Die Rolle von Galectin-3 während der Prozessierung von pre-mRNA.

Aus dem Institut für klinische Zytobiologie und Zytopathologie Direktor: Prof. Dr. Roland Lill

des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg

Die Rolle von Galectin-3 während der

Prozessierung von pre-mRNA

Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanbiologie (Dr. rer. nat.)

dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg

vorgelegt von

Katharina Fritsch

aus Sonneberg

Angenommen vom Fachbereich Medizin der Philipps-Universität Marburg am 23.09.2016

Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs

Dekan: Prof. Dr. Helmut Schäfer Referent: Prof. Dr. Ralf Jacob 1. Korefferent: Prof. Dr. Uwe Maier

Für meine Familie,

Inhaltsverzeichnis

1

Zusammenfassung

Summary 2

2

Einleitung

2.1 Das pre-mRNA Spleißen 3

2.1.1 pre-mRNA Spleißen, Introns und Exons 3

2.1.2 Die Spleißreaktion 4

2.1.3 Der Zusammenbau des Spleißosoms und die U snRNPs 5

2.1.4 Das alternative Spleißen 8

2.1.5 Erkrankungen 9

2.2 Die Spleißkomponenten hnRNPA2B1, U2AF65 und U1 70k 10

2.2.1 hnRNPA2B1 10

2.2.2 U1 snRNP und U1 70k 13

2.2.3 U2AF65 und U2 snRNP 15

2.3 Galectine 17

2.3.1 Galectin-3 18

2.4 Fragestellung der Arbeit 25

3

Material und Methoden

3.1 Geräte, Chemikalien und Materialien 26

3.1.1 Geräte 26

3.1.2 Chemikalien und Materialien 27

3.2 Allgemeine Puffer 29

3.3 Zellkultur 30

3.3.1 verwendete Zelllinien 30

3.3.2 Medien und Lösungen 30

3.3.3 Kultivierung 30

3.3.4 Passagieren 31

3.3.5 Einfrieren und Auftauen 31

3.3.6 Zellen zählen 31

3.4 Molekularbiologische Methoden 33

3.4.1 RNA-Isolierung 33

3.4.2 RNA-Sequenzierung 33

3.5 Zellbiologische Methoden 34

3.5.1 Zellkern-Extraktion 34

3.5.2 Herstellung von Zelllysaten 35

3.6 Allgemeine proteinbiochemische Methoden 36

3.6.1 Bestimmung der Proteinkonzentration 36

3.6.2 Co-Immunpräzipitation 36

3.6.3 Saccharid-Immunpräzipitation 39

3.6.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 39 3.6.5 Native Gelelektrophorese (Blue Native PAGE) 40

3.6.6 Western Blot Verfahren 43

3.6.7 Coomassie-Färbung 44

3.6.8 Massenspektrometrie: MALDI-TOF 45

3.7 spezielle proteinbiochemische Methoden 47

3.7.1 Herstellung von rekombinantem Galectin-3 47 3.7.2 Herstellung einer Affinitätssäule mit rekombinantem Galectin-3 48 3.7.3 Laktose-abhängige Aufreinigung von Interaktionspartnern über eine

Galectin-3-Affinitätssäule 49

3.7.4 Glycerol Gradient 50

3.8 Fluoreszenzmikroskopische Methoden 51

3.8.1 Vorbereiten der Zellen mit Immunfluoreszenz-Markierung 51

3.8.2 Proximity Ligation Assay 52

3.8.3 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 54 3.8.4 konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (KLSM) 55 3.8.5 Quantifizierung PLA 56 3.8.6 Quantifizierung FISH 56 3.9 Statistik 56

4

Ergebnisse

4.1 Galectin-3 interagiert mit der Spleißkomponente hnRNPA2B1 57 4.1.1 hnRNPA2B1 immunpräzipitiert gemeinsam mit Galectin-3 57 4.1.2 hnRNPA2B1 kolokalisiert mit Galectin-3 in vivo 60

4.1.3 Galectin-3 und hnRNPA2B1 befinden sich im selben Komplex 62 4.1.4 Galectin-3 scheint keine Affinität für N-Acetylglucosamin zu besitzen 64 4.2 Galectin-3 interagiert mit weiteren Spleißosomkomponenten im Zellkern 65 4.2.1 Galectin-3 interagiert mit U2AF65 in vitro 69 4.2.2 Galectin-3 kolokalisiert mit U2AF65 in vivo 71 4.2.3 Galectin-3 und U2AF35 scheinen sich in einem Abstand ≥ 40 nm

voneinander entfernt zu befinden 73

4.2.4 Galectin-3 scheint weiter als 40 nm vom U2 snRNP SAP155 entfernt

zu sein 76

4.2.5 Galectin-3 interagiert mit U1 70k 78

4.2.6 Galectin-3 kolokalisiert mit Speckles in verschiedenen Zelllinien 80 4.3 Galectin-3/Galectin-1 und hnRNPA2B1 sind an der Prozessierung von mRNA

beteiligt 82

4.3.1 Die Verminderung von hnRNPA2B1 führt zur Akkumulation von mRNA

im Zellkern 82

4.3.2 Der Doppel-knockdown von Galectin-1 und Galectin-3 führt zu einer

Akkumulation von mRNA im Zellkern 84

4.4 RNA-Sequenzierung 87

4.5 Die Analyse der Bindung der Galectin-3-Interaktionspartner untereinander 94 4.5.1 hnRNPA2B1 präzipitiert gemeinsam mit U2AF65 und U1 70k 94 4.5.2 Die untersuchten Spleißkomponenten befinden sich in einem

Maximalabstand von 40 nm zueinander 96

5

Diskussion

5.1 Galectin-3 interagiert mit Komponenten des Spleißosoms 99 5.1.1 Galectin-3 kolokalisiert mit dem Speckles-Marker Sc35 und ist selbst

eine Komponente des Spleißosoms 99

5.1.2 Galectin-3 interagiert mit hnRNPA2B1 im Zellkern 99 5.1.3 Galectin-3 interagiert mit U2AF65, aber nicht mit dessen

direkten Bindepartnern 101

5.1.4 Galectin-3 interagiert mit U1 70k 103

5.1.5 Galectin-3 im E/A-Komplex des Spleißosoms 103 5.2 Galectin-3 und Galectin-1 sind an der Prozessierung der mRNA beteiligt 106

5.3 Die Spleißkomponenten hnRNPA2B1, U2AF65 und U1 70k interagieren

untereinander 107

5.4 Galectin-3 und seine Rolle im Spleißen der pre-mRNA 108

5.5 Ausblick 110

6

Literaturverzeichnis

7

Anhang

7.1 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 132

7.2 Abkürzungsverzeichnis 134

7.3 Publikationen 137

7.4 Verzeichnis der akademischen Lehrer 137

1

1 Zusammenfassung

Galectin-3 ist ein Vertreter der Galectine, welche durch ihre Bindungsaffinität an β-Galactoside ge-kennzeichnet sind. Speziell Galectin-3 ist durch seinen chimären Aufbau, bestehend aus N-terminaler Oligomerisierungsdomäne, der C-terminalen Kohlenhydrat-Binderegion, und seinem ubiquitären Vor-kommen im adulten Gewebe gekennzeichnet. Abhängig vom Zelltyp oder dem Proliferationsstadium ist es vermehrt extrazellulär, im Zytoplasma oder im Zellkern zu finden. Diese diffuse Verteilung führt auch zu einer Vielzahl an Funktionen für Galectin-3, die bisher noch nicht ausreichend aufgeklärt sind. Die subzelluläre Verteilung ist auch in verschiedenen Tumorvarianten sehr unterschiedlich. In Zellen des klarzelligen Nierentumors wird das Lektin verstärkt in den Zellkern transportiert. Basierend auf dieser Beobachtung stellte sich die Frage nach möglichen Galectin-3-Interaktionspartnern im Zellkern und der Funktion dieser Interaktion.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst hnRNPA2B1 als Interaktionspartner von Galectin-3 identifi-ziert. Es konnte mittels biochemischer Methoden nachgewiesen werden, dass diese Interaktion Lak-tose-abhängig und RNA-unabhängig ist. Außerdem wurde die Interaktion mit Hilfe des Proximity

Liga-tion Assay bestätigt. Weitere mikroskopische Untersuchungen zeigten nukleäre KolokalisaLiga-tionen in

punktförmigen Strukturen. Anhand einer Affinitätschromatographie konnte nicht nur die Interaktion zum hnRNPA2B1 identifiziert werden, es wurden auch weitere Interaktionspartner von Galectin-3 ge-funden, wie die Spleißkomponenten U2AF65 oder U1 70k.

In zusätzlichen Experimenten konnte gezeigt werden, dass Galectin-3 an der Prozessierung von mRNA beteiligt ist, da es nach gemeinsamer Depletion von Galectin-3 und Galectin-1 zur Akkumulation von mRNA im Zellkern kam. Darüber hinaus wurde durch RNA-Sequenzierung nach Galectin-3 knockdown demonstriert, dass das Lektin das alternative Spleißen einzelner Gene beeinflusst. Diese Beobachtun-gen werden durch die hier identifizierten Galectin-3-Interaktionspartner unterstützt, da es sich dabei um Komponenten des alternativen Spleißapparates handelt.

2

1 Summary

Galectin-3 is a member of the galectin family, which is characterized by its binding affinity to β-galac-tosides. Galectin-3 contains a chimeric structure composed of an N-terminal oligomerization domain and a C-terminal carbohydrate recognition domain. The protein is also characterized by its ubiquitious distribution in adult tissues. Depending on cell type and proliferation state, galectin-3 can accumulate in the extracellular milieu, in the cytoplasm or in the nucleus. This diffuse distribution leads to a mul-tiplicity of functions for galectin-3 which are until now not clarified. The subcellular distribution is also diverse in various kinds of cancer cells. Renal clear cell carcinoma cells show an increased transport of the lectin into the nucleus. Based on these observations questions about putative nuclear interaction partners of galectin-3 and the function of these interactions arise.

In this work the heterogeneous ribonucleoprotein hnRNPA2B1 was identified as an interaction partner of galectin-3. Biochemical methods reveal that the interaction between hnRNPA2B1 and galectin-3 is RNA-independent but lactose-dependent. Moreover subcellular interaction of the two binding part-ners was confirmed by using the proximity ligation assay. Fluorescence microscopic analysis showed colocalizations in dot-like structures. Additional interaction partners of galectin-3, like the spliceoso-mal components U2AF65 or U1 70k, were found by affinity chromatography.

Further experiments showed an involvement of galectin-3 in mRNA processing and nuclear exit, since mRNA accumulated in the nucleus following a combined depletion of galectin-3 and galectin-1. RNA-sequencing then demonstrated that depletion of galectin-3 affected alternative splicing of several genes. These observations were supported by the identity of galectin-3 interaction partners identified in this work, which are all components of the alternative splicing machinery.

3

2 Einleitung

2.1 Das pre-mRNA Spleißen

2.1.1 pre-mRNA Spleißen, Introns und Exons

Die Transkription der genetischen Information von der DNA zur Vorläufer-mRNA (precursor messenger RNA - pre-mRNA) ist der erste Schritt in der Genexpression eukaryotischer Zellen. Die pre-mRNA be-steht zum größten Teil aus nicht-kodierenden Sequenzen, den Introns. Diese Introns werden auf dem Weg zur mRNA aus dem Transkript durch einen Prozess namens Spleißen entfernt (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)). Das Spleißen erfolgt in großen molekularen Maschinen von mehreren Mega-Dalton, den Spleißosomen. Diese bestehen aus verschiedenen Untereinheiten aus stabilen RNA-Molekülen in Assoziation mit vielen Proteinen. Die Untereinheiten sind Uridin-reiche small nuclear

ribonucleoproteins (snRNPs) zusammen mit nicht-snRNP Proteinfaktoren, welche zur Identifizierung

der Intron-Enden, gefolgt vom Zusammenbau eines aktiven Spleißosoms zur Katalyse der Intron-Ent-fernung fungieren (Burge et al. 1999; Staley und Guthrie 1998). Der spleißosomale Zusammenbau, die Aktivierung und der Abbau involviert ebenfalls viele ATP-abhängige Konformationsänderungen unter-stützt durch die DExD/H-Box RNA Helikasen (zusammengefasst in (Zhang et al. 2013)). Man unterschei-det zwischen zwei Spleißosom-Arten, zum einen gibt es das U2-abhängige Spleißosom, welches das am häufigsten vorkommende Spleißosom ist und zuständig ist für das Spleißen von U2-Typ Introns (siehe unten). Und zum anderen gibt es das selten vorkommende U12-abhängige Spleißosom, welches die U12-Typ Introns spleißt (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)). Ein humanes Gen besitzt typischerweise kurze Exons (50 – 250 bp) und lange Introns (> 100 bp), d.h. dass die Introns insgesamt mehr als 90 % des pre-mRNA-Transkripts einnehmen (zusammengefasst in (Wang und Burge 2008)). Introns werden anhand bestimmter Merkmale definiert, dazu zählen die konservierten Sequenzen an der 5‘ und 3‘ Spleißseite (ss), das Verzweigungsstellenadenosin (branch site adenosine, BS), sowie der Polypyrimidintrakt (eine Pyrimidinreiche Region) (Abb. 2-1) Die BS ist dabei der 3‘ ss um 18 – 40 Nuk-leotide vorgelagert und in höheren Eukaryoten folgt darauf der Polypyrimidintrakt (PPT) (Abb. 2-1). Die Spleißseiten und die BS unterscheiden sich in den U2- und U12-Typ Introns (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)) (Abb. 2-1), U12-Typ Introns zum Beispiel besitzen AT-AC Termini, anstelle von GT-AG Termini bei U2-Typ Introns. Im humanen System wurden ca. 300 Gene mit U12-Typ Introns identifiziert. Diese Gene sind aus den Bereichen der DNA Replikation und Reparatur; Transkription, RNA Prozessierung und Translation; sowie Organisation des Zytoskeletts, vesikulärer Transport und Ionenkanal-Aktivität (zusammengefasst in (Turunen et al. 2013)).

4 Evolutionär gesehen wird vermutet, dass die Introns Nachfahren der selbst-spleißenden Gruppe-II-Introns sind. Ebenso wie die Gruppe-II-Introns verfügen die Gruppe-II-Gruppe-II-Introns über einen 2-Schritte-Spleißme-chanismus. Auch signifikante Ähnlichkeiten in der Sequenz und der Sekundärstruktur weisen auf die evolutionäre Verwandtschaft hin. Hierzu zählt die U6 snRNA, die als katalytische Einheit sehr große Ähnlichkeit mit dem katalytischen Zentrum der Domäne V der Gruppe-II-Introns aufweist (zusammen-gefasst in (Valadkhan 2010)).

Auf den Introns und Exons sind zusätzlich noch cis-agierende pre-mRNA Elemente mit Spleißverstär-kern (ESE – exon splicing enhancer und ISE – intron splicing enhancer) sowie –hemmern (ESS – exon

splicing silencer und ISS – intron splicing silencer) zu finden. Im Normalfall sind diese Sequenzen sehr

kurz und verschieden. Durch die Bindung regulatorischer Proteine an diese Sequenzen wird das kon-stitutive und alternative Spleißen verändert. Diese regulatorischen Proteine bzw. trans-Faktoren wir-ken entweder stimulierend oder hemmend auf das Spleißosom (zusammengefasst in (Will und Lühr-mann 2011)).

2.1.2 Die Spleißreaktion

Die eigentliche Spleißreaktion sind 2 aufeinanderfolgende Transesterifikationen. Bei der ersten startet die 2’OH-Gruppe des BS-Adenosin einen nukleophilen Angriff auf die Phosphatgruppe am 5‘ ss, dies führt zur Abspaltung des 5‘ Exons und durch die Ligation des 5‘ Ende vom Intron mit dem BS-Adenosin zu einer Lassostruktur im Intron (Abb. 2-2). Die zweite Transesterifikationsreaktion ist gekennzeichnet durch den nukleophilen Angriff der 3’OH-Gruppe vom 5‘ Exon auf die Phosphatgruppe am 3‘ ss (Abb. 2-2). Dadurch kommt es zur Ligation der zwei Exons, also zur mRNA und das Intron wird in Form eines Lassos frei (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)) (Abb. 2-2). Die Introns können im An-schluss degradiert werden. Neben weiteren Entstehungsmöglichkeiten können auch auf diesem Weg die Introns zu nicht kodierenden RNAs werden (snoRNA, lncRNA, circular RNA) und unter anderem die Genexpression regulieren (zusammengefasst in (Yang 2015)).

Untersuchungen in S. cerevisiae zeigten, dass beide Transesterifikationsreaktionen vermutlich durch die U6 snRNA katalysiert werden, indem diese die Metalle (Magnesium) positioniert (Fica et al. 2013).

Abb. 2-1 U2-Typ-Introns und U12-Typ-Introns.

Die Übereinstimmungssequenzen der U2-Typ- und U12-Typ-Introns. Konservierte Sequenzen befinden sich an den 5‘ und 3‘ Spleißseiten sowie an der Verzweigungsstelle (branch site). Y – Pyrimidin, R – Purin, Yn – Polypyrimidintrakt, A – Verzweigungsadenosin. Exons sind als Boxen dargestellt. (Will und Lührmann 2006)

5 Abb. 2-2 Der 2-Schritte Mechanismus des pre-mRNA-Spleißens. (Will und Lührmann 2011)

2.1.3 Der Zusammenbau des Spleißosoms und die U snRNPs

Das pre-mRNA Spleißen wird katalysiert durch eine große molekulare RNP-Maschinerie, dem Spleißo-som (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2006)). Das SpleißoSpleißo-som ist eine dynamische Maschine, deren Komposition nicht statisch ist und deren Struktur während jedes Zykluses des Spleißens mehrere Umgestaltungen durchläuft. Der größte Umgestaltungsschritt hierbei ist während der Transformation vom Komplex B zum aktivierten Spleißosom (zusammengefasst in (Makarov et al. 2002)). Während sich das U2-abhängige

Spleißosom aus U1, U2, U5 und U4/U6 snRNPs mit nicht-snRNP Kom-plexen zusammensetzt, besteht das U12-abhän-gige Spleißosom aus U11, U12, U5 und U4atac/U6atac snRNPs. Die U1, U2 und U5 snRNPs bestehen aus einer snRNA zusammen mit 7 Sm Proteinen (B/B‘, D3, D2, D1, E, F und G) und einer

variab-len Anzahl an spezifischen Proteinen. Die U4/U6 snRNP besteht aus zwei snRNAs (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)). Die snRNAs sind eine Gruppe von reichlich vorkommenden, nicht-ko-dierenden und nicht-polyadenylierten Transkripten im Nukleoplasma. Nach deren Transkription wer-den die snRNAs zunächst ins Zytoplasma exportiert, wo sie zusätzlichen Reifungsprozessen unterzogen

Abb. 2-3 Zusammenbau der Sm-Klasse snRNPs.

Im Anschluß an die Translation werden die snRNAs im Zytoplasma mit den Sm-Proteinen zum snRNP zusammengebaut. Dies erfolgt unter Mithilfe des SMN/Gemin-Komplexes. (Ma-tera und Wang 2014)

6 und anschließend wieder in den Zellkern importiert werden. Der SMN (survival motor neutron) Pro-teinkomplex inklusive der GEMINe reguliert die zytoplasmatische Phase der snRNPs, diese rekrutieren die snRNAs und

kombinie-ren sie mit den 7 Sm Prote-inen (Abb. 2-3). Der Sm-Kern stabilisiert die snRNAs und schützt sie vor Nuklea-sen, außerdem ist er wich-tig für den nukleären Im-port in den Zellkern (zu-sammengefasst in (Matera und Wang 2014)). Die U1 snRNP zum Beispiel be-steht aus 4 Stammschleifen

(I – IV). Die Sm Proteine bilden einen heptameren Ring um die snRNA, wobei jedes Sm-Protein dabei ein Nukleotid der U snRNA kontaktiert (Abb. 2-4). Die assoziierten Proteine sind U1 70k, C und U1-A. Der N-Terminus von U1 70k und der C-Terminus von SmD3 erstellen eine Bindetasche für U1-C (Abb. 2-4). U1-C stabilisiert die Interaktion der Basenpaarung von U1 snRNA mit der 5‘ Spleißseite.

Die pre-mRNA zusammen mit der snRNA können sich nicht selbst in eine katalytisch aktive Struktur umbauen, dazu sind die spleißosomalen Proteine notwendig. Diese Proteine sind essentiell für die Er-kennung und Paarung von Spleißseiten, außerdem vermitteln sie RNA-RNA-, RNA-Protein- und Pro-tein-Protein-Interaktionen und sie positionieren die pre-mRNA für die Katalyse. Insgesamt sind mehr als 170 Proteine am Zusammenbau des Spleißosoms und am Spleißen beteiligt, dabei kommt es zum größten Proteinwechsel zwischen dem Zusammenbau und der Katalyse. Einige Proteine sind nur locker mit dem Spleißosom assoziiert und/oder haben nur redundante Funktionen, daher sind sie nicht für jedes pre-mRNA-Substrat notwendig (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)).

Noch während der Transkription lagern sich hnRNP Proteine um die pre-mRNA und bilden den H-Kom-plex (Das et al. 2000). Dann folgt der Zusammenbau des Spleißosoms mit der Erkennung und Bindung der 5’ss durch die U1 snRNP über Basenpaarung. Weiterhin erfolgt die Interaktion der nicht-snRNP Proteine SF1 und U2AF mit dem PPT und der 3’ss, wobei das SF1/BBP die BS und U2AF65 den Polypy-rimidintrakt bindet. SF1/BBP und U2AF65 interagieren miteinander während der Erkennung und Bin-dung. Außerdem bindet U2AF35 die AG-Dinukleotide der 3‘ss. Diese Formation bildet den E-Komplex. Im A-Komplex kommt es zur Assoziation von U2 snRNP mit der BS über Basenpaarung und unter ATP-Verbrauch, wobei sich das Adenosin vorwölbt und bereit ist für den nukleophilen Angriff während der ersten Transesterifikationsreaktion. Die Basenpaarung zwischen der BS und der U2 snRNP wird durch

Abb. 2-4 Aufbau der U1 snRNP.

Links: Strukturdiagramm der U1 snRNP mit den Sm-Proteinen, U1 70k und U1-C. Die Stammschleifen 1, 3 und 4 sowie das 5‘ Ende sind angedeutet in grau. Mitte: Strukturdi-agramm der Sm-Proteine und 7 Nukleotide der RNA. Rechts: Interaktion der U1 snRNA mit der 5‘ Spleißseite der pre-mRNA. (Will und Lührmann 2011)

7 die U2 snRNP assoziierten Proteine SF3a und SF3b sowie durch die Bindung mit U2AF65 stabilisiert, dadurch dissoziiert SF1/BBP. U2

snRNP positioniert sich schon im E-Komplex in der Nähe von der U1 snRNP und die räumliche Or-ganisation ändert sich beim Übergang von E-Komplex zum A-Komplex nur sehr wenig (zusam-mengefasst in (Will und Lühr-mann 2011) und (Wahl et al. 2009)). Die U4/U6 und U5 snRNPs bilden zuvor einen tri-snRNP-Komplex und interagie-ren daraufhin mit dem Spleißosom, dies bildet den B-Komplex. Im B-Komplex kommt es zu Umgestaltungen in RNA-RNA- und RNA-Protein-Interaktionen und dies führt zur Destabilisierung der U1 snRNP und der Basenpaarung der U4 snRNP mit der U6 snRNP und es kommt zur Dissoziation von U4 snRNP. Dadurch entsteht der ak-tive B*-Komplex, indem die U6 snRNP mit 5’ss eine Basenpaa-rung eingeht, welches zur Disso-ziation von U1 snRNP führt. Dies ist Ort der ersten Transesterifi-kationsreaktion. Durch die Ba-senpaarung zwischen U6 und U2 snRNP kommen die BS und die 5’ss zusammen. Die U5 snRNP

8 in der Nähe der 5’ss. Der C-Komplex schließt sich an und ist Ort der zweiten Transesterifikationsreak-tion. Nach Abschluss der Transesterifikationen und der Ligation der Exons sowie Freilassung der Int-rons löst sich das Spleißosom wieder auf und die Bestandteile nehmen wieder an einer neuen Spleiß-runde teil (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)). Alle Schritte während des Zusammenbaus des Spleißosoms inklusive der katalytischen Spleißschritte sind reversibel (zusammengefasst in (Ma-tera und Wang 2014)). Der Zusammenbau des Spleißosoms findet durch geordnete In(Ma-teraktionen der spleißosomalen snRNPs und vieler anderer Spleißfaktoren statt. Es wurden aber auch Spleißosomen gefunden, die sich in Abwesenheit von pre-mRNA zusammenbauen und erst durch die Anwesenheit von pre-mRNA aktiviert werden (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)).

2.1.4 Das alternative Spleißen

Alternatives Spleißen ist vorherrschend in Eukaryoten zu finden und durch diesen Prozess wird es mög-lich aus einem Gen mehrere Proteinisoformen herzustellen. Gleichzeitig dient es als quantitative Gen-kontrolle, indem unbrauchbare mRNA als nonsense mediated decay markiert wird (zusammengefasst in (Matlin et al. 2005)). Durch das alternative Spleißen können Exons übersprungen oder einbezogen werden. Durch Änderungen der 5’ss oder 3’ss können Exons verlängert oder verkürzt werden. Ebenso können auch Introns einbezogen oder übersprungen werden (Ast 2004; Black 2003). Die Effekte auf das entsprechende Protein sind sehr verschieden, es kann zum Beispiel zu einer Proteinisoform führen, die eine andere Funktion ausübt oder eine veränderte subzelluläre Lokalisation aufweist. Zu dem kön-nen auch Änderungen in der Bindungsspezifität auftreten (Black 2000). Aufgrund der Häufigkeit der alternativen Spleißevents ist diese Variante eher eine Regel als eine Ausnahme, da mehr als 50 % der humanen Gene alternativ gespleißt werden.

Der alternative Spleißvorgang wird durch regulatorische Elemente, den Verstärkern (Enhancer) und Hemmern (Silencer), reguliert. Diese Regulation ist spezifisch für jeden Zelltyp, Entwicklungsstadium und Signalweg. Während des Spleißens sind vor allem der H-, E- und A-Komplex Orte fürs alternative Spleißen. Die Regulatoren sind cis- Elemente bestehend aus Sequenzen der pre-mRNA. Man unter-scheidet bei den cis- agierenden Faktoren zwischen positiven und negativen Regulatoren. Die

Enhan-cer (ESE) sind Purinreiche und Adenosin/Cytosin-reiche Sequenzen, die ca. 6 – 8 Nukleotide kurz sind

(Smith et al. 2006). Sie vermitteln ihre regulatorischen Funktionen über die Rekrutierung von trans-agierenden Faktoren, welches meistens Mitglieder der SR-Proteinfamilie sind (Abb. 2-6) (Wang und Burge 2008). SR-Proteine können so die 3‘ oder 5‘ Spleißseite aktivieren und unter Anderem den Spleißfaktor U2AF65 zum Polypyrimidintrakt rekrutieren (zusammengefasst in (Matlin et al. 2005)). Die Silencer (ESS) sind eine weitere Klasse von regulierenden Spleißsequenzen. Diese interagieren mit den hnRNPs, was dazu führt, dass Exons, Spleißseiten oder Enhancer nicht mehr erreichbar sind (Abb.

9 2-6) (zusammengefasst in (Matlin et al. 2005)). Auch auf den Introns gibt es diese regulatorischen Spleißelemente (ISE und ISS) (Abb. 2-6) (Yeo et al. 2007).

Abb. 2-6 Reguliertes Spleißen.

Exons sind als Boxen und Introns als gezackte Linien dargestellt. Zwei alternative Spleißwege, indem das mittlere Exon ent-weder eingeschlossen oder entfernt wird (gestrichelte Linien). Spleißen wird durch die cis-Elemente (ESE, ESS, ISS, ISE) und trans-agierende Spleißfaktoren (SR Proteine, hnRNPs) reguliert. (Wang und Burge 2008)

2.1.5 Erkrankungen

Fehler beim pre-mRNA Spleißen bilden die Basis vieler humaner Erkrankungen (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)). So kann es durch Fehler im Spleißen zu folgenden humanen genetischen Erkrankungen kommen: Retinitis pigmentosa, Wirbelsäulen-Muskelatrophie und Myotone Dystrophie. Auch Veränderungen im alternativen Spleißen können zu Erkrankungen führen, dazu gehören vor al-lem der neoplastische Umbau und die Metastasierung von Tumoren (zusammengefasst in (Zhang et

al. 2013)). Das Spleißen kann durch erbliche Krankheitsallele verändert werden, indem Spleißelemente

unterbrochen, toxische RNA hergestellt oder Spleißfaktoren beeinflusst werden. Es kann aber auch durch Änderungen in den cis-Sequenzelementen und trans-agierenden RNA-Bindeproteinen zu Ver-änderungen im Spleißen kommen (zusammengefasst in (Fredericks et al. 2015)). Progerie, einige For-men des Brusttumors oder zystische Fibrose, gehen auf Punktmutationen zurück, die das Spleißen so beeinflussen, dass Spleißseiten abgeschwächt oder zerstört werden, aber auch indem kryptische Spleißseiten entstehen. Dies führt zu nonsense mediated decay oder zu fehlerhaften Proteinen (zu-sammengefasst in (Chabot und Shkreta 2016)). Andere Erkrankungen wie die chronische lymphozysti-sche Leukämie und Myelodysplasie entstehen durch Mutationen in SF3B1 und U2AF35 bzw. U2 snRNP-assoziierten Proteinen. Bei spinaler Muskelatrophie ist ein reduzierter SMN-Proteinlevel vorhanden und bei der Retinitis pigmentosa sind Mutationen in spleißosomalen Proteinen wie zum Beispiel dem Brr2 zu finden (zusammengefasst in (Matera und Wang 2014)).

10

2.2 Die Spleißkomponenten hnRNPA2B1, U2AF65 und U1 70k

2.2.1 hnRNPA2B1

Das heterogene nukleäre Ribonukleoprotein A2B1 (hnRNPA2B1) zählt zur Untergruppe der hnRNP A/B Proteinen der hnRNPs. Die hnRNPs sind eine Familie von Proteinen bestehend aus ca. 20 Polypeptiden, von hnRNPA1 (34 kDa) bis hnRNPU (120 kDa), und es sind die am häufigsten vorkommenden Kompo-nenten des Zellkerns (Dreyfuss et al. 1993; Dreyfuss et al. 2002; Pinol-Roma et al. 1988). Diese Proteine sind RNA-Bindeproteine, die Komplexe mit Polymerase II-Transkripten bilden. Dabei startet die Asso-ziation mit der RNA wenn die frei werdende pre-mRNA aus der RNA Polymerase II Transkriptionsma-schinerie austritt und bleibt während der Prozessierung sowie dem Export der mRNA bestehen (Dreyfuss et al. 1993). Währenddessen ist ihre Konstellation auf der mRNA dynamisch und abhängig von bestimmten Faktoren, wie die mRNA-Sequenz und das Repertoire an hnRNP Proteinen im Zellkern während der Transkription. Durch die Bindung an die mRNA beeinflussen sie die Struktur und die In-teraktion der pre-mRNA, und dies wiederrum beeinflusst das Schicksal sowie die Prozessierung der pre-mRNA (zusammengefasst in (Dreyfuss et al. 2002)). Man findet sie im Nukleoplasma und im Zyto-plasma, jedoch sind sie nicht in Nucleoli zu finden (Pinol-Roma 1997). Einige der hnRNP Proteine pen-deln zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma (hnRNPA1 und K), während andere ausschließlich im Zellkern verbleiben (hnRNPC1/C2 und hnRNPU) (Pinol-Roma und Dreyfuss 1992). Die meisten hnRNP Proteine bestehen aus einem oder mehreren RNA-Bindemotiven, dazu zählen die RNA-Bindedomänen (RBD oder RRM), die hnRNPK (KH)-Domänen und die Arginin/Glycin-reichen Boxen (RGG-Boxen). Ihre Struktur ist dabei bausteinartig aufgebaut, d.h. zu den RNA-Bindemotiven kommen noch ein oder mehrere Domänen, die die Protein-Protein-Interaktionen vermitteln um regulatorische Proteine zur pre-mRNA zu rekrutieren und dessen Lokalisation in der Zelle festzulegen. Die hnRNP Proteine besit-zen eine Vielzahl an Funktionen, dazu gehören die Regulation der Transkription, die DNA-Replikation, die Biogenese der Telomere, die Genrekombination der Immunglobuline sowie die Prozessierung der pre-ribosomalen RNA und des 3‘-Endes. Außerdem sind sie am konstitutiven und alternativen Splei-ßen, dem Transport, der Lokalisation, der Translation und der Stabilität der mRNA beteiligt (zusam-mengefasst in (Dreyfuss et al. 2002) und (He und Smith 2009)).

Die Untergruppe hnRNP A/B setzt sich aus den Proteinen A0, A1, A2, A3, AB, B1 und B2 zusammen, welche sich in einem Größenradius von 34 – 39 kDa befinden. Alle Proteine dieser Untergruppe sind Glycin-reiche Proteine (zusammengefasst in (He und Smith 2009); (Kumar et al. 1986; Leser et al. 1984; Wilk et al. 1985)) und evolutionär gesehen stammen sie von einem einzigen RNA-Bindeprotein ab, wobei sie durch Genduplikation entstanden sind (zusammengefasst in (He und Smith 2009)). Zusam-men mit den hnRNP C1/C2 bilden sie die Kern-Proteine der HeLa 40S Ribonucleoprotein Partikel. Diese bestehen aus mehreren Kopien von den 6 Proteinen A1, A2, B1, B2, C1 und C2 (Beyer et al. 1977). Die Proteine A1, C1 und C2 sitzen in diesen Partikeln peripher, während A2, B1 und B2 intern positioniert

11 sind und als Tetramere (A2)3(B1) oder Pentamere (A2)3(B1)(B2) vorliegen (Lothstein et al. 1985). Die

monomeren 40S hnRNP Partikel verpacken 700 ± 20 Nukleotide der pre-mRNA (Pullman und Martin 1983; Wilk et al. 1983).

Das hnRNPA2B1 umfasst zwei Isoformen, die identisch bis auf eine Insertion von 12 Aminosäuren bei B1 in der Nähe des

N-Termi-nus sind (Abb. 2-7) (Burd et

al. 1989). Daher werden

beide Isoformen gleich be-handelt und zu einem Pro-tein zusammengefasst. Strukturell gesehen besteht hnRNPA2B1 aus zwei RNA-Bindedomänen (RRM – RNA

recognition motif) und einer

weniger konservierten Glycin-reichen Domäne (Abb. 2-7) (Dreyfuss et al. 1993). Das hnRNPA2B1 wird kodiert durch das A2-Gen auf Chromosom 7p15, welches aus 12 Exons besteht und durch alternatives Spleißen entstehen die Isoformen A2 und B1 (Burd et al. 1989). Beim Vergleich mit dem A1-Gen konnte gezeigt werden, dass die Intron-Exon-Organisation identisch ist und dies könnte auf einen gemeinsa-men Ursprung durch Genduplikation zurückzuführen sein (Biamonti et al. 1994). Außerdem weist hnRNPA2B1 eine hohe Sequenzähnlichkeit zu hnRNPA1 auf (Kumar et al. 1986; Wilk et al. 1985), dabei zeigte sich, dass die RNA-Bindedomäne beider Proteine zu 80 % identisch ist und auch der C-terminale Glycin-reiche Bereich hoch konserviert ist (Burd et al. 1989).

Die Funktionen von hnRNPA2B1 liegen im Spleißen und im mRNA Transport (Burd und Dreyfuss 1994; Krecic und Swanson 1999; Mayeda et al. 1994; Pinol-Roma und Dreyfuss 1992). Außerdem ist es wich-tig für die Zellproliferation und Differenzierung, den Glukosetransport sowie die Aufrechterhaltung der Telomerlänge (Ainger et al. 1997; Camacho-Vanegas et al. 1997; Minoo et al. 1989). Die hnRNP A/B Proteine sind zentrale Komponenten des alternativen Spleißens. So kann zum Beispiel hnRNPA1 mit den ESS und den ISS assoziieren und auf diesem Weg die 3’ Spleißseite inhibieren oder die Verwendung fernerer 5’ Spleißseiten beeinflussen (Abb. 2-8). Durch die Bindung der ISS kann es die Assoziation von U2snRNP mit der pre-mRNA verhindern und somit den Zusammenbau des Spleißosoms inhibieren (Abb. 2-8). Das hnRNPA2B1 scheint während des alternativen Spleißens ähnlich wie hnRNPA1 zu agie-ren und scheint noch effektiver im Wechsel der Spleißseiten zu sein (zusammengefasst in (He und Smith 2009)). HnRNPA2B1 vermittelt den Tumorzell-Phänotyp über alternatives Spleißen, indem es an

cis-agierende Sequenzen, die 3‘-UTR mRNA von einigen tumorrelevanten Genen bindet (Stockley et al. 2014). Hierzu zählen Schlüsseltranskripte, die in die Onkogenese, den Tumorstoffwechsel und die

Abb. 2-7 Struktur und Isoformen von hnRNPA2B1.

Die RNA-Erkennungsmotive (RRM) sind als hellblaue Kästchen und die Glycin-reiche Re-gion als gelbes Kästchen dargestellt. Das dunkelblaue Kästchen steht für die RGG-Box. E – Exon, i – Intron, nt – Nukleotide, UTR – untranslated region. (He und Smith 2009)

12 invasive Zellmigration involviert sind (David et al. 2010; Golan-Gerstl et al. 2011; Moran-Jones et al. 2009). Hinsichtlich der Tumorbiologie dient das hnRNPA2B1 aufgrund seiner Überexpression auch als früher Marker für die Detektion von Lungen- und Pankreastumoren (Satoh et al. 2000; Snead et al. 2003; Sueoka et al. 1999; Yaginuma und Westphal 1992; Yan-Sanders et al. 2002; Zhou et al. 1996). Ebenfalls ist es in Tumoren der Brust, der Leber und des Magen-Darm-Traktes überexpremiert (Lee et

al. 2005; Lee et al. 2003; Yan-Sanders et al. 2002; Zhou et al. 2001). Die Gruppe um Golan-Gerstl konnte

2011 zeigen, dass hnRNPA2B1 auch als prognostischer Marker für Glioblastome verwendet werden kann, da das Protein hier ebenso überexpremiert wird. Dabei wurde gezeigt, dass hnRNPA2B1 das alternative Spleißen des Tumor-Suppressors BIN1, WWOX, sowie der anti-apoptotischen Proteine c-FLIP und Caspase-9B in den Glioblastomzellen verändert, indem es die Expression der onkogeneti-schen Isoformen verstärkt (Golan-Gerstl et al. 2011).

Abb. 2-8 hnRNP A/B Proteine im alternativen Spleißen. Oben: Bindung von hnRNP A/B Proteinen an die ESS führt zum Zusammenbau weiterer hnRNP A/B Proteine entlang der Int-ron-Exon-Verbindung und limitiert die Zugänglichkeit der ESS im Spleißosom. Unten: Das Spleißen wird durch hnRNP A/B Proteine unterdrückt, welche mit der BPS assoziieren und so den Zugang für die U2 snRNP blockieren. A/B – hnRNP A/B Proteine, BPS – branchpoint sequence, SR – SR Proteine, Py- Polypyrimidintrakt, ESE – exon splicing enhancer, ESS – exon splicing silencer, ss – Spleißseite, A1 – hnRNPA1. (He und Smith 2009)

13

2.2.2 U1 snRNP und U1 70k

Die U1 snRNA ist eine der am häufigsten vorkommenden nicht-kodierenden RNAs in humanen Zellen (zusammengefasst in (Guiro und O’Reilly 2015)). Diese snRNA ist am Spleißen von pre-mRNA beteiligt (Maniatis und Reed 1987). Sie besteht aus 164 Nukleotiden und ist assoziiert mit 10 Proteinen, welche zusammen die U1 snRNP bilden (Bringmann und Lührmann 1986). Zu den 10 Proteinen zählen die 7 Sm-Proteine und die 3 spezifischen U1 snRNP Proteine: U1 70k, U1-C und U1-A. (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)). Die U1 snRNA besteht aus 4 Stammschleifen, wobei die Sm-Proteine zwi-schen Stammschleife 3 und 4 sitzen und U1 70k sowie U1-A mit ihren RNA-Bindedomänen an die Stammschleifen 1 und 2

bin-den (Bach et al. 1990; Bring-mann und LührBring-mann 1986; Oubridge et al. 1994; Patton und Pederson 1988; Query

et al. 1989 a; Scherly et al.

1990; Yu et al. 1999). U1-C besitzt keine RNA-Bindedomäne und kann so-mit nicht direkt so-mit der U1 snRNA interagieren. Das Protein gelangt über Pro-tein-Protein-Interaktionen mit U1 70k und SmD3 zur U1 snRNA (zusammengefasst in

(Guiro und O’Reilly 2015)). U1-C stabilisiert die Basenpaarung der U1 snRNA mit der 5‘ Spleißseite (zusammengefasst in (Will und Lührmann 2011)). Dabei sind die Proteine U1-70k und U1-C funktionell voneinander abhängig. Ihre Abhängigkeit kennzeichnet sich zum einen durch die notwendige Anwe-senheit von U1 70k für eine stabile Verbindung von U1-C mit der U1 snRNP (Muto et al. 2004; Nelissen

et al. 1994) und zum anderen stimuliert die Interaktion von U1 70k mit dem Spleißfaktor SF2/ASF die

Bindung der U1 snRNP an die 5’ Spleißseite nur wenn U1-C anwesend ist (Jamison et al. 1995; Kohtz

et al. 1994).

Das U1 70k ist ein RNA-Bindeprotein, dessen Gen auf Chromosom 19q13.3 sitzt und 11 Exons besitzt (Spritz et al. 1990). Es besitzt eine RNA-Bindedomäne, welche spezifisch an die 5‘ Stammschleife (Stammschleife 1) der U1 snRNA bindet (Query et al. 1989 a, b). Außerdem besteht es aus 437 Amino-säuren mit einer langen sich wiederholenden Sequenz zwischen den AminoAmino-säuren 231 und 393 mit 41

Abb. 2-9 Model der humanen U1 snRNP. (Pomeranz Krummel et al. 2009) SL – Stammschleife.

14 % basischen Arginin-Resten und 30 % sauren Aminosäuren, dies ist die Serin/Arginin-reiche Region (Query et al. 1989 a; Spritz et al. 1987; Theissen et al. 1986). Der C-Terminus des Proteins dient als Bindestelle zahlreicher konstitutiver und alternativer Spleißfaktoren (Graveley 2000; Smith und Val-cárcel 2000). Dazu zählt der Spleißfaktor SF2/ASF, er interagiert direkt mit dem U1 70k über seine SR-Domäne (Kohtz et al. 1994), dies verstärkt vermutlich die Erkennung der 5‘ Spleißseite der pre-mRNA durch die U1 snRNA (Cao und Garcia-Blanco 1998). Weiterhin vermittelt die Interaktion den Zusam-menbau des E-Komplexes des Spleißosoms, wobei SF2/ASF mit seiner RNA-Erkennungsdomäne die Bindung von U1 70k zur pre-mRNA überbrückt. Die Erkennung des ESE und die Rekrutierung der U1 snRNP zur 5‘ Spleißseite über Bindung zu U1 70k werden gleichzeitig durch den Spleißfaktor SF2/ASF vermittelt (Cho et al. 2011).

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2.2.3 U2AF65 und U2 snRNP

Der Spleißfaktor U2AF (U2 snRNP auxiliary factor) ist ein Heterodimer, bestehend aus einer 65 und 35 kDa Untereinheit (Abb. 2-10) (Ruskin et al. 1988;

Zamore und Green 1989). Die große Untereinheit U2AF65 besitzt eine N-terminale RS-reiche Do-mäne, eine U2AF35-Interaktionsdomäne und 3 RNA-Bindedomänen (Abb. 2-10). U2AF65 erkennt und bindet den Polypyrimidintrakt an der 3‘ Spleißseite, der hauptsächlich aus Uridinen be-steht (Zamore et al. 1992). Die kleine Untereinheit U2AF35 besteht aus zwei Protein-Protein-Interak-tionsdomänen, wobei eine Region für die Dimeri-sierung mit dem U2AF65 zuständig ist und zusätz-lich gibt es eine SR-Domäne (Abb. 2-10) (Zhang et

al. 1992). U2AF35 formt möglicherweise eine

Brü-cke zwischen dem U2AF65 und der 3‘ Spleißseite (Wu und Maniatis 1993) und außerdem verstärkt es somit die Aktivität von U2AF65 (Zuo und Mani-atis 1996). Zusätzlich interagiert U2AF35 mit den AG-Dinukleotiden der 3‘ Spleißseite (Merendino

et al. 1999; Wu et al. 1999; Zorio und Blumenthal

1999). Zunächst bindet das Heterodimer U2AF die pre-mRNA als Komplex mit einem dritten Protein, dem Spleißfaktor SF1 (Abovich und Rosbash

1997). Das SF1 erkennt und bindet die branchpoint Sequenz, und parallel zur Bindung des SF1/U2AF-Komplex an die Erkennungssequenzen, assoziiert die U1 snRNP mit der 5‘ Spleißseite. Diese Formation bringt die BS, 5‘ Spleißseite und 3‘ Spleißseite zusammen in eine strukturierte Konformation (Kent und MacMillan 2002; Kent et al. 2003). Im folgenden Schritt formt die U2 snRNP einen ATP-abhängigien Komplex mit der BS und U2AF, wobei SF1 den Komplex verlässt und das U2AF65 mit dem U2 snRNP Protein SAP155 (SF3b155) interagiert (Abb. 2-11) (Gozani et al. 1998). Für die stabile Assoziation be-nötigt die U2 snRNP die N-terminale RS-Domäne des U2AF65 und das Enzym UAP56, zum Entwinden der RNA (Fleckner et al. 1997; Shen und Green 2004; Valcárcel et al. 1996). Das U2AF wird aus dem Spleißosom durch die U5 snRNP während der B-Komplex-Formation entfernt (Chiara et al. 1997). Die U2 snRNA besteht aus 187 Nukleotiden und bildet 4 Stammschleifen (Burge et al. 1999; Krämer 1996; Will und Lührmann 1997). Im Spleißosom interagiert die aktive U2 snRNA mit der branchpoint Abb. 2-10 Struktur vom U2AF65/U2AF35-Komplex (Kielkopf et al. 2001).

16 Sequenz auf dem Intron über Basenpaarung (Parker et al. 1997; Wu und Manley 1989; Zhuang und Weiner 1989). Die aktive U2 snRNA bildet ein U2 snRNP Partikel, wobei insgesamt 12 U2-spezifische Proteine interagieren und das 17 S U2 snRNP Partikel bilden (Behrens et al. 1993; Will und Lührmann 2001). Zuerst bildet sich ein 12 S U2 snRNP Partikel, dazu gehören die 7 Sm-Proteine und die assoziier-ten Proteine U2-A‘ und U2-B‘‘ (Behrens et al. 1993; Brosi et al. 1993 b). Für das aktive 17 S U2 snRNP kommen noch die SAPs (spliceosome associated protein) 61, 62 und 114, diese bilden die SF3a-Untereinheit, und die SAPs 49, 130, 145 sowie 155, welche zur SF3b-Untereinheit gehören, hinzu (zu-sammengefasst in (Hodges und Beggs 1994); (Brosi et al. 1993 a,b)). Die stabile Bindung von U2 snRNP an die BS ist abhängig von einigen Proteinen wie U2AF, SF3a und SF3b (Brosi et al. 1993 b; Krämer et

al. 1999; Roscigno et al. 1993; Ruskin et al. 1988; Zamore und Green 1989). Somit spielt die U2 snRNP

eine wichtige Rolle während der Anfangsschritte des Zusammenbaus des Spleißosoms und der Forma-tion des A Komplex, aber ebenso formt es zusammen mit der U6 snRNA das aktive Zentrum des Spleißosoms (zusammengefasst in (Burge et al. 1999)).

Abb. 2-11 Molekulare Interaktionen an der Verzweigungsstelle und der 3‘ Spleißseite im spleißosomalen E und A Komplex. Oben: E-Komplex, pre-mRNA wird durch SF1/BBP an der BS gebunden, während der Polypyrimidintrakt und die 3‘ Spleißseite durch U2AF65 sowie U2AF35 gebunden werden. U2AF65 interagiert dabei mit SF1/BBP und U2AF35. Unten: A-Komplex, U2 snRNP bindet an die BS und ersetzt SF1/BBP. U2AF65 interagiert mit SF3b155 (SAP155). Die U2/BS-Basenpaarung wird stabi-lisiert durch Komponenten der U2 snRNP und über die RS-Domäne von U2AF65. BS – branchpoint sequence, RS-Domäne – Arginin/Serin-reiche Domäne, RRM – RNA recognition motif. (Wahl et al. 2009)

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2.3 Galectine

Bei den Galectinen handelt es sich um eine Untergruppe der Lektine, welche durch die Fähigkeit, Sac-charide zu binden, gekennzeichnet sind. Eingeteilt werden die Lektine in folgende vier Klassen, die C-Typ Lektine (inklusive der Selektine), die P-C-Typ Lektine, die Pentraxine und die Galectine (zusammen-gefasst in (Barondes et al. 1994 b)).

Alle Galectine teilen sich zwei Eigenschaften, zum einen ist das die Bindeaffinität für β-Galactoside und zum anderen besitzen alle Galectine konservierte Sequenzelemente bestehend aus ca. 130 Aminosäu-ren in der carbohydrate recognition domain (CRD) (Barondes et al. 1994 a). Insgesamt weist die Gruppe der Galectine 15 Mitglieder auf, die anhand ihrer CRD in drei Untergruppen unterteilt sind (Abb. 2-12). Die erste Gruppe besitzt nur eine CRD und die Proteine dieser Gruppe werden daher als prototypische Galectine bezeichnet. Sie ist mit 9 Mitgliedern auch die größte Untergruppe und folgende Galectine zählen zu dieser Gruppe, Galectin-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 und -15. Die Galectine-4, -6, -8, -9 und -12 bilden die zweite Untergruppe und sind durch 2 homologe CRDs in einer Polypeptid-Kette gekenn-zeichnet. Die zwei CRDs sind durch einen Linker von bis zu 70 Aminosäuren voneinander getrennt und diese Proteine werden als tandem-repeat-type Galectine bezeichnet. Die dritte Untergruppe besitzt nur ein Mitglied, das Galectin-3, und wird als chimärer Typ bezeichnet, da dieses Protein aus einem N-Terminus von ca. 120 Aminosäuren und einer CRD am C-N-Terminus besteht (Cho und Cummings 1997; Cooper 2002).

Jedes der Galectine weist sich durch seine individuelle Kohlenhydrat-Bindepräferenz aus, hierbei un-terscheidet man zwischen bivalent und multivalent. Die prototypischen Galectine bilden Dimere und sind somit bivalent, ebenso wie die tandem-repeat-type Galectine. Da Galectin-3 in der Lage ist Pen-tamere zu bilden, gehört es zu den multivalenten Galectinen (Hirabayashi et al. 2002). Durch die Bin-dung von Glykokonjugaten können die Galectine so geordnete Gebilde in Form von Netzwerken aus-bilden und somit ihren Funktionen nachgehen (Brewer und Fred 2002; Sacchettini et al. 2001). Diese Netzwerkbildung ist abhängig von bestimmten Konditionen wie Konzentration und vorherrschenden Liganden. Prototypische Galectine können als Monomere, Dimere und als höher organisierte Oligo-mere agieren. Auch die tandem-repeat-type Galectine können als MonoOligo-mere auftreten, können aber auch zu höher organisierten Oligomeren assoziieren (zusammengefasst in (Leffler et al. 2004)). Galectine kommen in allen Säugetieren vor, sind aber auch in Vögeln, Amphibien, Fischen, Würmern, Schwämmen und Pilzen zu finden (Hirabayashi 1997). Ihre Expression ist jedoch gewebespezifisch oder wird über das Entwicklungsstadium reguliert. Jeder Organismus exprimiert mehrere Mitglieder der Galectin-Familie, wobei verschiedene Zellen eines Organismus eine unterschiedliche Anzahl an Galec-tinen aufweisen, dennoch besitzen fast alle Zellen mindestens ein Galectin (Cooper und Barondes 1999).

18 Galectine besitzen eine Vielzahl an Funktionen. Zum einen agieren sie extrazellulär über Interaktionen mit der Zelloberfläche und extrazellulären Matrixglykoproteinen sowie Glykolipiden. Und zum anderen fungieren sie auch intrazellulär über Interaktionen mit zytoplasmatischen und nukleären Proteinen (zusammengefasst in (Liu und Rabinovich 2005)).

Abb. 2-12 Einteilung der Galectine

2.3.1 Galectin-3

Galectin-3, auch als Mac-2, CBP-35 oder CBP-30 bezeichnet, ist ein Protein dessen Größe von 26,2 kDa (Mensch) bis 30,3 kDa (Hund) variiert. Co-diert wird es durch das LGALS3-Gen welches auf dem Chromosom 1p13 lokalisiert ist (zusammen-gefasst in (Barondes et al. 1994 b)). Aufgebaut ist Galectin-3 aus zwei verschiedenen Domänen, dem N-Terminus und dem C-Terminus mit der CRD. Der N-Terminus des Polypeptids weist meh-rere interne Sequenzhomologien auf, wobei jede aus sich wiederholenden 9 Aminosäureresten und einer konservierten Sequenz (Prolin-Glycin-Alanin-Tyrosin-Prolin-Glycin-X-X-X) besteht (See-tharaman et al. 1998). Der N-Terminus schließt sich ohne Linker-Sequenz an den C-Terminus

di-rekt an. Der C-Terminus ist gekennzeichnet durch seine CRD, dies ist eine β-Faltblatt-Struktur aus 185 Aminosäuren (Abb. 2-13). Die 6 Stränge der konkaven Seite formen eine Furche für die Bindung von Sacchariden (zusammengefasst in (Leffler et al. 2004)) (Abb. 2-13). Für die Bindung der Glykokonjugate Abb. 2-13 Kristallstruktur der CRD von Galectin-3 mit Laktose In diesem Bild sind die vermutlichen Bindestellen A - D für die Liganden (Laktose) zusammen mit den Wassermolekülen ange-deutet. (Su et al. 2015)

19 sind folgende Aminosäuren verantwortlich: H158, N160, R162, N174, W181, E184 und R186 (Seetha-raman et al. 1998). Beide Domänen sind strukturell und funktionell verschieden (Agrwal et al. 1993). Der N-Terminus weist keine Bindeaffinität für Glykokonjugate auf, aber er ist essentiell für die voll-ständige biologische Aktivität von Galectin-3 (Seetharaman et al. 1998). Er ist vor allem wichtig für die Cluster-Bildung und für die Multimerisierung, sowie für die nicht-klassische Sekretion von Galectin-3 (Massa et al. 1993; Menon und Hughes 1999). Der C-Terminus ist hingegen wichtig für die Bindung von Glykokonjugaten und Bindepartnern. Bei den Glykokonjugaten besitzt Galectin-3 eine große Affi-nität für Laktose und N-Acetyllactosamin (Seetharaman et al. 1998), wobei durch die Bindung von Sac-chariden es zur Konformationsänderung im Protein kommt (Brewer 2002).

Im adulten Organismus ist Galectin-3 in allen Kompartimenten zu finden, es kann im Zytoplasma und im Zellkern vorkommen, aber auch extrazellulär zu finden sein (zusammengefasst in (Dumic et al. 2006)). Es zeigte sich jedoch bei Versuchen mit Mauszellen, dass Galectin-3 im Embryonalstadium lokal begrenzt ist (Fowlis et al. 1995). Auch die intrazelluläre Lokalisation ist abhängig vom Proliferations-stadium der Zelle. Versuche in Fibroblasten konnten zeigen, dass Galectin-3 in nicht-proliferierenden Zellen nur im Zytoplasma detektiert werden konnte, wobei proliferierende Kulturen auch nukleäres Galectin-3 aufwiesen (Moutsatsos et al. 1987). Galectin-3 kann sich zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma hin und her bewegen, hierzu besitzt es ein Importin-α/β- vermitteltes nukleäres Lokalisa-tionssignal und ein Exportin-1-vermitteltes nukleäres Exportsignal. Galectin-3 kann aber auch auf-grund seiner Größe durch Diffusion zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma pendeln (Davidson et

al. 2002; Davidson et al. 2006; Li et al. 2006; Nakahara et al. 2006). Ebenso ist bekannt, dass nur

phos-phoryliertes Galectin-3 den Zellkern verlassen kann (Tsay et al. 1999). Die Phosphorylierung ist die einzige posttranslationale Modifikation die bisher für Galectin-3 beschrieben wurde. Galectin-3 kann in phosphorylierter und unphosphorylierter Form in Zellen vorkommen, dabei können die Serine 6 und 12 phosphoryliert bzw. auch dephosphoryliert werden. Die unphosphorylierte Form ist nur im Zellkern zu finden, während phosphoryliertes Galectin-3 nukleär und zytoplasmatisch lokalisiert ist. Die Phos-phorylierung erfolgt durch die Caseinkinase I und dies führt zu einer reduzierten Bindung von Saccha-riden, kommt es zu einer Dephosphorylierung wird die Bindeaktivität wieder hergestellt. Serin6-Mu-tanten von Galectin-3 zeigten keine anti-apoptotische Wirkung mehr, was auf die Wichtigkeit der Phosphorylierung von Galectin-3 für seine Funktionen hinweist (zusammengefasst in (Barondes et al. 1994 a, b)). Auch die GSK-3β (Glykogen-Synthetase Kinase 3β) kann Galectin-3 phosphorylieren (Shimura et al. 2005). Die Phosphorylierung führt voraussichtlich zu einer Konformationsänderung des Proteins (Mazurek et al. 2000).

20

2.3.1.1 Funktionen von Galectin-3

Aufgrund der diffusen Verteilung von Galectin-3 ist es in der Lage eine Vielzahl von Funktionen auszu-üben. Diese Funktionen werden zum Teil durch die Bildung von Netzwerken ausgeübt. Hierbei ist Ga-lectin-3 aufgrund seiner chimären Struktur in der Lage Pentamere zu bilden, diese Pentamere können mehrere Glykokonjugate binden und auf dieser Weise ein Netzwerk ausbilden. Diese Selbst-Verlinkung ist abhängig vom N-Terminus (zusammengefasst in (Yang et al. 2008)). Auf diese Weise ist Galectin-3 ein wichtiger Modulator der Zelladhäsion, dies erfolgt durch Interaktionen mit Laminin, Fibronectin, Hensin, Elastin, Kollagen IV und Tenascin C sowie R (zusammengefasst in (Dumic et al. 2006)). Die Formation dieser Netzwerke kann aber auch zur Verminderung der Aktivität einiger Rezeptoren führen und daher die Endozytose schwächen (Demetriou et al. 2001; Partridge et al. 2004). Um diese Aktivi-täten auszuüben muss Galectin-3 auch extrazellulär vorkommen, jedoch besitzt das Protein keine Sig-nalsequenz für die klassische Sekretion und wird daher über eine nicht-klassische Sekretion, der Exozy-tose, exportiert (zusammengefasst in (Krzeslak und Lipinska 2004)). In Endosomen kann Galectin-3 auch noch als Sortierrezeptor von Glykoproteinen an der apikalen Seite polarisierter Zellen dienen (Delacour et al. 2006).

Eine der größten intrazellulären Funktionen von Galectin-3 ist seine anti-apoptotische Aktivität (Hsu und Liu 2004; Hsu et al. 2006), welche unter anderem durch die Interaktion mit Bcl-2 (B cell lymphoma 2), einem Apoptose-Repressor, erfolgt (Yang et al. 1996). Ebenso erfolgt diese Funktion über weitere Interaktionen mit CD45, Nucling, Synexin und Alix (zusammengefasst in (Dumic et al. 2006)). Im Zell-kern wird Galectin-3 von der CK1 (Casein Kinase I) phosphoryliert und anschließend ins Zytoplasma exportiert. Dort aktiviert es die Kinasen ERK und JNK (MAPK-Signalweg) und inhibiert somit die Frei-setzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien. Dieser Vorgang verhindert die Aktivierung der Caspasen und somit das Fortschreiten von Apoptose-Vorgängen (Takenaka et al. 2004).

Galectin-3 ist auch involviert in der Regulation des Zellzyklus, wobei es Cyclin E und A herunterreguliert und p21 und p27 sowie Cyclin D hochreguliert. Diese Regulation führt zu einem Arrest der Zelle in der G1-Phase des Zellzyklus (zusammengefasst in (Dumic et al. 2006)).

Durch die direkte Interaktion von 3 mit β-Catenin und die Interaktion mit Axin spielt Galectin-3 auch eine wichtige Rolle in der Regulation des Wnt-Signalwegs (zusammengefasst in (Shimura et al. 2005)). Der Wnt-Signalweg reguliert Zellproliferation, Morphologie, Bewegung, Achsenformation und Organentwicklung (Huelsken et al. 2000; Miller et al. 1999). Das β-Catenin wird von einem Komplex aus APC, Axin und Kinasen phosphoryliert, dies führt zur Ubiquitinierung und zur Degradation (Behrens

et al. 1998; Kikuchi 1999; Kishida et al. 1998). Kommt es zur Dephosphorylierung von β-Catenin führt

dies zur Translokation des Proteins in den Zellkern, wo es den Transkriptionsfaktor Tcf/Lef bindet und somit die Transkription der Wnt Gene (c-myc, Cyclin D1 etc.) stimuliert (Shtutman et al. 1999; Tetsu

21 β-Catenin, und beide Proteine gelangen so in den Zellkern, wo sie die Transkription der Wnt Gene stimulieren (Shimura et al. 2004).

Galectin-3 ist in der Lage die Differenzierung und das Wachstum verschiedener Immunzellen zu beein-flussen und auf diesem Weg Entzündungsreaktionen zu fördern (zusammengefasst in (Yang et al. 2008)). Galect3 beeinflusst die Entzündungszellen durch autokrine und parakrine Mechanismen, in-dem es die Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten vermittelt. Ebenso induziert es die Freigabe von Mediatoren durch Mastzellen und vermittelt die Adhäsion von Neutrophilen an Laminin sowie Endothelzellen. Weiterhin erkennt Galectin-3 Galactosid-enthaltene Glykokonjugate auf Pathogenen mittels seiner CRD und über die N-terminale Domäne erkennt es nicht-Glykanstrukturen und Lipid A, dies ermöglicht die Adhäsion von Pathogenen (zusammengefasst in (Dumic et al. 2006)). Analysen mit Mäusen, denen Galectin-3 fehlt, zeigten Effekte bezüglich des kürzeren Überlebens von Neutrophilen und Makrophagen während Entzündungsreaktionen (Poirier 2002).

Abb. 2-14 Einige extrazelluläre und zytoplasmatische Funktionen von Galectin-3

Rote Pfeile stehen für positive Efekte und blaue Linien für negative Effekte. AKT – Serin/Threonin-Kinase AKT, ERK – extracellular signal-regulated kinase, GTP – Guanosintriphosphat, JNK – c-Jun NH2

-terminal kinase, MEK – mitogen-activated protein/ERK kinase, P – Phosphat, PI3K –

22 Neben diesen zahlreichen zytoplasmatischen Funktionen von Galectin-3, konnten auch einige nukle-äre Funktionen nachgewiesen werden. Dazu zählen die Regulation der Genexpression einzelner Gene (Nakahara und Raz 2007) und seine Rolle im pre-mRNA Spleißen (Dagher et al. 1995).

Anhand von Versuchen in Schilddrüsenzellen wurde gezeigt, dass Galectin-3 die transkriptionale Akti-vität des Transkriptionsfaktor TTF-1 (thyroid-specific transcription factor) hochregulieren kann, dies geschieht über eine direkte Interaktion der beiden Proteine und stimuliert die DNA-Bindeaktivität von TTF-1. Diese positive Regulation führt zu einer verstärkten Proliferation der Zelle (Paron et al. 2003). Im Bezug auf das Spleißen von pre-mRNA konnten mehrere Untersuchungen die Integration von Ga-lectin-3 zeigen. Zum einen zeigten Kolokalisationsstudien die lokale Übereinstimmungen mit dem Spleißosom-Marker Speckles (Laing und Wang 1988). Und zum anderen konnte mit Hilfe von Dichte-gradientenzentrifugationen gezeigt werden, dass Galectin-3 sich in einem Dichtebereich ansiedelt, in dem auch heterogene

nukle-äre Ribonukleoproteine und snRNPs zu finden sind (zusam-mengefasst in (Wang et al. 2004)). Beides sind wichtige Bestandteile des Spleißosoms. Weiterhin führte die Depletion von Galectin-3 zum Arretieren des Zusammenbaus des Spleißosoms im H/E-Komplex und dadurch kam es zu einer fehlenden Spleißaktivität. Dies führte zu der Annahme, dass der Wirkungsort von Galectin-3 im H/E-Komplex liegt (Dag-her et al. 1995; Vyakarnam et

al. 1997). Aber Galectin-3

scheint auch schon im Vorfeld des Zusammenbaus des

Spleißosoms eine Rolle zu spielen. Es interagiert direkt mit Gemin4, einer Komponente des SMN

(sur-vival of motor neuron) Komplex (Park et al. 2001). Diese SMN-Komplexe befinden sich vor allem im

Zytoplasma und sind wichtig für den Zusammenbau der snRNPs und deren Lieferung zum H-Komplex des Spleißosoms (Dietz 1998; Fischer et al. 1997; Matera und Frey 1998; Mattaj 1998; Meister et al. 2000; Pellizzoni et al. 1998).

Abb. 2-15 Einige nukleäre Funktionen von Galectin-3.

Rote Pfeile stehen für positive Effekte und blaue Linien für negative Effekte. SMN-Komplex – survival of motor neuron- SMN-Komplex, Tcf-4 – T-Zell-Faktor 4, TTF-1 – Thy-roid-spezifischer Transkriptionsfaktor.

23 Nach Inkubationen mit Antikörpern gegen Galectin-3 wurden alle 5 U snRNAs copräzipitiert und es wurde vor allem beobachtet, dass Galectin-3 sich hauptsächlich im Komplex mit U1 snRNA befindet und dort mit U1 70k interagiert (Haudek et al. 2009). Haudek et al. konnte somit eine Möglichkeit zeigen, wie Galectin-3 zum Spleißosom gelangt. Möglicherweise vermittelt U1 snRNP die Beladung der pre-mRNA mit Galectin-3 (Haudek et al. 2009), da Galectin-3 nicht direkt mit der pre-mRNA interagiert (Wang et al. 2006).

2.3.1.2 Tumorgenese und Galectin-3

Galectin-3 ist ein wichtiger Faktor in der Tumorgenese, es hat Einfluss auf die Initiierung, das Tumor-wachstum, die Entwicklung und die Metastasierung (Liu und Rabinovich 2005). Die Expression von Ga-lectin-3 ist in den verschiedenen Tumorarten unterschiedlich. So ist das Protein in Tumoren der Schild-drüse, Leber, Magen und des zentralen Nervensystems hochreguliert, während in Tumoren der Brust, der Eierstöcke, des Uterus und der Prostata die Expression von Galectin-3 herabgesetzt ist (zusam-mengefasst in (Haudek et al. 2010)). Neben der unterschiedlichen Expression von Galectin-3 in Tumor-zellen, ist auch die intrazelluläre Verteilung sehr verschieden. In Tumoren der Zunge kommt es zur Translokation von Galectin-3 vom Zellkern ins Zytoplasma während der neoplastischen Entwicklung (Honjo et al. 2000), während es in humanen Tumorzellen des Darms und der Prostata ausschließlich zytoplasmatisch zu finden ist (Lotz et al. 1993). Im Gegensatz dazu findet man Galectin-3 nur im Zell-kern von Tumorzellen des Ösophagus (Shibata et al. 2005).

Es wurde gezeigt, dass die Expression von Galectin-3 notwendig für die Initiierung von transformierten Phänotypen in Tumoren ist. Dies konnte nachgewiesen werden, da Zellkulturen aus Brust- und Schild-drüsentumorzellen ihren transformierten Phänotyp nach der Inhibition von Galectin-3 verlieren (Honjo et al. 2001; Yoshii et al. 2001). Im Gegensatz dazu führte die Zugabe von Galectin-3 cDNA zu normalen Schilddrüsenzellen zu einem transformierten Phänotyp (Takenaka et al. 2003).

Mittels LNCaP-Zellen (Galectin-3 negativen Prostata-Tumorzellen) konnte gezeigt werden, dass Galec-tin-3 in Abhängigkeit von der Lokalisation in der Zelle gegenläufige Aktivitäten ausübt. So wurde für nukleäres Galectin-3 festgestellt, dass es einen großen negativen Einfluss auf die Bösartigkeit von Tu-morzellen besitzt und somit anti-tumorale Funktionen hat. Im Gegensatz dazu weist zytoplasmatisches Galectin-3 Aktivitäten auf, die die Entwicklung von Tumoren stark begünstigen (Califice et al. 2004). Honjo et al. konnten nachweisen, dass in Zungentumorzellen die Expression von zytoplasmatischem Galectin-3 erhöht ist und im Gegensatz dazu die Expression des nukleärem Galectin-3 herabgesetzt ist. Diese Translokation des Galectin-3 vom Zellkern zum Zytoplasma während der Entwicklung von Zun-gentumoren könnte als prognostischer Faktor in der Diagnostik dienen (Honjo et al. 2000). Galectin-3

24 spielt eine Rolle im Wachstum und Entwicklung von Melanomen. So führt eine Verminderung von Ga-lectin-3 zur verminderten Expression von NFAT1 und Autotaxin und dies wiederrum vermindert das Tumorwachstum (Braeuer et al. 2012).

Es wurden auch Mutationen von Galectin-3 in Tumorzellen entdeckt, so vermittelt die Mutante Pro64His eine erhöhte Sensitivität für Rezeptor-vermittelte Apoptose in humanen Brusttumorzellen (Mazurek et al. 2011) und in der Mutante Pro191His wurde eine verstärkte nukleäre Akkumulation von β-Catenin detektiert, welches zur Verstärkung der Magentumore führt (Kim et al. 2011).

Da Galectin-3 ein wichtiger Faktor in der Tumorgenese darstellt, wurden Inhibitoren für Galectin-3 in der Tumortherapie erforscht. Eines dieser kompetitiven Inhibitoren ist das Pectin aus Zitrusfrüchten. Hierzu wurde die Struktur des Pectins mittels pH- und Temperaturbehandlung verändert und somit erhielt man ein modifiziertes Zitruspectin, kurz MCP. Die modifizierte Form bestand nun aus einer kur-zen, unverzweigten, Galaktose-reichen Kohlenhydratkette und dient daher als Ligand von Galectin-3 (Platt und Raz 1992). Es wurde gezeigt, dass MCP homotypische Aggregationen von Tumorzellen, die Angiogenese und die Tumorzell-Aggregation an Endothelzellen in vitro inhibieren kann (Nangia-Mak-ker et al. 2002; Pienta et al. 1995; Platt und Raz 1992). MCP behindert Zell-Zell-Interaktionen welche durch Galectin-3 vermittelt werden und es inhibiert auch die Metastasen, hat aber keinen Einfluss auf die Primärtumore (Pienta et al. 1995). Weiterhin inhibiert MCP die Angiogenese, indem es die Migra-tion und KapillarformaMigra-tion verhindert. Dies geschieht durch die Bindung von Galectin-3 an der Matrix und/oder auf Endothelzellen, oder indem es die Bindung von Galectin-3 an seinen Rezeptor behindert (Nangia-Makker et al. 2002). Intravenöse Injektionen von 0,5 % MCP führten zur Inhibierung experi-mentaler Lungenmetastasen von Melanomzellen (Platt und Raz 1992) und die orale Einnahme inhi-biert die spontane Metastasierung der Prostata-Adenokarzinomzellen von Ratten sowie humanen Brusttumorzellen (Iurisci et al. 2000; Pienta et al. 1995).

Ein weiterer Galectin-3-Antagonist ist GCS-100, ebenfalls ein modifiziertes Zitrusgewächs-Pectin, was auch durch Bindung an Galectin-3 das Tumorwachstum und die Metastasierung inhibiert (zusammen-gefasst in (Vladoiu et al. 2014)).

25

2.4 Fragestellung dieser Arbeit

Nach bisherigen Erkenntnissen ist das Galectin-3 vermehrt im Zellkern verschiedener Zelltypen und Tumorzellen zu finden. Im Zellkern ist Galectin-3 unter anderem an der Transkriptionskontrolle ver-schiedener Gene beteiligt, aber es ist auch eine Komponente des Spleißosoms. Im pre-mRNA Spleißen ist jedoch bisher unbekannt mit welchen weiteren Spleißkomponenten Galectin-3 interagiert. Mit Hilfe einer Affinitätschromatographiestudie und Immunpräzipitationen sowie mikroskopischen Methoden sollen die möglichen Bindepartner von Galectin-3 im Spleißosom analysiert werden.

Weiterhin ist bisher unbekannt welche Funktion Galectin-3 im Spleißosom einnimmt. Mittels Fluores-zenz-in-situ-Hybridisierung und RNA-Sequenzierung soll dieser Fragestellung auf den Grund gegangen werden.

Zusätzlich werden mit mikroskopischen Untersuchungsmethoden auch die Zusammenhänge zwischen einzelnen Spleißkomponenten untereinander und mit Galectin-3 untersucht.

26

3 Material und Methoden

3.1 Geräte, Chemikalien und Materialien

3.1.1 Geräte

Tab. 3-1 Geräte

Gerät

Bezugsquelle

Inkubatoren

Heraeus Brutschrank B6 Kendro, Langenselbold

Inkubator für Zellkultur (CO2-begast) HERA cell Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA

Sterilbank

Sterilbank für Zellkultur HeraSafe Kendro, Langenselbold

Zentrifugen

Allegra X-22R Beckman-Coulter, Fullerton, USA

Avanti™ J-20 XP Beckman-Coulter, Fullerton, USA

Kühlzentrifuge BioFuge fresco Heraeus

Rotofix 32A Hettich Zentrifugen, Tuttlingen

Tischzentrifuge BioFuge pico Heraeus

Ultrazentrifuge

Optima™ LE-80K Beckman-Coulter, Fullerton, USA

Rotoren

JLA16.250 Beckman-Coulter, Fullerton, USA

SW50.1 Beckman-Coulter, Fullerton, USA

SX4250 Beckman-Coulter, Fullerton, USA

Heizgeräte

Heizblock MB-102 Bioer, Hangzhou, China

Heizblock UBD Grant Instruments, Cambridge, UK

Thermomixer comfort Eppendorf, Hamburg

Schüttler

Rotationsschüttler Shaker DOS-10L Neolab, Heidelberg

Überkopfschüttler Reax 2 Heidolph Instruments, Schwabach

SDS-Gelelektrophorese

Elektrophoresekammer Mighty Small II Hoefer, San Francisco, USA Elektrophoresekammer miniVE Hoefer, San Francisco, USA Elektrophoresekammer SE600 Ruby Hoefer, San Francisco, USA

Gießvorrichtung Hoefer, San Francisco, USA

Netzgerät EPS 301 Amersham, Piscataway, USA

Netzgerät EPS 501 Amersham, Piscataway, USA

PerfectBlue™ Vertikales Doppelgelsystem Twin L Peqlap, Erlangen

Platten, „Spacer“, Kämme (8 x 10 cm) Hoefer, San Francisco, USA Platten, „Spacer“, Kämme (20 x 20 cm) Peqlap, Erlangen

Western Blot

Trans-Blot SD semi-dry transfer cell Biorad, Hercules, USA

Mikroskope

Inverses Lichtmikroskop Axiovert 10 Carl Zeiss AG, Oberkochen Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop (KLSM) TCS

SP2 montiert auf Stativ DM IRE2

Leica Microsystems, Wetzlar

Sonstige optische Geräte

27 Chemilumineszenz/ ECL Imager Intas, Göttingen

Mikroplatten-Leser Infinite M200 Tecan, Männedorf, Schweiz

Nanodrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA

Zellzähler Countess™ Invitrogen™, Carlsbad, USA

Sonstige Geräte

Äkta Purifier System 10 GE Healthcare, Uppsala, Schweden Absaugpumpe Integra Vacusafe Integra Biosciences, Biebertal

Analysewaage SBC 22 ScalTec Instrument, Göttingen

Elektroporator Gene Pulser Xcell Biorad, Hercules, USA Gradientenmischer Econo Gradient Pump Biorad, Hercules, USA Peristaltik-Pumpe Minipuls 3 Gilson, Middleton, USA

pH-Messgerät Cyberscan pH 510 Eutech Instruments, Landsmeer, Nieder-lande

Präzisionswaage SI-144 Denver Instrument, Göttingen

Reinstwasser-System Clear SG Wasseraufbereitung und Regeneration, Hamburg

High Pressur Homogenisierer (French Press) Emulsi-Flex-C3

Avestin

Software

ImageJ

LabImage Intas, Göttingen

Leica LAS AF Leica Microsystems, Wetzlar

Office 2007, 2013 Microsoft, Redmond, USA

Photoshop CS5 Adobe, San Jose, USA

Prism5 GraphPad, La Jolla, USA

Volocity 5 Improvision, Lexington, USA

3.1.2 Chemikalien und Materialien

Chemikalie/Material

Bezugsquelle

12-/24-Lagenplatten Sarstedt, Nürnbrecht

Acrylamid (30 %) Roth, Karlsruhe

Acrylamid 4K-Solution (40 %) Mix 32:1 AppliChem, Darmstadt

APS Merck, Darmstadt

Brillant Blue G250 Roth, Karlsruhe

Deckgläser 18 mm Ø, 12 mm Ø Menzel-Gläser, Braunschweig

DMSO Roth, Karlsruhe

DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Duolink® In Situ Detection Reagents Orange Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Duolink® In Situ Mounting Medium with DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Duolink® In Situ PLA® Probe Anti-Mouse MINUS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Duolink® In Situ PLA® Probe Anti-Goat PLUS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Duolink® In Situ PLA® Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Duolink® In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Dynabeads® M-280 Sheep anti-Mouse IgG Life Technologies, Carlsbad, USA Dynabeads® M-280 Sheep anti-Rabbit IgG Life Technologies, Carlsbad, USA ECL-Reagenz SuperSignal West Dura Extended Duration

Substrate

Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Filter für Spritze Filtropur S 0.45 Sarstedt, Nürnbrecht

28

FKS PAA Laboratories, Pasching, Österreich

α-L-Fucose Gel EY Laboratories, Inc., San Mateo, USA

Glasboden-Kulturplatte Willco-dish®GWSt-5040 WillCo Wells, Amsterdam, Niederlande

HEPES Serva, Heidelberg

HiTrap NHS-activated HP Säule GE Healthcare, Uppsala, Schweden

Instant Blue Coomassie Expedeon Ltd., Cambridge, UK

Kanüle BD Microlance™ 3 BD, New Jersey, USA

Kryoröhrchen Greiner, Kremsmünster

Laktose Gel EY Laboratories, Inc., San Mateo, USA

L-Glutamin (10x) PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Magnet-Probenständer DynaMag™-2 Life Technologies, Carlsbad, USA Molekulargewichtsstandard für SDS-PA-Gele PageRuler Fermentas, St. Leon-Rot

Mowiol 4-88 Merck, Darmstadt

N-Acetylglucosamine Gel EY Laboratories, Inc., San Mateo, USA Nitrocellulose-Membran Protran Schleicher & Schüll, Dassel

NP40 Merck, Darmstadt

PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA

PD-10 Desalting Columns GE Healthcare, Uppsala, Schweden

Penicillin/Streptomycin (10x) PAA Laboratories, Pasching, Österreich Pipettenspitzen (10 µL, 200 µL, 1000 µL) Greiner, Kremsmünster, Österreich

Protein A-Agarose Santa Cruz Biotechnology

Protein A/G PLUS-Agarose Santa Cruz Biotechnology

Protein G PLUS-Agarose Santa Cruz Biotechnology

Protein L-Agarose Santa Cruz Biotechnology

Protein A-Sepharose Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Protein G-Sepharose Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Protein-Konzentrations-Bestimmung DC™ Protein Assay Biorad, Hercules, USA

PVDF-Membran Porablot Macherey-Nagel, Düren

Reaktionsgefäße (0,5 mL, 1,5 mL, 2 mL, 15 mL, 50 mL) Sarstedt, Nürnbrecht

Spritzen Omnifix F Braun, Melsungen

Streptavidin Alexa Fluor® 546 Life Technologies, Carlsbad, USA

TEMED Roth, Karlsruhe

Triton X-100 Sigma-Aldrich, St. Louis, USA

Tris Roth, Karlsruhe

tRNA (Bäckerhefe) Roche, Basel, Schweiz

Trypan Blue stain 0,4 % Life Technologies, Carlsbad, USA

Trypsin/EDTA GE Healthcare, Uppsala, Schweden

UZ-Röhrchen für SW50.1-Rotor Beckman-Coulter, Fullerton, USA Vakuumfilter für 500 mL Flaschen Filtropur Sarstedt, Nürnbrecht

Zellkulturflaschen T175 Sarstedt, Nürnbrecht

Zellkultur-Medium DMEM high glucose Life Technologies, Carlsbad, USA Zellkultur-Medium Mc Coy´s 5a Life Technologies, Carlsbad, USA

Zellkulturplatten Sarstedt, Nürnbrecht

Zellschaber 25 cm Sarstedt, Nürnbrecht

Zell-Zählkammern Countess™ Invitrogen™, Carlsbad, USA Zentrifugen-Filtergefäße Amicon® Ultra-2 mL, 50 k Merck Millipore, Darmstadt Zentrifugen-Filtergefäße Amicon® Ultra-0.5 mL, 30 k Merck Millipore, Darmstadt Zentrifugen-Filtergefäße Amicon® Ultra-4 mL, 10 k Merck Millipore, Darmstadt