TARTU ÜLIKOOL
BIOLOOGIA-GEOGRAAFIATEADUSKOND MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT
RAKUBIOLOOGIA ÕPPETOOL
PILLE SÄÄLIK
RAKKU PENETREERUVATE PEPTIIDIDE
VALGUTRANSPORDI MEHHANISM, KINEETIKA JA EFEKTIIVSUS BIOTINÜLEERITUD PEPTIIDI JA AVIDIINI
KOMPLEKSI MUDELI ALUSEL
MAGISTRITÖÖ
Juhendajad: Margus Pooga, EBK vanemteadur, Ph.D Sulev Ingerpuu, dotsent, PhD
TARTU 2004
Sisukord
KASUTATUD LÜHENDID ...3
SISSEJUHATUS ...4
KIRJANDUSE ÜLEVAADE...5
Rakumembraan...5
Ainete transport rakku...5
Retseptor-vahendatud endotsütoos...6
Endotsütoos kaveoolide kaudu...7
Klatriin- ja kaveoliin-sõltumatu endotsütoos...9
Rakku penetreeruvad peptiidid ...9
Penetratsioon...10
Penetratiinid...12
Tat perekonna peptiidid...14
Transportaan ja selle analoogid...15
Arginiinirikkad peptiidid...17
Amfipaatsed ja hüdrofoobsed peptiidid ning valkude järjestustest pärinevad peptiidid (protein-derived peptides)...18
TÖÖ EESMÄRGID ...21
MATERJAL JA MEETODID ...22
Kasutatud rakku penetreeruvad peptiidid...22
Rakkude kultiveerimine...22
Konfokaalmikroskoopia...22
Internalisatsiooni eksperimendid...23
Analüüs läbivoolutsütomeetril...24
Analüüs fluorestsents-spektrofotomeetril...24
Fluorestsentsmikroskoopia...24
TULEMUSED ...26
Biotinüleeritud peptiid-avidiini komplekside paiknemine HeLa rakkudes....26
Biotinüleeritud peptiidide võime avidiini transportida on erinev...27
RPPde vahendatud avidiini transpordi kineetika...29
Seerumi ja söötme komponendid mõjutavad peptiid-vahendatud valgutransporti...30
Peptiid-avidiin-komplekside sisenemist vähendab tugevalt raku energiadefitsiit...31
Peptiid-valk-komplekside sisenemine rakku toimub osaliselt klatriin- vahendatud endotsütoosi kaudu...32
Rakumembraani kolesteroolirikkad piirkonnad osalevad RPPde vahendatud valgu transpordis...34
ARUTELU...38
KOKKUVÕTE ...45
SUMMARY...47
KASUTATUD KIRJANDUS ...49
KASUTATUD LÜHENDID
Ah aminohape
AP adaptervalk (adapter protein) Av-FITC avidiin-FITC
DOG desoksüglükoos
FACS fluorestsents-aktiveeritud läbivoolutsütomeeter (fluorescence-activated cell sorter)
FITC fluorestseiin- isotiotsüanaat
GFP roheliselt fluorestseeruv valk (green fluorescent protein) GPI glükosüülfosfatidüülinositool
HIV-1 inimese immuunpuudulikkuse viirus tüüp 1
LDL madala tihedusega lipoproteiin (low density lipoprotein) MAP amfipaatne mudelpeptiid (model amphipatic peptide) NaN3 naatriumasiid
NLS tuuma lokalisatsiooni signaal pAntp penetratiin (Antennapedia)
PBS fosfaat-puhverdatud soolalahus (phosphate-buffered saline) PNA peptiidne nukleiinhape
pTat Tat-peptiid
PTD valgu transduktsioonidomeen (protein transduction domain)
pVEC hiire vaskulaar-endoteliaalsest kadheriinist pärinev penetreeruv peptiid (vascular-endothelial-derived peptide)
RFU suhteline fluorestsentsi ühik (relative fluorescence unit) RPP/CPP rakku penetreeruv peptiid (cell penetrating peptide) SV40 simian virus 40
TP transportaan
SISSEJUHATUS
Rakumembraan on barjääriks raku välis-ja sisekeskkonna vahel, mis takistab suurte laetud biomolekulide, nagu nt valkude ja peptiidide, otsest liikumist rakku läbi plasmamembraani. Et võimaldada siiski biotehnoloogiliselt ja meditsiiniliselt oluliste ainete rakku sisestamist, on kaasaegses mo lekulaarbioloogias peamisteks meetoditeks seniajani olnud elektroporatsioon, lipofektsioon ja viirusvektorite vahendatud molekulide transport, mille ülekande saagis on aga sageli madal või ebaühtlane ning viirusvektorite puhul ei saa eirata ka võõr-DNA kasutamisest tulenevaid kõrvalnähte.
Alternatiiviks eelpool loetletud meetoditele võivad saada rakku penetreeruvad peptiidid (RPP), mis on võimelised transportima rakku suuri laetud biomolekule mitteinvasiivsel viisil ja seda ühtlase kontsentratsioonini kõigis rakkudes kultuuris.
RPPde ja nendega rakku viidavate lastmolekulide internaliseerumise mehhanism on seniajani olnud ebaselge : kuigi mitmete hiljutiste allikate põhjal on levinud seis ukoht, et endotsütootiliste protsesside osakaalu peptiidide internalisatsioonis on siiani alahinnatud, leidub siiski ka andmeid, mille kohaselt sisenevad mõningad peptiidid rakku otse läbi plasmamembraani.
RPPde kui potentsiaalsete vektormolekulide aktiivne uurimine on viimase kümnendi jooksul viinud nii uute efektiivsete RPPde otsimisele natiivsetest valgujärjestustest kui ka uute vektorpeptiidide kunstlikule disainimisele. Praeguseks on rakku penetreeruvatest peptiididest enim uuritud ja seetõttu ka märkimisväärselt rohkem rakendust leidnud HIV-1 viiruse Tat valgust pärinev peptiid, Antennapedia homeovalgu fragment pene tratiin ja kunstlikud polüarginiini järjestused.
Tulenevalt mitmetest vastuoludest erinevate RPPde vahendatud biomolekulide transpordis, on käesolevas töös võrreldud nelja erineva rakku penetreeruva peptiidi – penetratiini, pVECi, Tat-peptiidi ja transportaani - valgu transpordi võimet rakkudesse biotinüleeritud peptiidi ja avidiini kompleksi mudeli alusel. In vitro tingimustes on uuritud peptiid-vahendatud valgu transpordi kineetikat ning internaliseerumise sõltuvust rakkude füsioloogilisest seisundist ja endotsütootilistest protsessidest.
KIRJANDUSE ÜLEVAADE
Rakumembraan
Raku sisemust eraldab väliskeskkonnast rakumembraan, mis koosneb kahekihilisest lipiidikihist. Selle peamised komponendid on fosfoglütseriidid, sfingolipiidid, glükolipiidid ja steroolid eelkõige kolesterooli näol (Pollard 2002).
Rakumembraani võib vaadelda kui mikrodomeenidest koosnevat lipiidikihti, kus erinevate domeenide lipiidne koostis on heterogeenne, andes membraanile varieeruva viskoossuse. Kolesterooli- ja sfingolipiidide rikkad piirkonnad on mõnevõrra jäigema struktuuriga, mis tuleneb seal esinevate lipiidide suuremast korrastatuse astmest ja nendesse nn lipiidsetesse saarekestesse (i.k lipid rafts), on sageli lokaliseeritud erinevad valgud (GPI- ja rasvhappega ankurdatud valgud). Nii membraane läbivad kui ka sellega ankurdatud valgud ja lipiidsed saarekesed on võimelised fosfolipiidikihis lateraalselt difundeeruma (Pollard 2002), tehes rakumembraanist väga dünaamilise rakuorganelli.
Ainete transport rakku
Ainete transport läbi rakumembraani esineb nii vahendatud kui vahendamata kujul. Otse difusiooni teel kontsentratsioonigradiendi suunas kulgevad rakku mittepolaarsed väikesed molekulid, näiteks O2, CO2 ja steroidid. Vee ja enamuse polaarsete veeslahustuvate molekulide (aminohapped, ATP, glükoos) difusioon rakku on molekulide polaarsuse tõttu tunduvalt väiksem ning sarnaselt ioonidega vajavad nad rakku pääsemiseks spetsiifilisi transportvalke. Membraani transportvalgud jagatakse pumpadeks, kanaliteks ja transporteriteks ning nad kõik vahendavad väikeste polaarsete molekulide liikumist sub- ja ekstratsellulaarse keskkonna vahel. Keskmiste ja suuremate molekulide transpordiks, nagu seda on peptiidid ja valgud, nad võimelised ei ole. Suuremad molekulid pääsevad rakku endotsütoosi teel. Pinotsütoos on enim uuritud endotsütoosi vorm ja selle all mõistetakse makromolekulide ja lahustunud ainete rakku toimetamist väikestes plasmamembraanist punguvates vesiikulites. Kuna fagotsütoosivõime esineb vaid kindlail rakkudel, siis kasutatakse mõisteid pinotsütoos
ja endotsütoos sünonüümsetena. Pinotsütoosi saab jaotada vedela faasi pinotsütoosiks, kus rakku viiakse ekstratsellulaarset vedelikku koos seal lahustunud molekulidega, ja adsorptiivseks ehk retseptor-vahendatud pinotsütoosiks, kus makromolekulid kontsentreeruvad rakupinnale ja seonduvad kindlate retseptoritega (Lamaze and Schmid 1995).
Joonis 1. Endotsütoosi eriliigid. 1) fagotsütoos; 2)-5) pinotsütoos: 2) makropinotsütoos; 3) klatriin- vahendatud endotsütoos; 4) endotsütoos kaveoolide kaudu; 5) ja 6) klatriin- ja kaveoliin-sõltumatu endotsütoos (Conner, Schmid, 2003).
Retseptor-vahendatud endotsütoos
Retseptor- vahendatud endotsütoosi valdavaim vorm on klatriin-sõltuv endotsütoos, mis toimub rakumembraani piirkondades, kus membraani sisemisele küljele on võrgutaolise struktuurina koondunud heksameerne valk klatriin. Need piirkonnad võtavad rakumembraanist enda alla 1-2 % (Lamaze and Schmid 1995).
Klatriin-sõltuva endotsütoosi teel internaliseeritakse rakku eeskätt mitmeid ligand- retseptor-komplekse. Näiteks paiknevad klatriiniga kaetud lohkudes pidevalt LDL- retseptorid ja transferriini retseptorid, samas kui EGFi retseptori koondumise endotsüteeritavasse piirkonda vallandab alles ligandi seondumine retseptoriga (Mukherjee, Ghosh et al. 1997). Klatriiniga kaetud lohkudesse koondunud molekulid endotsüteeritakse kiiresti (10-50%/min) (Mukherjee, Ghosh et al. 1997), vesiikuli liikumine rakku on energiast sõltuv protsess, kus osalevad mitmed nn adaptorvalgud (AP-perekonna valgud, dünamiin, amfifüsiin) (Maxfield and McGraw 2004). Klatriini vahendatud internalisatsiooni blokeerimine spetsiifiliste inhibiitoritega pidurdab endotsütoosi ajutiselt ja osaliselt, hetkelisele pidurdumisele järgneb klatriiniga
mittekaetud vesiikulite kaudu toimuva endotsütoosi intensiivistumine, mis näitab mittekaetud vesiikulite võimet ainete transport rakku täielikult asendada (Pollard 2002).
Klatriin-sõltuvat rada mööda rakku endotsüteeritud vesiikul satub esmalt varastesse ehk sorteerivatesse endosoomidesse. Varaseks endosoomiks nimetatakse membraaniga ümbritsetud vesiikuleid, tuubuleid ja vakuoole sisaldavat kompleksset struktuuri, kus algab sisaldise sorteerimine: kergelt aluselise pH mõjul dissotsieerub ligand retseptorist ja viimane saadetakse retrograadse raja endosoomides tagasi rakupinnale või siis edasi sorteerivate endosoomide kaudu hilistesse endosoomidesse.
Sorteerivaist endosoomidest eralduvaid vesiikuleid nimetatakse ka multivesikulaarseteks kehadeks (Pollard 2002). Hiliste endosoomide järel jõuavad degradatiivsesse ratta sorteeritud molekulid lüsosoomidesse, mis on endotsüteeritud materjali lõplikud lagundajad ja mittelagundatava materjali säilitajad. Endosoomi pH langetamine toimub vesiikuli membraanis asuvate ATPaaside toimel, mis genereerivad membraanipotentsiaali ja pumpavad vesiikulisse vesinikioone, põhjustades sellega pH languse. Endosoomide pH langeb umbkaudu 6,5- lt varastes endosoomides 5-ni hilistes endosoomides.
Makropinotsütoos on endotsütootiline protsess, mida on leitud toimuvat paljudes rakutüüpides ja millega kaasneb intensiivne membraanijätkete väljasopistumine (i.k membrane ruffling). Need jätked langevad tagasi membraanile ja selle tagajärjel moodustub suur (>1µM) makropinotsütootiline vesiikul (Mukherjee, Ghosh et al. 1997; Conner and Schmid 2003). Makropinotsütoosi toimumist stimuleerivad mitmed kasvufaktorid ja väljasopististe teke on indutseeritav Rho- GTPaaside kaudu aktiini filamentide poolt. Makropinotsütoos on ajutiselt indutseeritav enamikes rakkudes, tema funktsiooniks peetakse aktiivsete signaalmolekulide kiiret mahareguleerimist ja ka osalemist raku liikumises substraadil (Conner and Schmid 2003).
Endotsütoos kaveoolide kaudu
Kaveoolid on kuni 50-80 nm läbimõõduga plasmamembraani kausjad moodustised, mille põhiliseks struktuuriühikuks on 22 kDa suurune valk kaveoliin. See asetseb membraani alumisel küljel spiraalitaolise struktuurina (Rothberg, Heuser et al.
1992). Kaveoole on leitud rohkelt endoteeli-, rasva- ja lihasrakkudest (Parton and
Richards 2003), endoteelirakkudes võtavad nad enda alla üle 10 % rakupinnast (Pollard 2002). Kaveoliin seondub suure afiinsusega membraanis asuva kolesterooliga, viimase eemaldamisel membraanist translokeerub kaveoliin rakusisestesse struktuuridesse, eelkõige Golgi kompleksi. Kaveoolide lipiidne koostis sarnaneb lipiidsete saarekeste koostisega: lisaks kolesteroolile leidub kaveoolides palju sfingolipiide ja nende külge ühendatud GPI-ankurdatud valke ning mitmeid nii retseptor- kui ka mitteretseptor- türosiinkinaase (Pelkmans and Helenius 2002). Seega võib kaveoole vaadelda kui kaveoliini sisaldavaid plasmamembraani lipiidseid saarekesi. Kaveoolide diameeter jääb vahemikku 50-120 nm. Nende kaudu sisenevad rakku näiteks SV40 viirus (Anderson, Chen et al. 1996) ja Vibrio cholerae toksiin, seetõttu on SV40 viiruspartiklit ja kooleratoksiini subühikuid sageli kasutatud kaveoolide toimemehhanismide uurimiseks. Kooleratoksiini rakku liikumise protsess on universaalsem ja võib toimuda nii klatriin- sõltuva kui -sõltumatu endotsütoosi teel ja seda nii kaveoolidest kui dünamiinist sõltumatult (Torgersen, Skretting et al. 2001). On teada, et tema esmaseks retseptoriks rakupinnal on peamiselt lipiidsetes saarekestes paiknev gangliosiid 1 (Wolf, Jobling et al. 1998). Kooleratoksiini rakku liikumine ja toksilisus säilib ka siis, kui rakupinnal eristatavad kaveoolid puuduvad, kuid sisenemine on takistatud rakumembraani lipiidsete saarekeste lõhkumise järel (Orlandi and Fishman 1998), viidates sisenemise sõltuvusele kolesteroolist. SV40 viiruspartiklite sisenemine kaveoolide kaudu on aeglane protsess ning sõltub aktiini tsütoskeletist, valgukinaaside aktiivsusest ja dünamiin II-st (Pelkmans, Puntener et al. 2002). Primaarne vesiikul viib oma sisaldise suurematesse, rohkem liigendatud tubulovesikulaarsetesse organellidesse, mida on nimetatud kaveosoomideks või plasmalemmi vesiikuliteks ja mis mõnedele andmetele tuginedes ei internaliseeri vedela faasi endotsütoosi markereid, nagu näiteks FITC-dekstraani (Pelkmans, Kartenbeck et al. 2001), teisalt jälle on selleks võimelised (Nichols 2002). On näidatud, et kaveosoomide kaudu rakku sisenenud viiruspartiklid jõuavad lõpuks siledapinnalisse endoplasmaatilisse retiikulumi (ER) (Pelkmans, Kartenbeck et al. 2001). See viitab kaveoolide kaudu käiva endotsütoosi eristatusele teistest defineeritud endotsütoosi liikidest transpordi algetappides ja radade ühildumisele hilisemates etappides. Sama teooriat toetavad ka katsed, kus inimese naha primaarsetes fibroblastides näidati, et EEA-1 valgu suhtes positiivsetes sorteerivates endosoomides paikneva kullaga märgistatud kooleratoksiini ja Golgi kompleksis
paikneva kaveoliin-1 tsütoplasmaatiline lokalisatsioon on osaliselt kattuv (Parton and Richards 2003).
Klatriin- ja kaveoliin-sõltumatu endotsütoos
On näidatud, et nii klatriin- kui kaveoliin-sõltuvate endotsütootiliste protsesside inhibeerimisel ei peatu membraani pinnalt endotsütootiliste vesiikulite moodustumine ja rakku liikumine. Lisaks klatriin-kaetud ja kaveoolidest lähtuvatele endotsütootilistele vesiikulitele on kirjeldatud ka klatriin-katmata vesiikuleid, mille tekkemehhanismide ja sisaldise kohta täpsed andmed puuduvad, nagu ka selle kohta, kas ja mil määral on nendega seotud rakupinna lipiidsed saarekesed. Lümfotsüütidel asuva interleukiin 2 retseptori rakku viimist ei peata klatriin- vahendatud endotsütoosi inhibeeriva AP kompleksi kuuluva epsiini mutantse vormi ekspressioon (Lamaze, Dujeancourt et al.
2001), mis näitab, et rakupinna retseptorite internaliseerimine ei toimu ainuüksi klatriin-kaetud lohkude kaudu.
Samuti on näidatud, et detergentide poolt mitteekstraheeritavatesse plasmamembraani lipiidsetesse parvedesse lokaliseeruv rohelise fluorestseeruva valguga märgitud glükosüülfosfatidüülinositool (GPI-GFP) liigub kiiresti plasmamembraani ja Golgi kompleksi vahel (Nicho ls, Kenworthy et al. 2001).
Vastavate vesiikulite transporti ei takista klatriin-sõltuva endotsütootilise raja inhibeerimine ja puudub kolokalisatsioon varaste endotsütootiliste vesiikulite markeritega. K üll aga põhjustab märgitud GPI jäämise Golgi kompleksi plasmamembraani kolesterooli ekstraheerimine (Nichols, Kenworthy et al. 2001).
Rakku penetreeruvad peptiidid
Polüpeptiidide, oligonukleotiidide ja erinevate hüdrofiilsete molekulide kasutamine terapeutiliselt on olnud seniajani piiratud ühelt poolt nende vähese võimega läbida bio loogilisi membraane ja teisalt nende suhteliselt kiire degradatsiooniga rakkudes/rakulises keskkonnas. Viimase kümnendi jooksul intensiivselt uuritud rakku penetreeruvatest peptiididest (Cell Penetrating Peptides – CPP) (Lindgren, Hallbrink et
al. 2000), mille sünonüümina on kasutusel ka valgu transduktsioonidomeeni mõiste (Protein Transduction Domain – PTD), loodetakse abivahendit hüdrofiilsete bioaktiivsete makromolekulide elusraku tsütoplasmasse ja rakutuuma kompartmentidesse toimetamiseks. Kuna penetreeruvad peptiidid säilitavad oma penetreerumisvõime ka konjugeerituna teiste molekulidega, pakuvad sellised mitteviiruselised vektorid huvi nii terapeutilistel kui biotehnoloogilistel eesmärkidel (Joliot and Prochiantz 2004), seda enam, et viimastele andmetele tuginedes on peptiidide ja isegi valkude penetratsioon elusorganismide poolt nende elutegevuses laiemalt kasutusel kui seni arvatud.
Penetratsioon
Penetratsiooni mõiste võeti kasutusele tähistamaks mõningate peptiidide võimet rakumembraanist läbi tungida (Derossi, Calvet et al. 1996), sest antud protsess on näiliselt endotsütoosist ja raku ATP energiast sõltumatu. Peptiidide rakku liikumise kohta on mitmeid teooriaid. Esimesena esitati hüpotees hüdrofiilsete positiivselt laetud molekulide rakku liikumise kirjeldamiseks pööratud mitselli moodustumisena (joonis 2b). Selle järgi indutseerib pööratud mitselli tekke peptiidi seostumine plasmamembraani lipiididega elektrostaatilise tõmbejõu mõjul ja mitsell avaneb membraani teisele küljele (Derossi, Chassaing et al. 1998). Selle teooria järgi on peptiid kogu aeg hüdrofiilses keskkonnas. Teine, vajuvaks parveks nimetatud mudel postuleerib üheks peptiidide rakku liikumise viisiks multimeriseerunud peptiidiheeliksite horisontaalse vajumise läbi membraani (Pokorny, Birkbeck et al.
2002) (joonis 2a) ja seda võib kõrvutada ka mehhanismiga, mille käigus liiguvad peptiidid rakku plasmamembraani poori moodustades, mis arvatakse olevat iseloomulik amfipaatsetele peptiididele (Deshayes, Heitz et al. 2004) (joonis 2c). Lisaks neile on hüdrofoobsete peptiidide puhul pakutud, et sisenemine toimub otse läbi lipiidkihi ja selle käigus muutub peptiidi a-heeliksi tertsiaarne struktuur (sisenemine juuksenõela struktuuri mudeli järgi, joonis 2d) (Veach, Liu et al. 2004). Viimasel ajal on üha enam leitud tõendeid ka endotsütootilisi radu kasutava internalisatsiooni toimumisest (Joliot and Prochiantz 2004), on isegi postuleeritud, et tegu on täies ulatuses endotsütootilise protsessiga ning et eelnevad difuusset tsütoplasmaatilist lokalisatsiooni näitavad tulemused on rakkude fikserimisest tulenev artefakt (Leifert, Harkins et al. 2002;
Lundberg and Johansson 2002; Richard, Melikov et al. 2003). Samas on andmeid, mis näitavad siiski ka peptiidide liikumist rakku otse läbi lipiidikihi (Deshayes, Heitz et al.
2004; Veach, Liu et al. 2004), välistades endotsütoosi osaluse sisenemise protsessis.
Difusiooni teel rakku tungimine on vähetõenäoline, kuna enamike puhul ületab peptiidi rakusisene kontsentratsioon rakuvälise, nt transportaani puhul on vahe rakku penetreerunud ja ekstratsellulaarses keskkonnas oleva peptiidi hulga vahel vähemalt 350-kordne (Hällbrink, Floren et al. 2001).
Samuti on siiani jäänud vaieldavaks rakupinna proteoglükaanide roll pepiidide rakku sisenemisel (Silhol, Tyagi et al. 2002; Couchman 2003) ning ühiseid primaarse ja sekundaarse struktuuri elemente iseloomustamaks efektiivset RPPd pole käesolevate andmete põhjal võimalik välja tuua. Olulisteks omaduseks RPPdele on peetud nii rakku liikuva peptiidi a-heeliksi moodusamise võimet, pepiidi positiivset kogulaengut (Wender, Mitchell et al. 2000) kui ka hüdrofoobsete aminohapete sisaldus t (Derossi, Joliot et al. 1994).
Joonis 2. Erinevad teooriad penetratsiooni mehhanismidest. A) vajuva parve mudel (Pokorny et al, 2002); B) pööratud mitselli mu del (Derossi et al, 1996); C) penetratsioon poori moodustamise läbi (Deshayes et al, 2004); D) Juuksenõela struktuuri ja viltuselt membraani sisemis e teooria hüdrofoobse peptiidi korral (Veach et al, 2004).
Penetratiinid
Penetratiini perekonna peptiidid on pärit Drosophila Antennapedia homeovalgust, mis oli esimene avastatud elusate rakkude poolt sekreteeritav ja internaliseeritav transkriptsioonifaktor (Perez, Joliot et al. 1992). Homeovalgud seonduvad DNA-ga 60 aminohappest koosneva motiivi kaudu, mida nimetatakse homeodomeeniks. See koosneb kolmest α-heeliksist, millest teine ja kolmas on ühendatud β-pöördega (Gehring, Qian et al. 1994). Homeovalkude võime rakust rakku translokeeruda on üldisem, kuna internaliseerumist kultuuris kasvavatesse rakkudesse on nüüdseks näidatud mitmete selle perekonna valkude puhul (Engrailed, Hoxa5, Pax6 jne) ning sellele viitab ka nendes transkriptsioonifaktorites esineva homeodomeeni kõrge konserveeritus eri organismide puhul (Prochiantz and Joliot 2003). Suunatud mutageneesiga on näidatud, et Antennapedia vähim translokeeruv element on valgu 43- 58 aminohappest (ah) koosnev järjestus (hiljem penetratiiniks nimetatud), mis internaliseerus fikseeritud neuronitesse nii 37° kui ka 4° C juures (Derossi, Joliot et al.
1994). Kuigi hiljem on leitud, et internaliseerumisvõimeline on ka 16 aminohappe pikkuse penetratiini seitsme ah pikkune N-terminaalne fragment, on selle efektiivsus internalisatsioonil tunduvalt madalam (Fischer, Zhelev et al. 2000). Derossi ja kaasautorid uurisid ka pööratud järjestusega (58-43) ja D-aminohapetest koosneva penetratiini võimet rakkudesse siseneda ja leidsid, et nimetatud analoogid on nii raku tsütoplasmas kui tuumas detekteeritavad nii 37° C kui 4° C juures (Derossi, Calvet et al. 1996), mis näitab, et spetsiifilise retseptori olemasolu rakupinnal pole internaliseerumiseks vajalik. Samale järeldusele viitavad ka tulemused elusrakkudes, fikseerimisest tingitud artefakte välistavates tingimustes, kus on detekteeritud penetratiini sisenemist MDCK rakkudesse madalal temperatuuril, mil endotsütootilised protsessid on tugevalt inhibeeritud (Christiaens, Grooten et al. 2004).
Ringdikroismi ja tuuma magnetresonantsi kasutades on kindlaks tehtud, et fosfaatpuhvris on penetratiin ~8 % ulatuses helikaalse struktuuriga (Christiaens, Grooten et al. 2004), kergemini moodustab a-helikaalset struktuuri peptiidi N- terminaalne osa ja helikaalsus suureneb hüdrofoobsemas keskonnas (Letoha, Gaal et al.
2003).
Esmaseks etapiks peptiidi penetratsioonil rakku peetakse seostumist membraani lipiididega ning seda on ulatuslikult uuritud kunstlikke vesiikuleid kasutades, kus
puuduvad muidu rakumembraanis esinevad valgud ja nendega seotud suhkrujäägid. On näidatud, et penetratiin translokeerub läbi suurte ühekihiliste lipiidvesiikulite membraani (Giant Unilamellar Vesicle – GUV) ilma poori moodustamata (Letoha, Gaal et al. 2003), väikeste ühekihiliste lipiidvesiikulite korral on aga näidatud, et peptiid internaliseerumiseks võimeline ei ole (Drin, Demene et al. 2001). Selle töö kohaselt omandab pene tratiin membraani läbimise võime mutatsioonide kaudu, mis suurendavad tema N-terminaalse osa hüdrofoobset momenti, võimaldades tungida sügavamale lipiidikihti (Drin, Demene et al. 2001). Vastuolulisi tulemusi võivad põhjustada erinevused kunstlike vesiikulite pinnalaengus ja lipiidses koostises, kus laengulised ja hüdrofoobsed interaktsioonid võivad sisenemise indutseerimisel erinevat kaalu omada.
On siiski näidatud, et kahe trüptofaanijäägi asendamine penetratiini ahelas fenüülalaniinidega (2W2F), mis muudab peptiidi hüdrofoobsemaks, kaotab täielikult peptiidi võime rakkudesse siseneda (Derossi, Joliot et al. 1994), viidates sellele, et trüptofaanijäägid, eriti 48. positsioonis asuv, võivad toimida membraanse ankruna ja sügavamale lipiidkihti sisenedes indutseerida pööratud mitselli tekke (Christiaens, Symoens et al. 2002).
Rakku viidava molekuli penetratiiniga liitmiseks on kasutatud kolme peamist võimalust, mis kehtivad ka teiste transportpeptiidide puhul. Esiteks, Antp kolmandat heeliksit saab sünteesida, lisades N-terminusse aktiveeritud tsüsteiini, mis moodustab selektiivselt disulfiidsideme transporditava molekuli küljes oleva tsüsteiiniga. Rakus disulfiidside redutseeritakse ja transporditav molekul vabaneb penetratiinist. Teiseks võimaluseks on kimäärse peptiidi keemiline süntees, mis ei võimalda transportpeptiidile lisada väga pikki polüpeptiide. Kolmanda võimalusena on laialdaselt kasutatud transportpeptiidi ja lastmolekuli fuseeritud valgu sünteesi (Derossi, Chassaing et al. 1998). Peptiidide rakku liikumise efektiivsust mõjutab ka nendega konjugeeritud märke või lastmolekuli iseloom: tetrametüülrodamiiniga N-terminaalselt märgitud penetratiin sisenes melanoomist pärinevasse rakuliini SKMel 37 1,5 korda efektiivsemalt kui analoogselt fluorestseiiniga märgitud peptiid (Fischer, Waizenegger et al. 2002). Kuid on ka näidatud, et penetratiini perekonna peptiidid on võimelised parandama adenoviiruse partiklite rakkuvõttu ka ilma keemilise sidemeta nii in vitro kui in vivo (Gratton, Yu et al. 2003), mis viitab, et mõningatel juhtudel piisab
internaliseerumiseks tugevatest laengulistest või hüdrofobsetest interaktsioonidest vedur- ja lastmolekuli vahel, seda eriti juhul, kui lastmolekuliks on negatiivselt laetud DNA.
Tat perekonna peptiidid
HI-viirusest pärinev ja viiruse transkriptsiooni transaktivatsioonil osaleva Tat valgu võime kultuuris kasvavatesse rakkudesse liikuda oli sisuliselt rakku penetreeruvate peptiidide uurimissuuna algust tähistav avastus (Frankel and Pabo 1988). Paljudele homeovalkudele analoogselt sekreteeritakse Tat rakkudest ja internaliseeritakse seejärel teiste rakkude poolt.
Tat valgust pärinevad erineva pikkusega peptiidid Tat (1-72) ja Tat (37-72) olid võimelised ka erinevate valgumolekulidega (β-galaktosidaas, mädarõika peroksüdaas) konjugeeritult internaliseeruma nii raku tsütoplasmasse kui tuuma ning seda ka temperatuuril 4° C (Fawell, Seery et al. 1994). Veelgi enam, kolme erineva märkega (magnetnanopartikkel, fluorestseiin ja magnetpartikli radioaktiivselt detekteeritav dekstraankate) Tat-(48-57) peptiid internaliseerus inimese hematopoeetilistesse CD43+ rakkudesse ja hiire neuraalsetesse eellasrakkudesse (C17.2), mis säilitasid partikli internalisatsiooni järel ka diferentseerumisvõime (Lewin, Bredow et al. 1999). In vivo on 15 ah pikkuse Tat-peptiidi internalisatsiooni näidatud enamikesse kudedesse, kaasa arvatud ajju, ning sealjuures säilis peptiidiga konjugeeritud ensüümi (antud näites β- galaktosidaas) aktiivsus (Schwarze, Ho et al. 1999). Tat peptiidiga on tulemuslikult rakkudesse transporditud ka liposoome suurusega kuni 200 nm (Torchilin, Levchenko et al. 2003).
Tat-peptiidiga rakku viidud molekulide aktiivsuse säilumist on demonstreeritud ka in vivo eksperimentides: Tat-peptiidist ja antiapoptootilisest valgust Bcl- XL
koosneva liitvalgu süstimine kahjustatud nägemisnärvi piirkonda vähendas apoptoosist tulenevat DNA fragmenteerumist retinaalganglionis 54 % võrra (Dietz, Kilic et al.
2002). Tat- Bcl-XL liitvalgu antiapoptootiline toime isheemilistele neuronitele säilis ka siis, kui liitvalku manustati veenisiseselt (Kilic, Dietz et al. 2002). Need tulemused näitavad, et liitvalk on võimeline liikuma läbi mitme membraani (endoteelist närvikoesse) ja säilitama oma aktiivsuse pikema aja vältel, seega vältides rakkudesse liikudes lüsosomaatilisi organelle.
Seisukoht Tat-peptiidi ja temaga liidetud molekulide rakku liikumise mehhanismi osas on olnud viimase paari aasta jooksul pidevalt muutuv. Just Tat- peptiidi puhul on näidatud, et rakku tungivate peptiidide internalisatsioonimehhanism ei pruugi erinevatel peptiididel olla sama. Tat-i 13 ah pikkune peptiid, mis sisaldab kuut arginiini ja kahte lüsiini jääki ja on tugevalt aluseline, ei vaja internalisatsiooniks interakteerumist rakupinna heparaansulfaatidega, mille puudumise korral on aga Tat- i täispika valgu internalisatsioon rakku tugevalt pärsitud (Silhol, Tyagi et al. 2002).
Teisalt jälle on näidatud ka Tat valgu lühikese translokeeruva järjestuse sisenemise sõltuvust heparaan- ja kondroitiinsulfaatidest (Wadia, Stan et al. 2004). Edasine rakku liikumine leiab ilmselt aset kas kaveool- vahendatud endotsütoosi (Ferrari, Pellegrini et al. 2003; Fittipaldi, Ferrari et al. 2003) ja/või makropinotsütoosi (Wadia, Stan et al.
2004) kasutades ning rakus toimub endotsütootiliste vesiikulite hapustamise käigus peptiidi ja temaga seotud molekuli vesiikulist väljalekkimine, mida võib fluorestsentsmikroskoopiat kasutades detekteerida tsütoplasma difuusse märkumisena (Potocky, Menon et al. 2003; Wadia, Stan et al. 2004) ning mida postuleeriti juba 10 aastat tagasi (Fawell, Seery et al. 1994). Hüpoteesi lekkivatest vesiikulitest kinnitas kaudselt ka CHO rakkude fraktsioneerimine pärast inkubeerimist 125I-märgitud Tat (47- 57)-ga, näidates märgatava osa peptiidi asumist tsütoplasmaatilises fraktsioonis (Zaro and Shen 2003).
On näidatud, et erinevaist viirusvalkudest pärit rakku penetreeruvad peptiidid jagavad tõenäoliselt internalisatsioonimehhanismi, kuna esmalt ülehulgas lisatud HI- viiruse valk Rev-(34-50) takistab Tat-(48-60) penetratsiooni peaaegu samal määral kui Tat-(48-60) kohalolu ise Sama toimet omas ka Tat-(48-60) Rev-(34-50) internalisatsioonile (Suzuki, Futaki et al. 2002).
Transportaan ja selle analoogid
Transportaani eellasmolekul galparaan on kimäärne peptiid, mis koosneb kahest fragmendist: aminohapped 1-13 pärinevad neuropeptiid galaniinist ja aminohapped 14- 27 vastavad herilase mürgi komponendile mastoparaanile (Langel, Pooga et al. 1996).
Galparaan on galaniini retseptori jaoks suhteliselt kõrge afiinsusega ligand. Lisaks sellele stimuleerib ta Na+/K+-ATPaasi, mida galaniin ei tee (Langel, Pooga et al. 1996) ja suurendab doos-sõltuvalt atsetüülkoliini vallandamist roti ajus läkaköha tekitava
bakteri Bordetella pertussis toksiini- sõltuval moel (Consolo, Baldi et al. 1997).
Uurimaks galparaani lokalisatsiooni rakkudes, sünteesiti tema analoog, kus 13.
positsiooni proliin galaniini osas asendati lüsiiniga. Lüsiini kõrvalahelas asuv aminorühm võimaldas molekuliga lihtsalt liita soovitud reportergruppi, biotiini, ja jälgida galparaani seondumist ja lokalisatsiooni. Üllatuslikult näitas asendusega galparaan tugevat tsütoplasmaatilist ja tuuma lokalisatsiooni ja neist omadustest lähtudes nimetati uus molekul transportaaniks (Pooga, Hallbrink et al. 1998).
Transportaani internalisatsioon ei ole ilmselt retseptor-vahendatud, kuna peptiid liigub rakku kiiremini kui retseptor- vahendatud endotsütoos toimuda saaks ja transportaani internalisatsiooni ei takista rakkude preinkubatsioon tema eellaste, galaniini, mastoparaani või galparaaniga, mis näitab, et ga laniini retseptorite küllastatus peptiidi rakku sisenemist ei blokeeri. Lisaks pole transportaani puhul täheldatud rakuspetsiifikat (Langel 2002). Juba 1 minuti möödudes on Bowes rakkude plasmamembraan ja tsütoplasma markeerunud, hiljem liigub peptiid ka tuumaümbrisesse ja tuuma. Lisaks sellele ei blokeeri transportaani internalisatsiooni endotsütoosi välistav madal temperatuur, hüperosmolaarsed lahusetingimused ega rakupinna valkude ristsidumine (Pooga, Hallbrink et al. 1998). Tuuma sisenemist takistab siiski madal temperatuur, 0°C tuumalokalisatsioon puudub.
Kuna erinevalt mastoparaanist inhibeerib transportaan summaarset GTPaasset aktiivsust rakumembraanides, on sünteesitud erinevaid transportaani analooge, et leida retseptoritega mitteseonduv ja raku elutegevusele minimaalselt mõjuv transportpeptiid.
Transportaani derivaatide analüüs on näidanud, et efektiivselt internaliseeruvatel analoogidel on ühise tunnusena olemas mastoparaani osas vähemalt 10 aminohapet ja galaniini C-terminaalne piirkond (Soomets, Lindgren et al. 2000). Sellest tulenevalt arvatakse, et need struktuurielemendid on transportaani internalisatsiooni määravad tegurid. Nende motiivide puudumisel transportaani perekonna peptiidid rakku ei penetreeru.
Seni on ainsana leitud GTPaase inhibeeriv aktiivsus puuduvat transportaani analoogil TP10, millel on deleteeritud N-terminusest galaniini osast kuus esimest aminohapet (Soomets, Lindgren et al. 2000). TP10 omab ka mõningal määral antimikroobset aktiivsust, inhibeerides Staphylococcus aureus’e ja Candida albicans’i kasvu madalatel kontsentratsioonidel (< 10µM) (Nekhotiaeva, Elmquist et al. 2004).
Transportaan ja tema analoogid võimaldavad rakku transportida erineva suurusega hüdrofiilseid molekule, siiani on temaga rakku viidud lühikesi peptiide (Hällbrink, Floren et al. 2001), peptiidse nukleiinhappe (PNA) oligomeere (Pooga, Hallbrink et al. 1998) ja 30-150 kDa suurusi valke (GFP, streptavidiin, antikehad).
Lisaks sellele on transportaan võimeline rakku transportima ka ligi 1 MDa suuruseid kolloidse kulla partikleid (Pooga and Langel 2001). Magzoub ja kaasautorid on transportaani ja kunstlike lipiidvesiikulite interaktsioone uurides näidanud, et nii negatiivse kui neutraalse kogulaenguga lipiid vesiikulite juuresolekul säilitab transportaan a-helikaalse struktuuri (Magzoub, Eriksson et al. 2003).
Arginiinirikkad peptiidid
Hüpoteesiga positiivselt laetud aminohapete olulisusest rakku liikumise käigus ühtib hästi lühikeste, ainult arginiinijääkidest koosnevate peptiidide rakku liikumise ja molekulide transpordi võime. Arvatakse, et penetratsioonil on olulised arginiini kõrvalahelad, mis kujutavad endast guanidiinrühmi (Wender, Mitchell et al. 2000).
Mitchell ja kaasautorid on omavahel võrrelnud lühikesi arginiini, lüsiini, histidiini ja ornitiini oligomeere ning näidanud, et rakku penetreerumisel on efektiivseim seitsmest arginiinist koosnev peptiid (Mitchell, Kim et al. 2000). Huvitavaks omaduseks arginiini oligomeeridele on nende internalisatsiooni efektiivsuse vähenemine ja tsütotoksilisuse suurenemine ahela pikenedes, maksimaalset internalisatsiooni ja akumuleerumist tuuma on näidanud 6 ja 8 arginiini pikkused oligomeerid ning vähemalt 6 arginiini olemasolu oli vajalik erinevatest viirustest pärit aluseliste peptiidide internalisatsiooniks rakku (Futaki, Suzuki et al. 2001; Futaki 2002). Tat-peptiidiga (49-57) võrreldes on lühikesed arginiinijärjestused nii L-kui D-analoogide kujul penetratsioonil kiiremad (Wender, Mitchell et al. 2000). Samas on polüguanidiini sisaldavate peptoidide internalisatsioon rakku arginiini oligomeeridega efektiivsuselt täiesti võrreldav, viidates vesiniksidemete ja peptiidse selgroo vähesele rollile rakku penetreerumisel (Wender, Mitchell et al.
2000).
Mitme märke liitmist võimaldavad haruneva ahelaga arginiini oligomeerid on samuti võimelised HeLa rakkudesse sisenema (Futaki, Nakase et al. 2002). Kuigi selliste molekulide süntees on mõningal määral keerukam, lubab mitme märke liitmine ühe kandjamolekuliga viimase laiemat biotehnoloogilist kasutamist.
Arginiini oligomeeride puhul on kinnitust leidnud ka nende sobivus erinevate biomolekulide in vivo rakendusteks. Nimelt on Rothbard ja kaasautorid demonstreerinud heptameerse arginiini külge liidetud tsüklosporiin A efektiivsust in vivo katsetes, kus peptiidi ja ravimi konjugaat tungis hiire ja transplanteeritud inimese epidermise keratinotsüütidesse, inhibeerides seal põletikulisi protsesse ning seda lokaalselt ja doos-sõltuvalt (Rothbard, Garlington et al. 2000). Modifitseerimata tsüklosporiini kasutamist piirab tema efektiivsusele vaatamata vähene kudedesse tungimise võime.
Amfipaatsed ja hüdrofoobsed peptiidid ning valkude järjestustest pärinevad peptiidid (protein-derived peptides)
Peamiselt lüsiini, alaniini ja leutsiini sisaldavad amfipaatsed mudelpeptiidid (Model Amphipatic Peptide – MAP) disainiti algselt uurimaks biofüüsikalisi aspekte peptiidi ja lipiidkihi vahelistes interaktsioonides (Steiner, Schar et al. 1991).
Analüüsides interaktsioone polükatioonsete peptiidide ja lipiidsete membraanide vahel (Dathe, Fabian et al. 1996), leiti, et need peptiidid olid võimelised sisenema endoteeli rakkudesse hoolimata sellest, et nii endotsütootilised kui energeetilised protsessid olid inhibeeritud (Oehlke, Scheller et al. 1998). Sellised mudelpeptiidid, millel a-heeliksisse voltununa üks külg kannab laengut ja teine on hüdrofoobsete omadustega, seostuvad ilmselt negatiivselt laetud fosfolipiide sisaldavate vesiikulitega elektrostaatilise interaktsiooni tõttu, neutraalsete vesiikulite puhul toimib arvatavasti hüdrofoobne interaktsioon.
Modifitseerides amfipaatse ahela pikkust, laengut ja heeliksi moodustamise omadusi, näidati, et ainsana on amfipaatse peptiidi internalisatsiooniks obligatoorne vähemalt nelja täispöörde olemasolu heeliksis (Scheller, Oehlke et al. 1999). Üllatav oli aga aluseliste kõrvalahelatega lüsiinide asendamisel laenguta glutamiinidega saadud peptiididel ilmnenud kõrgenenud internalisatsioonimäär (Scheller, Oehlke et al. 1999), millest johtuvalt saab järeldada, et üldine positiivne laeng pole selle penetreeruva peptiidi klassi puhul peamine internalisatsioonitegur. Mitteobligatoorseks on osutunud ka amfipaatsus ise: internaliseerumisvõimelised on amfipaatsete peptiidide mitteamfipaatsed analoogid (Scheller, Wiesner et al. 2000). Samal ajal seonduvad amfipaatsed analoogid ilmselt rakuorganellidega tugevamalt ja on rakkude töötlemise
käigus raskemini välja pestavad, mistõttu annavad tugevamaid signaale fluorestsentsmikroskoopias.
MAP-peptiidi sekundaarstruktuur sarna neb mõningate antimikroobsete peptiididega ning omab sarnaselt nendega ka antimikroobset aktiivsust ja kõrget toksilisust eukarüootide plasmamembraanide suhtes (Dathe, Fabian et al. 1996; Oehlke, Scheller et al. 1998).
Kunstlik peptiid Pep-1, mis koosneb kolmest erinevast domeenist - hüdrofoobsest trüptofaanirikkast osast, SV40 suure T-antigeeni (Large T antigen) NLS- st tuletatud hüdrofiilsest lüsiinirikkast osast ja proliinirikkast linkeralast, internaliseerub eri rakuliinidesse nii füsioloogilisel kui ka endotsütoosi välistava l madalal temperatuuril. Samas ei ilmuta see kimäärne peptiid testitud kontsentratsioonide ulatuses toksilisust ning võimaldab mittekovalentselt suurte valkudega seotuna (119 kDa β-galaktosidaas, 150 kDa antikehad) nende transporti rakku, olles näiliselt seni välja töötatud rakku penetreeruvaist peptiididest funktsionaalseim (Morris, Depollier et al. 2001).
Pep-1 ja lastmolekuli vahel toimivad ilmselt hüdrofoobsed reaktsioonid, sest lahuse soolakontsentratsiooni suurendamine internaliseerumist kunstlikesse lipiidvesiikulitesse ei takista (Deshayes, Heitz et al. 2004).
Rakku liikumise võime esineb ka hüdrofoobsetel peptiididel. Liitpeptiid, mille N-terminaalses osas on 16 ah pikkune hüdrofoobne signaaljärjestus ja C-terminaalses osas asub NF-?B-d inhibeeriv oligopeptiid, sisenes rakuenergiast sõltumatult kultuuris kasvavatesse rakkudesse ja kunstlikesse lipiidvesiikulitesse ning seda nii L- kui ka D- analoogidest koosnevat N-terminaalset osa omades (Veach, Liu et al. 2004).
Mitmed hiljem rakku penetreeruvate peptiididena (RPP) defineeritud peptiidid on esialgselt olnud uurimisobjektiks mingil teisel eesmärgil ning membraani läbivad omadused on avastatud n.ö kõrvalnähtusena või mingi mutatsiooni tulemina (nt transportaan). pVEC on 18 ah pikkune hiire vaskulaar-endoteliaalse kadheriini transmembraansest ja tsütoplasmaatilisest osast pärinev aluseline peptiidijärjestus, mida uuriti esmalt kui potentsiaalset kadheriinide kaudu kulgevate signalisatsiooniradade aktivaatorit. Üllatuslikult avastati, et vastav järjestus on võimeline läbi plasmamembraani translokeeruma : pVEC sisenes endoteelirakkudesse ja fibroblastidesse nii L- kui D-analoogina (Elmquist and Langel 2003) ja selle biotiiniga
märgistatud derivaat viis rakkudesse streptavidiini (Elmquist, Lindgren et al. 2001).
Samuti omab see peptiid madalatel kontsentratsioonidel antibakteriaalseid omadusi, mõjutamata seejuures erütrotsüütide ja HeLa rakkude elulemust. Alla 10 µM jäävatel kontsentratsioonidel inhibeerib pVEC Mycobacterium smegmatis’e kasvu (Nekhotiaeva, Elmquist et al. 2004).
Mõnede RPPde antibakteriaalne aktiivsus ei ole üllatav, kuna paljud nendest omavad antimikroobsete peptiididega sarnaseid struktuurielemente. Antimikroobseid peptiide on praeguseks kirjeldatud üle 700 nii selgrootutes kui –roogsetes ning nad omavad kindlat rolli organismide kaasasündinud immuunsuses. Inimesest leitud antimikroobsete peptiidide hulka kuuluv 37 ah pikkune amfipaatne peptiid LL-37 on võimeline moodustama plasmiidse DNAga stabiilset kompleksi, kaitses nukleiinhapet seerumi nukleaaside eest ning vahendas DNA liikumist raku tsütoplasmasse ja ka tuuma (Sandgren, Wittrup et al. 2004). LL-37-vahendatud transpordi toimumine sõltus rakupinna proteoglükaanidest ja kolesteroolirikastest piirkondadest. Kuna antimikroobsed peptiidid lüüsivad baktereid eelkõige rakust sekreteerituna, oletati samas allikas, et lüüsimise järgselt bakteriaalse DNAga komplekseerudes ja rakku liikudes võivad antimikroobsed peptiidid olla horisontaalse geeniülekande indutseerijaks (Sandgren, Wittrup et al. 2004).
TÖÖ EESMÄRGID
• Võrrelda nelja rakku penetreeruva peptiidi (transportaan, Tat-peptiid, penetratiin ja pVEC) valgu transpordivõimet ja transpordi kineetikat koekultuuri tingimustes HeLa rakkudesse biotinüleeritud peptiid-avidiin kompleksi mudeli alusel.
• Selgitada peptiid-valk-komplekside sisenemise mehhanismi,
a) inhibeerides komplekside sisenemise seisukohast potentsiaalselt olulisi raku metaboolseid ja endotsütootilisi protsesse,
b) jälgides komplekside rakusisest paiknemist erinevate endotsütootiliste markerite suhtes
MATERJAL JA MEETODID
Kasutatud rakku penetreeruvad peptiidid
Töös kasutati nelja C-terminaalselt amideeritud peptiidi: penetratiini, pVECi, Tat- peptiidi ja transportaani, mis olid märgistatud biotiiniga, võimaldamaks peptiidi komplekseerimist fluorestseiin- isotiotsüanaadiga (FITC) märgitud avidiiniga (tabel 1).
Biotiin oli kõigil kasutatud peptiididel konjugeeritud N-terminaali, v.a transportaan, mille puhul paiknes biotiinmärge 13. positsioonis asuva lüsiini e-aminorühma küljes.
Kõik peptiidid sünteesiti Stockholmi Ülikooli Neurokeemia ja Neurotoksikoloogia Instituudis, kasutades Applied Biosystem M431A peptiidisüntesaatorit ja rakendades t- Boc strateegiat tahkel faasil. Peptiidid puhastati, kasutades C18 pööratud faasi kolonnkromatograafiat (HPLC – High Pressure Liquid Chromathography) ja autentsus kontrolliti täpse molekulmassi mõõtmisega MALDI- TOF mass-spektromeetril (Voyager-DE STR, Applied Biosystems, Foster City, CA).
Rakkude kultiveerimine
HeLa rakke, mis pärinevad inimese emakakaela kartsinoomist (ATCC – CCL- 2), kultiveeriti IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) söötmes, millele oli lisatud 10% veise looteseerumit, 100 IU/ml penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini.
Rakke kasvatati CO2 inkubaatoris 5% süsinikdioksiidi keskkonnas veeauruga küllastatud atmosfääris temperatuuril 37 °C. Nii läbivoolutsütomeetril kui fluorestsents- spektrofluorimeetril teostatavate katsete jaoks külvati 6-kannulistesse plaatidesse 250 000 HeLa rakku 2,5 ml söötmes ja lasti 24 tundi kinnituda.
Konfokaalmikroskoopia
Konfokaalmikroskoopiaks külvati eelmisel päeval 20 000 rakku klaaspõhjaga 8- kannulistesse rakukambritesse (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Kinnitunud rakke inkubeeriti 37 ºC juures 45 minutit 200 µl seerumiga IMDMs, mis sisaldas 0,15 µM Alexa Fluor 488-ga (Molecular Probes, Leiden, Holland) märgitud avidiini ja 0,5 µM biotinüleeritud peptiidi.
Pärast komplekse sisaldava söötme eemaldamist pesti rakke 2 korda PBS ga ja lisati 100 µl sama puhvrit, kuhu oli lisatud CaCl2 ja MgCl2 kontsentratsioonidega vastavalt 1ja 0,5 mM. Kujutised elusatest rakkudest salvestati erinevatel kõrgustasanditel iga 1µm järel seeriatena, kasutades skaneerivat laserkonfokaalmikroskoopi MRC-1024 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Seejärel lisati kambrisse ettevaatlikult 100 µl 8 %- list paraformaldehüüdi lahust PBSs, saavutamaks fiksaatori kontsentratsiooni 4%.
Kujutised samast rakust salvestati 10 minutit pärast paraformaldehüüdi lisamist ja pärast seda 10-minutiliste intervallidena ja mikroskoobi seadistust muutmata.
Internalisatsiooni eksperimendid
HeLa rakke inkubeeriti FITC- märgitud avidiiniga (Av-FITC) või biotinüleeritud peptiid i ja avidiini kompleksidega IMDM söötmes, mis sisaldas 10 % veise looteseerumit, kui pole märgitud teisiti. Biotinüül-peptiidi komplekseerimine avidiiniga toimus 2-3 minuti jooksul minimaalses ruumalas, mille järel lisati inkubatsioonilahus, nii et biotinüleeritud peptiidi ja avidiin-FITCi lõppkontsentratsioonid olid vastavalt 0,5 µM ja 0,15 µM. Inkubatsioonilahus lisati rakkudele ja sõltuvalt eksperimendist toimus inkubeerimine temperatuuril 37 °C või jääl ning inkubatsiooniaeg varieerus 15 minutist kuni 24 tunnini. Madalal temperatuuril läbi viidud katsete puhul teostati preinkubatsioon jääl 15 minuti jooksul enne peptiid- valk-komplekse sisaldava lahuse lisamist. Energeetiliste protesside inhibeerimiseks inkubeeriti rakke enne peptiid-valk- komplekside lisamist 0,5% naatriumasiidi, 25 mM desoksüglükoosi või mõlemat inhibiitorit sisaldava lahusega (desoksüglükoosi kasutamise korral toimus inkubeerimine PBS- is).
Kolesterooli ekstraheerimiseks plasmamembraanist ink ubeeriti rakke seerumvabas IMDMs, kuhu oli lisatud 10mM metüül-ß-tsüklodekstriini (Sigma), mis põhjustab lipiidsete saarekeste ja kaveoolide kadumist ja takistab ka nende taasteket (Thyberg 2002). Rakke töödeldi vastava inhibiitoriga 30 minuti jooksul 37° C juures, mille möödudes lisati peptiid-valk-kompleksid samasse lahusesse ja jätkati inkubatsiooni 30 minuti vältel.
Hüperosmolaarse keskkonna saavutamiseks inkubeeriti rakke seerumvabas söötmes 0,4 M sahharoosiga 10 minutit enne peptiid-valk-komplekside lisamist, selle järel jätkus inkubeerimine kompleksidega 30 minuti jooksul 37° C juures.
Analüüs läbivoolutsütomeetril
Pärast eelmisel päeval külvatud rakkude (70-90% konfluentsed) inkubatsiooni sõltuvalt eksperimendist kas ilma või koos inhibiitoritega ja peptiid-valk- kompleksidega pesti rakke 2 korda PBS- ga ja eemaldati plastikult inkubeerides trüpsiinilahusega (0.5 mg/ml PBS-s, 0.2 mg/ml EDTA) 37° C juures 3 või 15 minutit.
Trüpsiniseeritud rakud suspendeeriti, tsentrifuugiti 5 minutit 250 ×g 4 °C juures ja resuspendeeriti PBSs. Rakkude intaktsuse mõõtmiseks lisati rakususpensioonile 1 µg/ml propiidiumjodiidi. Läbivoolutsütomeetril loendati igast proovist 30 000 rakku ning rakkudega seondunud fluorestseeruvate peptiid-valk-komplekside analüüsimiseks kasutati firma “Becton Dickinson” läbivoolutsütomeetrit FACSCalibur ja sama firma tarkvara CellQuest (BD Biosciences, Heidelberg, Saksamaa). Andmete analüüsiks kasutati MS Excelit. Iga tulemus on esitatud kolme katse keskmisena.
Avidiin-FITCi kontsentratsioon HeLa rakkudes pärast 4-tunnist inkubatiooni arvutati standardkõvera alusel, mis saadi avidiin-FITCi lahusest 0,1 M naatriumhüdroksiidis.
Analüüs fluorestsents-spektrofotomeetril
Eelmisel päeval külvatud HeLa rakke inkubeeriti biotinüleeritud peptiidi ja FITC-märgitud avidiini kompleksidega nagu on kirjas internalisatsiooni eksperimentides. Peptiid-valk-komplekse sisaldav lahus eemaldati, rakke pesti 2 korda PBSga ja trüpsiniseeriti 15 minutit. Pärast 5 minutit tsentrifuugimist 250 ×g 4 °C juures pesti rakke veel kord PBS ga, tsentrifuugiti uuesti ja lüüsiti 1 ml-s 0,1 M naatriumhüdroksiidi lahuses. Saadud rakulüsaadi fluorestsentssignaali intensiivsus mõõdeti fluo restsents-spektrofotomeetril F-4500 (Hitachi, Jaapan), kasutades 10 × 10 mm küvetti. Fluorestseiini ergastuse ja emissiooni lainepikkused olid vastavalt 490 ja 520 nm ja monokromaatori pilu laius 10 nm. Andmete kvantitatiivseks analüüsiks kasutati MS Excelit ja iga tulemus esitab kolme katse keskmist.
Fluorestsentsmikroskoopia
Fluorestsentsmikroskoopiaks külvati eelmisel päeval 30 000 HeLa rakku 24- kaevuliste plaatide kannudesse ümmargustele katteklaasidele (“Menzel- Glazer”, #1, diameetriga 12 mm). Klatriin- ja kaveoliin-sõltuva endotsütoosi esiletoomiseks kasutati
vastavalt transferriini (10 µg/ml) ja kooleratoksiini B-subühikut (5 µg/ml), mis olid konjugeeritud Alexa Fluor 594-ga (Molecular Probes). Transferriini korral toimus inkubatsioon seerumvabas söötmes. Enne peptiid-valk-komplekse ja endotsütoosi markereid sisaldava söötme lisamist inkubeeriti rakke 30 min jooksul jääl, et maha suruda endotsütootilisi protsesse. Koinkubatsioon transferriini ja kooleratoksiiniga ning peptiid-avidiin-kompleksidega toimus 30 minuti jooksul jääl, mille järel üks kinnitunud rakkudega klaas iga proovi duplikaadist fikseeriti ja sulundati, teise klaasi inkubatsioon jätkus 37 ºC juures veel 30 minutit. Klaasidel olevaid rakke pesti pärast inkubeerimise lõppu 2 korda PBS-ga ja fikseeriti 4%-lise paraformaldehüüdi lahusega 15 minuti jooksul jääl inkubeerides. Rakkudega katteklaasid sulundati, kasutades fluorestsentsmärgiste pleekimist vähendavat sulundusvedelikku SlowFade (Molecular Probes). Fluorestsentskujutised dokumenteeriti CCD kaameraga DX70 varustatud Olympus BX41 fluorestsentsmikroskoobiga ning töödeldi arvutiprogrammiga DP mana ger. Saadud fluorestsentskujutiste töötlemiseks kasutati arvutiprogrammi Adobe Photoshop 6.0.
Tabel 1. Uuritud peptiidide aminohappeline järjestus Peptiid (Lühend) Järjestus
Penetratiin (pAntp) R*QIKIWFQNRRMKWKK amiid
Tat G*RKKRRQRRRPPQ amiid
pVEC L*LIILRRRIRKQAHAHSK amiid
Transportan (TP) GWTLNSAGYLLGK*INLKALAALAKKIL amiid
* biotiiniga märgistatud aminohape, kõik peptiidid (v.a transportaan) on märgitud N- terminaalselt, transportaanil asub biotiinmärge N,elüsiini küljes.
TULEMUSED
Biotinüleeritud peptiid-avidiini komplekside paiknemine HeLa rakkudes Avidiin on 67 kDa suurune valk, mis moodustab väga stabiilse kompleksi biotiiniga (vitamiin H). See biotiini omadus võimaldab tema kaudset visualiseerimist streptavidiini või avidiiniga, millega on liidetud näiteks fluorestseeruv rühm, ß- galaktosidaas jne. Antud töös kasutati fluorestseiin- isotiotsüanaadiga märgitud avidiini (Av-FITC) uurimaks biotiiniga konjugeeritud rakku penetreeruvate peptiidide võimet vahendada suurte biomolekulide transporti rakkudesse.
Fluorestsentsmikroskoopiat kasutades on näidatud, et biotinüleeritud transportaani ja avidiini kompleksid seonduvad stabiilselt rakumembraaniga juba 5 minuti möödudes (Pooga, Hallbrink et al. 1998). 45 minuti pärast on valdav osa peptiid- valk-komplekse jätkuvalt seotud rakumembraaniga või paiknevad membraanilähedastes tsütoplasma piirkondades, kuid märgatav osa fluorestseeruvaid partikleid asub ka raku sisemuses perinukleaarses piirkonnas, eelistatavalt vesikulaarsetes struktuurides (joonis 3). Kuna hiljuti on ilmunud andmeid, mis viitavad RPPde rakusisese lokalisatsiooni sõltuvusele rakkude fikseerimisest (Richard, Melikov et al. 2003), otsustati jälgida, kas rakkude fikseerimine mõjutab peptiid-valk- komplekside subtsellulaarset paiknemist. Kasutades konfokaalmikroskoopiat, pildistati peptiid-avidiin-kompleksidega töödeldud HeLa rakke enne fikseerimist PBSs, mille järel lisati ettevaatlikult fikseerimislahus ja jätkati pildistamist 10- minutiliste intervallidega 40 minuti jooksul. Tulemustest nähtub, et ümberkorraldused rakusiseses asetuses on fikseerimise tulemusena minimaalsed (võrd. joonis 3a, b), lubades oletada, et antud tingimustel rakkude fikseerimine peptiid-avidiin-komplekside olulist ümberasetumist ei põhjusta.
Joonis 3. Biotinüleeritud peptiidide ja avidiin-FITC-komplekside paiknemine rakkudes enne ja pärast fikseerimist. HeLa rakke inkubeeriti 0,15 µM avidiin -FITCga ja 0,5 µM biotinüleeritud transportaaniga 45 minuti jooksul 37 °C juures. Konfokaalkujutised rakkude ekvatoriaaltasandist enne (A) ja pärast 10 minuti pikkust fikseerimist paraformaldehüüdiga (B).
Biotinüleeritud peptiidide võime avidiini transportida on erinev
Kasutades läbivoolutsütomeetrit (FACS), mis võimaldab elusate rakkude fluorestsentsi kvantitatiivset analüüsi, ilmnes, et 30- minutiline HeLa rakkude inkubeerimine peptiidi ja avidiin-FITC kompleksidega temperatuuril 37 °C põhjustab võrreldes ainult avidiin-FITCga inkubeeritud rakkudega peptiid-valk-kompleksidega inkubeeritud rakkude fluorestsentsi tõusu ligi 10 korda biotinüleeritud penetratiini ja üle 100 korra biotinüleeritud transportaani puhul (joonis 4a). pVEC- i ja Tat-peptiidi võime avidiini transportida jääb selle miinimumi ja maksimumi vahele. Samas on iga peptiid- valk-kompleksidega töödeldud rakupopulatsioon homogeenne, viidates kõigi analüüsitud rakkude märkumisele. Inkubeerides rakke peptiid-valk-kompleksidega jääl (0-4 °C), kus ATP-st sõltuvad energeetilised protsessid ja endotsütoos on tugevalt inhibeeritud, on näha, et signaali tugevus, s.o rakkudega seondunud/rakku sisenenud peptiid- valk-komplekside hulk, on märgatavalt vähenenud (joonis 4c). Siiski säilib populatsiooni homogeensus ja peptiidide efektiivsuse sama järjestus.
Kuna FACS detekteerib kogu raku fluorestsentsi, ei saa välistada, et osa kogutud signaalist pärineb rakumembraani välisküljega seotud peptiid-valk- kompleksidelt, mis ei ole rakku sisenenud. Nende komplekside eemaldamiseks
A B
pikendati rakkude töötlust trüpsiinilahusega 15 minutini, mille tulemusena vähenes fluorestsentsi intensiivsus kõigi biotinüleeritud peptiidide puhul (joonis 4b). Pika trüpsiinitöötluse ja madalal temperatuuril inkubeerimise kombineerimine mõjub kõigi peptiid- valk-komplekside võimele membraaniga seonduda/rakku siseneda. Penetratiini puhul täheldati väga tugevat signaali vähenemist: biotinüleeritud penetratiini ja avidiiniga inkubeeritud rakupopulatsiooni fluorestsents jäi samale tasemele avidiin- FITC ga töödeldud rakkudega, mis oli negatiivseks kontrolliks. See viitab penetratiini vahendatud transpordi sõltuvusele temperatuurist. Kõige vähem mõjutab madala temperatuuri ja pika trüpsiinitöötluse koos kasutamine Tat-vahendatud valgutransporti (joonis 4d).
Joonis 4. Biotinüleeritud peptiid-avidiin-komplekside rakku liikumise erinev efektiivsus. HeLa rakke inkubeeriti 0,15µM avidiin-FITCga ja 0,5 µM biotinüleeritud peptiidiga seerumvabas söötmes 30 minuti jooksul temperatuuril 37 °C (a, b) ja 4 °C (c, d) ning töödeldi trüpsiinilahusega 3 (a, c) ja 15 minuti (b, d) jooksul. Rakke inkubeeriti avidiin-FITCga (1) või komplekseerituna biotinüleeritud penetratiini (2), pVECi (3), Tat-i (4) ja transportaaniga (5). Y-teljel on esitatud rakkude arv ja X-teljel fluorestsentsi intensiivsus.
1
2 3 5
4
a
c
2 1
3 4
5
1 2
3 5 4
b
12
3 5
_
4d
1
2 3 5
4
a
c
2 1
3 4
5
1 2
3 5 4
b
12
3 5
_
4d
RPPde vahendatud avidiini transpordi kineetika
Uurimaks biotinüleeritud RPPde vahendatud valgu transpordi protsessi ajas, inkubeeriti HeLa rakke peptiid- valk-kompleksidega 15 ja 30 minuti, 1, 2, 4 ja 24 tunni jooksul temperatuuril 37 °C seerumit sisaldavas söötmes. FACS- l rakkudega seotud fluorestsentsi kasvu jälgides toimub esimese tunni jooksul kõigi peptiidide vahendatuna rakkude märkumine avidiin-FITC ga lineaarselt, mis näitab, et komplekside rakkudesse kontsentreerumine on ajas sõltuv protsess (joonis 5a). Avidiin-FITC liigub rakkudesse analoogse kineetika alusel, kuid tunduvalt vähemal määral (joonis 5a). Pärast 4-tunnist inkubeerimist ilmneb, et transportaani ja Tat-peptiidi võime avidiini rakkudesse toimetada on võrreldes pVECi ja penetratiiniga ligikaudu 10 korda suurem (joonis 5a).
Samas toimub nende kahe peptiidi puhul pärast tunniajalist inkubeerimist fluorestsentsi tõusu peatumine, mis pole aga lõplik ja fluorestsentsi signaali kasv jätkub endises tempos kahe tunni möödudes (joonis 5a). Tegu võib olla komplekside rakku liikumise protsessi ajutise küllastumisega, fluorestseiini emissiooni nõrgenemisega vastusena komplekside ümberpaiknemisele või muutustega värvainet ümbritsevas keskonna s. On näidatud, et happelises keskkonnas fluorestseiini kvantsaagis väheneb ja emissiooni maksimum nihkub pikema lainepikkuse suunas, mis võib toimuda ka sel juhul, kui peptiid-avidiin-kompleksid asuvad rakus happelistes vesiikulites. Et seda hüpoteesi kontrollida, lüüsiti rakud pärast inkubeerimist peptiid-avidiin-kompleksidega 0,1 M naatriumhüdroksiidis, kus fluorestseiini tavapärased emiteerivad omadused peaksid taastuma, ja mõõdeti saadud lüsaadi fluorestsentsi intensiivsus spektrofluorimeetril.
Vastukaaluks FACS-l saadud peptiidide efektiivsuse suurele erinevusele näitavad spektrofluorimeetril saadud tulemused, et transportaani ja Tat-peptiidi võime avidiini rakku viia on ainult 2,5-3 korda suurem kui pVEC-l ja penetratiinil (joonis 5b). Samuti on kõigi peptiid- valk-komplekside rakku liikumise kineetika ajas lineaarselt tõusev, ilma FACS-l täheldatud märkumise languseta 1 ja 2 tunni vahel (joonis 5b).
Rakkude inkubatsiooniaja pikendamine peptiid- valk-kompleksidega 24 tunnini põhjustab kõigi peptiid-valk-komplekside puhul fluorestsensi signaali ligikaudu 2- kordse kasvu nii FACS-l kui fluoromeetril detekteerides (joonis 5c, d). Eriti intensiivne signaali tõus esineb transportaani poolt vahendatud avidiini rakku liikumisel, osutades,
et vähemalt selle aja jooksul ei ole transportaan-vahendatud avidiini rakku transport küllastatav.
Spektrofluorimeetrias saadud tulemusi arvutuslikult analüüsides leiti, et pärast 4 tunni pikkust inkubeerimist peptiid-valk-kompleksidega kontsentreerub avidiin rakkudesse enim pärast Tat-peptiidi vahendatud transporti, 18 korda ja kõige vähem, 7 korda, pVEC i poolt rakku viiduna. Transportaan kontsentreeris avidiini rakkudesse võrreldes inkubatsioonikeskkonnaga 11 ja penetratiin 8 korda.
Joonis 5. Biotinüleeritud peptiidide ja avidiin-FITC-komplekside rakku liikumise kineetika. HeLa rakke inkubeeriti 0,15 µM avidiin-FITCga ja 0,5 µM biotinüleeritud peptiidiga 37 °C juures 15 minutist 4 tunnini (a, b) ja 1 – 24 tunnini (c, d) analüüsituna FACS-l (a, c) ja spektrofluorimeetril (b, d).
Fluorestsentsi intensiivsus on esitatud suhtena töötlemata rakkude suhtes.
Seerumi ja söötme komponendid mõjutavad peptiid-vahendatud valgutransporti
Peptiidide ja nendega seotud lastmolekulide internaliseerumist on siiani enamasti uuritud seerumvabas keskkonnas, kus puuduvad muidu seerumi koostises
0 100 200 300 400 500 600 700
0 1 2 3 4 5
Aeg (h)
RFU
AvFITC pAntp pVEC pTat TP
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
AvFITC pAntp pVEC pTat TP
RFU
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
AvFITC pAntp pVEC pTat TP
1h 4h 24h
c d
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0 1 2 3 4 5
Aeg (h)
RFU
a b
esinevad proteaasid, mis põhjustavad valguliste komponentide kiirema lagundamise.
Komplekside sisenemist seerumit sisaldavas ja seerumvabas IMDMs läbivoolutsütomeetril analüüsides leiti, et seerumvaba keskkond mõjub soodsamalt ainult transportaani poolt initsieeritud avidiini rakku sisenemisele. Võrreldes nelja peptiidi va lgu transpordi efektiivsust PBS s, seerumita IMDMs ja seerumiga IMDMs, selgus, et eelistatuim internalisatsioonikeskkond penetratiini, pVECi ja Tat-peptiidi jaoks on seerumit sisaldav sööde (joonis 6). Samas on seerumiga sööde transportaanile eelistatum ainult lühemate, s. o 15- ja 30-minutiliste inkubatsiooniaegade puhul, 24- tunnise inkubatsiooni korral osutub sarnaselt teistega eelistatuks seerumit sisaldav keskkond (joonis 5c, d). PBS inkubatsioonikeskkonnana on ebasoodsaim kõigile peptiid- valk-kompleksidele peale penetratiini ning ilmutab tulemustes kõige suuremat varieeruvust.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
pAntp pVEC pTat TP
RFU
Joonis 6. Inkubatsioonikeskkonna mõju peptiid-avidiin-komplekside rakku sisenemisele. HeLa rakke inkubeeriti vastava peptiidi (0,5µM) ja avidiin-FITCi (0,15 µM) ko mpleksiga 30 minuti jooksul PBSs (tühjad tulbad), seerumita IMDMs (mustad tulbad) ja seerumiga IMDMs (viirutatud tulbad).
Fluorestsentsi intensiivsus on esitatud suhtena avidiin-FITCga töödeldud rakkudesse.
Peptiid-avidiin-komplekside sisenemist vähendab tugevalt raku energiadefitsiit
Et jälgida peptiidi ja lastmolekuli membraaniga seondumise ja rakku liikumise sõltuvust raku energeetilistest protsessidest, töödeldi rakke enne peptiid-valk- komplekside lisamist 30 minuti jooksul kas eraldi või kombineerituna
mittemetaboliseeritava 2-desoksüglükoosi (DOG) ja naatriumasiidiga, mis peatab rakuhingamise. Pärast poole tunni pikkust inkubeerimist peptiid-valk-kompleksidega põhjustab 0,5 %- line naatriumasiid sõltuvalt peptiidist rakkudega seotud fluorestsentssignaali 2 (penetratiin, TP, Tat) kuni 5-kordse (pVEC) vähenemise (joonis 7). Desoksüglükoosi mõju 25 mM kontsentratsioonil on nõrgem, puududes penetratiini puhul täielikult ja alandades teiste peptiidide efektiivsust 1,2-2 korda. Mõlema kemikaali koosmõju omab aga summaarset efekti, mõjudes sõltuvalt peptiidist 3-6 korda signaali vähendavalt (joonis 7). Samal ajal ei blokeeri töötlus kemikaalidega komplekside seondumist rakkudega täielikult, andes ainult avidiiniga töödeldud rakkudest 2-5 korda tugevama fluorestsentsi signaali.
0 10 20 30 40 50 60 70
pAntp pVEC pTat TP
RFU
Joonis 7. Raku energiadefitsiidi mõju peptiid-Av-FITC-komplekside internalisatsioonile. FACS-l analüüsitud peptiid-valk-komplekside sisenemine töötlemata HeLa rakkudesse (tühjad tulbad) eelnevalt 0,5 % NaN3 (mustad tulbad), 25 mM desoksüglükoosi (viirutatud tulbad) või mõlema inhibiitoriga (punkteeritud tulbad) inkubeeritud rakkudesse. Pärast 30 minuti pikkust inkubatsiooni inhibiitoreid sisaldavas söötmes lisati 0,15 µM avidiin-FITC ja 0,5 µM biotinüleeritud peptiid ja jätkati inkubatsiooni 37 °C juures 30 minutit. Fluorestsentsi intensiivsus on esitatud suhtena avidiin-FITCga töödeldud rakkudesse.
Peptiid-valk-komplekside sisenemine rakku toimub osaliselt klatriin- vahendatud endotsütoosi kaudu
Fluorestsentsmikroskoopia ja elektronmikroskoopia tulemused näitavad, et suur osa peptiidide poolt rakku viidud avidiinist asub vesikulaarsetes struktuurides.
Selgitamaks nende vesiikulite iseloomu, inkubeeriti HeLa rakke 30 minuti jooksul
peptiid-avidiin-kompleksidega hüperosmolaarsetes lahusetingimustes, mis pärsib klatriin-kaetud vesiikulite formeerumist. Võrreldes isotoonilise lahusega väheneb rakkude fluorestsentsi signaal FACS- l detekteerides pärast inkubeerimist 0,4 M sahharoosi lahuses pVECi, transportaani ja Tat-peptiidi puhul ligikaudu 1,5 korda, samas kui mõju penetratiini vahendatud valgutranspordile on suurem, alanedes 3 korda (joonis 8). Saadud andmed on võrreldavad fluorestsentsmikroskoopia tulemustega, kus kõrvutati roheliselt fluorestseeruvate peptiid- valk-komplekside ja punase valguse lainepikkusel emiteeriva Alexa Fluor 594-ga märgitud transferriini, mis siseneb rakkudesse klatriin- vahendatud vesiikulites, rakusisest paiknemist. Peptiid-AvFITC- komplekside ja transferriini rakusisene lokalisatsioon on kõigi nelja peptiidi puhul mõningal määral kattuv (joonis 10). Transferriiniga märkunud vesiikulid asetsevad ühtlaselt üle raku tsütoplasma ja eriti tugevalt on märkunud perinukleaarne, arvatavasti Golgi kompleksi sisaldav ala (joonis 10, punane signaal), fluorestseiinmärkega avidiini kompleksid on väiksemad ja asuvad rohkem rakkude perifeerias ning membraanil (joonis 10, roheline signaal). Kujutiste ühildamisel on lokalisatsioonilt kattuvad ja kollase signaalina detekteeritavad vesiikulid võrreldes rohelistega suuremad ja mõnevõrra rohkem liikunud raku perinukleaarse piirkonna suunas (joonis 10).
0 20 40 60 80 100 120 140 160
pAntp pVEC pTat TP
RFU
Joonis 8. Klatriin-vahendatud endotsütoosi mõju biotinüleeritud peptiidide ja avidiin-FITC- komplekside sisenemisele. HeLa rakke inkubeeriti 0,15 µM avidiin-FITCi ja 0,5 µM biotinüleeritud peptiidi kompleksidega isotoonilises (tühjad tulbad) ja 0,4 M sahharoosi sisaldavas söötmes (mustad tulbad). Fluorestsentsi intensiivsus on esitatud suhtena avidiin-FITCga töödeldud rakkudesse.
Rakumembraani kolesteroolirikkad piirkonnad osalevad RPPde vahendatud valgu transpordis
Kuna rakumembraani kolesteroolirikaste piirkondade kaudu toimub nii kaveool- sõltuv kui ka -sõltumatu endotsütootiliste vesiikulite rakku liikumine, otsustati kontrollida peptiid-vahendatud valgutranspordi toimumist tingimustes, kus plasmamembraani kolesteroolirikaste piirkondade tavapärane organiseeritus on häiritud. Selleks töödeldi rakke enne inkubatsiooni peptiid-valk-kompleksidega 30 minuti jooksul metüül-ß-tsüklodekstriiniga, mis eemaldab rakumembraanist kolesterooli, põhjustab kaveoolide kadumist ning takistab lipiidsete saarekeste organiseerumist. Analüüs FACS-l näitab,et rakkude töötlus metüül-ß-tsüklodekstriiniga vähendab penetratiini ja pVECi vahendatud valgutranspordi efektiivsust ligikaudu 2 korda, avidiini rakkuviimine Tat-peptiidi ja transportaaniga on kemikaali töötlusest vähem mõjustatud, vähenedes ligikaudu 1,2 korda (joonis 9).
Fluorestsentsmikroskoopia tulemustest nähtub, et väga suur osa peptiid-valk- komplekse asub rakus vesiikulites/granulaarsetes struktuurides, mis sisaldavad ka kooleratoksiini (joonis 11). Kooleratoksiin seondub membraani lipiidsetesse saarekestesse koondunud GM1 gangliosiididega ja internaliseerub vastavate piirkondade kaudu. Samas leidub kõigi peptiid-valk-komplekside puhul siiski ka üksnes roheliselt fluoresteeruvaid graanuleid, seda eeskätt plasmamembraanil ning mõningal määral rohkem penetratiin- avidiini kompleksidega töödeldud rakkudes (joonis11).
Märkimisväärne on ka punase signaali, s.o ainult kooleratoksiini sisaldavate vesiikulite puudumine Tat-, transportaan- ja penetratiin-avidiiniga koinkubeeritud rakkudes, viidates kooleratoksiini ning nimetatud peptiidi ja avidiini komplekside ühisele rakku liikumise teele.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
pAntp pVEC pTat TP
RFU
Joonis 9. Rakumembraani kolesteroolirikaste piirkondade eemaldamise mõju peptiid-avidiin-komplekside sisenemisele rakkudesse. Pärast HeLa rakkude 30 minuti pikkust töötlust seerumvabas söötmes 10 mM metüül-ß-tsüklodekstriiniga lisati samasse lahusesse peptiid-AvFITC-kompleksid (vastavalt 0,5 µM ja 0,15 µM) ning jätkati inkubatsiooni 30 minuti jooksul. Fluorestsentsi intensiivsus on esitatud suhtena avidiin-FITCga töödeldud rakkudesse.
