSCHNER et al., 2003; MUYTJENS et al., 1988; SIMMONS
et al., 1989) oder selektive Bouillons wie EE-Bouillon (= Enterobacteriaceae enrichment) (MUYTJENS et al., 1988) oder LST-Bouillon (= lauryl sulphate tryptose)
(KANDHAI et al., 2004b) verwendet. Teilweise soll das bevorzugte Aufwachsen von
Cronobacter durch die Unterdrückung der grampositiven Begleitflora mit Vancomycin (RESTAINO et al., 2006), Erythromycin (LEHMACHER et al., 2007) oder Gallensalzen
(IVERSEN &FORSYTHE, 2007a) erreicht werden. Andere Ansätze bestehen im Erhöhen
der Inkubationstemperatur bis auf 45 °C (KANDHAI et al., 2004b) oder der
Erniedrigung des aw-Wertes durch den Zusatz großer Zuckermengen (IVERSEN &
FORSYTHE, 2007a).
Der kulturelle Nachweis von Cronobacter aus der Anreicherung macht sich zwei Besonderheiten zunutze. Zum einen werden Medien so ausgewählt, dass das gelbe Pigment ausgebildet wird (z.B. auf TSA) (OH & KANG, 2004), wobei etwa 2 % der
Cronobacter-Stämme dieses nicht ausbilden (IVERSEN & FORSYTHE, 2007a). Zum
anderen finden Zusätze Verwendung, die über Farbgebung oder Fluoreszenz (LEUSCHNER et al., 2003) das Vorhandensein von α-Glucosidase-Aktivität anzeigen
(DFI-Agar (Oxoid, Wesel, Deutschland); ESIA (AES Chemunex, Angelbachtal, Deutschland)). DFI- und ESIA haben sich dabei dem ursprünglich gebräuchlichen VRBG-Agar (LEUSCHNER et al., 2003; OH & KANG, 2004) als überlegen erwiesen
(BESSE et al., 2006; DERZELLE et al., 2007). Der DFI-Agar zeigte sich dabei als der
sensitivste, der ESIA als der spezifischste (IVERSEN & FORSYTHE, 2007a). Auch das
mittlerweile durch die Verordnung EG (VO) 2073/2005 gesetzlich vorgeschriebene Verfahren setzt nach selektiver Anreicherung mit Vancomycin ESIA und TSA zum Nachweis ein. Verdächtige Kulturen werden meistens mit dem API 20E oder dem API-ID32E System (bioMérieux, Nürtingen, Deutschland) biochemisch charakterisiert und bestimmt.
Die angewandten PCR-Verfahren sind heute beinahe ausschließlich real-time-PCR-Verfahren. Da über die Virulenz nicht genügend bekannt ist, beruhen alle
Nachweisverfahren auf leicht zugänglichen Sequenzen bekannter bakterieller Prozesse. Ziel ist entweder das 16S rRNS kodierende Gen (LEHMACHER et al., 2007;
MALORNY & WAGNER, 2005), die benachbarte Sequenz zwischen den Genen für die
16S und die 23S rRNS mit dem tRNAGlu-Gen (LIU et al., 2006) oder die Region, die
durch das 3’-Ende von rpsU und dem 5’-Ende von dnaG begrenzt wird (SEO &
BRACKETT, 2005).
1.1.7 Rechtliche Einordnung
Die rechtliche Situation bezüglich der Verkehrsfähigkeit von Erzeugnissen mit positivem Nachweis von Cronobacter war in Deutschland über einen längeren Zeitraum nicht geregelt. Der spezifische Nachweis von Cronobacter war nicht vorgeschrieben und erfolgte höchstens indirekt über den Nachweis coliformer Keime. Das damalige BgVV (Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin) hatte in seiner Stellungnahme vom Mai 2002 bereits angeregt, bei positiven Nachweisen von Enterobacteriaceae, die nicht zu einer Beanstandung gemäß Diätverordnung geführt hätten, weitere Untersuchungen durchzuführen.
FAO (Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen) und WHO (Weltgesundheitsorganisation) haben 2004 Cronobacter als „Organismus der Kategorie A“ (Zusammenhang zwischen Vorkommen und Infektionen klar erwiesen) eingestuft (ANONYMUS, 2004). Die Europäische Kommission hat 2005 mit der
Verordnung EG (VO) 2073/2005 spezifische Vorschriften zu Untersuchungen erlassen. Im Jahr 2006 hat auch das BVL (Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit) die Untersuchung von Säuglingsnahrung auf Cronobacter in den „Bundesweiten Überwachungsplan“ (BÜp) aufgenommen (BVL, 2008), für 2010 steht gemäß aktuellem BÜp gerade eine erneute bundesweite Untersuchung an. Die Fachgruppe Lebensmittelhygiene und Sicherheitskonzepte des BfR (Bundesinstitut für Risikobewertung) stuft bei der Einteilung der Lebensmittel bezüglich des mikrobiologischen Gefährdungspotenzials aufgrund der möglichen Schwere der Erkrankung durch Cronobacter Säuglingsnahrung in die höchste Kategorie ein (ELLERBROEK, 2007).
1.2 Säuglingsanfangsnahrung
Durch Artikel 2 der Säuglingsanfangsnahrungsrichtlinie 2006/141/EG wird der Begriff Säuglingsanfangsnahrung definiert. Danach versteht man darunter „Lebensmittel, die
für die besondere Ernährung von Säuglingen während der ersten Lebensmonate bestimmt sind und für sich allein den Ernährungserfordernissen dieser Säuglinge bis zu Einführung angemessener Beikost entsprechen“. Dies stellt auch eine Abgrenzung zur Folgenahrung dar, die u. a. nicht als alleinige Nahrung gegeben werden darf. Als Säugling gelten entsprechend dieser Richtlinie „Kinder unter zwölf Monaten“, als Kleinkinder gelten „Kinder zwischen 1 Jahr und 3 Jahren“.
Säuglingsanfangsnahrung wird mit den Kürzeln „PRE“ und „1“ in Verkehr gebracht. Die „PRE“- Nahrung enthält als einzige Kohlenhydratquelle Lactose und ist eher dünnflüssig, eine Fütterung ist nach Belieben möglich. Sollte die Nährstoffdichte nicht mehr ausreichen, wird auf die „1“-Nahrung übergegangen, die neben der Lactose weitere Kohlenhydrate enthält. In den meisten Fällen handelt es sich dabei um Stärke im Bereich von zwei Gewichtsprozent. Diese Nahrung ist sämiger und sättigender, allerdings ist hier eine Überfütterung möglich (FILER, 1971; MAID
-KOHNERT, 2002).
1.3 GFP – Grün fluoreszierendes Protein
Durch die Untersuchung der Rohstoffe wie Stärke sollten mögliche Eintragsquellen von Cronobacter in den Herstellungsprozess der Säuglingsanfangsnahrung identifiziert werden. Pflanzen, die zur Gewinnung dieser Rohstoffe eingesetzt werden, sollten als mögliches natürliches Reservoir von Cronobacter näher untersucht werden. Cronobacter ist bereits in Pflanzen epi- und endophytisch nachgewiesen worden (GARDNER et al., 1982; KUKLINSKY-SOBRAL et al., 2004). In
Keimungsversuchen sollte die mögliche Vermehrung und Lokalisation zuvor mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) markierter Cronobacter-Isolate in Keimligen studiert werden. Mögliche Wege von kontaminierten Pflanzen, die als Ausgangsmaterial für Zutaten der Säuglingsanfangsnahrung dienen, könnten so aufgezeigt werden.
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) hat sich als genetisch integrierbare Sonde, als fluoreszenter Marker für lebende Organismen in der Forschung etabliert. SHIMOMURA et al. entdeckten im Jahr 1962 bei der Qualle Aequorea victoria dieses
kleine aus 238 Aminosäuren bestehende Protein, dessen ungewöhnliche β-barrel Struktur durch eine die Achse des gebildeten Zylinders umschließende α-Helix gebildet wird. In das Zentrum dieser Struktur ist das Chromophor eingeschlossen,
das auf diese Weise gegenüber äußeren Einflüssen sterisch geschützt ist. Entscheidend für die heutigen Anwendungsmöglichkeiten des GFP waren die Arbeiten von PRASHER et al., der im Jahre 1992 die Möglichkeit zum Klonen des
Gens aufzeigte, und von CHALFIE et al. im Jahre 1994, der dieses Gen in anderen
Organismen zur Expression brachte und Bakterien und Würmer damit zum Fluoreszieren brachte. Gleichzeitig war der Beweis erbracht, dass lediglich das GFP-Gen ausreicht, um die gewünschte Fluoreszenz zu erzeugen, also keine weiteren quallenspezifischen Proteine nötig sind.
Nach der Gewinnung wichtiger Erkenntnisse über die fluoreszenzbildenden Strukturbeziehungen (HEIM et al., 1994) gelang es durch gezielte Mutagenese die
heute gebräuchliche Form des GFP zu entwickeln (HEIM et al., 1995), die eine
kürzere Fluorophorreifung und ein vereinfachtes Spektrum mit einer intensiven Absorptionsbande besitzt.
Zusätzlich zur Lokalisation der Bakterien ist ein Einfluss auf das generelle Pflanzenwachstum interessant. Ein unterschiedliches Wachstum von beimpften und unbeimpften Keimlingen könnte Aussagen über eine mögliche symbiotische Beziehung zwischen Cronobacter und untersuchten Pflanzen liefern.
1.4 Lineare multiple Regression
Mit Hilfe der durch die Untersuchungen von Säuglingsanfangsnahrung und Rohstoffen gewonnenen Cronobacter-Stämme und anderer in der Säuglingsanfangs-nahrung vorhandenen Arten soll durch Trocknungsversuche ein mathematisches Modell entwickelt werden, mit dem sich im Rahmen der Parameter das Absterbeverhalten berechnen und in den Grenzen der untersuchten Bedingungen vorhersagen lässt. Zudem soll die Fähigkeit von Cronobacter zum Überleben in Trockenheit mit anderen in diesem Lebensmittel anzutreffenden Enterobacteriaceaen verglichen werden.
Ein dafür sehr gut geeignetes mathematisches Verfahren ist die lineare multiple Regression. Die lineare multiple Regression ist eine Weiterentwicklung der einfachen linearen Regression, die den Zusammenhang zwischen einer abhängigen (endogenen oder zu erklärenden) und einer unabhängigen (exogenen oder erklärenden) Variablen abbildet. Sie beschreibt die Zusammenhänge zwischen einer abhängigen Variablen und mehreren unabhängigen Variablen. Der Grundgedanke aller Regressionsanalysen besteht darin, empirische Daten zu nutzen, um die
Parameter (Schätzer oder Schätzparameter) einer ex ante formulierten Gleichung (Schätzmodell) möglichst präzise zu schätzen. Bei linearen Regressionen wird hierbei unterstellt, dass die endogene Variable y sich aus einer linearen Gleichung mit N exogenen Variablen xi (i = 1...N) bestimmen lässt. Dieser Zusammenhang soll per Annahme für alle empirischen Beobachtungswerte j derselbe sein. Ferner wird unterstellt, dass nicht beobachtete bzw. nicht beobachtbare (Stör-)Einflüsse u existieren, die einen (ebenfalls linearen) Einfluss auf y haben. Seien a und bi die Schätzparameter ergibt sich als Grundform der multiplen linearen Regression, die nachfolgende Gleichung: 1 N j i ij j i y a b x u = = +
∑
⋅ +Diese Gleichung wird im Rahmen der Regressionsanalyse nun derart bestimmt, dass die Summe der Abweichungen über alle uj minimal, mithin die Approximation der linearen Gleichung an die beobachteten Werte möglichst gut ist. Dieses Verfahren ermöglicht die mathematische Berechnung und Überprüfung komplexer Zusammen-hänge und macht verschiedene Einflussgrößen wie Luftfeuchtigkeit, Temperatur und Zeit miteinander vergleichbar.
Bei der Erstellung einer beschreibenden mathematischen Gleichung spielen die oben skizzierten Residuen (uj) eine zentrale Rolle. Darunter versteht man die Differenzen zwischen den wahren und den prognostizierten Werten; je kleiner die aggregierte Gesamtdifferenz ist, desto besser ist die Vorhersagekraft des Modells. Die angewandte Schätzmethode, also die Aggregationsvorschrift zur Bestimmung der Gesamtdifferenz, die es im Rahmen der Schätzung zu minimieren gilt, ist das „Ordinary-Least-Squares“-Verfahren (OLS), bei dem alle Residuen quadriert werden und die Summe dieser Werte möglichst klein sein muss.
Die Schätzung eines derartigen Modells muss, um verallgemeinerbare Aussagen generieren zu können, verschiedenen Annahmen erfüllen. So muss der Fehler gleichmäßig verteilt (Normalverteilung) und nicht systematischer Natur sein, so dass im Idealfall die Summe aller Fehler null beträgt und die Verteilung der Residuen einer Normalverteilung mit dem Erwartungswert Null entspricht. Weiterhin wird die Unabhängigkeit der Variablen sowie Homoskedastizität gefordert, d. h. die Residuen sollten einer Varianzhomogenität unterliegen (KOHLER & KREUTER, 2008).
1.5 Zielsetzung der Arbeit
Ziel der Arbeit war es den Nachweis von Cronobacter in Lebensmitteln zu verbessern, sein Vorkommen und seine Überlebensfähigkeit in trockenen Lebensmitteln zu untersuchen und Einblicke in die Lebensweise des Krankheitserregers mit Pflanzen zu erhalten. Mit der mathematischen Modellierung des Absterbeverhaltens von Cronobacter soll zur Problematik der Kontamination von pulverförmiger Säuglingsanfangsnahrung ein Vorhersagemodell zum Absterbe-verhalten von Cronobacter entwickelt werden.
2
Material und Methoden
2.1 Kultureller Nachweis von Cronobacter
Zur kulturellen Untersuchung der Proben wurden die Verfahren der U.S. Food and Drug Administration (FDA) (2002), nach KANDHAI et al. (2004) und LEHMACHER
(2004) angewandt, die nachfolgend in 2.1.1 bis 2.1.3 beschrieben sind. Dabei wurde zur Quantifizierung von Cronobacter das „Most Probable Number“-Verfahren (MPN-Verfahren) eingesetzt. Dieses liefert mit statistischen Mitteln eine Aussage über den wahrscheinlichsten Wert des Keimgehaltes einer Probe. Die Methode wird vor allem zur Bestimmung sehr niedriger Bakteriengehalte benutzt. Die Auswertung erfolgte mittels tabellierter Werte (MPN-Tabelle nach DEMAN (1983)). In einem Ansatz
wurden, abhängig vom Cronobacter-Keimgehalt, jeweils dreimal 100 g, 10 g und 1 g oder 10 g, 1 g und 0,1 g in das entsprechende flüssige Anreicherungsmedium des jeweiligen Untersuchungsverfahrens in einer 1:10 Verdünnung in maximaler Wiederbelebungslösung eingewogen und über Nacht inkubiert, so dass 333 g oder 33,3 g einer Probe untersucht wurden.
Positive kulturelle Cronobacter-Befunde wurden mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (2.1.4) bestätigt. Mehrere Cronobacter-Isolate aus einer Produktlinie von pulverförmiger Säuglingsanfangsnahrung wurden mit der Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) (2.1.5) differenziert.
Aus den jeweiligen Anreicherungen der drei beschriebenen Verfahren wurden zusätzlich Ausstriche auf VRB-Agar (Oxoid) getätigt und diese für 24 h bei 37 °C inkubiert, um die coliforme Flora zu untersuchen. Bewuchs wurde mittels API20E (bioMérieux) überprüft.
2.1.1 Kultureller Nachweis von Cronobacter nach FDA (2002)
Die Probe wurde in 9 Volumen steriles destilliertes auf 37 °C temperiertes Wasser eingerührt. Die Mischung wurde 24 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 10 mL in 90 mL EE-(Enterobacteriaceae enrichment)-Bouillon (Oxoid) überführt und 24 h bei 37 °C inkubiert. Diese Bakteriensuspension wurde auf VRBG-Agar (Oxoid) ausgestrichen und dieser 24 h anaerob bei 37 °C inkubiert. Violette Kolonien mit violettem Hof wurden auf TSA (Difco) überimpft und 48-72 h bei 25 °C inkubiert. Gelbpigmentierte Stämme wurden mittels API20E (bioMérieux) überprüft. Für die Untersuchungen von Stärke und Lecithin wurde die Voranreicherung dahingehend abgeändert, dass gepuffertes Peptonwasser anstelle von Wasser eingesetzt wurde.
2.1.2 Kultureller Nachweis von Cronobacter nach KANDHAI et al. (2004)
Die Probe wurde in 9 Volumen auf 45 °C temperierter LST-Bouillon (Oxoid) mit dem Zusatz von 0,5 M Natriumchlorid eingerührt. Die Mischung wurde bei 45 °C 24 h inkubiert. Danach wurde die Bakteriensuspension auf VRB-Agar (Oxoid) ausgestrichen, dieser wird 24 h anaerob bei 37 °C inkubiert. Violette Kulturen mit violettem Hof werden auf TSA (BioRad, München, Deutschland) überimpft und bei Raumtemperatur und Raumlicht inkubiert. Gelbpigmentierte Stämme wurden mittels API20E (bioMérieux) bestimmt.
2.1.3 Kultureller Nachweis von Cronobacter nach LEHMACHER 2004
Die Anreicherung bei diesem Verfahren erfolgte in 9 Volumen gepuffertem Peptonwasser (Merck, Darmstadt, Deutschland), das 8 mg Erythromycin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland)/L enthielt und auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt wurde. Nach Zugabe der Probe wurde die Mischung 18 h bei 37 °C mit 100-120 Schüttelbewegungen pro Minute in einem 2 L-Erlenmeyerkolben auf einem Laborschüttler VKS 75 (Bühler, Tübingen, Deutschland) geschüttelt. Der Vereinzelungsausstrich erfolgte auf Agar (siehe 8.1). Die inokulierte PP2MB-Agarplatte wurde 18 h bei 30 °C inkubiert, um die Fluoreszenz des entstehenden 4-Methylumbelliferons nach Spaltung des 4-Methylumbelliferyl-α-glucosids durch die α-Glucosidase von Cronobacter beobachten zu können und weitere 30 h bei 30 °C, um eine mögliche Produktion des gelben Pigments von Cronobacter zu erkennen. Mögliche positive Befunde wurden zur Bestätigung mittels PCR untersucht (2.1.4).
2.1.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Nachweis von Cronobacter
Die PCR mit anschließender Agarose-Gelelektrophorese diente als schnelle Methode zum Nachweis von Cronobacter in Lebensmitteln. Zur Identifizierung wurde eine Positiv- sowie eine Negativ-Kontrolle mitgeführt.
Zum PCR-Nachweis von Cronobacter wurde ein 392 bp großes Fragment des 16S rRNS-kodierenden Gens amplifiziert (LEHMACHER et al. 2007). Als Thermocycler dient
der PCR Thermocycler Primus HT-Duo (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland). Dazu wurde die DNS verdächtiger Bakterien mit InstaGene (BioRad) gemäß den Anweisungen des Herstellers gewonnen.
Für die PCR mit dem Gesamtvolumen von 50 µL wurden 0,5 µL Bakterienlysat mit 10 pmol Primern (synthetisiert von MWG Biotech), 200 µM dNTPs, einer Einheit klonierter Thermus aquaticus DNS Polymerase (Q-Biogene, Heidelberg, Deutschland) und dem Probenpuffer mit Magnesiumchlorid mit einer Endkonzentration von 2 mM gemischt. Das PCR Fragment wurde mit den Primern Start (5´-GCA TTT GAA ACT GGT CAG CTT GAG TCT CG-3´) und Es-16S-Ende (5´-CTC CCG CAT CTC TGC AGG ATT CTC T-3´) amplifiziert. Initial wird die DNS 20 s auf 94 °C erhitzt, die Denaturierung fand bei 92 °C für 10 s statt. Danach wurde für 10 s auf 55 °C abgekühlt, anschließend wurde das Fragment bei 72 °C für 30 s amplifiziert. Die PCR wurde in 34 Amplifikationszyklen durchgeführt. Der letzte Amplifizierungsschritt wurde auf 2 min verlängert.
Die gelelektrophoretische Auftrennung der Amplifikate erfolgte in einem 1,8 %igen Seakem LE Agarosegel (Cambrex Bio Science, Walkersville, Maryland, USA) bei 120 V und 400 mA für 35 min in der Elektrophoresekammer Mini-Sub Cell GT (BioRad). Als Größenstandard wurde der pGEM-DNA-Marker (Promega, Mannheim, Deutschland) eingesetzt. Nach Färbung des Gels mittels Ethidiumbromid (1 µg/mL) wurde eine digitale Dokumentation mit der GelDoc 1.000-Kamera und der Diversity Database Software (BioRad) durchgeführt.
2.1.5 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) von Cronobacter-Isolaten
Für die Makrorestriktionsanalyse wurden von den Cronobacter-Isolaten Übernachtkulturen jeweils einer Kolonie auf TSA mit 5 % defibriniertem gewaschenen Schafsblut (Oxoid) angelegt. Die DNS einer Bakterienmenge von 0,4 OD 600 nm wurde in 1 mL 4 °C kalter steriler TE100-Lösung (siehe 8.1) 3 min bei 4 °C mit einer RZB von 13680 (Biofuge fresco (Hareus, Kleinostheim, Deutschland)) zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 µL TE100-Lösung mit 1 mg Pronase/mL (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) suspendiert. Diese Suspension wurde mit 85 µL einer 50 °C warmen Lösung 1% InCert low-melting Agarose (Cambrex Bio Science) in TE100-Lösung gemischt und in 100 µL Einweggießformen gegossen (Bio-Rad). Zur Festigung wurden die gegossenen Blöckchen 5 min bei 4 °C kühl gestellt. Dann wurden diese in 500 µL steril filtrierter Pronase-Lösung (siehe 8.1) mit 0,1 mg Pronase/mL bei 50 °C für 3 h inkubiert.
Es folgten zwei Waschschritte von 30 min bei 50 °C, der erste mit 900 µL TE5-Puffer (siehe 8.1) mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), der zweite mit 900 µL
TE5-Puffer ohne PMSF. Zur Vorbereitung des Restriktionsverdaus wurden die Blöckchen 10 min mit 900 µL Restriktionspuffer M (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) bei 4 °C gewaschen. Der Restriktionsverdau fand anschließend 12 h bei 37 °C in 300 µL Restriktionspuffer M mit 40 U des Restriktionsenzyms XbaI (Promega) statt. Daraufhin wurden die Blöckchen 1 h mit 900 µL kalter TBE-Lösung (siehe 8.1) bei 4 °C äquilibriert. Für die Elektrophorese wurde ein 1 %iges SeaKem Gold-Agarosegel (Cambrex Bio Science) mit TBE als Laufpuffer verwendet. Das Gel wurde 30 min vor dem Lauf unter gleichen Bedingungen des späteren Laufs konditioniert. Die Elektrophorese erfolgte 22,5 h in der Apparatur CHEF DR III (BioRad) bei einer Pulszeit von 5 s bis 40 s mit linearem Ramping, einer angelegten Spannung von 6 V/cm und einem Winkel von 120 ° bei 10 °C. Nach dem Lauf wurde das Gel 30 min mit Ethidiumbromid (1 µg/mL) gefärbt, zweimal 45 min mit 5 mM EDTA gewaschen und eine digitale Dokumentation mit der GelDoc 1.000-Kamera und der Diversity Database Software (BioRad) durchgeführt.
2.2 Wachstum von Cronobacter in Maiskeimlingen
Zur Klärung der Frage, ob Cronobacter in der Lage ist, Maiskeimlinge zu besiedeln, wurden Maiskörner entkeimt (2.2.1) und mit verschiedenen GFPUV-transformierten Stämmen (2.2.2) beimpft und über einen definierten Zeitraum angezüchtet (2.2.3). Anschließend wurden Dünnschnitte von Wurzel und Spross der Keimlinge mit einem Fluoreszenzmikroskop auf das Vorkommen der eingesetzten Bakterien hin untersucht (2.2.4).
2.2.1 Entkeimung der Maiskörner
Die eingesetzten Maiskörner (Kiepenkerl, Zuckermais, Golda 2888, Profi-Line) werden in Anlehnung an BACON et al. (1994) entkeimt. Dazu werden sie mit sterilem
dest. Wasser versetzt und 5 min stehen gelassen. Das Wasser wird entfernt, die Maiskörner werden mit Natriumhypochlorit-Lösung (≈ 5,5 % aktives Chlor) versetzt und 10 min per Hand geschüttelt. Danach werden sie dreimal mit sterilem dest. Wasser gewaschen und im letzten Waschwasser 2 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird dreimal mit auf 60 °C temperiertem Wasser gewaschen. Zweimal wird das Waschwasser verworfen, im dritten Waschwasser werden die Körner 5 min in einem 60 °C warmen Wasserbad erwärmt. Anschließend werden die Körner mit raumtemperiertem sterilen dest. Wasser gewaschen und in
einer offenen Petrischale etwa 10 min in einem auf 30 °C temperierten Trocken-schrank getrocknet.
2.2.2 Gewinnung GFPUV-tranformierter Stämme
Zur Gewinnung GFPUV-tranformierter Stämme wurden zuerst kompetente Bakterien der ausgesuchten Stämme erzeugt (2.2.2.1) und anschließend transformiert (2.2.2.2). Der für die Transformation verwendete Vektor pGFPUV mit der Größe von 3,3 kb stammt von der Firma Clontech, Mountain View, California, USA. Er überträgt die Eigenschaften des grün fluoreszierenden Proteins (GFP). Der Vektor leitet sich vom pUC19-Vektor, einem Multicopy-Plasmid von Escherichia coli ab. Als Selektionsmarker dient die Ampicillinresistenz: durch Ampr ist ein β-Lactamase-Gen codiert. Der vor dem GFP-Gen befindliche Lac-Promotor wird durch IPTG induziert. Das GFPUV-Gen ist von einer „multiple cloning site“ (MCS) umgeben, die mehrere verschiedene Restriktionsschnittstellen enthält. Der Erfolg der Transformation wurde mittels PCR überprüft (2.2.2.3).
2.2.2.1 Gewinnung kompetenter Bakterien
Für die Erzeugung kompetenter (d.h. DNS-aufnahmefähiger) Bakterien wurde die von MANIATIS et al. (1989) beschriebene Calciumchlorid-Methode in modifizierter
Form angewandt. Durch einen Überschuss an Calcium-Ionen wurde die Durchlässig-keit der Zellmembran und damit die AufnahmefähigDurchlässig-keit der Zellen für Fremd-DNS gesteigert. Bei der folgenden Transformation wird eine optimierte Aufnahme der DNS durch eine Kälte-Wärme-Behandlung erzielt. An die Transformation wird eine PCR zur Überprüfung der DNS-Aufnahme angeschlossen.
Von angelegten Übernachtkulturen in LB-Bouillon der Stämme C. sakazakii DSM 4485, Cronobacter muytjensii ATCC 51329, Escherichia coli DH5α (als heterologe Kontrolle) und eines aus Bruchmais isolierten Cronobacter-Wildstammes wurden mit 0,2 mL je 20 mL LB-Medium angeimpft. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte (OD 550 nm) von 0,4. Anschließend wurden die Zellen bei 4 °C für 5 min mit einer RZB von 9500 zentrifugiert (Biofuge fresco (Hareus)) die Überstände wurden verworfen und die Zellpellets jeweils in 10 mL TF-Lösung (Tris.HCl 10 mM; Calciumchlorid 100 mM) resuspendiert. Nach einer Inkubation von 20 min auf Eis wurden die Zellen erneut zentrifugiert (RZB = 9500), die Zellpellets wurden in 0,3 mL eiskalter TF-Lösung resuspendiert.
2.2.2.2 Transformation der kompetenten Bakterien
40 µL der jeweiligen TF-Lösung kompetenter Bakterien eines Stammes wurden jeweils mit 0,5 µL Plasmid pGFPUV (Clontech) DNS versetzt. Die Mischungen wurden 30 min auf Eis, danach 30 s bei 42 °C im Thermoblock TB 1 (Biometra, Göttingen, Deutschland) inkubiert. 450 µL SOC-Medium (siehe 8.1) wurden jeweils hinzugefügt. Anschließend wurden die Bakteriensuspensionen 1 h bei 37 °C und 150 min-1 geschüttelt. Diese wurden darauf 3 min mit einer RZB von 9500 zentrifugiert und die Zellpellets in 50 µL steriler physiologischer (0,85 %iger) Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Bakteriensuspensionen wurden auf LB-Agar mit Zusätzen (siehe 8.1) ausplattiert.
2.2.2.3 PCR zur Überprüfung der Transformation mit pGFPUV
Die PCR wurde analog zu 2.1.4 durchgeführt, wobei andere Primer und ein abweichendes PCR-Programm benutzt wurden. Zum Nachweis des GFP-kodierenden Gens werden die Primer GFP-Start (5´-TCA AAG CTA ACT TCA AAA TTC GCC -3´) und GFP-Ende (5´-TCA TCC ATG CCA TGT GTA ATC C -3´) benutzt, um ein 223 bp großes Fragment zu amplifizieren.
Nach initialer Erhitzung der DNS auf 94 °C für 20 s, fand die Denaturierung bei 92 °C für 20 s statt. Dann wurde für 20 s auf 55 °C abgekühlt, anschließend wurde das Fragment bei 72 °C für 25 s amplifiziert. Die PCR wurde in 38 Zyklen durchgeführt, wobei der letzte Amplifizierungsschritt auf 2 min verlängert wurde.
2.2.3 Anzüchtung der Maiskörner (mit GFPUV-produzierenden Stämmen)
Die entkeimten Maiskörner (2.2.1) wurden auf modifizierten Kartoffelagar (siehe 8.1) gegeben. Die Maiskörner wurden mit 2 µL je einer der Übernachtkulturen der GFPUV-bildenden Bakterien (verwendete Stämme: C. sakazakii DSM 4485 pGFPUV, Cronobacter muytjensii ATCC 51329 pGFPUV, Cronobacter Bruchmais pGFPUV, Escherichia coli DH5α pGFPUV) beimpft. Als Übernachtkulturmedium wurde LB-Bouillon mit Zusätzen (siehe 8.1) verwendet. Alle Petrischalen wurden vier Tage im zwölfstündigen Wechsel mit und ohne Licht gehalten.
2.2.4 Fluoreszenzmikroskopie der Maiskeimlinge
Mit Einmalskalpellen und Rasierklingen wurden Querschnitte von Wurzel und Sprossen angefertigt und als Wasserpräparate auf einem Objektträger mikroskopisch
untersucht. Die Dünnschnitte wurde neben der fluoreszenzmikroskopischen Betrachtung einer lichtmikroskopischen Kontrolle unterworfen. Die Fluoreszenz-anregung erfolgte mit blauem (488 nm) sowie UV-Licht (395 nm) was eine grüne Fluoreszenz (Emission 509 nm) zur Folge hatte. Für alle mikroskopischen Untersuchungen wurde das Axioskop Nr. 2 (Zeiss, Jena, Deutschland) verwendet. Einige Schnitte wurden mittels Phloroglucinlösung angefärbt. Dieses Reagenz wurde durch Lösen von wenig Phloroglucin in einer Lösung von Ethanol und Wasser gleicher Volumenanteile hergestellt. Die Färbung kommt zustande, indem man etwas Phloroglucinlösung auf den Schnitt auftupft und einen Tropfen Salzsäure hinzugibt. Die Aufnahmen wurden mit der Kamera AxioCam MRc5 (Zeiss) aufgenommen. Die Aufnahmen und Auswertungen erfolgten digital über die Software Axio Vision 4.0 (Zeiss). Mit entsprechenden Objektiven wurden Bilder mit 100-facher bzw. 400-facher Vergrößerung erstellt.
2.3 Untersuchungen zu möglichen Wechselwirkungen zwischen Maiskeimlingen und Cronobacter
Inwieweit das Wachstum von Maiskeimlingen durch Cronobacter beeinflusst wird, wurde statistisch untersucht. Dazu wurden entkeimte Maiskörner (2.2.1) mit Cronobacter beimpft (2.3.1) und Keimlingsgewicht und Längenwachstum mit nicht beimpften Maiskeimlingen nach gleicher Wachstumsphase verglichen. Einige der Wurzeln wurden für die Bestimmung der Wurzeltrockenmasse (2.3.2) herangezogen. Die entkeimten Maiskörner (2.2.1) wurden in geschlossene Petrischalen auf Kartoffelagar (siehe 8.1) gegeben. Die eine Hälfte der Maiskörner wird mit 10 µL einer Übernachtkultur eines aus Bruchmais isolierten Stammes Cronobacter in LB-Bouillon äußerlich beimpft, die andere Hälfte mit 10 µL steriler LB-LB-Bouillon. Alle Petrischalen zusammen werden nun vier Tage im zwölfstündigen Wechsel mit und ohne Licht gehalten.
Die Bestimmung der Trockenmasse der Wurzeln geschieht in Anlehnung an das im Lebensmittelbereich übliche Seesandverfahren. Danach werden etwa 1 g fein gehackte Wurzeln auf 0,1 mg genau in flache mit geglühtem Seesand gefüllte und exakt gewogene (± 0,1 mg) Aluminiumschalen eingewogen und mit dem Sand verrieben. Diese Schalen werden 1 h in einen auf 102 ± 2 °C temperierten Trockenschrank gestellt. Nach dem Abkühlen werden sie wiederum exakt gewogen (± 0,1 mg). Trocknung und Wägung werden wiederholt bis zur Gewichtskonstanz.
2.4 Trocknungsmodell
Mittels multipler linearer Regression wurde ein Modell zur Vorhersage des Absterbeverhaltens von Enterobacteriaceae unter definierten Bedingungen entwickelt. Aus den nach 2.1 gewonnenen Stämmen aus der Säuglingsanfangs-nahrung und den Rohstoffen wurde eine Auswahl getroffen (2.4.1), die um weitere Stämme aus der Sammlung des Institutes für Hygiene und Umwelt Hamburg ergänzt wurde. Diese wurden im Rahmen der definierten Bedingungen (2.4.2) getrocknet und nach einer einheitlichen Vorgehensweise (2.4.3) regelmäßig quantitativ bestimmt.
2.4.1 Auswahl der untersuchten Enterobacteriaceae-Stämme
In das Modell wurden neben Cronobacter mit Pantoea agglomerans (P. agglomerans) und E. cloaceae Stämme zweier weiterer Gattungen der Entero-bacteriaceae aufgenommen, die bei den durchgeführten Untersuchungen häufig in Säuglingsanfangsnahrung zu finden waren (Tab. 1; siehe auch 4.1.1).
Tabelle 1: Stammauswahl für das Trocknungsmodell
Anzahl Art Herkunft 1. Versuch weitere Versuche Säuglingsanfangsnahrung 8 2 Hospitalisierte Patienten 1 1 Gewürz (Pfeffer) 1 1 Cronobacter sakazakii Referenz (DSM 4485) 1 1
Cronobacter turicensis Hospitalisierte Patienten 1 0
Säuglingsanfangsnahrung 1 1 Pantoea agglomerans Hospitalisierte Patienten 1 1 Säuglingsanfangsnahrung 1 1 Enterobacter cloaceae Hospitalisierte Patienten 1 1
Der Schwerpunkt lag bei der Auswahl auf Cronobacter-Stämmen: neben acht aus Säuglingsanfangsnahrung isolierten Stämmen (den fünf selbst isolierten und den drei aus der Stammsammlung des Institutes für Hygiene und Umwelt Hamburg) wurden zwei Stämme von hospitalisierten Patienten ausgewählt. Zusätzlich wurde ein Isolat aus einem anderen trockenen Lebensmittel (Pfeffer) und ein Referenzstamm, der ebenfalls von hospitalisierten Patienten stammt (DSM 4485), mitgeführt. Dieser wurde einzeln geführt, um eine mögliche repräsentative Funktion des Typstammes für das Absterbeverhalten von Cronobacter zu ermitteln. Von Pantoea agglomerans
und E. cloaceae wurden je ein aus Säuglingsanfangsnahrung und aus klinischem Material isolierter Stamm untersucht. Nach der ersten Versuchsreihe bei 20 °C und 50 % relativer Luftfeuchtigkeit wurde die Zahl der mitgeführten C. sakazakii aus der Säuglingsnahrung reduziert, da sich das Absterbeverhalten innerhalb der Herkunftsgruppen nicht signifikant unterschied.
2.4.2 Versuchsbedingungen
Über einen Zeitraum von bis zu 55 Wochen (bei 20 °C/50 % relativer Luftfeuchtigkeit, ansonsten 10 Wochen) wurde das Absterbeverhalten der eingesetzten Stämme unter acht verschiedenen konstanten Konstellationen von Temperatur und relativer Luftfeuchtigkeit beobachtet. Bei einer Temperatur von 20 °C wurde die relative Luftfeuchtigkeit im Bereich von 20 % bis 90 % variiert, bei einer konstant gehaltenen relativen Luftfeuchtigkeit von 50 % wurde die Temperatur von 20 °C an in 10 °C-Schritten bis auf 50 °C erhöht (Abb. 1).
Abbildung 1: Versuchsbedingungen der Trocknungsuntersuchungen
Weiterhin wurde die Tenazität mit und ohne den Zusatz von trockener Säuglingsanfangsnahrung überprüft. Die Keimzählung der überlebenden Enterobacteriaceae (Absolutwert) erfolgte am Tag des Trocknungsbeginns und darauf wöchentlich. Bei höheren Temperaturen wurde der Abstand der Keimzählungen auf Tage bzw. Stunden verkürzt.
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5
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3
3
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0
2
2
0
0
4
4
0
0
2
2
0
0
3
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0
5
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0
0
Luftfeuchtigkeit
ϕ
[%]
9
9
0
0
7
7
0
0
Zeit t [Wochen]
(bis 55 Wochen)Abbildung 2: Einflussgrößen des Trocknungsmodells
Der Quotient aus der Lebendkeimzahl zum Zeitpunkt der Zählung (N) und der An-fangskeimzahl bildet die für die Berechnungen verwendete Verhältniszahl (NRel). Die Modellberechnungen erfolgen anhand der logarithmierten Verhältniszahl (NRelLog). Neben den grundsätzlichen Parametern Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Zeit wurden auch die Einflüsse untersucht, die aus der Herkunft der Keime, der Verschiedenartigkeit der Stammtypen und des Zusatzes von pulverförmiger Säuglingsanfangsnahrung resultieren (Abb. 2).
2.4.3 Versuchsdurchführung der Keimzählung der untersuchten
Entero-bacteriaceae nach Trocknung
Die bei –80 °C in Kryokultur gelagerten Stämme werden auf passendem Nährmedium (Cronobacter auf TSA (Oxoid), die anderen Enterobacteriaceae-Stämme auf MacConkey-Agar (Oxoid)) angezüchtet. Danach wird eine Kolonie in Bouillon überimpft und 24 h bei 37 °C bebrütet. Anschließend wird 0,1 mL der LB-Bouillon in 20 mL Minimalmedium M9 (siehe 8.1) überimpft und dieses auf einem Schüttler mit 150 min-1 4 h bei 37 °C belassen. Das bebrütete M9 Minimalmedium wurde bei 4 °C 3 min zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde mit 1,5 mL steriler 0,85 %iger Kochsalzlösung gewaschen und daraufhin in 1 mL steriler 0,85 %iger Kochsalzlösung resuspendiert. 10 µL dieser Suspension (≈107 Zellen) wurden in die Kavitäten von zwei Mikrotiterplatten gegeben. In die Vertiefungen einer dieser Platten wurden zusätzlich 0,2 g keimfreie pulverförmige Säuglingsanfangsnahrung gegeben. Die Platten wurden in einen Konstantklimaschrank KBF 115 (Binder, Tuttlingen,
Anzahl KBE
(Absolutwert „N“)
Zeit t [Wochen]
Temperatur T [°C]
Luftfeuchtigkeit ϕ [%]
Stammtyp
Zusatz
Säuglingsanfangsnahrung
Herkunft
Verhältniszahl
(„N
Rel“)
log
10Verhältniszahl
(„N
RelLog“)
Deutschland) gestellt, der mit der Temperatur und relativen Luftfeuchtigkeit für den entsprechenden Versuchsdurchgang vorkonditioniert wurde.
Zur Keimzählung wurde zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt von dem jeweiligen getrockneten Enterobacteriaceae-Stamm eine Verdünnungsreihe erstellt. Dazu wurden 100 µL sterile 0,85 %ige Kochsalzlösung in eine Kavität der Mikrotiterplatte gegeben und die Zellen (und ggf. die pulverförmige Säuglingsanfangsnahrung) resuspendiert. Diese Suspension wurde in 900 µL sterile 0,85 %ige Kochsalzlösung überführt. In gleicher Weise wurden sieben weitere (im späteren Verlauf durch das Absterben bedingt weniger) dekadische Verdünnungen erstellt. Je 100 µL jeder Verdünnung dieser Verdünnungsreihe wurden in handwarmen Plate Count-Agar (PC-Agar) (siehe 8.1) gleichmäßig vergossen. Nach 24 h bei 37 °C wurden die koloniebildenden Einheiten (KBE) gezählt. Kontrollproben der sterilen 0,85 %igen Kochsalzlösung und der keimfreien pulverförmigen Säuglingsanfangsnahrung wurden mitgeführt.
Die Erstellung dieser Verdünnungsreihe wurde wöchentlich wiederholt, bei höheren Temperaturen wurden die Zeitabstände zur KBE-Zählung an das Absterbeverhalten angepasst. Wenn durch die Verdünnungsreihe keine Keimzählung mehr möglich war, wurden die 100 µL aus der Mikrotiterplattenkavität direkt in den handwarmen PC-Agar gleichmäßig vergossen.
