Studien zur Optimierung der rekombinanten Genexpression in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris

Studien zur Optimierung der rekombinanten Genexpression in der methylotrophen Hefe

Pichia pastoris

Von dem Fachbereich Biologie der Universität Konstanz zur Erlangung der Würde eines Doktors der

Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Abhandlung

Vorgelegt von Fatma Kabaoglu

ALTANA Pharma AG, Konstanz 2005

Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde bei ALTANA Pharma AG in Konstanz im Zeitraum von Oktober 2001 bis März 2005 durchgeführt. Ich bedanke mich bei ALTANA Pharma AG für die finanzielle Unterstützung dieser Dissertation und die Bereitstellung der Arbeitsumgebung.

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Klaus P. Schäfer für die Überlassung des Themas, für den wissenschaftlichen Freiraum, eigene Gedanken und Ideen verfolgen zu können und für die ausgezeichneten Arbeitsbedingungen im Labor, die maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Frau Dr. Inge Mühldorfer danke ich ganz besonders für die Betreuung dieser Arbeit, ihre sehr hilfreichen Anregungen und die ständige Diskussionsbereitschaft. Außerdem danke ich ihr für die Motivation, das delikate Essen bei unseren Labortreffs und natürlich für die Durchsicht und Korrektur dieses Manuskriptes.

Herrn Prof. Dr. Knippers danke ich ganz herzlich für die Übernahme des Zweitgutachtens und für seine Diskussionsbereitschaft während der Durchführung dieser Arbeit.

Ich bedanke mich bei allen Mitarbeitern der Forschungseinheit für Biotechnologie der ALTANA Pharma AG für die große Hilfsbereitschaft und die gute Zusammenarbeit.

Besonders hervorheben möchte ich die Mitarbeiter des Labors für Mikrobiologie: Waltraud Burckhardt-Boer, Anja Buttkewitz (danke für die spritzig tiefgründige Freundschaft!), Dominik Geiger, Karsten Keldermann (vor allem für die philosophischen Diskussionen und für den unübertrefflichen Humor), Aswin Mangerich, Thomas Reinberg (besonders für die fachlichen Anregungen) und Katja Schürer (insbesondere für die praktische Unterstützung). Daniela Kubanek danke ich für die Mitarbeit an den Klonierungen der Aspartat-Peptidasen während ihrer Ausbildungszeit. Klaus Hägele danke ich für die MALDI-MS-Messungen.

An dieser Stelle möchte ich auch einige liebe Menschen nennen, die mich in allen Phasen der Promotion tatkräftig unterstützt haben. Steffi Sonnenschein, Jana Ryliska, Janet Wappler und Jens Breyer danke ich für ihre Freundschaft und Motivation. Ich danke meinen Eltern und Geschwistern Alican und Kenan sowie meinem Schwager Jürgen Hoffmann, die stets für mich da waren. Meiner Mutter sei hiermit gesagt, dass sie weltweit die beste Köchin ist! Meiner Schwester Saniye, dem wundervollsten Menschen dieser Welt, danke ich im Besonderen, sie weiß wofür.

Meinen Eltern

.

Inhaltsverzeichnis 1

Inhaltsverzeichnis

1 ZUSAMMENFASSUNG _________________________________________ 9 2 ABSTRACT _________________________________________________ 10

3 EINLEITUNG ________________________________________________ 11 3.1 Mikrobielle Expressionsysteme_______________________________ 13 3.2 Das Pichia pastoris-Expressionssystem _______________________ 16 3.3 Funktionelle Protein-Technologie (FunProTec) __________________ 19

3.4 Peptidasen ________________________________________________ 21 3.4.1 Aspartat-Peptidasen ___________________________________________ 22 3.4.2 Peptidasen in P. pastoris _______________________________________ 24

3.5 Proteinkandidaten für die Expresssion in P. pastoris_____________ 26 3.5.1 SP-D(N/CRD) ________________________________________________ 26 3.5.2 PDE1B1 und kPDE10A_________________________________________ 27 3.5.3 PhoA _______________________________________________________ 28 3.5.4 LipA ________________________________________________________ 28

4 ZIELSETZUNG_______________________________________________ 29

5 MATERIAL UND METHODEN___________________________________ 30 5.1 Geräte ____________________________________________________ 30 5.2 Chemikalien und Enzyme ____________________________________ 30 5.3 Antikörper ________________________________________________ 31 5.4 Kits ______________________________________________________ 31 5.5 Verbrauchsmaterialien ______________________________________ 31

5.6 Software und Datenbanken __________________________________ 31 5.7 Oligonukleotide ____________________________________________ 32 5.8 P. pastoris Stämme_________________________________________ 33 5.9 Bakterienstämme __________________________________________ 34 5.10 Plasmide _________________________________________________ 34 5.11 Medien und Medienzusätze __________________________________ 34

5.12 Allgemeine molekularbiologische Methoden ____________________ 35 5.12.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ________________________________ 35 5.12.2 Phenol-Chloroform-Extraktion____________________________________ 35 5.12.3 Fällung von DNA mit Ethanol ____________________________________ 35 5.12.4 Bestimmung der DNA-Konzentration ______________________________ 36 5.12.5 Qualitative RNA-Bestimmung ____________________________________ 36 5.12.6 Bestimmung der RNA-Konzentration ______________________________ 36 5.12.7 Agarose-Gel-Elektrophorese ____________________________________ 36 5.12.8 Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen _________________ 37 5.12.9 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen _______________________ 37 5.12.10 Dephosphorylierung mit CIAP ___________________________________ 37 5.12.11 Ligation mit T4-DNA-Ligase _____________________________________ 37 5.12.12 TOPO TA Klonierung __________________________________________ 37 5.12.13 Sequenzierung von DNA _______________________________________ 38

5.13 Methoden zum Arbeiten mit E. coli ___________________________ 38 5.13.1 Stammhaltung und Kultivierung von E. coli_________________________ 38 5.13.2 Kolonie-PCR ________________________________________________ 39 5.13.3 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli durch Hitzeschock _________ 39 5.13.4 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ___________________________ 39

5.14 Methoden zum Arbeiten mit P. pastoris _______________________ 39 5.14.1 Stammhaltung und Kultivierung von P. pastoris _____________________ 39 5.14.2 Ermittlung der optimalen Konzentration an Selektionsmarker___________ 40

Inhaltsverzeichnis 3

5.14.3 Klonierung in pPICZαA und Selektion _____________________________ 40 5.14.4 Transformation von linearisierter Plasmid-DNA in P. pastoris durch Elektro-

poration _____________________________________________________41 5.14.5 Transformation von linearisierter Plasmid-DNA in chemisch behandelte P.

pastoris Zellen________________________________________________ 42 5.14.6 Bestimmung des Mut-Phänotyps__________________________________ 43 5.14.7 Kolonie-PCR _________________________________________________ 43 5.14.8 Rekombinante Schüttelkolben-Expression in P. pastoris _______________ 43 5.14.9 Zellaufschluss ________________________________________________ 44 5.14.10 Isolierung von Aspartat-Peptidasen unbekannter Sequenz______________ 44 5.14.11 Isolierung genomischer DNA aus P. pastoris ________________________ 45 5.14.12 Isolierung von Gesamt-RNA aus P. pastoris_________________________ 46 5.14.13 Isolierung von mRNA aus Gesamt-RNA ____________________________ 46 5.14.14 Herstellung von Aspartat-Peptidase-Deletionsmutanten durch Genaustausch 46

5.15 Methoden zum Arbeiten mit Proteinen ________________________ 50 5.15.1 Bestimmung der Proteinkonzentration ______________________________ 50 5.15.2 Fällung mit Trichloressigsäure (TCA) _______________________________ 50 5.15.3 SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) ____________________ 51 5.15.4 Immunologischer Nachweis von Proteinen mittels Western-Blot __________ 52

5.16 Bestimmung von Enzymaktivitäten ___________________________ 52 5.16.1 Aktivitätsbestimmung der Lipase A_________________________________ 52 5.16.2 Aktivitätsbestimmung der alkalischen Phosphatase____________________ 53

6 ERGEBNISSE _______________________________________________ 54

6.1 Klonierungen und Genexpressionen in P. pastoris_______________ 54 6.1.1 Klonierung und Expression von lipA________________________________ 55 6.1.2 Klonierung und Expression von phoA_______________________________ 57 6.1.3 Klonierung und Expression von kPDE-10A __________________________ 58 6.1.4 Klonierung und Expression von PDE-1B1 ___________________________ 58 6.1.5 Klonierung und Expression von SP-D(N/CRD)________________________ 59 6.1.6 Ermittlung der Schnittstellen von rekombinantem SP-D(N/CRD) mittels MS-

Analyse _____________________________________________________ 60

6.2 Zusammenfassung: Klonierungen und Genexpressionen in P. pastoris 62

6.3 Expressionsoptimierung von SP-D(N/CRD) hinsichtlich der Protein- degradation _______________________________________________ 63 6.3.1 Expression von SP-D(N/CRD) unter verschiedenen Kultivierungs-

bedingungen _________________________________________________ 63 6.3.2 Expression von SP-D(N/CRD) in verschiedenen P. pastoris-Stämmen ____ 65 6.3.3 Intrazelluläre Expression von SP-D(N/CRD)_________________________ 67 6.3.4 Expression von SP-D(N/CRD) in Anwesenheit von spezifischen Protease-

Inhibitoren ___________________________________________________ 68

6.4 Zusammenfassung: Expressionsoptimierung von SP-D(N/CRD) in P.

pastoris __________________________________________________69

6.5 Molekularbiologische Identifizierung von Aspartat-Peptidasen in P.

pastoris __________________________________________________ 70 6.5.1 Amplifikation von Aspartat-Peptidasen mit unbekannter Nukleotidsequenz _ 71 6.5.1.1 Primer-Design_____________________________________________ 71 6.5.1.2 cDNA Erststrang-Synthese __________________________________ 73 6.5.1.3 PCR mit degenerierten Oligonukleotiden und Untersuchung der

Amplifikate _______________________________________________ 74 6.5.2 Identifizierung von Aspartat-Peptidasen mit Hilfe der Genomsequenz von P.

pastoris _____________________________________________________ 77

6.6 Zusammenfassung: Identifizierung von Aspartat-Peptidasen in P.

pastoris __________________________________________________ 80

6.7 Bioinformatische Untersuchungen der Aspartat-Peptidasen aus P.

pastoris __________________________________________________ 80 6.7.1 Bestimmung der Aktiven Zentren der Aspartat-Peptidasen _____________ 80 6.7.2 Signalsequenzen______________________________________________ 83 6.7.3 Propeptide___________________________________________________ 84 6.7.4 Lokalisation der Aspartat-Peptidasen in P. pastoris ___________________ 85 6.7.5 Konservierte Domänen _________________________________________ 86

Inhaltsverzeichnis 5

6.8 Zusammenfassung: Bioinformatischen Analysen der Primärstruktur 86 6.8.1 Suche nach evolutionär bzw. strukturell ähnlichen Proteinsequenzen _____ 87

6.9 Deletion von Aspartat-Peptidasen in P. pastoris und Expression von SP-D(N/CRD) ______________________________________________ 93 6.9.1 Herstellung von P. pastoris X-33∆AP-3 ____________________________ 94 6.9.2 Expression von SP-D(N/CRD) in P. pastoris X-33∆AP-3-SP-D(N/CRD) ___ 94 6.9.3 Herstellung von P. pastoris X-33∆AP-5 ____________________________ 96 6.9.4 Expression von SP-D(N/CRD) in P. pastoris X-33∆AP-5-SP-D(N/CRD) ___ 96

6.10 Zusammenfassung: Expression von SP-D(N/CRD) in P. pastoris

Aspartat-Peptidase-Deletionsmutanten ________________________ 97

7 DISKUSSION ________________________________________________ 99 7.1 Expression heterologer Proteine in P. pastoris _________________ 100

7.2 Expression von SP-D(N/CRD) in P. pastoris ___________________ 101 7.2.1 Herabsetzung der proteolytischen Degradation von SP-D(N/CRD) ______ 102 7.2.2 Expression von SP-D(N/CRD) in P. pastoris X-33∆AP-3-SP-D(N/CRD) __ 103 7.2.3 Expression von SP-D(N/CRD) in P. pastoris X-33∆AP-5-SP-D(N/CRD) __ 104

7.3 Literaturvergleich bezüglich Experimenten zur Herabsetzung der

Proteolyse rekombinanter Proteine in P. pastoris_______________ 104

7.4 Amplifikation von Aspartat-Peptidasen mit unbekannter Nukleotid- sequenz__________________________________________________107 7.5 Deletion von Aspartat-Peptidasen in P. pastoris ________________ 108

7.6 Bioinformatische Untersuchungen der Aspartat-Peptidasen aus P.

pastoris _________________________________________________ 109 7.7 Ausblick _________________________________________________ 111 8 ANHANG __________________________________________________ 113

8.1 Amplifizierte Sequenzen mittels SMART^TM RACE _______________ 113 8.2 Homologe Sequenzen zur Deletion von Aspartat-Peptidasen _____ 115 9 LITERATUR ________________________________________________ 117

Abkürzungsverzeichnis 7

Abkürzungsverzeichnis

aa Aminosäure(n) kan^R Kanamyzinresistenz

Abb. Abbildung kb Kilobase(n)

Ao Aspergillus oryzae kPDE10A Humane Phosphodiesterase 10A, verkürzte Form

AOX Alkoholoxidase LB Luria Bertani

AOX1p Promotor der Alkoholoxidase 1 LiAc Lithiumacetat

APS Ammoniumpersulfat LipA Lipase A aus Bacillus subtilis 168M

BHK Baby Hamster Kidney LPS Lipopolysaccharid ble Bleomycin-Gen von

Steptoalloteichus hindustanus MALDI-MS Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation- Massenspektrome-trie

bp Basenpaar(e) Mut Methanol utilization phenotype BSA Rinderserumalbumin P. pastoris

bzw. Pp Pichia pastoris

c Konzentration PAGE Polyacrylamid-Gelelektro-

phorese

Ca Candida albicans PCR Polymerase-Kettenreaktion

CIAP Alkalische Phosphatase aus

Kälberdarm PDE1B1 Humane Phosphodiesterase 1B1

Cp Candida parapsilosis PHO1 Signalpeptid der sauren Phosphatase von P. pastoris ddNTP Didesoxynukleotid-5´-triphosphat PhoA Alkalische Phosphatase von E.

coli

DNA Desoxyribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute dNTP Desoxynukleotid-5´-triphosphat RT Raumtemperatur

DTT Dithiothreitol S. cerevi-

siae bzw.

Sc

Saccharomyces cerevisiae

E. coli Escherichia coli SCP Single Cell Protein EDTA Ethylendiamintetraessigsäure SDS Natriumdodecylsulfat FDA American Food and Drug

Administration

Sf Saccharomycopsis fibuligera FunProTec Funktionelle Protein-Techno-

logie SP-

D(N/CRD) Lungensurfactant Protein D, verkürzte Form

GAPp Promotor der Glyceraldehyd-3- Phosphatdehydrogenase

Tab. Tabelle GPI-Anker Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol-

Anker TCA Trichloressigsäure

GRAS Generally Regarded As Safe TEMED N, N, N´, N´-

Tetramethylendiamin

HIS4 Histidinoldehydrogenase t-PA Tissue Plasminogen Activator

Einheiten Nukleotide

A Ampere A Adenin

°C Grad Celsius C Cytosin

Da Dalton G Guanin

g Gramm T Thymin

h Stunde

L Liter Vorsätze

M Molar k kilo (10³)

min Minute m milli (10^-3)

s Sekunde µ mikro (10^-6)

V Volt n nano (10^-9)

Aminosäuren

A Ala Alanin M Met Methionin

C Cys Cystein N Asn Asparagin

D Asp Aspartat P Pro Prolin

E Glu Glutamat Q Gln Glutamin

F Phe Phenylalanin R Arg Arginin

G Gly Glycin S Ser Serin

H His Histidin T Thr Threonin

I Ile Isoleucin V Val Valin

K Lys Lysin W Trp Tryptophan

L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin

Zusammenfassung 9

1 Zusammenfassung

Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris wurde als eukaryotisches Expressions- und Sekretionssystem zur Evaluierung einer Funktionellen Protein Technologie (FunProTec) getestet. Die humanen Phosphodiesterasen 10A und 1B1 (kPDE10A, PDE1B1), das humane Lungensurfactant Protein D (SP-D(N/CRD)), die alkalische Phosphatase (PhoA) aus E. coli K-12 und die Lipase A (LipA) aus B.

subtilis 168M wurden als Beispielproteine für die heterologe Genexpression gewählt. Außer für kPDE10A wurde die Expression und Sekretion aller Proteine in das Medium gezeigt.

Bei der Expression von rekombinantem SP-D(N/CRD) wurde gezeigt, dass die Expressionsprodukte proteolytisch degradiert waren. Es wurden mehrere physiologische und molekularbiologische Strategien zur Minimierung der Protein- degradation von rekombinantem SP-D(N/CRD) verfolgt. Durch den Einsatz von Pepstatin (15 µg/mL) wurde bei der Schüttelkolbenexpression ein Rückgang der Degradation von SP-D(N/CRD) erzielt. Dieses Experiment zeigte auch, dass möglicherweise eine Aspartat-Peptidase an der Degradation von SP-D(N/CRD) beteiligt war.

Ausgehend von der P. pastoris Genomsequenz wurden acht Aspartat-Peptidasen identifiziert: Proteinase A und sieben weitere, vorher nicht beschriebene, Aspartat- Peptidasen (Aspartat-Peptidase 1 bis Aspartat-Peptidase 7). Diese neu identifizierten Aspartat-Peptidasen wurden kloniert und mittels bioinformatischer Studien untersucht. Es konnten mögliche Aussagen über wichtige Strukturelemente getroffen werden.

Die Aspartat-Peptidasen 3 und 5 wurden in dem P. pastoris-Stamm X-33 durch homologe Rekombination deletiert. Die Expression von rekombinantem SP- D(N/CRD) erfolgte in beiden Protease-defizienten Stämmen und zeigte vor allem bei dem Stamm P. pastoris X-33∆AP-5-SP-D(N/CRD) ein verändertes Degradationsprofil im Vergleich zum Wildtyp-Stamm.

2 Abstract

The methylotrophic yeast Pichia pastoris was used as a possible eukaryotic expression and secretion system for the evaluation of a functional protein technology (FunProTec). Human phosphodiesterase 1B1 and 10A, a truncated form of human lung surfactant protein D (SP-D(N/CRD)), lipase A from Bacillus subtilis 168M and alkaline phosphatase from E. coli K-12 were chosen as examples for heterologous gene expression. Gene expression and protein secretion was observed for all proteins except for phosphodiesterase 10A.

The analysis of the expression products of SP-D(N/CRD) showed that the recombinant protein was proteolytically degraded. Several experiments, including physiological and molecular approaches, were performed to avoid proteolytic degradation of recombinant SP-D(N/CRD). Only when the inhibitor of aspartic proteinases pepstatin (15 µg/mL) was added to the medium a significant decrease of protein degradation could be observed. This experiment also showed that probably al least one aspartic proteinase was involved in the proteolytic degradation of SP-D(N/CRD).

Based on the preliminary P. pastoris genome sequence data proteinase A and seven yet undescribed aspartic proteinases destinated aspartic proteinase 1 to aspartic proteinase 7 were identified. The sequence data of these proteinases were verified by cloning experiments and subjected to bioinformatic studies so that conclusions concerning the primary structure of the proteinases were drawn.

Protease-deficient strains of aspartic proteinase 3 and aspartic proteinase 5 were constructed in P. pastoris X-33. Expression of recombinant SP-D(N/CRD) was carried out in the designed protease-deficient strains and showed to be different in comparison to the wildtype strain.

Einleitung 11

3 Einleitung

In den letzten Jahren hat die Biotechnologie in der Pharmazeutischen Industrie immer mehr an Interesse gewonnen. Ausschlaggebend für diese Entwicklung waren unter anderem die enormen Fortschritte, die Mitte der 70er Jahre durch die rekombinante DNA Technologie und die monoklonale Antikörper Technologie erzielt wurden [1].

Die Biotechnologie beinhaltet die technologische Anwendung biologischer Systeme, lebender Organismen oder Teile davon zur Herstellung oder Modifizierung eines spezifischen Produkts oder eines spezifischen Prozesses [2].

Alle Bereiche der Biotechnologie, die eine medizinische Anwendung zum Ziel haben, werden unter dem Begriff der Roten Biotechnologie zusammengefasst.

Hierzu gehören diagnostische Proteine, wie Antikörper und Enzyme sowie therapeutische Proteine, die der Herstellung von Medikamenten dienen.

Während früher die Vielzahl an therapeutischen Wirksubstanzen in der Pharmazeutischen Industrie chemisch hergestellt wurde, wurden Wirkstoffe aus lebenden Zellen, wie Blutprodukte, Impfstoffe, einige Hormone und Enzyme aus natürlichem Material wie Blut oder tierischem Gewebe isoliert. Hierbei war man durch die Verfügbarkeit des biologischen Materials und der natürlich produzierten Menge an Wirkstoff limitiert. Therapeutische Proteine aus tierischem Gewebe, die nicht human-identisch waren, konnten schwerwiegende immunologische Reaktionen auslösen. Zusätzlich bestand die Gefahr, dass die aufgereinigten Produkte durch potentielle Krankheitserreger kontaminiert waren. Die rekombinante DNA-Technologie erlaubt es heute, Proteine in unbegrenzter Menge pathogenfrei herzustellen. Hinzu kommt, dass bei rekombinant hergestellten Proteinen die Möglichkeit besteht, diese zu modifizieren. So kann z. B. die Primärsequenz eines therapeutischen Proteins verändert werden, bei glykosylierten Proteinen kann die Glykosylierung modifiziert werden, oder es können Moleküle wie Polyethylenglykol kovalent an das Protein gebunden werden. Diese Veränderungen können pharmakokinetische Vorteile, wie eine schnellere Wirksamkeit und eine veränderte biologische Halbwertszeit mit sich

bringen [3]. Das erste biotechnologisch hergestellte Therapeutikum wurde in den USA vor über 20 Jahren auf den Markt zugelassen. Es handelte sich hierbei um rekombinantes Insulin (Humulin, Tabelle 1). Seither wurden über 114 Biopharmazeutika auf dem europäischen bzw. amerikanischen Markt für die Anwendung am Menschen zugelassen und über 500 Bio-pharmazeutika werden in klinische Studien evaluiert, wobei der Begriff Biopharmazeutika neben rekombinanten Proteinen und monoklonalen Antikörpern auch Nukleinsäure- basierte Produkte beinhaltet. Allein zwischen den Jahren 2000 und 2003 wurden 30 neue Biopharmazeutika wie Hormone, Blutfaktoren, Impfstoffe, Interferone, monoklonale Antikörper und therapeutische Enzyme für die Anwendung am Menschen zugelassen [4]. Diese Zahlen verdeutlichen das Wachstum und das steigende Interesse an Biopharmazeutika. Eine Auswahl an rekombinant hergestellten Proteinen, die therapeutisch eingesetzt werden, ist in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tab. 1: Beispiele weltweit rekombinant hergestellter humaner Proteine für therapeutische Zwecke, modifiziert aus Publikation von Walsh (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2004) [3]. t-PA = „Tissue Plasminogen Activator“, BHK = „Baby Hamster Kidney“.

Produktname Protein Expressions- system

Therapeutische Indikation

Hersteller und Zulassungsjahr Kogenate Faktor VIII BHK Zellen Hämophilie A Bayer, 1993 (USA) Activase t-PA CHO Zellen Akuter

Herzinfarkt

Genentech, 1987 (USA)

Humulin Insulin E. coli Diabetes Mellitus

Eli Lilly, 1982 (USA)

Nutropin Wachstumsfaktor E. coli Turner Syndrom Genentech, 1994 (USA)

Gonal -f^TM Follikel

Stimulierendes Hormon

CHO Zellen Anovulation Serono, 1995 (EU)

Epogen Erythropoietin Säugerzellen Anemie Amgen, 1989 (USA)

Neupogen^® Granulozyten stimulierender Faktor

E. coli Neutropenie Amgen, 1991 (USA)

Actimmune Interferon-α-1b E. coli Granulomatose Genentech, 1990 (USA)

Roferon^®-A Interferon-α-2a E. coli Haarzell- Leukämie

Roche, 1986 (USA)

IntronA Interferon-α-2b E. coli Krebs, Hepatitis Schering Plough, 1986 (USA)

Einleitung 13

3.1 Mikrobielle Expressionsysteme

Rekombinante Proteine werden in der Pharmazeutischen Industrie neben dem Einsatz als Therapeutika („Biologics“) oder Diagnostika auch zu Forschungs- zwecken (z. B. Interaktionsstudien, Funktionstests oder Targetvalidierung) benötigt. Das wachsende Interesse an rekombinanten Proteinen und die Diversität der Proteine selbst führt zu der Frage nach einem geeigneten Expressionssystem.

Für die Genexpression stehen eine Vielzahl von Organismen zur Verfügung.

Expressionssystem

Prokaryotisch Eukaryotisch

gram-positiv gram-negativ Hefen Insektenzellen Säugerzellen

z.B.E. coli z.B.

Bacillus ssp.

L. lactis

z.B.

S. cerevisiae S. pombe P. pastoris K. lactis Y. lipolytica H. polymorpha

z.B.

Baculovirus

z.B. CHO HEK

Abb. 1: Beispiele mikrobieller Expressionssysteme.

Prinzipiell unterscheidet man pro- und eukaryotische Expressionsstämme.

Beispiele prokaryotischer Systeme sind E. coli K-12, Lactococcus lactis und Bacillus ssp. Als eukaryotische Syteme werden Hefen (wie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica und Hansenula polymorpha), Insektenzellen (hier vor allem das Baculovirus-System) oder Säugerzellen verwendet. Häufig verwendete Säugerzellen sind humane Zelllinien oder Chinese Hamster Ovary-Zellen (CHO).

Tab. 2: Vergleichende Zusammenstellung mikrobieller Expressionssysteme, modifiziert aus Publikation von Fernandez und Hoeffler (Gene Expression Systems, 1998) [5].

Eigenschaften Bakterien Hefen Insektenzellen Säugerzellen Stammhaltung und Kultivierung

Verdopplungszeit 20 min 2.5 h 0.5-1 d 1 d Kosten für Medien niedrig niedrig hoch hoch Kultivierung in

definiertem Medium

ja ja nein nein

Genetische Manipulierbarkeit und Expression Genetische

Manipulierbarkeit

einfach einfach anspruchsvoll anspruchsvoll Expressionsgrad hoch hoch mittel niedrig

Sekretion heterologer Proteine ins Medium

nur begrenzt möglich

ja ja ja

Posttranslationale Modifikationen

Proteinfaltung - + + +

Disulfidbrücken - + + +

Glykosylierung - + + +

Phosphorylierung - - + +

Acetylierung - + + +

Acylierung - + + +

γ-Carboxylierung - - - +

E. coli K-12 ist der bekannteste und am häufigsten eingesetzte prokaryotische Expressionsstamm. Er wird als Generally Regarded As Safe-Organismus (GRAS) eingestuft, ist genetisch sehr gut charakterisiert und ermöglicht eine Überexpression von Proteinen. Das Vorhandensein von gut etablierten Fermentationsprozessen und die kostengünstige Kultivierung von E. coli sind weitere Vorteile dieses Systems [6]. Die extrazelluläre Proteinexpression ist in E.

coli K-12 jedoch nur begrenzt möglich. Bisher besteht nur die Möglichkeit über Fusionsproteine zwischen heterologen Proteinen und endogenen Signalpeptiden, Proteine mit mäßigem Erfolg ins Periplasma bzw. seltener ins extrazelluläre Medium zu sezernieren. Heterologe Proteine können in E. coli K-12 natürlicherweise nicht posttranslational modifiziert werden. Bei der Überexpression rekombinanter Proteine im Cytoplasma besteht meist die Gefahr, dass sich unlösliche Aggregate (Einschlusskörper) mit nicht-funktionellen Proteinen bilden.

Nur bei Vorhandensein guter Renaturierungsprotokolle für die entsprechenden Proteine können sich Einschlusskörper als vorteilhaft erweisen, da sie die Reinigung des Proteins im Downstream Prozess erleichtern können. E. coli K-12 hat wie alle gram-negativen Organismen Lipopolysaccharide (LPS) in seiner

Einleitung 15

Außenmembran. LPS, auch als Endotoxine bekannt, sind für den Menschen pyrogen, wenn sie in die Blutbahn gelangen. Daher müssen bei der Reinigung therapeutischer Proteine die Lipopolysaccharide entfernt werden [1]. Mit dem E.

coli-Expressionssystem werden u. a. Somatostatin, Insulin, Wachstumshormone, Interleukin 2, Interferon α, β und γ hergestellt.

Bacillus spp. ist ein gram-positiver Organismus, dessen Vorteile darin liegen, dass im Fermenter hohe Zelldichten erreicht und einige rekombinante Proteine ins Medium sezerniert werden können [7]. Obwohl viele Expressionsvektoren und starke Promotoren für Bacillus ssp. beschrieben worden sind, sind die wenigsten davon kommerziell erhältlich.

Lactococcus lactis gehört wie auch andere Laktobacilli zu den GRAS Organismen und kann teilweise heterologe Proteine ins Medium sezernieren [8]. Antigene wie diverse Malaria Antigene werden für die Impfstoffherstellung in Lactococcus lactis hergestellt.

Hefen sind beliebte eukaryotische Expressionssysteme, da sie als Einzeller viele Vorteile des E. coli Systems anbieten, wie eine einfache und billige Kultivierbarkeit und leichte genetische Manipulierbarkeit. Im Gegensatz zu E. coli K-12 haben Hefen subzelluläre Kompartimente und können dadurch Proteine posttranslational prozessieren und modifizieren [9]. Viele Hefen werden von der American Food and Drug Administration (FDA) als GRAS Organismen eingestuft. Mittels einer N- terminalen Signalsequenz können Proteine in Hefen kotranslational in das Endoplasmatische Retikulum transloziert und in das Medium abgegeben werden.

Ein weiterer Vorteil von Hefe-Expressionssystemen ist die stabile Integration heterologer Gene in das Hefegenom. Zudem gibt es durch die jahrelange Erfahrung mit Hefe in der Backindustrie und Brauerei gut etablierte Fermentationsprotokolle. Der erste genetisch veränderte Impfstoff, der von der FDA für die Anwendung am Menschen zugelassen wurde, war das Hepatitis B Oberflächenantigen, welches in der Bäckerhefe S. cerevisiae produziert wurde.

Obwohl für S. cerevisiae starke Promotoren vorhanden sind, ist die Produktausbeute von 1 – 5% an Gesamtprotein gering. Die teilweise erfolgende

Hyperglykosylierung von heterologen Glykoproteinen und die Akkumulation sezernierter Proteine im periplasmatischen Raum führten zum Einsatz alternativer Hefen [10, 11]. Klyveromyces lactis wurde ursprünglich für die Herstellung von Einzellerprotein als Futterzusatz benutzt und wird mittlerweile als Expressionsstamm für β-Galaktosidase eingesetzt [12]. Dieser Stamm hat sich besonders für die Expression höhermolekularer Proteine, die in das Medium abgegeben werden sollen, bewährt. Die methylotrophen Hefen H. polymorpha und P. pastoris gehören heute zu den am häufigsten eingesetzten alternativen Hefen im Vergleich zu S. cerevisiae. H. polymorpha kann Proteine in hohen Menge ins Medium sezernieren und benötigt nur eine kurze Fermentationsdauer. P. pastoris kann hohe Zelldichten erreichen und heterologe Proteine effizient ins Medium sezernieren (siehe 3.2).

Der Einsatz von Insektenzellen zur Expression heterologer Proteine ist in den letzten Jahren populär geworden. Hierbei wird meist das Baculovirus Expressionssystem benutzt. Das Virus infiziert etablierte Insektenzelllinien und kann sich replizieren. Produktausbeuten von 1 – 600 mg Protein pro Liter Kulturmedium wurden beschrieben [1]. Nachteile dieses Systems sind hohe Kosten für die Kultivierung und der Einsatz von nicht-definiertem Medium.

Säugerzellen werden als Expressionssystem vor allem bei humanen Glykoproteinen eingesetzt, wenn das richtige Glykosylierungmuster von entscheidender Bedeutung für die Aktivität oder Immunogenität eines Proteins ist [8]. Außerdem werden Säugerzellen bei komplexen, multimeren Proteinen als Expressionssystem herangezogen. Die Nachteile von Säugerzellen sind u. a. ein komplexer Nährstoffbedarf und langsames Wachstum.

3.2 Das Pichia pastoris-Expressionssystem

Pichia pastoris ist eine methylotrophe Hefe, die in der Lage ist, Methanol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle zu nutzen. In den 70er Jahren wurde Pichia pastoris wegen ihrer Kultivierbarkeit zu Hochzelldichten von der Phillips Petroleum Company in den USA zur Produktion von Einzellerprotein (Single Cell Protein, SCP) eingesetzt. Aufgrund der Ölkrise der 70er Jahre und des dadurch stark angestiegenen Methanpreises, konnte sich Pichia pastoris ökonomisch als

Einleitung 17

Lieferant für Einzellerprotein nicht durchsetzen. In Zusammenarbeit mit dem Salk Institute of Biotechnology and Industrial Associates Inc. wurde Pichia pastoris daraufhin zu einem System für die Expression heterologer Proteine entwickelt [13]. Das Pichia pastoris-Expressionssystem wird heute von der Firma Invitrogen vertrieben, wobei die Lizenzrechte bei der amerikanischen Firma Research Corporation Technologies (RTC) liegen.

Abb. 2: Mikroskopische Aufnahme von P. pastoris im Phasenkontrast bei 400- facher Vergrößerung.

In den letzten Jahren hat sich das Pichia pastoris-Expressionssystem zu einem weitverbreiteten und beliebten System für die Expression heterologer Proteine entwickelt. Bisher wurden mehrere hundert Proteine aus den verschiedensten Organismen rekombinant in P. pastoris hergestellt. Eine Auswahl an therapeutisch interessanten Proteinen, die in P. pastoris exprimiert wurden, ist in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tab. 3: Zusammenstellung einiger medizinisch interessanter humaner Proteine, die rekombinant in P. pastoris hergestellt wurden.

Protein Ausbeute Referenz

Antikörperfragmente (scFv) 50 mg/L [14]

Caspase-3 1 mg/g [15]

CD14 20 mg/L [16]

CD38 455 mg/L [17]

CD40 Ligand (lösliche Form) 255 mg/L [18]

IGF-1 600 mg/L [19]

Insulin nicht bekannt [20]

Interleukin-17 0.35 mg/L [21]

Serum Albumin (hSA) 3 g/L [22]

TNFα 10 g/L [23]

P. pastoris bietet zum einen einige Vorteile des E. coli-Expressionssystems, wie das schnelle Wachstum auf preiswerten und definierten Medien und eine einfache genetische Manipulierbarkeit. Zum anderen kann P. pastoris als Eukaryot im Gegensatz zu E. coli posttranslationale Modifikationen, wie limitierte Proteolyse, Faltung, Disulfidbrückenbildung und Glykosylierung durchführen [24].

Für die Expression heterologer Proteine in P. pastoris gibt es konstitutive und induzierbare Promotoren. Ein besonders starker Promotor ist der Promotor der Alkoholoxidase AOX1p. Die Alkoholoxidase (AOX) katalysiert die Umwandlung von Methanol zu Formaldehyd in den Peroxisomen und wird von den zwei Genen AOX1 und AOX2, die zu über 90% identisch sind, kodiert, wobei AOX1 für die meiste Aktivität der Alkoholoxidase verantwortlich ist [25]. Die Expression des AOX1 Gens ist streng reguliert und wird durch Methanol induziert. In Zellen, die auf Methanol wachsen, kodieren etwa 5% der polyadenylierten RNA für AOX1 [26].

Rekombinante Proteine können in P. pastoris intrazellulär oder durch Anfügen einer N-terminalen Signalsequenz extrazellulär exprimiert werden. Die am häufigsten verwendete Signalsequenz besteht aus dem Präpro-Peptidanteil des α- Faktors von Saccharomyces cerevisiae [27]. Weil P. pastoris nur wenige endo- gene Proteine sezerniert und in definiertem Medium wachsen kann, stellt das sezernierte heterologe Protein den Hauptanteil des Gesamtproteingehaltes im Kulturüberstand dar.

Tab. 4: Zusammenstellung sekretorischer Vektoren, die von Invitrogen erhältlich sind. PHO1 = Signalpeptid der sauren Phosphatase von P. pastoris, α-Faktor = Präpro-Peptid des α-Faktors von S. cerevisiae.

Sekretionsvektor Selektionsmarker Promotor Signalpeptid

pHIL-S1 HIS4 AOX1p PHO1

pPIC9K HIS4 + kan^R AOX1p α-Faktor

pPICZαA/B/C ble^R AOX1p α-Faktor

pGAPZαA/B/C ble^R GAPp α-Faktor

P. pastoris kann im Vergleich zu S. cerevisiae höhere Zelldichten erreichen (>130 g L^-1 Trockenmasse [25]) und neigt weniger zur Hyperglykosylierung heterologer Glykoproteine.

Einleitung 19

Für die Expression in P. pastoris stehen verschiedene Wirtsstämme zur Verfügung. Der am häufigsten eingesetzte Stamm ist P. pastoris GS115, der eine Histidinauxotrophie besitzt, die zugleich als Selektionsmarker eingesetzt werden kann. Aber auch der prototrophe Wildtyp-Stamm P. pastoris X-33 wird häufig eingesetzt. Der Stamm KM71 besitzt keine funktionelle Alkoholoxidase 1, sondern nur das transkriptionell schwächere AOX2-Gen und wächst daher nur langsam mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle.

Tab. 5: Auswahl an P. pastoris Expressionsstämmen, die von Invitrogen erhältlich sind. Protease- defiziente Stämme sind in dieser Tabelle nicht aufgenommen, siehe hierzu Tabelle 7.

Stamm Genotyp Phenotyp Referenz

X-33 - Wildtyp Invitrogen

GS115 his4 Mut⁺ His^- [28]

KM71 aox1∆::SARG4 his4 arg4 Mut^S His^- [29]

Zur Minimierung der Proteindegradation heterologer Proteine gibt es schließlich Protease-defiziente P. pastoris Stämme, bei denen die Proteinase A, Proteinase B und die Carboxypeptidase KEX1 deletiert sind. Eine Übersicht an Protease- defizienten Stämmen ist unter 3.4.2 wiedergegeben.

3.3

FunProTec ist eine Funktionelle Protein-Technologie, die es erlauben soll, native Proteine einfach und schnell mit einer hohen Ausbeute in einem Expressionssystem herzustellen. FunProTec wurde von Dr. I. Mühldorfer und Prof.

Dr. K.-P. Schäfer erfunden und am 20.12.2000 von der Firma Byk-Gulden unter dem Titel „Process for the production and purification of proteins and the production of arrays of proteins“ zum US-Patent (B1042USPRO01 12001) angemeldet. Die Funktionelle Protein-Technologie besteht aus einer Kombination eines Expressions- und Sekretionssystems mit einem Kompartimentierungssystem und kann sowohl der Herstellung von Proteinarrays als auch der Herstellung löslicher Proteine dienen. Beispiele mikrobieller Expressions- und Sekretionssysteme sind das P. pastoris-Expressionssystem bzw. das E. coli-Haemolysin System [30]. Das Kompartimentierungssystem kann zum einen aus einem Doppelfilter-System und zum anderen aus einem

gestapelten Mikrotiterplatten-System bestehen. Bei dem Doppelfilter-System werden zwei Filter auf einer Agarplatte übereinander gelegt. Der obere Filter ist zellundurchlässig und besitzt eine niedrige Proteinbindekapazität. Der untere Filter hingegen hat eine hohe Proteinbindekapazität. Eine Minimal-Agarplatte gewährleistet einen geringen Protein-Hintergrund. Rekombinante Zellen, die auf dem oberen Filter wachsen oder transferiert werden, können heterologe Proteine produzieren und sezernieren, welche auf den Filter mit hoher Proteinbindekapazität binden können. Auf diese Art und Weise erhält man Proteinarrays.

Agarplatte

Oberer Filter mit rekombinanten P. pastoris Kolonien

Oberer Filter mit einem Poren- durchmesser, der die Zellmigration verhindert, aber den Durchfluß der sezernierten Proteine erlaubt.

Unterer Filter mit hoher Protein- binde kapazität Unterer Filter mit sezernierten Proteinen

1 Spot = rekombinantes Protein, sezerniert durch eine Hefekolonie 1 Hefekolonie

Agarplatte

Abb. 3: Das FunProTec Doppelfiltersystem.

Werden die Proteine in löslicher Form benötigt, kann das gestapelte Mikrotiterplatten-System benutzt werden. Hierbei sind zwei übereinander stapelbare Mikrotiterplatten durch einen Filter, der zellundurchlässig aber durchlässig für das Kulturmedium ist, getrennt. Auch hier werden die rekombinanten Zellen auf die obere Platte transferiert, wo sie rekombinantes Protein herstellen und in das Medium abgeben können. Das Medium kann über eine Absaugstation in den unteren Filter gesaugt werden.

Einleitung 21

Zwei übereinander gelegte Mikrotiterplatten werden durch einen Filter getrennt. Der Filter hat einen Porendurchmesser, der die Zellmigration verhindert aber den Durchfluss der rekombinanten Proteine, die

sich im Medium befinden, erlaubt.

Jede Vertiefung der Mikrotiterplatte enthält einen rekombinanten P.

pastoris Klon, der rekombinantes Protein ins Medium sezerniert

Obere Mikrotiterplatte mit rekombinanten P. pastorisZellen

Untere Mikrotiterplatte mit sezernierten Proteinen

Abb. 4: Das FunProTec gestapelte Mikrotiterplatten-System.

3.4 Peptidasen

Peptidasen bzw. Proteasen (EC 3.4.) sind hydrolytische Enzyme, die die Spaltung von Peptidbindungen innerhalb eines Proteins oder Peptids katalysieren.

S e rin - C y s te in - A s p a rta t-

M e ta llo -

A m in o - D ip e p tid y la m in o -

C a rb o x y - D ip e p tid y lc a rb o x y- P e p tid a s e

E n d o p ro te in a s e

E x o p e p tid a s e

Abb. 5: Einteilung von Peptidasen.

Peptidasen lassen sich je nach Angriffspunkt in zwei Gruppen unterteilen.

Exopeptidasen hydrolisieren Peptidbindungen am N- oder C-terminalen Ende.

Dabei spalten Amino- und Carboxypeptidasen einzelne Aminosäuren und

Dipeptidylamino- und Dipeptidylcarboxypeptidasen Dipeptide. Endopeptidasen, auch Proteinasen genannt, hydrolysieren hingegen Peptidbindungen innerhalb eines Proteins. Nach der Art des katalytischen Mechanismus bzw. nach den Aminosäuren im aktiven Zentrum gibt es hier vier Hauptgruppen: Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metallo-Peptidasen und einige mit anderen Reaktionstypen, wie z.

B. die Threonin-Peptidasen. Aspartat-Peptidasen werden im Folgenden näher beschrieben. Ausgehend von ihrer Struktur werden Peptidasen in Gruppen eingeteilt, die in ihrem evolutionären Ursprung verwandt sind.

Viele Peptidasen können durch biologische oder synthetische Peptidasen- Inhibitoren inhibiert werden. Peptidasen-Inhibitoren sind entweder spezifisch für das aktive Zentrum, wo sie irreversible Modifikationen bewirken, oder es handelt sich um Pseudosubstrate.

Peptidasen erfüllen eine Vielzahl essentieller Funktionen, wie den Verdau von Nährstoffen, den intrazellulären Proteinstoffwechsel, die Reifung und Zielsteuer- ung neu synthetisierter Proteine und die Aktivierung von Zymogenen. Peptidasen sind auch an biologischen Prozessen beteiligt. Hierzu gehört die Blutgerinnung, die Fibrinolyse, die Komplement-Aktivierung, Gewebsab- und -aufbau und Entzündungsreaktionen. Außerdem sind Peptidasen an der Sporulation, Befruchtung, Tumorzellinvasion und Apoptose beteiligt. Wegen dieser Diversität an katalysierten Reaktionen kommen Peptidasen in allen lebenden Zellen und Organismen vor.

3.4.1 Aspartat-Peptidasen

Aspartat-Peptidasen (EC 3.4.23), auch saure Peptidasen genannt, sind Endopeptidasen, deren katalytische Aktivität durch Aspartatreste vermittelt wird.

Im Gegensatz zu Serin- und Cystein-Peptidasen bei denen die nukleophile Seitenkette der aktiven Aminosäure die Hydrolyse von Peptidbindungen vermittelt, wird bei Aspartat-Peptidasen die Katalyse durch ein aktiviertes Wassermolekül (Nukleophil) eingeleitet, wobei zwei Aspartatreste als Liganden an das Wasser binden. In seltenen Fällen bindet ein Aspartatrest und ein anderer Aminosäurerest an das Wasser. Die meisten Aspartat-Peptidasen bestehen aus einer einzelnen Peptidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 35 kDa [31]. Mitglieder der

Einleitung 23

Aspartat-Peptidase-Familie teilen eine Sequenzidentität von etwa 5% zueinander.

Die beiden katalytisch aktiven Aspartatreste befinden sich in charakteristischen Motiven: in der N-terminalen Domäne das Strukturmotiv Xaa-Phe/Ile/Leu-Asp-Thr- Gly-Ser und in der C-terminalen Domäne das Strukturmotiv Xaa-Asp-Thr/Ser-Gly- Ser/Thr, wobei Xaa eine hydrophobe Aminosäure darstellt. Ausgehend von der Primär- und Tertiärstruktur weisen die zwei Domänen eine zweifache Symmetrie auf. Viele Aspartat-Peptidasen werden als inaktive Zymogene mit einem N- terminalen Propeptid von einer Länge von bis zu 50 Aminosäuren gebildet und durch limitierte Proteolyse, teilweise autokatalytisch, aktiviert.

Die meisten Aspartat-Peptidasen haben eine weite Peptid-Bindungs-Spezifität und können spezifisch durch Pepstatine - das sind Pentapeptide, die von verschiedenen Actinomyceten hergestellt werden - oder Diazoacetylnorleucinmethylester und 1,2-Epoxy-3-(p-Nitro-Phenoxy)-Propan inhibiert werden. Aspartat-Peptidasen werden aufgrund ihrer evolutionären Verwandtschaft in Clan AA, Clan AB, Clan AC, Clan AD oder Clan AF und weiterhin aufgrund gemeinsamer Merkmale wie der Tertiärstruktur in bestimmte Familien eingeteilt [32].

Tab. 6: Einteilung von Aspartat-Peptidasen, modifiziert aus Publikation von Barrett et al.

(Handbook of proteolytic Enzymes, 2004) [32]. Unter katalytisch aktive Aminosäuren sind hier die Aminosäuren zu verstehen, die an das nukleophile Wasser binden.

Clan Familie Katalytisch aktive Aminosäuren AA A1, A2, A3A, A3B, A9, A11,

A12, A16, A17, A18

Asp, Asp (oder His)

AB A6, A21 Asp (oder Glu), Asn

AC A8 Asp, Asp

AD A22, A24A, A24B Asp, Asp

AF A26 Asp, Asp, Asp, His

A- A4, A5 -

Clan AA besteht aus 10 Familien: A1, A2, A3A, A3B, A9, A11, A12, A16, A17 und A18. Proteine von Clan AA haben zwei Domänen mit je einem katalytisch aktiven Aspartatrest bzw. einem katalytisch aktiven Aspartat- und Histidinrest. Familie A1 besteht ausschließlich aus eukaryotischen Peptidasen mit zwei homologen Domänen. Pepsin, Saccharopepsin und Yapsin 1 sind Vertreter dieser Familie.

Familie A2 ist eng verwandt mit Familie A1 und besteht aus Aspartat-Peptidasen von RNA Viren und Retrotransposons. Die Struktur vieler Vertreter dieser Familie

wurde aufgeklärt. Im Gegensatz zu Familie A1 haben Vertreter der Familie A2 nur eine Domäne mit einem katalytisch aktiven Aspartatrest, wobei eine Dimerisierung möglich ist. Familie A3 beinhaltet Endopeptidasen von Pararetroviren und Familie A9 das virale Spumapepsin. In Familie A11, A12, A16, A17 und A18 sind hauptsächlich putative Endopeptidasen von Retrotransposons von Pilzen, Pflanzen und Tieren zu finden. Vertreter von Clan AB haben einen katalytisch aktiven Aspartat- bzw. Glutamat- und Asparaginrest. Clan AB besteht aus den zwei Familien A6 und A21, die ihrerseits virale Hüllproteine beinhalten. Mitglieder von Clan AC, der aus Familie A8 besteht, haben zwei katalytisch aktive Aspartatreste. Die prokaryotische Signalpeptidase II aus E. coli ist ein Vertreter dieser Familie. Vertreter von Clan AD besitzen ebenfalls zwei katalytisch aktive Aspartatreste und lassen sich in die Familien A22, A24A und A24B einteilen. Die Familien A24 und A22 beinhalten Membranendopeptidasen mit acht Transmembrandomänen, wobei sich die katalytisch aktiven Reste in der Membran oder in unmittelbarer Umgebung dieser befinden. Clan AF besteht aus der Familie A26 mit dem bakteriellen Omptin als Beispiel. Des Weiteren gibt es Familien, die sich keinem Clan zuordnen lassen. Bei den Vertretern der Familie A4 und A5 konnten die katalytisch aktiven Aminosäuren nicht identifiziert werden.

Endopeptidasen dieser Familie sind bei einem sauren pH-Wert aktiv und lassen sich nicht von charakteristischen Inhibitoren anderer Peptidasen inhibieren.

3.4.2 Peptidasen in P. pastoris

Während die meisten proteolytischen Aktivitäten aus S. cerevisiae bereits gut charakterisiert worden sind [33], gibt es nur wenige Informationen über die proteolytischen Aktivitäten aus P. pastoris. Die meisten Peptidasen befinden sich bei S. cerevisiae in der Vakuole, einem Organell, das den Lysosomen höherer Eukaryoten entspricht. Proteinase A, eine vakuoläre Aspartat-Peptidase aus S.

cerevisiae, die durch das PEP4 Gen kodiert wird, nimmt eine entscheidende Rolle bei der eigenen Prozessierung und der Prozessierung weiterer Peptidasen in der Vakuole ein. So wird die Carboxypeptidase Y, die durch das PRC1 Gen kodiert wird, zu etwa 50% und die Proteinase B, die durch das PRB1 kodiert wird, nahezu vollständig durch die Proteinase A proteolytisch aktiviert [34]. Zudem befinden sich bei S. cerevisiae zwei Carboxypeptidasen: Carboxpeptidase Y (CpY) und Carboxpeptidase S (CpS) und zwei Aminopeptidasen: Aminopeptidase I (ApI) und

Einleitung 25

Aminopeptidase Co (ApCo) in der Vakuole. Die Dipeptidyl-Aminopeptidase B (DPAP-B) befindet sich in der Membran der Vakuole [35]. Das im Cytoplasma befindliche Proteasom ist verantwortlich für die Degradation fehlerhaft prozessierter Proteine, die durch eine Polyubiquitinierung markiert sind [36].

Extrazelluläre Proteasen, wie das Barrierpepsin (BAR1), das spezifisch im α- Faktor schneidet und von Zellen des MATa-Typs hergestellt wird, konnten in S.

cerevisiae auch beschrieben werden. [37]. Obwohl P. pastoris als effizientes Expressionssystem beschrieben wird, kann es vorkommen, dass ein heterologes Protein während der Expression oder Aufreinigung durch Proteasen abgebaut wird [34] und dadurch die Gesamtausbeute an spezifischem Protein herabgesetzt wird.

Während einer Fermentation erhält man typischerweise 1% Zelllyse, wodurch vakuoläre Proteasen freigesetzt werden und heterologe Proteine abgebaut werden können [38].

Bisher waren die Nukleotid- und Proteinsequenzen von vier Peptidasen aus P.

pastoris bekannt und durch öffentliche Datenbanken zugänglich: Proteinase A (PEP4), Proteinase B (PRB1), Carboxypeptidase Y (PRC1) und Carboxypeptidase KEX1. Proteinase A ist eine Aspartat-Peptidase und Proteinase B eine Serin- Peptidase, die beide neben der Carboxypeptidase Y in der Vakuole vorkommen.

Entsprechend wurden Protease-defiziente Stämme hergestellt. Der Stamm P.

pastoris SMD1168H trägt eine Deletion hinsichtlich der Proteinase A, der Stamm P. pastoris SMD1165 eine Deletion hinsichtlich der Proteinase B und der Stamm P. pastoris SMD1163 hat weder Proteinase A noch Proteinase B Aktivität. Eine Zusammenstellung an publizierten Protease-defizienten P. pastoris Stämmen ist in Tabelle 7 zu sehen.

Tab. 7: Protease-defiziente P. pastoris Stämme, modifiziert aus Publikation von Cereghino und Cregg (FEMS, 2000) [25].

Stamm Genotyp Referenz

SMD1168 ∆pep4::URA3 his4 ura3 [34]

SMD1168H ∆pep4::URA3 ura3 Invitrogen

SMD1168 kex1::SUC2 ∆pep4::URA3 ∆kex1::SUC2 his4 ura3 [39]

SMD1165 prb1 his4 [34]

SMD1163 pep4 prb1 his4 [34]

3.5 Proteinkandidaten für die Expresssion in P. pastoris

Im folgenden Abschnitt werden die Proteine vorgestellt, die im Rahmen dieser Arbeit in P. pastoris exprimiert wurden.

3.5.1 SP-D(N/CRD)

Das Surfactant der Lunge ist eine von den Alveolarepithelzellen gebildete grenzflächenaktive Substanz, die aus einer Mischung von Proteinen, Phospholipiden und Neutrallipiden besteht.

Das Surfactant Protein D (SP-D) ist ein kollagenhaltiges Lektin des Ca²⁺- abhängigen C-Typs und ist an Prozessen der angeborenen Immunabwehr beteiligt [40]. SP-D ist ein hydrophiles Glykoprotein, das eine komplexe Struktur aus 4 Trimeren bildet.

N-terminale Region kollagenähnliche Region α-helikale Halsregion

Kohlenhydrat-Binde Domäne Trimer

Monomer Dodecamer

Abb. 6: Schematische Darstellung der Struktur von SP-D, modifiziert aus Publikation von Haagsman und Diemel (Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol., 2001) [41].

Die Primärstruktur von SP-D lässt sich in vier charakteristische Regionen einteilen:

(1) eine N-terminale Region, die an einer Disulfidbrückenbildung beteiligt ist, (2) eine kollagenähnliche Region mit Wiederholungen der Sequenz Gly-Xaa-Yaa, (3) eine α-helikale Halsregion (Neck) und (4) eine Kohlenhydrat-Binde Domäne (Carbohydrate Recognition Domain, CRD). SP-D(N/CRD) ist eine verkürzte Variante von SP-D, bestehend aus der α-Helikalen Halsregion und der Kohlenhydrat-Binde Domäne. Bei diesem Konstrukt wurde gezeigt, dass eine Trimerisierung stattfinden kann und die Eigenschaften hinsichtlich der

Einleitung 27

Zuckerspezifität, der Bindung an LPS gram-negativer Bakterien und die Interaktion mit Phospholipiden im Vergleich zu nativem SP-D erhalten bleiben [42].

3.5.2 PDE1B1 und kPDE10A

Zyklische Nukleotid-Phosphodiesterasen (PDEs) sind durch die Modulation der intrazellulären cAMP- und cGMP-Konzentration an Signaltransduktions-Prozessen beteiligt [43]. Die Gruppe der PDEs beinhaltet 11 verschiedene Proteinfamilien, die Ähnlichkeiten hinsichtlich ihrer Primärstrukturen und den biochemischen Eigenschaften aufweisen [44].

N C

N C

(A)

(B) Katalytische Domäne

Katalytische Domäne GAF-Domäne

GAF-Domäne

Ca/CaM-binde Domäne Ca/CaM-binde

Domäne

Abb. 7: Schematische Darstellung der Domänen von (A) PDE1A, B, C und (B) PDE10A. GAF- Domäne = cGMP-specific and –regulated cyclic nucleotide phosphodiesterase, Adenylyl cyclase and E. coli transcription factor FhlA; CaM = Calmodulin.

Zyklische Nukleotid-Phosphodiesterasen der PDE1-Familie werden in Anwesenheit von Ca²⁺ durch Calmodulin allosterisch reguliert. Dies führt zu einer erhöhten Hydrolyse von cAMP und cGMP [43]. PDE1A, PDE1B, PDE1B1 (eine durch alternatives Spleißen entstandene Variante des Genes PDE1B) und PDE1C sind Vertreter dieser Familie.

Da die Transkription und Translation der PDE1B1 in proliferierenden CD4- Lymphozyten und bei der Differenzierung von Monozyten zu Dendriten und Makrophagen hochreguliert wird, wird angenommen, dass das PDE1B1-Protein eine wichtige Funktion bei Entzündungsreaktionen einnimmt.

Die zyklische Nukleotid-Phosphodiesterase 10A (PDE10A) der PDE-Familie 10 hydrolysiert sowohl cAMP als auch cGMP, wobei eine höhere Affinität zu einer cAMP-Bindung besteht. Im N-terminalen Bereich sind - ähnlich wie bei den PDEs der Familien 2, 5 und 6 - zwei cGMP-bindende Domänen vorhanden (GAF- Domänen). Die subzelluläre Lokalisation der PDE10A ist abhängig vom Spleißvariantentyp und wird posttranslational durch Phosphorylierung reguliert

[45]. kPDE10A besteht aus der Konsensussequenz der PDE10A1 und PDE10A2, die sich in den ersten 15 N-terminalen Aminosäuren voneinander unterscheiden.

3.5.3 PhoA

Ausgehend von dem pH-Optimum und von der Substratspezifität unterscheidet man in E. coli vier periplasmatische Phosphatasen [46].

Die alkalische Phosphatase (PhoA; EC 3.1.3.1) zeigt ihr pH-Optimum im alkalischen Bereich und katalysiert die unspezifische Spaltung von Phosphatmonoestern zu anorganischem Phosphat und Alkohol. PhoA ist ein homodimeres Metalloenzym, das zwei fest gebundene Zink- und ein Magnesium- Ion am aktiven Zentrum besitzt [47].

3.5.4 LipA

Lipasen sind Triacylglycerolester-Hydrolasen (EC 3.1.1.3), welche die Spaltung von Triglyceriden zu Di- bzw. Monoglyceriden, Fettsäuren und Glycerol katalysieren. Charakteristisch für die Aminosäuresequenzen von Lipasen, wie auch für Esterasen, ist das konservierte Pentapeptid Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly, welches das für die Katalyse erforderliche nukleophile Serin bereitstellt. Strukturell gesehen gehören Lipasen zu den α/β-Hydrolasen mit acht nahezu parallel angeordneten β-Faltblattstrukturen, die von beiden Seiten her von α-Helices umgeben werden [48].

Die extrazelluläre Lipase A aus Bacillus subtilis hat im Vergleich zu anderen Lipasen keine charakteristische Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly Sequenz. Der katalytisch aktive Serinrest befindet sich hier in der Sequenz Ala-His-Ser-Met-Gly.

Zielsetzung 29

4 Zielsetzung

Das wachsende Interesse an rekombinanten Proteinen in der Pharmazeutischen Industrie führt zu der Frage nach einem geeigneten Expressionssystem. Ziel dieser Arbeit war es, die Eignung des Pichia pastoris Expressions- und Sekretionssystems als eukaryotisches System zur Entwicklung einer funktionellen Protein-Technologie auszutesten und ggf. dieses Expressionssystem mit biochemischen und molekularbiologischen Methoden zu optimieren. Hierbei sollte der Fokus der Optimierung auf das Herabsetzen der proteolytischen Degradation heterologer Proteine liegen.

5 Material und Methoden

5.1 Geräte

Applied Biosystems (Kalifornien, USA): 3100 Avant Genetic Analyzer; Agilent Technologies (Waldbronn, Deutschland): 2100 Bioanalyzer; B. Braun Biotech International (Melsungen, Deutschland): Centramat R; Bachofer (Reutlingen, Deutschland): SpeedVac Concentrator; BIO-RAD (Californien, USA): Gene Pulser^® II, Mini Sub^®Cell GT, Power Pac 200 und Mini-PROTEAN^® 3 Cell; DuPont Instruments (Leipzig, Deutschland): Sorvall^® RC5C Kühlzentrifuge mit Sorvall^® GSA und Sorvall^® GS-3 Rotor; Eppendorf (Hamburg, Deutschland): Mastercycler Gradient, BioPhotometer, Thermomixer 5436 und Zentrifuge 5415 D; Fuji Photo Film GmbH (Düsseldorf, Deutschland): LUMINESCENT IMAGE ANALYZER LAS- 1000plus; Heidolph (Schwabach, Deutschland): Magnetrührer MR 2000; Hoefer Scientific Instruments (San Francisco; USA): TRANSPHOR electrophoresis unit;

Kendro (Hanau, Deutschland): Zentrifuge Z360K, Brutschrank B5060E und HERAsafe Sterilbank; Mettler Toledo (Giessen, Deutschland): PM4600 Delta Range^® und AE163 Waage; Sauter (Sulgen, Deutschland): Autoklav; Scientific Industries (New York, USA): Vortex Genie 2; SYNGENE (Cambridge, UK): Bio Imaging System, Digital Graphic Printer; WTW (Weilheim, Deutschland): inoLab pH-Meter.

5.2 Chemikalien und Enzyme

Die verwendeten Chemikalien besaßen analytischen Reinheitsgrad und wurden von den Firmen Difco (Detroit, USA), Merck (Darmstadt, Deutschland), Riedel-de Haen (Seelze, Deutschland), Roth GmbH (Karlsruhe, Deutschland) und Sigma Chemie (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. Restriktionsendonukleasen sowie DNA-modifizierende Enzyme und DNA-Polymerasen wurden von den Firmen Amersham Biosciences (Freiburg, Deutschland), New England Biolabs (Schwalbach, Deutschland), Eppendorf (Hamburg, Deutschland), MBI Fermentas (St. Leon-Roth, Deutschland) und Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Deutschland) bezogen.

Material und Methoden 31

5.3 Antikörper

Dianova (Hamburg, Deutschland): Peroxidase-(POX)-konjugiertes Ziegen Anti- Maus IgG (H+L); University of Southern Denmark/Immunology and Microbiology (Odense, Dänemark): Anti-hSP-D monoklonaler Maus-Antikörper; QIAGEN GmbH (Hilden, Deutschland): Anti-His4 monoklonaler Maus-Antikörper.

5.4 Kits

BD Biosciences (Kalifornien, USA): SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit; BIO- RAD (Californien, USA): Bradford Protein Assay; Invitrogen (Carlsbad, USA):

EasySelect^TM Pichia Expression Kit, FastTrack^® mRNA Isolation Kit und TOPO TA Cloning^® Kit; MACHEREY-NAGEL (Düren, Deutschland): Nucleospin Plasmid Miniprep Kit; Pierce (Rockford, USA): GelCode Blue Stain Reagent; Promega (Mannheim, Deutschland): Wizard^® Genomic DNA Purification Kit; QIAGEN GmbH (Hilden, Deutschland): DyeEx^TM 2.0 Plasmid Spin Kit, QIAquick PCR Purification Kit, QIAquick Gel Extraction Kit und HiSpeed^TM Plasmid Midi Kit; Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Deutschland): Lumi-Light Western Blotting Substrate.

5.5 Verbrauchsmaterialien

Biometra (Göttingen, Deutschland): 3 MM Papier für Blots; Eppendorf (Hamburg, Deutschland): Combitips; Hellma (Mühlheim, Deutschland): Quarzglasküvetten;

Greiner (Fredensborg, Dänemark): Mikrotiterplatten und Falcontubes; Millipore (Eschborn, Deutschland): Filtrationseinheiten (0.2 und 0.45 µm); Nunc GmbH &

Co. KG (Wiesbaden, Deutschland): Petrischalen; Schleicher & Schuell GmbH, (Dassel, Deutschland): Nitrozellulose Transfermembran.

5.6 Software und Datenbanken

Anwendung Programm URL

Genomanalyse Phylosopher Workbench

http://www.genedata.com/

Homologie Suchmaschine BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Literaturrecherche PubMed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.

fcgi?db=PubMed Sequenzvergleich

Sequenzüberlagerung

Vector NTI 7 http://www.informaxinc.com/