3 Ergebnisse
3.1 Untersuchung von Patienten mit einem Pankreaskarzinom auf Nachweisbarkeit von Cytokeratin 20 in Vollblutproben
Zu Beginn der Arbeit wurde 32 Patienten, die an einem Pankreaskarzinom litten, eine Blutprobe entnommen, die daraufhin auf eine Cytokeratin 20 mRNA Expression untersucht worden ist.
Dazu wurde mit der RNA eine nested RT-PCR durchgeführt, da herausgefunden werden sollte, ob disseminierte Tumorzellen des Pankreaskarzinoms im venösen Blut der Patienten vorhanden waren und mittels der PCR nachgewiesen werden konnten.
Auf der unten stehenden Abbildung erkennt man die Agarose Gel Elektrophorese der RT-PCR von Pankreaskarzinomzellen. Dabei ging die geringste Stärke nachweisbarer Zellen auf 5 ng zurück.
Abbildung 3.1
Agarose Gel Elektrophorese von Pankreaskarzinomzellen
Auf der folgenden Abbildung erkennt man die detektierten CK 20 mRNA Zellen in der Agarose Gel Elektrophorese.
Abbildung 3.2
Agarose Gel Elektrophorese von positiv detektierter Cytokeratin 20 mRNA
3.1.1 Auswertung
Für die Auswertung und Zusammenhänge der einzelnen Daten wurden jeweils folgende Daten der Fallgruppe erhoben: Alter, Geschlecht, Tumorstatus, Tumorausbreitung, Überlebenszeitraum, Nachweisbarkeit von Cytokeratin 20. Die erhobenen Daten wurden dann untereinander verglichen und somit detailliert.
3.2 Untersuchung von venösem Blut bei Pankreaskarzinom- patienten auf Cytokeratin 20
Das Blut von insgesamt 32 Patienten, die an einem Pankreaskarzinom litten, wurde auf Nachweisbarkeit von CK 20 mRNA hin untersucht.
Von den 32 Patienten wurden 12 (37,5%) als positiv auf CK 20 detektiert. Die 32 Patienten teilten sich auf in je 16 (50%) Männer und 16 (50%) Frauen. Von den 12 positiv detektierten Patienten auf CK 20 waren 4 (33,33%) männliche und 8 (66,67%) weibliche Patienten.
4 männliche Patienten (25%) konnten positiv detektiert werden, bei den Frauen waren es 8 Patienten (50%).
Diagramm 3.1
Verteilung der CK 20 positiv getesteten Patienten auf die Gesamtzahl
37,50%
62,50%
25%
75%
50%50%
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
gesamt männlich weiblich
CK 20 positiv CK 20 negativ
Des weiteren wird eine Einteilung bezüglich des Alters vorgenommen. Da der Häufigkeitsgipfel beim Pankreaskarzinom im 6. Lebensjahrzehnt liegt, ist es zweckmäßig, dies bei der Alterseinteilung dementsprechend zu berücksichtigen. Dazu
In der ersten Gruppe befinden sich demnach 17 der insgesamt 32 Patienten (53,13%).
Von diesen 17 Patienten konnten wiederum 6 Patienten (35,29%) positiv detektiert werden.
In der zweiten Gruppe befanden sich 15 der insgesamt 32 Patienten (46,87%), wovon 6 Patienten (40%) positiv detektiert werden konnten.
Diagramm 3.2
Abhängigkeit der CK 20 Detektion vom Patientenalter
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
40-59 Jahre
60-84 Jahre
CK 20 positiv CK 20 negativ
3.2.1 Korrelation mit den TNM-Stadien des Pankreaskarzinoms
Tabelle 4.1 zeigt eine Verteilung der Patienten in Abhängigkeit des Tumorstadiums bei Erstmanifestation des PankreaskarzinomsTabelle 3.1
Einteilung der Patienten in Abhängigkeit des TNM-Stadiums in Bezug auf das Geschlecht
TNM-Stadium
Patientenanzahl männlich
in den Stadien weiblich
Patienten insgesamt
T1 5 3 8
T2 3 2 5
T3 8 11 19
N0 6 5 11
N1 10 11 21
Mx 6 7 13
M0 7 3 10
M1 3 6 9
G1 0 0 0
G2 4 4 8
G3 8 9 17
G4 4 3 7
Im Stadium T1 befanden sich insgesamt 8 Patienten, davon 5 männliche (62,5%) und 3 weibliche (37,5%). Von den insgesamt 5 Patienten im Stadium T2 waren 3 männliche (60%) und 2 (40%) weibliche Patienten. 8 der insgesamt 19 Patienten im Stadium T3
waren Männer (42,11%), 11 hingegen waren Frauen (57,89%).
Im Stadium N0 gab es insgesamt 11 Patienten, 6 Männer (54,55%) und 5 Frauen (45,45%). Im Stadium N1 befanden sich von den insgesamt 21 Patienten 10 Männer (47,62%) und 11 Frauen (52,38%).
Im Stadium Mx gab es 6 männliche (46,15%) sowie 7 weibliche (53,85%) von den insgesamt 13 Patienten. Bei insgesamt 10 Patienten, 7 männliche (70%) und 3 weibliche (30%), konnten im Stadium M0 keine Fernmetastasen festgestellt werden. Hingegen konnte bei 3 männlichen Patienten (33,33%) sowie bei 6 weiblichen Patienten (66,67%) von insgesamt 9 Patienten im Stadium M1 eine Fernmetastasierung bereits nachgewiesen werden.
Im Stadium G1 konnten insgesamt 7 Patienten nachgewiesen werden, davon 4 männliche (57,14%) und 3 weibliche (42,86%). Von den insgesamt 8 sich im Stadium G2 befindlichen Patienten waren je 4 männlich und weiblich (je 50%). Schließlich waren 8 der insgesamt 17 Patienten im Stadium G3 männlich (47,06%) und 9 weiblich (52,94%). Im Stadium G4 befand sich kein Patient (0%).
Tabelle 3.2
Einteilung der untersuchten Patienten in verschiedene Stadien im Hinblick auf eine CK 20-Expression
Staging
zugehörige TNM- Klassifikation
Patientenanzahl in den Stadien
Cytokeratin 20 positiv Detektierte
I T1; N0; M0/X 6 1
II T2/3; N0; M0/X 4 1
III jedes T; N1; M0/X 13 7
IV jedes T; jedes N; M1 9 3
Von den insgesamt 32 Patienten wurden 6 (18,75%) in das Staging-Stadium I eingeteilt, 4 (12,5%) Patienten in das Stadium II, 13 (40,63%) Patienten in Stadium III und 9 (28,12%) Patienten in Stadium IV.
Im nachfolgenden Diagramm soll die Einteilung noch einmal verdeutlicht werden.
Diagramm 3.3
Einteilung der Patienten in die verschiedenen Stadien in Bezug auf die CK 20 Expression
0 2 4 6 8 10 12 14
Anzahl Fälle
I II III IV
Stadien
positiv negativ gesamt
Vergleicht man die positiv getesteten Proben mit der Gesamtzahl der Patienten, so ergeben sich für die einzelnen Klassen folgende Werte:
Im Staging-Stadium I ist 1 von 6 Patienten positiv detektiert worden (16,67% der Fälle), im Stadium II waren es bei einer Gesamtzahl von 4 ein Patient (25%), im Stadium III waren es 7 positive Fälle von insgesamt 13 Patienten (53,85%) und schließlich 3 Patienten von 9 im Stadium IV (33,33%).
Hieraus ergeben sich für die jeweiligen Stadien die Diagramme 3.4 bis 3.7.
Anteil der positiv getesteten Patienten in den Stadien I bis IV an der Gesamtzahl der sich im jeweiligen Stadium befindlichen Patienten
Diagramm 3.4 Stadium I
Gesamtzahl der Patienten: 6
Diagramm 3.5 Stadium II
Gesamtzahl der Patienten: 4
Diagramm 3.6 Stadium III
Gesamtzahl der Patienten: 13
Diagramm 3.7 Stadium IV
Gesamtzahl der Patienten: 9
16,67%
83,33%
positiv negativ
25%
75%
positiv negativ
53,85%
46,15% positiv
negativ
33,33%
66,67%
positiv negativ
Aus den erstellten Diagrammen ist ersichtlich, dass sich in allen Stadien eine signifikante Korrelation von CK 20 Expression mit dem Vorliegen eines Pankreaskarzinoms ergibt. Dies wird noch einmal in dem Diagramm 3.8 verdeutlicht.
Diagramm 3.8
Anteil der CK 20 Expression im jeweiligen Stadium
Damit ist bewiesen, dass in allen Stadien der Nachweis von Cytokeratin 20 gelingt.
Obgleich ist hier offensichtlich, dass die Nachweisbarkeit von CK 20 mit den Staging- Stadien ansteigt, um beim Stadium III sein Maximum zu erfahren. Im Stadium IV wird eine niedrigere Detektionsquote erzielt.
3.2.2 Korrelation mit dem Differenzierungsgrad G
Der Differenzierungsgrad gibt einen Einblick in das histologische Bild des Tumors. Je höher der Differenzierungsgrad, also je schlechter der Tumor differenziert ist, desto höher ist seine Malignität.
Hier fanden sich 7 Patienten von 32 (21,88%) im Differenzierungsgrad G1. Von diesen 7 Patienten konnten 2 (28,57%) positiv auf CK 20 getestet werden.
Im Differenzierungsgrad G2 gab es insgesamt 8 Patienten (25%), von denen 3 (37,5%) positiv detektiert wurden. 17 Patienten (53,12%) befanden sich im Differenzierungsgrad G3, von denen wiederum 7 (41,18%) detektiert werden konnten.
16,67%
25%
53,85%
33,33%
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
I II III IV
Hieraus ergibt sich Diagramm 3.9.
Diagramm 3.9
Detektion von CK 20 in Abhängigkeit des Differenzierungsgrades
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
G1 G2 G3
CK 20 positiv CK 20 negativ
3.3 Korrelation der CK 20 Expression mit der Überlebensrate
Den 32 Tumorpatienten wurde venöses Blut abgenommen, welches auf die Detektion von CK 20 untersucht wurde.
Die Patienten befanden sich bei der Diagnose des Pankreaskarzinoms in unterschiedlichen Tumorstadien. Wie aus dem Vortext ersichtlich ist, korreliert die Nachweisbarkeit von CK 20 im venösen Blut mit dem Stadium, in dem sich die Patienten befanden. In Tabelle 3.3 werden die einzelnen Überlebensraten miteinander verglichen.
Tabelle 3.3
Darstellung der verschiedenen Überlebensraten in Monaten nach Sicherung der Diagnose
Überlebensrate in Monaten Anzahl der Patienten
1 2 2 2 3 1 4 3 5 0 6 2 7 2 8 1 9 1 10 2 11 2 12 0 13 0 14 1 15 0 16 0 17 0 18 0 19 1 20 0 21 0 23 0 24 0 25 0 26 0 27 1
28 0 29 0 30 0 31 0 32 0 33 1 34 1 35 0 36* 6 37* 3
* Die Patienten mit einer Überlebensrate von 36 bzw. 37 Monaten leben zum Teil noch heute
Die mittlere Überlebensrate liegt bei 17,5 Monaten.
Fasst man die Überlebensrate in Jahren zusammen, so ergibt sich Tabelle 3.4
Überlebensrate in Jahren der Tumorpatienten vom Zeitpunkt der Diagnose
Überlebensrate in Jahren Anzahl der Patienten
1 18 2 2 3 2
Das erste Überlebensjahr reicht vom ersten Tag nach Diagnosestellung bis zum Erleben des letzten Tags des zwölften Monats. Das zweite Überlebensjahr reicht vom ersten Tag des überlebten dreizehnten Monats bis zum letzten Tag des vierundzwanzigsten Monats, das Dritte Jahr reicht vom ersten Tag des fünfundzwanzigsten Überlebensmonats bis zum letzten Tag des sechsunddreißigsten Monats nach Diagnose. Überlebte der Patient den ersten Tag des siebenunddreißigsten Monats und/oder lebt er heute noch, so hat er das vierte Überlebensjahr erreicht.
Nach der vorliegenden Tabelle verstarben demnach 56,25% der Patienten schon im ersten Jahr nach erfolgter Diagnose, jeweils 6,25% im zweiten und im dritten Jahr nach Sicherung der Diagnose, 31,25% der Patienten verstarben entweder erst im dritten Jahr nach Diagnose oder haben bis heute überlebt.
In Tabelle 3.5 werden die Überlebensraten der einzelnen Patienten mit den jeweiligen Krankheitsstadien verglichen.
Tabelle 3.5
Überlebensraten der Patienten bezogen auf die jeweiligen Krankheitsstadien
Stadium 1
Überlebensrate 2
in Jahren
3 4
Gesamtzahl der Patienten
I 0 0 0 6 6 II 2 0 0 2 4 III 9 1 1 2 13 IV 7 1 1 9
Von den 6 Patienten in Stadium I haben alle 6 (100%) länger als 3 Jahre überlebt. Im Stadium II befanden sich insgesamt 4 Patienten, von denen 2 (50%) innerhalb des ersten Jahres nach Diagnosestellung verstarben, die anderen 2 (50%) das dritte Jahr überlebt haben. 9 von insgesamt 13 Patienten (69,23%) im Stadium III haben das erste Jahr nach Diagnose nicht überlebt, im zweiten Jahr verstarb ein Patient (7,69%), ein Patient (7,69%) überlebte das dritte Jahr nicht. 2 der insgesamt 13 Patienten (15,38%) überlebten das dritte Jahr nach Diagnose bzw. leben zum Zeitpunkt der Studie noch. Im Stadium IV befanden sich insgesamt 9 Patienten, von denen 7 (77,78%) im ersten Jahr verstarben, einer (11,11%) verstarb im zweiten und ebenfalls einer (11,11%) im dritten Jahr nach Diagnosefindung.
Zur Übersicht ist die Korrelation der beiden Größen in einem Diagramm zusammengefasst.
Diagramm 3.10
Korrelation der Überlebensrate mit den verschiedenen Stadien
Stadium
Hieraus wird ersichtlich, dass mit steigendem Krankheitsstadium die Patienten eine
0 0 0
100
50
0 0
50 69,23
7,6 7,69 15,38
77,78
11,11 11,11 0
20 40 60 80 100 120
1 Jahr 2 Jahre 3 Jahre 4 Jahre Überlebensrate
Patientenzahl (%)
I II III IV
Von den 32 Patienten konnten insgesamt 12 (37,5%) positiv auf CK 20 getestet werden.
Von den 12 Patienten überlebten 9 (75%) das erste Jahr nicht, jeweils einer (8,33%) verstarb im zweiten und dritten Jahr und einer (8,33%) konnte das dritte Jahr überleben.
Diagramm 4.8 gibt einen Überblick über die Daten.
Diagramm 3.11
Einteilung der Überlebensrate auf die CK 20 positiv detektierten Patienten
75%
8,33%
8,33%
8,33%
1 Jahr 2 Jahre 3 Jahre 4 Jahre
Die 9 Patienten, die bereits im ersten Jahr verstarben, befanden sich in unterschiedlichen Stadien der Krankheit. In den Diagrammen 4.9 bis 4.wird Der Überlebenszeitraum in Korrelation gebracht mit den Krankheitsstadien der Patienten.
Diagramm 3.12
Überlebenszeitraum: 1 Jahr
Es befanden sich von den insgesamt 9 Patienten keiner (0%) im Stadium I, ein Patient (11,11%) im Stadium II, sechs Patienten (66,67%) im Stadium III und zwei Patienten (22,22%) im Stadium IV.
Diagramm 3.13
Überlebenszeitraum: 2 Jahre
V o n
0 1 2 3 4 5 6
Patientenz ahl
I II III IV
Stadium
1 Jahr
0,2 0,4 0,6 0,8 1
Patientenz
ahl 2 Jahre
insgesamt einem Patienten befanden sich keine Patienten (0%) in den Stadien I, II und III. Ein Patient (100%) befand sich im Stadium IV.
Diagramm 3.14
Überlebenszeitraum: 3 Jahre
Von insgesamt einem Patienten befanden sich keine Patienten (0%) in den Stadien I, II und IV. Ein Patient (100%) befand sich im Stadium III.
Diagramm 3.15
Überlebenszeitraum: 4 Jahre
Hierin befand sich ein Patient von insgesamt einem Patienten (100%) im Stadium I. In den Stadien II, III und IV befanden sich keine Patienten (0%).
3.4 Patienten ohne karzinomatöse Vorerkrankungen als Kontrollgruppe
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Patientenz ahl
I II III IV Stadium
3 Jahre
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Patientenz ahl
I II III IV Stadium
4 Jahre
tumoröse Erkrankung, wurde 34 Patienten, die nicht an einer karzinomatösen Erkrankung litten, ebenfalls Blut entnommen und dieses untersucht. Es konnte bei keinem der Patienten (0%) eine Cytokeratin 20 Expression nachgewiesen werden.
Um nachzuweisen, dass die gesunden Probanden eine intakte cDNA besitzen, wurde bei ihnen eine PCR mit ß-Actin-Primern durchgeführt. Abbildung 3.3 zeigt den Nachweis.
Abbildung 3.3
Nachweis von ß-Actin-Primern bei gesunden Probanden
3.5 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Für die untersuchten Patienten lässt sich anhand der erhobenen Daten eine Kontingenztafel errichten (siehe Kapitel 3.8.2). Dies wird in Tabelle 4.6 für die Pankreaskarzinompatienten veranschaulicht.
Tabelle 3.6
Kontingenztabelle für Pankreaskarzinom
CK 20 positiv CK 20 negativ Gesamtzahl
Fall 12 20 32
Kontrolle 0 34 34
Gesamtzahl 12 54 66
Der Assoziationskoeffizient nach Yule ist demnach
(12 x 34) – (20 x 0) Ayule = ———————— = 1
(12 x 34) + (20 x 0)
Mit dem Wert Ayule = 1 liegt beweisend eine Assoziation zwischen Pankreaskarzinom und Nachweis von CK 20 im Blut des Patienten vor. Vergleicht man die Wahrscheinlichkeiten für n11 bzw. n01, CK 20 positiv zu sein, so ergibt sich, dass nur bei Patienten mit Pankreaskarzinomnachweis eine Assoziation vorliegt, bei der Kontrollgruppe jedoch nicht.
Gemäß der Formeln für Sensitivität und Spezifität (Kapitel 3.8.3) gilt:
Sensitivität 12
Die Sensitivität beträgt also 100 %. Das bedeutet, dass ein Patient, der einen CK 20 Nachweis hat, auch zu 100% an einem Pankreaskarzinom leidet.
Spezifität
34
P = ——— = 0,629 20 + 34
Die Spezifität beträgt demnach 62,9%. Das wiederum bedeutet, dass ein Patient, bei dem CK 20 nicht nachgewiesen werden konnte, zu 62,9% auch nicht an einem Pankreaskarzinom leidet.
Die richtige Klassifikation wird auch bei der gesunden Kontrollgruppe mit 62,9%iger Treffsicherheit erkannt.
4 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit ist 32 Patienten, die an einem Pankreaskarzinom litten, venöses Blut abgenommen worden. Es wurde versucht, die mRNA des Karzinoms zu isolieren und weiterhin auf eine Cytokeratin 20 Expression hin zu untersuchen.
Es sollte ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten von Pankreaskarzinomen und der Nachweisbarkeit von Cytokeratin 20 gefunden werden.
Man hätte anstelle des venösen Blutes auch andere Medien untersuchen können, so etwa Gewebe, Lymphe oder Lymphknoten, Knochenmark oder Wundexsudat. Das venöse Blut wurde bevorzugt, da es schnell und relativ sicher entnommen werden kann. Zudem ist es leicht zugänglich und im Gegensatz zu anderen Medien relativ resistent vor äußeren Einflüssen.
Das Blut wurde jeweils prae- bzw. perioperativ entnommen, da sich ein eventueller Blutverlust postoperativ negativ auf die Detektierbarkeit der Tumorzellen auswirken kann [Weitz et al. 1997].
Disseminierte Tumorzellen behalten viele Eigenschaften ihres ursprünglichen Muttergewebes [Soeth et al. 1997]. Daher ist es besonders ratsam, sich diese Eigenschaften bei der Suche nach disseminierten Tumorzellen zu Nutze zu machen.
Die Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes expremieren unter anderem Cytokeratin 20, das ansonsten früher nur in Merkel-Zellen und dem Harnblasenurothel beschrieben wurde [Moll et al. 1992; Moll et al. 1993].
Einen ersten Schritt zur Detektion disseminierter Tumorzellen gelang 1994. Bis dato konnte eine Mikrometastasierung nur mit äußerst aufwendigen Methoden nachgewiesen werden, die zudem eine niedrigere Spezifität aufwiesen [Juhl et al. 1994].
Jetzt konnte ein immuncytologischer Nachweis disseminierter Tumorzellen mittels des Einsatzes spezifischer Antikörper in Peritoneallavage bzw. im Knochenmark von
Ein früher Nachweis disseminierter Tumorzellen ist besonders beim Pankreaskarzinom wichtig, da es sehr schnell zu Mikrometastasierungen kommen kann. Frühere Studien belegen, dass bei etwa 10 % aller Sektionsbefunde bei Pankreaskarzinom Metastasen im Bereich des Skeletts zu finden sind [Klöppel et al. 1984].
Das Pankreaskarzinom ist äußerst maligne und in nur ca. 10 % der Fälle überhaupt operabel. Nur etwa 1-2% der Patienten überleben die ersten 5 Jahre nach Diagnose [Klöppel et al. 1996].
Ein Tumormarker sollte schnell und spezifisch, ohne allzu viel Aufwand prognostiziert werden können [Cross et al. 1996]. Tumormarker wie z.B. das Carcinoembryonale Antigen (CEA) konnten bereits früher im Knochenmark bei kolorektalem Karzinom nachgewiesen werden [Gerhard et al. 1994]. Die Beschaffung geeigneter Proben war jedoch durchaus schwierig, so dass sich diese Methodik nicht durchsetzen konnte.
Eine Limitierung der Detektierbarkeit erfahren disseminierte Tumorzellen durch unzureichende Transkription tumorassoziierter oder epithelspezifischer Gene und durch ungenügende Expression des Markers in mikrometastatischen Absiedlungen [Zippelius et al. 1997].
Da eine karzinomatöse Erkrankung in der Regel erste Symptome relativ spät bei einer Tumorzellzahl von1010 bis 1012 zeigt [Böcker et al. 1997], muß der Nachweis mikrometastatischer Tumorzellen als prognostischer Faktor angesehen werden, um eine schnelle Beurteilung des Tumors zu ermöglichen. Gerade beim Pankreaskarzinom ist eine kurative Operation bei Auftreten von ersten Symptomen praktisch unmöglich [Klöppel et al 1997].
Ein besonderes Augenmerk gilt daher dem Aufspüren mikrometastatischer Tumorzellen, da bei einer Aussaat, egal ob hämatogen oder lymphogen, die Prognose sofort erheblich verschlechtert wird [Schusdziarra et al. 2001].
Da das Pankreaskarzinom eines der bösartigsten Tumoren ist und eine Heilung bei Absiedlungen von Tumorzellen praktisch nicht mehr erreicht werden kann [Lindblom et al. 1998], muss unser Tun und Können dazu beitragen, den Patienten mit einer verbesserten Lebensqualität zu unterstützen und die Lebensdauer eventuell zu verlängern.
4.1 Die Cytokeratin 20 nested RT-PCR zum Nachweis disseminierter Tumorzellen im Blut von Pankreaskarzinompatienten
Um die Cytokeratin 20 Expression aus Pankreaskarzinomzellen beweisen zu können, muss CK 20 erst einmal in einen nachweisbaren Status gebracht werden. Dies geschieht mit Hilfe der RT-PCR, die dazu dient, RNA zu vervielfältigen. Dadurch war in 12 der 32 Fälle eine CK 20 Expression nachweisbar. Diese war wiederum stadienabhängig, so dass man letztendlich sagen kann, dass bei höheren Tumorstadien eine Expression von CK 20 umso wahrscheinlicher wird.
Allerdings erfährt die RT-PCR durch ungenügende Expression und unzureichende Transkription wie oben beschrieben eine Limitierung [Zippelius et al. 1997]. Ebenso wurde in früheren Studien keine zwingende Korrelation zwischen der Ausschüttung von z.B. Guanylylcyclase als Tumormarker und dem jeweiligen Tumorstadium gefunden [Bustin et al. 1999].
Der Vorteil dieser Methodik ist zweifelsfrei darin zu sehen, dass mit relativ wenig Material ausgekommen werden kann. Blut ist im Gegensatz zu z.B. Knochenmark leichter zugänglich. Für den Patienten ist es ein großer Vorteil, dass das Blut schmerzarm entnommen werden kann. Für spätere Kontrollen ist nicht gleich ein stationärer Aufenthalt notwendig, sondern kann problemlos beim Hausarzt weitergeführt werden.
Allerdings ist dies wenige Material sehr störanfällig auf äußere Einflüsse. Daher muss bei der Arbeit mit den Blutproben und den zugehörigen Reagenzien auf äußerste Sauberkeit geachtet werden. Fremd-DNA oder –RNA würden die Ergebnisse sofort beeinträchtigen und verfälschen. Auch sind die Reagenzien, mit denen die Proben versetzt werden, teilweise gesundheitsschädlich. Als Beispiel sei hier die Kanzerogenität des Ethidiumbromids genannt.
Bereits in früheren Studien wurden verschiedene Methoden getestet, um die
sich in sofern als unzureichend, als das die erforderliche Menge der mRNA nicht zufriedenstellend produziert werden konnte.
Auch konnte in früheren Studien keine Korrelation zwischen CK 20 Expression und Pankreaskarzinom gefunden werden [Soeth et al. 1997].
Mit der in der vorliegenden Arbeit verwandte Methode konnte ausreichend Material erhalten werden, mit der dann schließlich die nested RT-PCR durchgeführt und das Cytokeratin 20 detektiert werden konnte.
4.2 Prognostische Relevanz disseminierter Tumorzellen im Vollblut von Pankreaskarzinompatienten
Bei 12 der insgesamt 32 Fälle (37,5%) konnte ein positiver Nachweis von Cytokeratin 20 erfolgen. Bei den Probanden in der Kontrollgruppe konnte in keiner Probe (0%) CK 20 nachgewiesen werden.
Insgesamt kann festgestellt werden, dass die Detektierbarkeit von CK 20 abhängig ist vom Tumorstadium. So sind 53,85% der Patienten im Stadium III und 33,33% der Patienten im Stadium IV detektiert worden, insgesamt in diesen beiden Stadien 45,45%.
Der Nachweis disseminierter Tumorzellen hat dadurch einen hohen Stellenwert bekommen.
Bereits 1992 konnten Lindemann et al. bei Patienten mit kolorektalem Karzinom den CK 18 Nachweis mit einer Gesamtdetektionsrate von 32% erbringen.
Ebenso konnte auch eine CEA Expression mit dem Auftreten des gleichen Karzinomtyps in Verbindung gebracht werden [Castells et al. 1997], während andere Studien bereits eine protektive Eigenschaft es Vitamin D auf dieses Karzinom sahen [Cross et al. 1996].
Moll et al. fanden 1992 einen Zusammenhang zwischen dem Nachweis von CK 20 und dem Auftreten verschiedener gastrointestinaler Tumoren.
Bei allen früheren Studien ist die Überlebensrate der Patienten nicht longitudinal beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit war die Überlebensrate der Patienten stark abhängig von dem Tumorstadium, in dem sie sich zum Zeitpunkt der Diagnose befanden. Die durchschnittliche Überlebensrate lag hier bei 17,5 Monaten bzw. 1,81 Jahren.
Mit steigendem Tumorstadium sank die Überlebensrate allerdings rapide ab, so dass im Stadium IV sechs von neun Patienten (66,67%) das erste Halbjahr nicht überlebten.
Gerade deshalb ist es wichtig, disseminierte Tumorzellen so früh wie möglich im Blut zu beweisen, um dann frühestmöglich eine adjuvante Therapie einleiten zu können (Strahlentherapie; Polychemotherapie).
In dieser Arbeit sollte die PCR etabliert werden als eigenständige und einfache Methode, disseminierte Tumorzellen im Blut nachzuweisen. Bereits in früheren Studien sind Untersuchungen an menschlichem Gewebe mittels PCR durchgeführt worden [Soeth et al. 1997; Burchill et al. 1994; Funaki et al. 1997]. Die Methodik der RT-PCR wurde daraufhin durchaus auch kontrovers gesehen [Bustin et al. 1999]. Fakt ist jedoch, dass selbst geringste disseminierte Tumorzellen aufgespürt werden können. Da ein Tumor in der Regel erst symptomatisch wird, sobald die Tumorzellen eine Zahl von 1010 oder mehr erreicht haben [Knebel Doeberitz et al. 1996], ist es notwendig, auch Tumoren in geringeren Stadien nachweisen zu können.
4.3 Cytokeratin 20 als Tumormarker bei Pankreaskarzinom und Korrelation mit der Überlebensrate
Die zentrale Frage der Arbeit war, inwiefern Cytokeratin 20 als prognostischer Faktor
Staging. Insgesamt gab es eine Detektionsrate von 37,5%; den höchsten Anteil daran hatten die Patienten im Stadium III (53,85%). Es folgen die Patienten des Stadium IV (33,33%), Stadium II (25,0%) und des Stadium I (16,67%). Es waren also in allen Stadien CK 20 positive Proben zu finden.
Ihnen wurde eine 34 köpfige Kontrollgruppe gegenübergestellt, von denen niemand (0%) positiv detektiert werden konnte.
Somit ist die Expression von CK 20 auf die Fälle beschränkt und als Prognosefaktor anzusehen.
Von den 12 positiv getesteten Patienten überlebten 9 (75%) das erste Jahr nicht. Jeweils ein Patient (8,33%) verstarb im zweiten bzw. dritten Jahr nach Diagnosestellung, und nur ein Patient (8,34%) überlebte das dritte Jahr. Für die 12 positiv detektierten Patienten wurde eine durchschnittliche Überlebenszeit von 1,5 Jahren errechnet.
Eine Korrelation zwischen dem Nachweis von CK 20 und der Überlebensrate ist insofern zu sehen, als dass sich die Überlebenszeit bei vorhandener CK 20 Expression von 1,81 Jahren auf 1,5 Jahren reduziert.
Die Bestimmung von CK 20 im Vollblut ist einfach und relativ schmerzfrei.
Kontrolluntersuchungen können beim niedergelassenen Arzt durchgeführt werden. Dies ist als erheblicher Vorteil zu den bisher üblichen Methoden (Knochenmarkpunktion) zu sehen.
In keiner früheren Studie wurde die Überlebenszeit der Patienten bei Pankreaskarzinom derart berücksichtigt und diskutiert, so dass letztendlich gesagt werden kann, dass die gezeigten Ergebnisse aussagekräftig und neu sind.
5 Zusammenfassung
Insgesamt 32 Patienten der Westfälischen Wilhelms-Universität und des Klinikum Kreis Herford , die an einem Pankreaskarzinom litten, wurde Blut entnommen und auf die Detektierbarkeit von Cytokeratin 20 mittels einer Reverse Transcriptase- Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) untersucht. Dieser Fallgruppe wurde eine Kontrollgruppe aus 34 Probanden, die an keiner karzinomatösen Erkrankung litten, gegenüber gestellt.
12 der 32 Karzinompatienten (37,5%) konnten positiv auf eine CK 20 Expression getestet werden. Davon befand sich ein Patient (8,33%) im Stadium I, ein Patient (8,33%) im Stadium II. Im Stadium III befanden sich 7 Patienten (58,34%) und im Stadium IV letztlich 3 Patienten (25%).
Die Überlebensrate aller Patienten war abhängig von der Expression von CK 20. 9 der 12 positiven Patienten (75%) überlebten das erste Jahr nach Diagnosestellung nicht, jeweils ein Patient (8,33%) verstarb im zweiten bzw. dritten Jahr und nur ein Patient (8,34%) konnte das dritte Jahr überleben.
Die Überlebensrate war ebenfalls abhängig von dem Stadium, in dem sich die Patienten befanden. Überlebten im Stadium I noch alle Patienten (100%) das dritte Jahr, so sank sie bis zum Stadium IV auf 0%; es überlebte also niemand die Krankheit über drei Jahre.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Möglichkeit besteht, eine CK 20 Expression mittels der RT-PCR nachzuweisen.
In allen Stadien konnten Patienten positiv detektiert werden. Im Stadium I, in dem sich 6 Patienten befanden, war es einer (16,67%). Im Stadium II war es von insgesamt 4 Patienten einer (25%), der ermittelt werden konnte. Bei 7 (53,85%) der insgesamt 13 Patienten im Stadium III konnte ein positiver Nachweis von CK 20 erfolgen. Hier ist die höchste Detektionsrate zu sehen. Im Stadium IV wurde CK 20 noch bei 3 der insgesamt 9 Patienten, also bei 33,33%, gefunden.
Das Cytokeratin lässt sich in allen Stadien und Graden des Karzinoms nachweisen.
Sowohl die Überlebenszeit als auch die Detektion korrelieren dabei eng mit dem jeweiligen Tumorstadium. Damit ist CK 20 als prognostischer Faktor in der Suche nach disseminierten Tumorzellen bei Pankreaskarzinom anzusehen.
