Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
von
Lebensmittelchemiker
Sascha Rinne
geboren am 30. Mai 1979 in Minden (Westf.)
2009
Referent/in: Prof. Dr. Ralf G. Berger Korreferent/in: Prof. Dr. Holger Zorn Tag der Promotion: 08.01.2009
Die Enzyme aus Pleurotus sapidus, welche das Monoterpen α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon oxidieren, wurden nach Aufschluss des Pilzmyzels und Gradienten- zentrifugation in der mikrosomalen Fraktion lokalisiert und durch Detergentienzusatz partiell in Lösung gebracht. In einem alternativen Ansatz wurden die beteiligten Enzyme durch Lyophilisation aus ihrer Matrix gelöst, wobei auf mehrere Arbeitsschritte der etablierten Aufarbeitungen (Aufschluss, Solubilisierung, Dialyse) verzichtet werden konnte. Die Lyophilisation eröffnete damit einen effektiven Zugang zu den Zielenzymen. Bei der Biotransformation von α-Pinen akkumulierten die Produkte (E)-Verbenol und Verbenon in Summenkonzentrationen bis zu 300 mg L-1, das Z-Isomer des Verbenols hingegen nicht. Bei Zudosierung von (Z)-Verbenol als Substrat wurde dieses quantitativ zu Verbenon oxidiert, (E)-Verbenol dagegen nicht.
Somit liegt nahe, dass α-Pinen in einem ersten Reaktionsschritt zu den beiden Verbenol-Isomeren oxidiert wurde, woraus (Z)-Verbenol in einem zweiten Reaktions- schritt von einer stereospezifischen Dehydrogenase zu Verbenon oxidiert wurde.
Bei der Biotransformation des Monoterpens β-Myrcen zu Perillen, einem hochpotenten Aromastoff, wurde ein Screening mit Lyophilisaten ausgewählter Pleurotus-Stämme durchgeführt. Pleurotus sapidus wurde als potentester Pilz für die weiteren Arbeiten ausgewählt. Der Biokonversionsweg wurde untersucht und mit einem von Hapetta (Dissertation LUHannover 2006) für Submerskulturen von Pleurotus ostreatus postulierten verglichen. Hierzu wurden einige der potentiellen Zwischenprodukte synthetisiert und als Substrate für die Konversion mit Lyophilisaten eingesetzt. Es wurde ein zweiter, bislang unbekannter Bildungsweg für Perillen vorgeschlagen. Die beteiligten Enzyme wurden nach Lyophilisation mit Hilfe von Detergentien in Lösung gebracht und die Produktausbeuten auf bis zu 63 mg L-1 gesteigert.
Schlagwörter: Biokonversion, Terpene, Pleurotus sapidus
Novel enzymes of basidiomycetes, which were able to transform terpenes efficiently, were biochemically characterised. The enzymes of Pleurotus sapidus, found to oxidise α-pinene to trans-verbenol and verbenon, were located in the microsomal fraction and partially solubilised using detergents. As an alternative, the involved enzymes were made amenable using freeze drying of the fungal mycelium. Thus, common steps, such as disruption, dissolution and dialysis were avoided. As a result, lyophilised cultures presented a more efficient access to the target enzymes. During the transformation of α-pinene the biotransformation products (E)-verbenol and verbenone accumulated in concentrations of up to 300 mg L-1, whereas (Z)-verbenol, was found in traces only. Both verbenol isomers were added as a substrate, but only the oxidation of (Z)-verbenol to verbenone was observed. Thus it appeared that α- pinene was oxidised in a first step to both verbenol isomers. Then, in a second step, (Z)-verbenol was oxidised to verbenone by a stereo-specific dehydrogenase.
Lyophilisates of selected strains of Pleurotus were tested for their capability to oxidise the monoterpene β-myrcene to perillene, a highly potent flavour compound. Pleurotus sapidus was chosen for further experiments because of its high efficiency. The bioconversion pathway was elucidated and compared to a pathway of a Pleurotus ostreatus strain supplemented with β-myrcene in submerged cultures (Hapetta, PhD Thesis LUHannover 2006). Some key metabolites of the proposed pathway were synthesised and used as substrates in the conversion assays using lyophilisates. As a result, a second and so far unknown way to perillene was derived. Enzymes of the pathway were solubilised from the lyophilisates using detergents, and the yield of perillene was increased up to a maximum concentration of 63 mg L-1.
Keywords: bioconversion, terpenes, Pleurotus sapidus
Bisherige Veröffentlichungen:
Fraatz, M. A.; Rinne S.; Berger, R. G.; Zorn, H. (2007) Terpenoide Aromen aus nachwachsenden Rohstoffen, Lebensmittelchemie
Krings, U.; Krügener, S.; Rinne, S.; Berger, R.G. Bioconversdion of ß-Myrcene to Perillene – Metabilites, Pathways, and Enzymes, Proceedings of the 12th WEURMAN Flavour Symposium, in press
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis... I
Abkürzungsverzeichnis...V
1 Einleitung...1
1.1 Zielsetzung 1... 4
1.2 Zielsetzung 2... 4
2 Ergebnisse ...5
2.1 Biokonversion des Monoterpens α-Pinen... 5
2.1.1 Auswahl der Mikroorganismen ... 5
2.1.2 Produktion von Biomasse und Enzyminduktion durch Dosierung von α-Pinen ... 5
2.1.3 Identifizierung der Biokonversionsprodukte... 5
2.1.3.1 Identifizierung von α-Pinenhydroperoxiden ... 7
2.1.3.2 Identifizierung von (E)-Verbenol ... 9
2.1.4 Biokonversion nach Zellaufschluss aus Submerskultur ... 13
2.1.4.1 Lokalisierung der Aktivität nach Gradientenzentrifugation... 13
2.1.4.2 Enzymstabilität ... 14
2.1.4.3 Einfluss von Detergentien auf die Solubilisierung... 15
2.1.4.4 Rekombinationsversuche nach Solubilisierung ... 15
2.1.4.5 Inaktivierungsversuche nach Solubilisierung ... 16
2.1.4.6 Bildungskinetik der α-Pinenhydroperoxide, (E)-Verbenol und Verbenon ... 17
2.1.4.7 CO-Differenzspektrum zur Detektion von P450-Aktivität ... 18
2.1.5 Biokonversion mit Lyophilisat ... 18
2.1.5.1 Vergleich des Produktspektrums und der Produktausbeuten von Lyophilisat und Mikrosomen ... 18
2.1.5.2 Solubilisierung der Aktivität aus Lyophilisaten ... 20
2.1.5.3 Einfluss von Detergentien auf die Solubilisierung... 21
2.1.5.4 Biokonversion weiterer Substrate ... 22
2.1.5.5 Umsetzung von (E)-Verbenol, (Z)-Verbenol und Verbenon... 22
2.2 Biokonversion des Monoterpens β-Myrcen ... 23
2.2.1 Identifizierung der flüchtigen Biokonversionsprodukte ... 23
2.2.2 Screening verschiedener Pleurotus-Stämme ... 26
2.2.3 Einfluss von Detergentien auf die Solubilisierung ... 28
2.2.4 Maximierung der Perillenbildung ... 29
2.2.4.1 Einfluss der eingesetzten Lyophilisatmenge auf die Produktausbeute ... 29
2.2.4.2 Einfluss der Detergentienkonzentration auf die Aktivität ... 30
2.2.4.3 Einfluss des pH-Wertes... 32
2.2.4.4 Einfluss der Substratkonzentration ... 33
2.2.4.5 Optimierung der Biokonversionszeit ... 34
2.2.4.6 Bildungskinetik von Nebenprodukten... 35
2.2.6 Scale up des Aktivitätstests ... 38
2.2.7 Biokonversion mit verschiedenen Substraten ... 38
2.2.7.1 3,10-Epoxy-β-myrcen als Substrat... 39
2.2.7.2 1,2-Epoxy-β-myrcen als Substrat... 42
2.2.7.3 6,7-Epoxy-β-myrcen als Substrat... 42
2.2.7.4 α,α-Acariolid als Substrat... 44
2.2.7.5 α,α-Acarilactol als Substrat... 44
2.2.7.6 α-(Z)-Acaridiol als Substrat ... 45
2.2.7.7 Perillen als Substrat ... 46
2.2.8 β-(Z)-Ocimen als Substrat... 47
2.2.9 Aufreinigung der an der Biokonversion beteiligten Enzyme... 49
2.2.9.1 Fraktionierte Solubilisierung... 49
2.2.9.2 Aufreinigung per FPLC... 51
2.2.9.3 Gelfiltrationschromatographie (GFC) ... 52
2.2.9.4 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ... 54
3 Diskussion ...57
3.1 Terpene als Grundlage für die Aromastoffproduktion... 57
3.1.1 Terpenbiosynthese ... 57
3.1.2 α-Pinen als Ausgangsstoff für hochwertige Naturstoffe ... 58
3.1.3 β-Myrcen als Substrat für die Biokonversion ... 59
3.1.4 Problematik der eingesetzten Substrate bei der Biokonversion ... 59
3.1.4.1 Flüchtigkeit der eingesetzten Substrate... 60
3.1.4.2 Etablierung eines Aktivitätstests ... 60
3.2 Biokonversion des Monoterpens α-Pinen... 61
3.2.1 Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP)... 62
3.2.2 Lokalisierung und Solubilisierung der Enzymaktivität... 63
3.2.3 Verwendung von Lyophilisaten... 64
3.2.4 Biokonversionsprodukte von α-Pinen durch P. sapidus ... 64
3.2.5 Zusammenfassung der Biokonversion des Monoterpens α-Pinen... 65
3.3 Biokonversion des Monoterpens β-Myrcen ... 66
3.3.1 Vorkommen und Bedeutung von β-Myrcen ... 66
3.3.2 Optimierung der Biokonversion ... 67
3.3.3 Metabolisierungsmechanismus ... 67
3.3.3.1 Epoxidierung von β-Myrcen ... 67
3.3.3.2 Biokonversion zu Perillen... 68
3.3.3.3 Mögliche Bildung eines β-Myrcen-Endoperoxids... 68
3.3.3.4 Postulierte Biokonversion durch eine Cyclooxygenaseaktivität... 70
3.3.4 Zusammenfassung der Biokonversion des Monoterpens β-Myrcen ... 71
4 Material und Methoden...73
4.1 Verwendete Mikroorganismen ... 73
4.2 Chemikalien ... 74
4.2.1 Bestandteile der Kulturmedien... 74
4.2.2 Standardsubstanzen und Substrate ... 75
4.2.3 Chemikalien für die Proteinanalytik ... 75
4.2.4 Chemikalien für die chemische Synthese... 76
4.2.5 Detergentien zur Solubilisierung... 77
4.2.6 Sonstige Chemikalien ... 78
4.2.7 Lösungsmittel... 79
4.2.8 Gase ... 80
4.2.9 Standardpuffer ... 80
4.2.9.1 Hepes-Puffer für Arbeiten mit Mikrosomen... 80
4.2.9.2 Hepes-Puffer für Arbeiten mit Lyophilisat ... 80
4.3 Geräte und sonstige Hilfsmittel... 81
4.3.1 Verwendete Geräte und Hilfsmittel ... 81
4.3.2 Rührwerkskugelmühle ... 82
4.4 Kultivierung von Biokonversionskulturen ... 83
4.4.1 Kulturmedien... 83
4.4.1.1 SNL-Standardnährmedium ... 83
4.4.1.2 SNL-Agar... 83
4.4.2 Kulturführung ... 84
4.4.2.1 Stammkultivierung... 84
4.4.2.2 Homogenisieren von Kulturen... 84
4.4.2.3 Vorkulturen ... 84
4.4.2.4 Hauptkulturen ... 84
4.4.3 Ernte der Hauptkultur... 84
4.4.4 Herstellung von Lyophilisaten... 85
4.5 Bestimmung von Kulturparametern ... 85
4.5.1 Biofeuchtmasse ... 85
4.5.2 Trockenmasse nach Gefriertrocknung... 85
4.5.3 Prüfung auf Kontamination ... 85
4.6 Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle ... 85
4.7 Gradientenzentrifugation ... 86
4.8 Solubilisierung... 86
4.8.1 Solubilisierung der mikrosomalen Fraktion... 86
4.8.2 Solubilisierung von Lyophilisat... 86
4.8.3 Fraktionierte Solubilisierung von Lyophilisat ... 86
4.9 Konzentrierungen... 87
4.9.1 Ethanolfällung ... 87
4.9.2 Zerschäumung ... 87
4.10 Proteinbestimmung ... 88
4.10.1 Gesamtproteinbestimmung nach Lowry ... 88
4.11 Aktivitätstests ... 88
4.11.1 α-Pinen Aktivitätstest ... 88
4.11.2 β-Myrcen Aktivitätstest ... 88
4.11.3 Scale up des β-Myrcen Aktivitätstests ... 89
4.11.4 P450 Aktivitätsbestimmung durch CO-Differenzspektrum ... 89
4.12 Chemische Synthesen ... 90
4.12.1 Synthese von α-Pinenhydroperoxiden ... 90
4.12.2 Synthese von 1,2- und 3,10-Epoxy-β-myrcen ... 90
4.12.3 Synthese von 6,7-Epoxy-β-myrcen... 92
4.12.4 Synthese von α,α-Acariolid ... 93
4.12.5 Synthese von α-(Z)-Acaridiol und α,α-Acarilactol ... 96
4.12.6 Synthese von Perillen ... 96
4.13 Destillation von β-Myrcen ... 97
4.14 Chromatographie ... 97
4.14.1 Dünnschichtchromatographie (DC) ... 97
4.14.2 Säulenchromatographie (LC)... 98
4.14.3 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ... 98
4.14.4 Fast Protein Liquid Chomatography (FPLC) ... 98
4.14.4.1 Gelfiltrationschromatographie (GFC)... 99
4.14.4.2 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)... 99
4.14.5 Gaschromatographie (GC) ... 99
4.14.5.1 Gaschromatographie mit Flammenionisierungsdetektor (HRGC-FID)... 99
4.14.5.2 Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometie (HRGC-MS)... 100
4.14.5.3 Gaschromatographie mit olfaktorischer Detektion (HRGC-O) ... 100
4.14.6 Berechnung der Kováts-Indices... 101
4.15 NMR-Spektroskopie... 101
4.16 UV/VIS-Spektroskopie ... 101
4.17 Elektrophorese... 102
4.17.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ... 102
4.17.2 Lösungen für die SDS-PAGE ... 103
4.17.3 Anfärbemethoden ... 104
5 Literatur ...105
Abkürzungsverzeichnis
APS – Ammoniumperoxodisulfat BHT – 2,6-Di-tert.-butyl-hydroxytoluen Bidest. – Bidestilliert
BIS – Bisacrylamid
BSTFA – bis-Trimethylsilyl-trifluoracetamid Bw – Blindwert
c – Konzentration
CI – chemische Ionisierung
CBS – Centralbureau voor Schimmelcultures, Baarn (Niederlande)
chem. rein – chemisch rein
DC – Dünnschichtchromatographie DIBAL-H – Diisobutylaluminiumhydrid DMF – Dimethylformamid
DSMZ – Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig
DTT – Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz EI – Elektronenstoßionisation
F – Fraktion
FID – Flammenionisationsdetektor
FPLC – Fast Protein Liquid Chromatography g – Erdbeschleunigung: 9,81 m/s²
GC – Gaschromatographie
GC-MS – Gaschromatographie gekoppelt mit einem Massenspektrometer
h – Stunde(n)
HEPES – 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure HIC – Hydrophobe Interaktionschromatographie HMPA – Hexamethylphosphoramid
HPLC – Hochleistungsflüssigchromatographie
HPLC-MS – Hochleistungsflüssigchromatographie gekoppelt mit einem Massenspektrometer
ID
I.d.F.d.B.
– –
Innendurchmesser
In der Fassung der Bekanntgabe IS
K
– –
Interner Standard
Kontamination aus vorangegangener Synthese kDa – Kilodalton
KI – Kováts-Index L – Liter (= 1000 cm3) LC – Flüssigchromatographie
(abgeleitet von engl.: liquid chromatography) LDA – Lithiumdiisopropylamid
Lsg. – Lösung
Lsgm. – Lösungsmittel M+● – Molekülion
MS – Massenspektrometrie mCPBA – m-Chlorperbenzoesäure
min – Minuten
MW – Molekulargewicht
(abgeleitet von engl.: molecular weight) Mw – Mittelwert
m/z – Masse-Ladungs-Verhältnis
NOE – Kern-Overhauser-Effekt Differenzspektroskopie OBAS – 4-Octylbenzyl-amidosulfobetain
OXONE® – Lösung aus 50 mmol KHSO5 in 200 mL dest. Wasser PAGE – Polyacrylamidgelelektrophorese
R2 – Bestimmtheitsmaß Rf – Retentionsfaktor
RT – Raumtemperatur (ca. 22 °C) Rz – Retentionszeit
rpm – Umdrehungen pro Minute SC – Säulenchromatographie SDS – Natriumdodecylsulfat
SNL – Standardnährlösung (Medium)
SL – Stammlösung
Stabw – Standardabweichung
TEMED – N,N,N´,N´-Tetramethylethyldiamin THF – Tetrahydrofuran
TMBZ – 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin Tris – Trishydroxymethylaminomethan
ÜS – Überstand
UV – ultraviolett
% (v/v) – Volumenprozent
% (w/v) – Massenkonzentration
Pilze spielen im biologischen Kreislauf der Natur eine wichtige Rolle, sei es wegen ihrer degradativen Eigenschaften bei dem Abbau von pflanzlichem oder tierischem Material oder aber wegen ihrer symbiotischen Lebensweise mit anderen Pflanzenarten.
Unter „Pilzen“ versteht der Mensch meist nur die sichtbaren Fruchtkörper, das Myzel, das unterirdische Fadengeflecht des Pilzes, ist weitaus unbekannter. Das Myzel ist bei seiner Verbreitung nicht ausschließlich auf den Humus im Boden angewiesen, sondern kann sich auch aufgrund seiner vielfältigen Enzymausstattung auf vielen verschiedenen Substraten ansiedeln. Basidiomyceten (Ständerpilze) verfügen aufgrund ihres natürlichen Wachstums auf Holz über eine Vielzahl an Enzymen, die befähigt sind terpenoide Substrate zu oxidieren (Berger & Schrader, 2001). Der Begriff Terpen stammt vom Terpentin, dem „Kiefernharz“, einem zähflüssigem Balsam mit frischem Geruch, ab. Neben Nadelhölzern verbreiten auch Zitrusfrüchte, Lavendel, Pfefferminzarten, Rosen, Hopfen und viele andere Pflanzen charakteristische Düfte, schmecken würzig oder entfalten eine bestimmte pharma- kologische Wirkungen. Diese Wirkung beruht überwiegend auf den enthaltenen Terpenen (Breitmaier, 2005).
Terpene dienen in Pflanzen sowohl als Abwehrstoffe gegen Schädlinge, als auch als Pheromone zum Anlocken von Nützlingen, z.B. zur Verbreitung von Pollen oder Samen (Watzl et al., 1999). Sie weisen aber auch für den Menschen eine Vielzahl an nützlichen Eigenschaften auf. Aufgrund ihrer niedrigen Geruchsschwelle werden als angenehm empfundene Terpene gerne in der Parfum-, Kosmetik- oder Lebensmittelindustrie eingesetzt. Zudem besitzen viele Monoterpene antimikrobielle Eigenschaften und können somit als natürliche Konservierungsstoffe eingesetzt werden (Griffin et al., 1999).
Die wichtigste natürliche Quelle für die mengenmäßig dominierenden Monoterpene ist Kiefernrohharz (Produktion ca. 1,5 Mio t p.a.). Durch Wasserdampfdestillation werden jährlich ca. 160.000 t α-Pinen und 26.000 t β-Pinen gewonnen, wovon 25%
in die chemische Riechstoffsynthese, der überwiegende Rest als preiswerte Lösemittel in die Lack- und Farbenindustrie gehen (Ohloff, 1994).
Mit den Monoterpenen steht also ein großer regenerativer Pool chiraler Naturstoffe zur Verfügung, deren Potential als Leitstrukturen für die Synthese hochwertiger bioaktiver Wertstoffe bisher nur in geringem Umfang industriell genutzt wird.
Durch den Einsatz der weißen Biotechnologie ergeben sich neue Optionen terpenhaltige Abfallströme aus der Industrie als Ausgangsstoffe für hochwertige Naturstoffe zu nutzen. Während bei der organischen Synthesechemie durch Oxidationsmittel wie Cr6+ oder Mn7+ nur unselektiv oxidiert werden kann und die Umwelt belastet wird, nutzen P450 Monooxygenasen (P450) den kostengünstigen molekularen Sauerstoff der Luft zur selektiven Oxidation von auch nicht-aktivierten Kohlenstoffatomen.
Während in der Parfum- und Kosmetikindustrie synthetisch hergestellte Geruchsstoffe verwendet werden können, finden diese bei Lebensmitteln durch die Forderung des Verbrauchers nach „natürlichem“ Aroma gemäß Aromenverordnung (I.d.F.d.B. vom 15.05.2006) deutlich weniger Akzeptanz. Somit liefert die enzymatische Oxyfunktionalisierung einen weiteren Ansatz die steigende Nachfrage nach natürlichen Aroma- und Naturstoffen zu bedienen.
Die Biokonversion des Monoterpens α-Pinen durch den Basidiomyceten Pleurotus sapidus (Abb. 1.1) führt zu zahlreichen interessanten Oxidationsprodukten (Hardebusch, 2006).
O
OH O OH
HO
HO
HO
OH OH
α-Pinen Myrtenal Myrtenol
(E)-Sobrerol
(Z)-Verbenol
(E)-Verbenol
Verbenon (E)-Carveol
(E)-Pinocarveol
Abb. [1.1]: Transformationsprodukte aus der Biotransformation von α-Pinen durch Pleurotus sapidus (Hardebusch, 2006)
Inhibierung der Acetylcholinesterase (Miyazawa et al., 1997). Verbenol und Verbenon werden als natürliche Insektenpheromone in umweltverträglichen Pestiziden eingesetzt (Trudgill, 1994).
Ein weiteres für Biokonversionen bisher nur wenig eingesetztes Monoterpen ist das β-Myrcen, ein aliphatisches Monoterpen mit zwei konjugierten und einer isolierten Doppelbindung, welches als Bestandteil vieler pflanzlicher Öle ebenfalls ubiquitär vorkommt. Einer der Hauptlieferanten aus dem Lebensmittelbereich ist mit 63% das etherische Öl des Hopfens (Ohloff et al., 1994). Verwendung findet β-Myrcen zur Synthese von Geraniol, Citronellal, Citronellol und anderen Parfümrohstoffen, aber auch zur Synthese der Vitamine A und E sowie als Hilfsstoff bei Kunststoff- Synthesen wird β-Myrcen eingesetzt (Eisenbrand, 2006). Bis heute wurden nur wenige Biotransformationen mit Myrcen beschrieben, da β-Myrcen durch seine 1,3- Dienstruktur zur Polymerisierung neigt (Yamazaki et al., 1988). Die Biokonversion von β-Myrcen zu einer Vielzahl von oxidierten Derivaten wurde von Busmann und Berger (1994) beschrieben.
Durch Biokonversion mit Pilzen der Gattung Pleurotus konnte β-Myrcen zu einem hochwertigen Aromastoff, dem Perillen, oxyfunktionalisiert werden (Brauer, 2004).
Perillen ist ein furanoides Monoterpen. Es weist eine citrusartige, blumige Duftnote auf, welche neben Rosenfuran, Rosenketon, β-Damascenon und β-Damascon charakterbildend für Rosenöle ist (Breitmeier, 2005).
Namensgeber des Perillens ist die aus dem asiatischen Raum stammende Heil- und Gewürzpflanze Perilla frutescens, aufgrund des Vorkommens von Perillen im Pflanzenöl dieser Pflanze (Brenner, 1993).
In vorangegangene Arbeiten am Institut konnte ein Biokonversionsweg für Submerskulturen von Pleurotus ostreatus postuliert werden (Hapetta, 2006), der einen vielversprechenden Einstieg zur biotechnologischen Produktion des Perillens bietet, aber aufgrund limitierender Schritte noch Optimierungspotential bietet.
1.1 Zielsetzung 1
Nach einem von Fraatz (2007) und Hardebusch (2006) durchgeführten Screening von Basisiomyceten nach eukaryotischen P450-Enzymen wurde Pleurotus sapidus als potentester Stamm zur Oxyfunktionalisierung von α-Pinen für die nähere Charakterisierung der beteiligten Enzyme ausgewählt. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, membranständige P450 Monooxygenasen im Pilzmycel zu lokalisieren und unter geringstem möglichem Aktivitätsverlust zu solubilisieren. Darüber hinaus sollte die Stereochemie der aus α-Pinen gebildeten Verbenolverbindungen aufgeklärt werden.
1.2 Zielsetzung 2
Der von Hapetta (2006) aufgezeigte Mechanismus der Biokonversion von β-Myrcen zu Perillen durch Pleurotus ostreatus bildet den Ausgangspunkt dieser Arbeiten.
Anhand eines Screenings von Lyophilisaten mehrerer Pleurotus-Stämme sollte der aktivste Stamm zur genaueren Identifizierung der beteiligten Enzyme herangezogen werden. Hierzu sollte der von Hapetta (2006) für Submerskulturen postulierte Mechanismus mit dem Biokonversionsmechanismus des potentesten Stamms verglichen und geklärt werden, welche Teilschritte des Mechanismus enzymatisch und welche autoxidativ ablaufen.
2.1 Biokonversion des Monoterpens αααα -Pinen
2.1.1 Auswahl der Mikroorganismen
Für die Biokonversion von α-Pinen wurde der Basidiomycet Pleurotus sapidus verwendet, der in vorangegangenen Arbeiten (Onken, 1999; Hardebusch, 2006;
Fraatz, 2007) untersucht wurde und sich in einem Screening mit mehreren Terpen- transformierender Basidiomyceten als potentester Stamm erwies.
2.1.2 Produktion von Biomasse und Enzyminduktion durch Dosierung von αααα-Pinen
Für jede Versuchsreihe wurden 3 L Hauptkultur (Pool aus 6 Ansätzen) verwendet. P.
sapidus wurde in den Hauptkulturen jeweils sechs Tage submers kultiviert, wobei am 1. und 4. Tag ein α-Pinen-Zusatz (10 mM) zur Enzyminduktion erfolgte. Das geerntete Mycel wurde mit Wasser gewaschen und für die weiteren Arbeiten bei – 20
°C eingefroren (Kap. 4.4.3).
2.1.3 Identifizierung der Biokonversionsprodukte
Die Identifizierung der α-Pinen-Oxidationsprodukte (Abb. [2.2]) erfolgte nach Extraktion gaschromatographisch (Abb. [2.3]) mittels GC-FID über einen Vergleich mit Referenzsubstanzen und anhand von Kováts-Indices (Tab. [2.1]); quantifiziert wurde über den internen Standard BHT. Parallel dazu wurden GC-MS- Untersuchungen durchgeführt und die Massenspektren der Oxidationsprodukte mit Spektrenbibliotheken verglichen. Die Stereochemie der Verbenole (E/Z) wurde mittels NMR-Spektroskopie abgesichert (Kap. 2.1.3.1). Die α-Pinenhydroperoxide wurden nach Moore et al. (1955) synthetisiert (Kap. 4.11.1) und über Vergleich der Kováts-Indices und Massenspektren identifiziert.
Tab. [2.1]: α-Pinen-Biokonversionsprodukte (MS = Referenz-Massenspektrum; KI = Kováts-Index, Std = Referenzverbindung; Syn = Synthese; NMR = eigene Messungen; Lit.: [a] Lee et al., 2005;
[b] Schieberle und Grosch, 1989; - = keine Angabe)
Substanz Identifizierung KI (CW 20 M)
KI Std.
(CW 20 M)
KI Lit.
(CW 20 M)
α-Pinenoxid, 1 MS, KI, Std. 1608 1612 -
Myrtenal, 2 MS, KI, Std. 1612 1602 1596[b]
(E)-Pinocarveol, 3 MS, KI, Std. 1652 1655 1648[a]
(Z)-Verbenol, 4 MS, KI, Std. 1658 1662 1660[a]
(E)-Verbenol, 5 MS, KI, Syn, NMR 1681 1680 1675[a]
Verbenon, 6 MS, KI, Std. 1703 1700 1695[a]
Myrtenol, 7 MS, KI, Std. 1792 1790 1789[a]
(E)-Carveol, 8 MS, KI, Std. 1841 1838 1833[a]
α-(Z)-Pinenhydroperoxid, 9 MS, Syn 2103 2093 -
α-(E)-Pinenhydroperoxid, 10 MS, Syn 2132 2127 -
(E)-Sobrerol, 11 MS, KI, Std. 2225 2222 -
α-Pinen
OH
OH (Z)-Verbenol (4)
(E)-Verbenol (5)
O Verbenon (6) O
HO
Myrtenal (2)
Myrtenol (7)
OH
(E)-Pinocarveol (3)
O
a-Pinenoxid (1)
HO
(E)-Carveol (8) HO
HO
(E)-Sobreol (11)
OOH
OOH α-(Z)-Pinenhydroperoxid (9) α-(E)-Pinenhydroperoxid (10)
Abb. [2.1]: Oxidationsprodukte aus der Biokonversion von α-Pinen:
2.1.3.1 Identifizierung von αααα-Pinenhydroperoxiden
Zur Identifizierung der α-Pinenhydroperoxide als Biokonversionsprodukte von α-Pinen wurden diese nach Moore et. al. (1955) synthetisiert (Kap. 4.12.1). α-Pinen wurde im Sauerstoffstrom oxidiert (Abb. [2.3]), anschließend die α-Pinen- hydroperoxide (9 + 10) primär zu (E)- und (Z)-Verbenol, aber auch zu den α-Pinen- oxidationsprodukten Myrtenal, (E)-Pinocarveol und Myrtenol reduziert (Abb. [2.4]).
Zusätzlich wurden die Hydroperoxide mittels GC-MS analysiert (Abb. [2.5]). Bei der Fragmentierung beider Hydroperoxide wurde kein Unterschied festgestellt, die absoluten Mengen vor und nach der Reduktion lassen jedoch darauf schließen, dass es sich bei 9 um α-(Z)-Pinenhydroperoxid und bei 10 um α-(E)-Pinen-hydroperoxid handelt.
Abb. [2.2]: GC-FID-Chromatogramm der α-Pinen-Biokonversionsprodukte: 1) α-Pinenoxid;
2) Myrtenal; 3) (E)-Pinocarveol; 4) (Z)-Verbenol; 5) (E)-Verbenol; 6) Verbenon; 7) Myrtenol;
8) (E)-Carveol; 9) α-(Z)-Pinenhydroperoxid; 10) α-(E)-Pinenhydroperoxid; 11) (E)-Sobrerol (6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 250 mg Mikrosomen)
Abb. [2.3]: GC-FID-Chromatogramm nach Autoxidation von α-Pinen nach Moore et. al. (1955) (9 α-(Z)-Pinenhydroperoxid, 10 α-(E)-Pinenhydroperoxid)
Abb. [2.4]: GC-FID-Chromatogramm nach Reduktion der Autoxidationsprodukte von α-Pinen (Moore et. al., 1955)
Abb. [2.5]: MS-Spektrum von α-(E)-Pinenhydroperoxid 10
2.1.3.2 Identifizierung von (E)-Verbenol
Da zur Identifizierung von (E)-Verbenol keine Referenzsubstanz kommerziell erhältlich war, wurde die Verbindung zusätzlich zur Identifizierung über GC-MS (Abb. [2.7]) synthetisiert (Kap. 4.12.1). Die NMR-Daten wurden ausgewertet und mit denen von (Z)-Verbenol verglichen.
Von (Z)- und (E)-Verbenol wurden 13C-NMR- und 1H-NMR-Spektren aufgenommen, die sich jedoch kaum voneinander unterscheiden (Tab. [2.2] und Tab. [2.3]). Ein Unterschied besteht in der Verschiebung der Hydroxygruppe des trans-Isomers, welches aufgrund seiner größeren Acidität Hochfeld verschoben ist. Die genaue Strukturaufklärung der beiden Isomere wurde durch ein NOE-NMR ermöglicht. Bei beiden Isomeren wurde am Wasserstoffatom an Position 4 (H4) (Abb.:[2.6]) eingestrahlt. Das trans-Isomer (Abb. [2.8]; δ = 0,93) zeigte einen NOE-Kontakt zwischen dem H4 und der Methylgruppe an Position 9 (Abb. [2.6]), die beim cis- Isomer (Abb. [2.9]; δ = 1,21) nicht auftrat.
OH OH
(Z)-Verbenol (4) (E)-Verbenol (5)
1
2 2
7
1 3
8 4 4
3
5 5
6 6
7 10
9 9
10
8
Abb. [2.6]: Struktur von (Z)-Verbenol (links) und (E)-Verbenol (rechts)
SR21-6-VII #1322 RT:25.04 AV:1SB:19 25.27-25.57 NL:8.54E4 T:{0,0} + c EI det=350.00 Full ms [ 33.00-300.00]
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z 0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Relative Abundance
41.1
94.1 91.1
59.1
55.1 109.1
43.1 79.1
67.1
95.1 119.1 77.1
83.1 53.1
51.1
105.1
96.1 134.1
121.1
138.1 150.1
SR-NMR_050914103820 #1338-1342 RT:25.30-25.37 AV:5SB:9 25.10-25.24 NL:9.10E5 T:{0,0} + c EI det=350.00 Full ms [ 33.00-300.00]
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z 0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Relative Abundance
91.0
41.0
108.9
42.9 80.9
94.0 66.9
54.9 68.9
76.9 95.0 118.9
58.9
83.0
53.0 106.9
104.9 51.0
121.0
96.0 133.9
150.0 153.0
Abb. [2.7]: GC-MS-Spektrum von (Z)-Verbenol (oben) und (E)-Verbenol (unten)
Position
in C6D6 in CDCl3
Multiplizität
1 1,90 (dd 5,62; 1,25) 48,2 CH
2 - 147,4 C
3 5,42 (m) 119,3 CH
4 4,49 (m) 73,6 CH
4a 1,40 (d 8,5) - OH
5 2,32 (ddd 5,80; 3,33; 1,81) 47,7 CH
6a 6b
1,35 (d 9,00)
2,42 (ddd 9,00; 6,14; 5,40) 35,6 CH2
7 - 38,9 C
8 1,37 (s) 22,6 CH3
9 1,21 (s) 22,6 CH3
10 1,66 (m) 26,9 CH3
Tab. [2.3]: 1H-NMR und 13C-NMR-Daten von (E)-Verbenol
Position δδδδ H (m, J in Hz)
in C6D6
δδδδ C
in CDCl3
Multiplizität
1 1,95 (dd 5,68; 1,47) 48,1 CH
2 - 147,2 C
3 5,52 (m) 120,1 CH
4 4,45 (m) 70,1 CH
4a 3,7 (s) - OH
5 2,31 (m) 47,4 CH
6a 6b
1,66 (d 8,62)
2,27 (m) 28,9 CH2
7 - 45,7 C
8 1,32 (s) 22,7 CH3
9 0,93 (s) 20,5 CH3
10 1,70 (m) 26,7 CH3
Abb [2.8]: NOE-NMR-Spektrum von (E)-Verbenol
Abb [2.9]: NOE-NMR-Spektrum von (Z)-Verbenol
2.1.4.1 Lokalisierung der Aktivität nach Gradientenzentrifugation
Nach Zellaufschluss (nach Kap. 4.6) wurden die Zellfragmente von den Mikrosomen durch eine Gradientenzentrifugation (Kap. 4.7) getrennt und die einzelnen Fraktionen für den Aktivitätstest (Kap.4.11.1) eingesetzt. Die höchste Aktivität wurde in den bei 100.000 x g sedimentierten Mikrosomen gefunden (Abb. [2.10]).
0 25 50 75 100
Puffer Pellet 10.000 x
g
Pellet 20.000 x
g
Pellet 100.000
x g
[%]
(E)-Verbenol + Verbenon
Abb. [2.10]: Biokonversion von α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon durch verschiedene Proteinfraktionen; Einfachbestimmungen, 100% bezogen auf die Aktivität in dem 100.000 x g Pellet
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 24h)
2.1.4.2 Enzymstabilität
Für die anstehenden Arbeitsschritte wurde die „Aktivitätsstabilität“ (vermutete Enzymstabilität) bei verschiedenen Lagerungsbedingungen untersucht. Hierzu wurde das mikrosomale Pellet mit 20% Glycerol versetzt und aliquotiert. Ein Teil wurde direkt für den Aktivitätstest eingesetzt, die anderen wurden für 4 Tage bei -18 °C bzw. -70 °C eingefroren, anschließend im Kühlschran k (4 °C) wieder aufgetaut und ebenfalls für den Aktivitätstest eingesetzt (Abb. [2.11]).
0 20 40 60 80 100 120 140
direkt - 18 °C - 70 °C
[%] Verbenon
(E)-Verbenol
Abb. [2.11]: Biokonversion von α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon: Enzymatische Aktivität der mikrosomalen Fraktion nach Lagerung; direkte Verarbeitung = 100%
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 24h)
Das Einfrieren verursachte einen starken Aktivitätsverlust. Für weitere Arbeiten wurde das mikrosomale Pellet ohne Zwischenlagerung direkt eingesetzt.
Für die Solubilisierung der enzymatischen Aktivität aus dem mikrosomalen Pellet wurde ein Screening mit verschiedenen Detergentien durchgeführt. Hierzu wurden 4-Octylbenzylamidosulfobetain (OBAS), Amidosulfobetain-14 (ASB-14), Amido- sulfobetain-16 (ASB-16), CHAPS, Tween 20 sowie Natriumcholat einzeln sowie in verschiedenen Kombinationen und Konzentrationen eingesetzt.
Tween 20 zeigte keine Solubilisierungswirkung, CHAPS, ASB-14 und ASB-16 wirkten solubilisierend, hemmten aber auch die Aktivität. Als am besten geeignet erwies sich eine Kombination aus 0,5% OBAS und 2% Natriumcholat (Abb. [2.12]).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
[%] Verbenon
(E)-Verbenol
Abb. [2.12]: Biokonversion von α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon: Vergleich der
Solubilisierungswirkung unterschiedlicher Detergentien: Einfachbestimmungen, 100% bezogen auf die Aktivität im Pellet vorm Solubilisieren: 1) mikrosomales Pellet, 2) 0,01% OBAS, 3) 0,5% OBAS + 2%
Natrium-cholat, 4) 1% OBAS + 0,5% Natriumcholat, 5) 1% OBAS + 1% Natriumcholat, 6) 1% OBAS + 2% Natriumcholat, 7) 1% OBAS + 1,5% CHAPS, 8) 1,5% CHAPS + 2% Natriumcholat, 9) 0,5% OBAS
+ 0,5% ASB-14, 10) 0,5% OBAS + 0,5% ASB-16, 11) 4% Tween 20, 12) 2% OBAS, 13) 4%
Natriumcholat, 14) 2% CHAPS
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 24h)
2.1.4.4 Rekombinationsversuche nach Solubilisierung
Zur Überprüfung der Solubilisierungsleistung der einzelnen Detergentien bzw.
Kombinationen (Kap. 2.1.4.3) wurde der gewonnene Überstand mit dem ausgewaschenen Pellet rekombiniert und für den Aktivitätstest eingesetzt. Hierbei wurde beim Einsatz von Natriumcholat und OBAS eine erhöhte Aktivität bezüglich der Grundaktivität gefunden (bis zu 170%). ASB-14, ASB-16 und CHAPS wirkten hingegen aktivitätshemmend, Tween 20 bewirkte keine Veränderung der Aktivität.
2.1.4.5 Inaktivierungsversuche nach Solubilisierung
Durch die Solubilisierung konnte nicht die komplette Aktivität in Lösung gebracht werden, eine Rekombination von ausgewaschenem Pellet und gewonnenem Überstand hingegen brachte höhere Aktivitäten als die Grundaktivität im mikrosomalen Pellet. Durch Inaktivierungsversuche sollte herausgefunden werden, ob an der Biokonversion mehrere Komponenten beteiligt sind, die durch die Solubilisierung nur teilweise in Lösung gebracht werden konnten.
Nach Solubilisierung mit 0,5% OBAS und 2% Natriumcholat (Abb. [2.12], 3)) wurden Inaktivierungsversuche durchgeführt (Abb. [2.13]). Nach dem Solubilisieren wurde der gewonnene Überstand sowie das zurückgebliebene Pellet aliquotiert und vor der Rekombination jeweils ein Bestandteil in kochendem Wasser (20 min) desaktiviert.
Sowohl die Desaktivierung des Überstandes als auch des Pellets wirkte sich auf die Gesamtaktivität aus, allerdings wurde die Aktivität durch Inaktivierung eines Bestandteils nicht komplett zerstört (Abb. [2.13], 5) und 6)).
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5 6 7
[%] Verbenon
(E)-Verbenol
Abb. [2.13]: Biokonversion von α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon: Solubilisierung und Desaktivierung einzelner Fraktionen; Einfachbestimmungen; 100% bezogen auf die Aktivität im Pellet
vor dem Solubilisieren. 1) Pellet vor Solubilisierung; 2) Rekombinat aus Pellet und Überstand (beides desaktiviert); 3) Pellet nach Solubilisierung; 4) Rekombinat aus Pellet und Überstand; 5) Rekombinat aus Pellet und desaktiviertem Überstand; 6) Rekombinat aus desaktiviertem Pellet und Überstand;
7) Überstand nach Solubilisierung
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 24h)
Verbenon
Die Mikrosomen (nach Kap. 4.7) wurden in 21 mL Puffer resuspendiert, in 1,5 mL große Aliquots geteilt und bei 24 °C eine Bildungsk inetik der Verbenol- und Verbenonbildung aufgenommen.
Proben wurden sukzessive über 24 h genommen, extrahiert und gaschromato- graphisch analysiert (Abb. [2.14]).
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0 5 10 15 20 25
Zeit [h]
[µg g-1 ]
Verbenon (E)-Verbenol Summe der
Pinenhydroperoxide
Abb. [2.14]: Biokonversion von α-Pinen durch Mikrosomen: Bildungskinetik von Verbenon, (E)-Verbenol und α-Pinenhydroperoxiden, Einfachbestimmungen
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C)
Die Produktkonzentration von Verbenon und (E)-Verbenol war nach 17 h maximal.
Eine Akkumulation der Pinenhydroperoxide im Biokonversionsansatz trat erst nach 4 h auf, danach nahm die Konzentration stark zu, was mit einer Stagnation der Verbenol- und Verbenonkonzentration einherging.
2.1.4.7 CO-Differenzspektrum zur Detektion von P450-Aktivität
Zusätzlich zum Aktivitätstest (nach Kap. 4.11.1) wurden aus dem Überstand nach Solubilisierung CO-Differenzspektren aufgenommen (nach Kap. 4.11.4). Sehr geringe P450-Aktivitäten wurden im solubilisierten Überstand detektiert (Abb. [2.15]).
Abb. [2.15]: CO-Differenzspektrum einer 1:10 verdünnten Probe aus dem Überstand nach Solubilisieren der mikrosomalen Fraktion
2.1.5 Biokonversion mit Lyophilisat
Neben den mikrosomalen Fraktionen wurden Lyophilisate von Pleurotus sapidus zur Biokonversion eingesetzt. Die Lyophilisate sind im Gegensatz zu Mikrosomen einfacher in der Handhabung und Lagerung.
2.1.5.1 Vergleich des Produktspektrums und der Produktausbeuten von Lyophilisat und Mikrosomen
Das Produktspektrum der Biokonversionen von α-Pinen mit Mikrosomen (Abb. [2.6]) und Lyophilisaten (Abb. [2.16]) war nahezu identisch, allerdings wurden mit Lyophilisaten deutlich höhere Produktausbeuten als mit Mikrosomen erzielt (Abb.
[2.17]).
Abb. [2.16]: GC-Chromatogramm der Biokonversion von α-Pinen durch Lyophilisat von P. sapidus (6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 50 mg Lyophilisat, 24 °C, 15h; Bezifferung wie
Abb.:[2.2])
Abb. [2.17]: Vergleich der Biokonversion von α-Pinen durch mikrosomale Fraktionen und mit Lyophilisaten von P. sapidus;
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 15h)
2.1.5.2 Solubilisierung der Aktivität aus Lyophilisaten
Zur Solubilisierung der Aktivität aus Lyophilisaten wurde die für die Solubilisierung aus den Mikrosomen optimierte Detergentienkombination (0,5% OBAS + 2%
Natriumcholat) verwendet (Kap. 2.1.4.3) und mit einem Ansatz ohne Detergenz verglichen. Hierzu wurde das Lyophilisat 1 h in Puffer rehydratisiert, bei 100.000 × g zentrifugiert und der resultierende Überstand vom erhaltenen Pellet getrennt.
Für den Aktivitätstest wurden der Überstand, ein Rekombinat aus Pellet und Überstand sowie das Pellet resuspendiert in Puffer eingesetzt.
Bei der Solubilisierung ohne Detergens wurde nur geringe Aktivität aus dem Lyophilisat herausgelöst (Abb. [2.18]), allerdings zeigte das Pellet nach der Extraktion ebenfalls wenig Aktivität.
Abb. [2.18]: Biokonversion von α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon: Aktivitätstest nach Solubilisierung ohne Detergens, Einfachbestimmungen
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 15h)
Bei der Solubilisierung mit Detergens konnte die Aktivität hingegen zu einem Großteil aus dem Lyophilisat in Lösung gebracht werden (Abb. [2.19]).
Abb. [2.19]: Biokonversion von α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon: Aktivitätstest nach Solubilisierung mit Detergens; Einfachbestimmungen
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 15h)
2.1.5.3 Einfluss von Detergentien auf die Solubilisierung
Bei Solubilisierung mit und ohne Detergentien wurde im zurückgebliebenen Pellet jeweils keine Aktivität detektiert (Abb. [2.18] und Abb. [2.19]). Um den Einfluss der Detergentien auf die Aktivität zu untersuchen, wurde das Lyophilisat 1 h in detergentienfreiem Puffer solubilisiert, anschließend bei 100.000 × g zentrifugiert und der resultierende Überstand vom Pellet getrennt. Für den Aktivitätstest wurden Überstand, Überstand + Detergentien sowie Puffer + Detergentien eingesetzt (Abb.
[2.20]).
0 25 50 75 100 125 150
Überstand Überstand + Detergens Puffer + Detergens [mg L-1]
Verbenon (E)-Verbenol
Abb. [2.20]: Biokonversion von α-Pinen zu (E)-Verbenol und Verbenon: Einfluss von Detergentien auf die Aktivität
(6 µL α-Pinen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 24 °C, 15h)
Die Aktivität wurde also auch ohne Detergentien aus dem Lyophilisat gelöst und durch deren Zusatz signifikant gesteigert.
2.1.5.4 Biokonversion weiterer Substrate
Das Hauptaugenmerk der Biokonversion von α-Pinen wurde bisher auf die Produkte (E)-Verbenol und Verbenon gelegt. Um weitere Informationen über die Spezifität der beteiligten Enzyme zu erhalten, wurden die beiden konfigurationsisomeren Verbenole und Verbenon als Substrate für den Aktivitätstest mit Lyophilisat eingesetzt.
2.1.5.5 Umsetzung von (E)-Verbenol, (Z)-Verbenol und Verbenon
Da (E)-Verbenol und Verbenon während der Biokonversion akkumulierten, wurden die Verbenole als Substrat für den Aktivitätstest eingesetzt. Hierbei wurde lediglich (Z)-Verbenol quantitativ zu Verbenon oxidiert (Abb. [2.21]), während (E)-Verbenol nicht umgesetzt wurde. Auch das Oxidationsprodukt Verbenon wurde nicht weiter verändert. Dieses lässt auf eine stereoselektive Alkoholdehydrogenase schließen.
Abb. [2.21]: Biokonversion von (Z)-Verbenol durch Lyophilisat von P. sapidus; 100% bezogen auf das eingesetzte Substrat.
(1mg (Z)-Verbenol, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 50 mg Lyophilisat, 24 °C, 15h)
2.2.1 Identifizierung der flüchtigen Biokonversionsprodukte
Die Identifizierung der β-Myrcen-Oxidationsprodukte (Tab. [2.4]; Abb. [2.23]) erfolgte nach Extraktion gaschromatographisch mittels GC-FID (Abb. [2.22]) anhand der Retentionindices (Kováts-Indices), der EI-Massenspektren im Vergleich zu Literaturwerten, Spektrenbibliotheken (Hapetta, 2006; Wiley, Nist Spektrensammlungen) und authentischen Standardverbindungen. Quantifiziert wurde über den internen Standard BHT.
Abb. [2.22]: GC-MS Chromatogramm der Biokonversionsprudukte von β-Myrcen (1 ml β-Myrcen, 50 mL HEPES-Puffer, pH 5,0, 2 g Lyophilisat, 24 °C, 17h)
Tab. [2.4]: Identifizierte Produkte der β-Myrcen-Biokonversion
Produkt Rz [min] KI (ZB-Wax) MS [m/z] ([%]) Unbekannt, 12 15,17 1412 138(7), 123(7), 109(7), 96(8),
95(27), 69(100), 67(26), 55(7), 53(17), 51(7), 41(94), 39(45) 6,7-Epoxy-β-myrcen, 13 15,53 1421 152(M+·), 93(15), 91(13),
85(16), 81(18), 79(100), 77(23), 71(54), 68(12), 67(34), 59(56), 57(15), 53(20), 53(46), 43(46), 41(54), 39(29)
3,10-Epoxy-β-myrcen, 14 15,97 1433 152(M+·), 137(2), 119(5), 109(11), 93(11), 91(19), 83(21), 82(41), 80(25), 79(34), 71(24), 69(53), 67(60), 65(11), 55(36), 53(40), 43(22), 41(100), 39(53) Perillen, 15 16,07 1435 150(M+·,46), 135(12), 94(8),
82(32), 81(83), 77(6), 70(8), 69(100), 68(6), 67(9), 53(32), 51(10), 41(93), 40(6), 39(20) 1,2-Epoxy-β-myrcen, 16 19,37 1513 152(M+·),109(16), 93(10),
91(12), 85(17), 81(8), 79(14), 69(92), 68(8), 67(20), 55(10), 53(13), 43(11), 41(100), 39(20) Unbekannt, 17 25,92 1678 152(1), 96(88), 95(84), 81(20),
68(20), 67(88), 66(24), 59(100), 57(24), 55(37), 53(20), 43(62), 42(22), 41(92), 40(21), 39(55) 6,7-Epoxyperillen, 18 26,72 1698 166(M+·,2), 151(4), 108(11),
107(14), 95(19), 93(23), 91(25), 85(25), 81(44), 79(50), 77(25), 67(30), 59(48), 55(37), 53(50), 43(67), 41(99), 39(100)
α,β-Acarilactol, 19 44,04 2203 168(M+·), 150(10), 135(7), 107(6), 99(8), 91(8), 82(17), 81(45), 69(73), 67(16), 53(47), 41(100), 40(50)
α,α-Acariolid, 20 44,41 2216 166(M+·), 98(53), 91(7), 79(8), 77(6), 70(8), 69(100), 67(12), 55(12), 53(13), 44(6), 43(12), 42(7), 41(87), 40(9), 39(22)
Produkt Rz [min] KI (ZB-Wax) MS [m/z] ([%])
α,β-Acariolid, 21 49,32 2381 166(M+·), 109(7), 98(19), 97(9), 79(5), 70(8), 69(99), 68(9), 67(15), 55(12), 53(13), 43(12), 42(7), 41(100), 40(8), 39(25) α-(Z)-Acariolal, 22 51,30 2451 168(M+·), 107(13), 85(22),
82(8), 81(9), 79(9), 70(9), 69(87), 67(18), 55(13), 53(17), 43(15), 42(7), 41(100), 40(7), 39(22)
α-(E)-Acaridiol, 23 56,60 2633 170(M+·), 139(3), 121(5), 119(7), 109(12), 91(9), 83(9), 81(13), 69(72), 67(21), 55(28(), 53(26), 43(16), 41(100), 40(45)
β-Myrcen (24)
O O
O O
O Unbekannt (12)
Unbekannt (17) O 6,7-Epoxy-β-myrcen (13)
O
3,10-Epoxy-β-myrcen (14)
Perillen (15) O
1,2-Epoxy-β-myrcen (16) O
O
O
6,7-Epoxyperillen (18) O
OH
α,β -Acarilactol (19) α,α-Acariolid (20) O O
α,β-Acariolid (21) O
O
O OH
α-(Z)-Acariolal (22)
α-(E)-Acaridiol (23) OH O
Abb. [2.23]: Identifizierte und postulierte Biokonversionsprodukte von β-Myrcen
2.2.2 Screening verschiedener Pleurotus-Stämme
In einer vorangegangenen Arbeit von Brauer (2004) wurden bereits 7 Pleurotus- Stämme auf ihre Fähigkeit hin untersucht, β-Myrcen zu transformieren. Die Stämme wurden für dieses erneute Screening zuerst submers kultiviert und anschließend für die Biotransformation des ß-Myrcens (Aktivitätstest Kap. 4.11.2) lyophilisiert (Kap.
4.4.4) eingesetzt. Wie schon in Submerskultur (Brauer, 2004) wurden auch bei den Lyophilisaten mit den Stämmen P. ostreatus (DSMZ 1020) und P. sapidus (DSMZ 8266) die höchste Biokonversionsleistung erzielt (Abb. [2.24]). P. eryngii zeigte eine deutlich geringere Bildung von Perillen, P. lampas und P. sajor-caju zeigten keine Aktivität.
0 5 10 15 20 25
PSA PLA PER PSAJ POS
[mg L-1 ]
6,7-Epoxymyrcen Perillen
Abb. [2.24]: Vergleich der Biokonversion von β-Myrcen durch Lyophilisate von P. sapidus, P. lampas, P. eryngii, P. sajor-caju und P. ostreatus
(8 µL β-Myrcen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,5, 50 mg Lyophilisat, 24 °C, 24 h)
Mit dem Ziel weitere potentere Stämme zu finden, wurde ein weiteres Screening mit den Lyophilisaten von 5 P. ostreatus- und 2 P. sapidus-Stämmen durchgeführt.
Hierbei wurde neben der Perillenbildung auch die Bildung von Biomasse (angegeben als Menge resultierendes Lyophilisat) nach 5-tägiger Hauptkulturführung betrachtet (Abb. [2.25]).
0 5 10 15 20 25 30
POS (DSMZ 1833) POS (DSMZ 2344)
POS (DSMZ 5332) POS (DSMZ 5333)
POS (DSMZ 11191) PSA (DSMZ 8266)
PSA (CBS 195.92) [mg L-1 ]
0 2,5 5 7,5
Lyophilisat [g L-1 ]
6,7-Epoxymyrcen Perillen
Lyophilisat
Abb. [2.25]: Vergleich der Biokonversion von β-Myrcen durch Lyophilisate von 2 P. sapidus Stämmen und 5 P. ostreatus Stämmen
(8 µL β-Myrcen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,5, 50 mg Lyophilisat, 24 °C, 24 h)
Die höchste Perillenbildung wurde bei P. sapidus (DSMZ 8266) gefunden. Mit diesem Stamm wurden, wenn nicht anders beschrieben, alle weiteren Arbeiten durchgeführt.
2.2.3 Einfluss von Detergentien auf die Solubilisierung
Für die Solubilisation der an der Biokonversion beteiligten Enzyme wurde das für die Biokonversion optimierte Detergentiengemisch (2% Natriumcholat + 0,5% OBAS;
Kap. 2.1.4.3) auf das neue System angewendet. Im Gegensatz zur Solubilisierung der an der Biokonversion von α-Pinen beteiligten Enzyme, war der Einsatz von Detergentien zur Enzymsolubilisierung in diesem Fall zwingend notwendig. Eine Steigerung der Aktivität durch eine spätere Zugabe der Detergentien zum Transformationsansatz hatte keine Auswirkungen auf die Perillenbildung (Abb.
[2.26]).
0 2 4
Überstand Überstand + Detergens Puffer + Detergens [mg L-1]
6,7-Epoxymyrcen Perillen
Abb. [2.26]: Biokonversion von β-Myrcen: Einfluss von Detergentien auf die Aktivität bei der Solubilisierung aus Lyophilisaten
(8 µL β-Myrcen, 1,5 mL HEPES-Puffer, pH 5,5, 50 mg Lyophilisat, 24 °C, 24 h)
