Aus dem Zentrum für Lebensmittelwissenschaften Institut für Lebensmitteltoxikologie und Chemische Analytik
- Chemische Analytik und Endokrinologie - der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchungen zur Verteilung
ausgewählter Kationen in Plasma und Granula von nativem, embryonierten
und
lebensmitteltechnologisch verarbeiteten Hühnereigelb
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Sarina Bäckermann
aus Bremen
Hannover 2007
wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. W. Ternes
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. W. Ternes 2. Gutachter: PD Dr. G. Glünder
Tag der mündlichen Prüfung: 22.05.2007
Diese Arbeit wurde zum Teil gefördert durch die Fritz Ahrberg Stiftung, Hannover
Meiner Familie in
Dankbarkeit
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung... 1
2. Schrifttum ... 5
2.1 Das Hühnerei...5
2.1.1 Aufbau des Hühnereies ...5
2.1.1.1 Eischale ... 5
2.1.1.2 Eiklar ... 5
2.1.1.3 Eigelb... 6
2.1.2 Mineralstoffgehalt ...11
2.1.3 Technologische Behandlung von Eigelb...15
2.1.3.1 Gefrieren... 15
2.1.3.2 Zutaten... 17
2.1.3.3 pH-Wert... 18
2.1.3.4 Trocknung ... 19
2.2 Embryonalentwicklung ...20
2.2.1 Entwicklung des Embryos...20
2.2.2 Verbleib der Mineralstoffe während der Embryogenese ...22
2.3 Mengenelemente ...26
2.3.1 Calcium ...26
2.3.1.1 Biologische Bedeutung... 26
2.3.1.2 Vorkommen im Ei ... 27
2.3.2.1 Biologische Bedeutung... 29
2.3.2.2 Vorkommen im Ei ... 30
2.4 Spurenelemente ...31
2.4.1 Eisen ...32
2.4.1.1 Biologische Bedeutung... 32
2.4.1.2 Vorkommen im Ei ... 33
2.4.2 Kupfer...36
2.4.2.1 Biologische Bedeutung... 36
2.4.2.2 Vorkommen im Ei ... 37
2.4.3 Zink ...38
2.4.3.1 Biologische Bedeutung... 38
2.4.3.2 Vorkommen im Ei ... 39
2.5 Thiamin und seine Phosphatester...40
2.5.1 Chemische Eigenschaften ...40
2.5.2 Biochemie...41
2.5.3 Thiaminmangel...45
2.5.4 Thiamingehalt in Lebensmitteln ...46
2.5.4.1 Allgemein ... 46
2.5.4.2 Thiamin im Ei... 46
2.6 Analytische Methoden ...48
2.6.1 Nachweis von Thiamin...48
2.6.2 Elementanalyse mit Atomabsorptionsspektrometrie (AAS)...55
2.6.2.1 Calcium ... 59
2.6.2.2 Magnesium ... 60
2.6.2.3 Eisen ... 60
2.6.2.4 Kupfer... 61
2.6.2.5 Zink ... 62
3. Material und Methoden... 65
3.1 Behandlung und Fraktionstrennung der Eier ...65
3.1.1 Native Eiproben...65
3.1.2 Eigelbproben mit Zusatz ...66
3.1.3 Gefriergetrocknete Eigelbproben mit Zusatz ...68
3.1.4 Bruteier...69
3.2 Thiaminanalyse ...71
3.2.1 Probenmaterial ...71
3.2.2 Probenaufarbeitung ...71
3.2.2.1 Ansetzen der Lösungen ... 71
3.2.2.2 Thiaminextraktion ... 72
3.2.2.3 Thiaminextraktion aus Plasmaproben ... 73
3.2.2.4 Thiaminextraktion aus Eiklarproben ... 74
3.2.2.5 Thiaminextraktion aus Granulaproben ... 74
3.2.2.6 Thiaminextraktion aus Embryoproben ... 75
3.2.2.7 Derivatisierung ... 76
3.2.2.8 Festphasenextraktion ... 76
3.2.2.9 Dotierung... 77
3.2.3 Trennung und Analyse ...77
3.2.3.1 Ansetzen der Kalibrierlösungen ... 77
3.2.3.2 Hochdruckflüssigkeitschromatographie ... 77
3.3.1 Chemikalien und Gerätschaften ...79
3.3.2 Probenmaterial ...79
3.3.3 Säureaufschluss ...80
3.3.4 Analyse mit Flammen-Atomabsorptionsspektrometrie ...81
3.3.4.1 Apparatur... 82
3.3.4.2 Ansetzen der Lösungen ... 83
3.3.4.3 Bestimmung von Calcium in Granula, Plasma und Eiklar... 83
3.3.4.4 Bestimmung von Magnesium in Granula, Plasma und Eiklar ... 86
3.3.4.5 Bestimmung des Eisengehaltes in der Granulafraktion ... 88
3.3.4.6 Bestimmung von Zink in Granula, Plasma und Eiklar... 89
3.3.4.7 Bestimmung von Zink in gefriergetrockneten Proben ... 91
3.3.4.8 Bestimmung von Zink in nativen Eigelbproben mit Zusatz... 91
3.3.5 Analyse mit Graphitrohr-Atomabsorptionsspektrometrie ...93
3.3.5.1 Apparatur... 93
3.3.5.2 Ansetzen der Lösungen ... 93
3.3.5.3 Kupfer... 93
3.3.5.4 Eisen ... 94
3.3.6 Analyse mit ICP-Spektrometrie ...95
3.4 Trockenmassebestimmung...96
3.4.1 Analyse...96
3.5 Rasterelektronenmikroskopie ...98
3.5.1 Probenvorbereitung ...98
3.5.2 Analyse...99
3.6 Statistische Auswertung...99
4. Ergebnisse ... 101
4.1 Thiamin ...101
4.1.1 Thiamingehalt in Plasma und Granula nativer Eier ...101
4.1.2 Thiamingehalt in Plasma und Granula 5 Tage embryonierter Eier ...104
4.1.3 Thiamingehalt in 5 und 7 Tage alten Embryos ...107
4.1.4 Wiederfindungsrate, Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze 112 4.2 Mineralstoffe ...113
4.2.1 Trockenmassegehalt der Proben ...113
4.2.2 Mineralstoffgehalt in Granula nativer Eier und von Bruteiern ...113
4.2.3 Mineralstoffgehalt im Plasma nativer Eier und von Bruteiern ...115
4.2.4 Kupfergehalt im Plasma von Eigelbproben mit Zusätzen ...117
4.2.4.1 Gefriergetrocknete Proben mit Zusätzen... 117
4.2.4.2 Native Eigelbproben mit Zusätzen ... 119
4.2.5 Eisengehalt im Plasma von Eigelbproben mit verschiedenen Zusätzen .124 4.2.5.1 Gefriergetrocknete Proben mit Zusatz ... 124
4.2.5.2 Native Eigelbproben mit Zusatz... 126
4.2.6 Rasterelektronenmikroskopie...131
5. Diskussion... 135
5.1 Thiamin ...135
5.1.1 Methodenentwicklung und Thiaminanalytik ...135
5.1.2 Thiamin- und Thiaminphosphatgehalte in Proben...141
5.1.2.1 Thiamingehalt in Plasma und Granula ... 141
5.2 Mineralstoffe ...145
5.2.1 Trockenmassebestimmung in Granulaproben...145
5.2.2 Mineralstoffgehalt in nativen Eiern in Plasma und Granula...145
5.2.3 Mineralstoffgehalt in Plasma und Granula 5 Tage embryonierter Eier ..147
5.2.4 Kupfer- und Eisengehalt in technologisch behandelten Proben ...150
5.2.4.1 Veränderung des Kupfergehaltes in Plasmaproben... 150
5.2.4.2 Veränderung des Eisengehaltes in Plasmaproben ... 153
5.2.5 Rasterelektronenmikroskopie...156
6. Zusammenfassung... 157
7. Summary ... 161
8. Anhang... 165
8.1 Chemikalienverzeichnis ...165
8.2 Geräteliste...167
9. Abkürzungsverzeichnis... 168
10. Tabellenverzeichnis ... 169
11. Abb. Verzeichnis... 172
12. Lit. Verzeichnis... 174
1. E
INLEITUNGDas Ei ist als Objekt wissenschaftlicher Forschung in vielerlei Hinsicht interessant. Vom biologischen Standpunkt aus, da sich, anders als bei Säugetieren, ein Küken fast vollständig von der Außenwelt abgeschieden, mit den im Ei zur Verfügung stehenden Nährstoffen, entwickelt. Diese werden aus den Nährstoffdepots mobilisiert, zum Embryo transportiert und verwertet.
Als Nährstofflieferant ist das Ei auch für die menschliche Ernährung sehr wertvoll und wird, auch wegen seiner vielen technofunktionellen Eigenschaften, bei der Zubereitung von Speisen geschätzt.
Fragen aus diesen beiden Gebieten der Forschung rund um das Ei werden auch in der vorliegenden Arbeit näher beleuchtet. Einige Nährstoffe werden herausgegriffen und bislang ungeklärte Fragen auf den Gebieten der Embryogenese und der technologischen Bearbeitung geklärt. Besonders im Nährstoffdepot Eigelb vorhandene und an Proteine gebundene Nährstoffe sind in diesem Zusammenhang interessant. Daher fiel die Wahl auf Thiamin, als proteingebundenes Molekül mit ionischem Charakter und die zum Teil proteingebundenen Kationen Calcium, Magnesium, Eisen, Kupfer und Zink.
Als essentielles Vitamin ist Thiamin, welches auch als Vitamin B1 bezeichnet wird, im Eigelb des Eies gespeichert. Das Eigelb selbst kann in eine granuläre Fraktion und eine wässrige Fraktion unterteilt werden, die sich bei der Zentrifugation trennen lassen. Welche Verteilung des Thiamins in den beiden Fraktionen vorliegt, ist aber bislang ungeklärt.
Die Bezeichnung Thiamin ist ein Sammelbegriff und schließt die Formen Thiaminhydrochlorid, Thiaminmonophosphat, -diphosphat und -triphosphat ein.
Das Thiaminhydrochlorid hat im Körper keine bekannte biologische Aktivität.
Erst wenn es zu Thiaminphosphaten umgewandelt wird, erfüllt es
schon im Ei für den sich entwickelnden Embryo zur Verfügung stehen, oder erst in der frühen Embryonalphase gebildet werden. In der Literatur konnten zu diesem Thema nur Studien zum Thiamingehalt im Herz 20 Tage alter Hühnerembryos oder zum Vorhandensein bestimmter im Stoffwechsel von Thiamin relevanter Enzyme gefunden werden (Olkowski und Classen, 1999;
Sanders, 1980; Sawano und Fujita, 1981).
Angaben zu Thiaminphosphaten in den verschiedenen Fraktionen von nativen Eiern, embryonierten Eiern oder zu dem sich entwickelnden Embryo konnten dagegen nicht gefunden werden. Diese Fragen zum Thiamin- und Thiaminphosphatgehalt sollen daher in der vorliegenden Arbeit geklärt werden.
Die Methodenentwicklung zum Nachweis von Thiamin ist ein wichtiger Teil der vorliegenden Arbeit, da diese aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften von Thiamin und den Thiaminphosphaten in zahlreichen vorausgegangenen Arbeiten zu Schwierigkeiten geführt hat und keine zufrieden stellende Methodik in der Literatur gefunden wurde. Daher wurde, sowohl bei der Probenaufarbeitung, als auch bei der Analyse mit HPLC und einem Fluoreszenzdetektor eine neue Möglichkeit der Trennung ausprobiert.
Die für die Entwicklung des Embryos notwendigen Mineralstoffe sind ebenfalls im Ei enthalten. Die Konzentration der Mineralstoffe in Eigelb und Eiklar, aber auch in den Fraktionen des Eigelbs im unbebrüteten Ei, ist bekannt. Vor allem Calcium, Eisen, Kupfer und Zink sind in den Granula des Eigelbs fest gebunden und daher nicht ohne weiteres verwertbar (Ternes et al., 1994).
Für den sich entwickelnden Embryo werden zwei unterschiedliche Arten der Nährstoffaufnahme diskutiert. Zum einen die Aufnahme der Granula per Endozytose in die Zellen, zum anderen ein extrazellulärer Abbau (Bellairs, 1958; Berg und Szekerczes, 1962; Freeman und Vince, 1974). Da ein Großteil der Mineralstoffe gebunden vorliegt, würden diese entweder bei der Endozytose der Granula mit aufgenommen oder bei der extrazellulären Verdauung frei und
sich im Plasma anreichern. Würden alle gebundenen Ionen ausschließlich per Endozytose aufgenommen, würde dies womöglich zu einer Anreicherung von Eisen-, Zink- und Kupferionen in toxischen Konzentrationen führen. Es ließen sich jedoch in der Literatur keine Angaben zum Mineralstoffgehalt in den Fraktionen embryonierter Eier finden, so dass unklar ist, ob beim extrazellulären Abbau Mineralstoffe freigesetzt werden und sich folglich im Plasma anreichern.
Die Bestimmung der Mineralstoffkonzentration im Plasma embryonierter Eier würde also einen wichtigen Hinweis liefern auf welche Weise die Mineralstoffe während der Embryogenese freigesetzt und vom Embryo aufgenommen werden.
Um den Mechanismus des extrazellulären Abbaus zu beleuchten, werden elektronenmikroskopische Aufnahmen der Granula unbebrüteter und bebrüteter Eier angefertigt um festzustellen, ob Veränderungen der Granula zu erkennen sind.
Einige Kationen, vor allem Eisen und Kupfer, liegen in den Granula in einem Komplex vor, so dass diese beim Verzehr eines Eies im Darm eine geringe Bioverfügbarkeit aufweisen. Für Eisen wurden daher schon einige technologische Bearbeitungsverfahren auf ihre Tauglichkeit hin getestet, das gebundene Eisen frei zu setzen und damit verfügbar zu machen. Nur Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Ascorbinsäure schienen diesbezüglich einen Effekt zu haben (Albright et al., 1984; Morris und Greene, 1972; Ternes et al., 1994). Für Kupferionen ließen sich keine Angaben finden, ob eine technologische Bearbeitung oder der Zusatz von Substanzen zum Eigelb eine Freisetzung fördert. Daher sollte in einem weiteren Versuchsaufbau der Einfluss verschiedener Substanzen auf die Freisetzung in den Granula gebundener Eisen- und Kupferionen untersucht werden, indem der Gehalt im Plasma bestimmt wurde.
In diesem Zusammenhang sollte auch untersucht werden, ob eine im Technikum des Instituts neu entwickelte Gefriertrocknungsmethode von Eigelb einen
2. S
CHRIFTTUM2.1 DAS HÜHNEREI
2.1.1 Aufbau des Hühnereies 2.1.1.1 Eischale
Die Eischale schützt das Eiinnere vor mechanischer Belastung und gewährleistet den Wärme-, Gas- und Flüssigkeitsaustausch. Für die späte Entwicklungsphase des Embryos wird außerdem Calcium aus der Schale (Glaser und Piehler, 1934;
Johnston. und Comar., 1955) für den Knochen- und Muskelaufbau mobilisiert.
Der anorganische Teil der Schale, die Kristallitschicht, besteht zu 95 % aus Calciumcarbonat und enthält nur einen geringen Anteil anderer Verbindungen, wie Magnesiumcarbonat, Tricalciumphosphat und Aragonit. Andere Elemente unter anderem Eisen, Kupfer und Zink kommen nur in Spuren vor (Ternes et al., 1994). Zur Eischale werden außerdem die Kutikula (Wachsschicht) und die Eischalenmembranen gezählt (siehe Abbildung 1).
2.1.1.2 Eiklar
Um die Dotterkugel ist das Eiklar angeordnet, das einen dreischichtigen Aufbau erkennen lässt (Abbildung 1). Innen liegt die innere dünnflüssige Schicht, gefolgt von der mittleren dickflüssigen Schicht. Ganz Außen liegt das äußere dünnflüssige Eiklar. In der Längsachse des Eies ziehen die Hagelschnüre, auch Chalazen genannt, zur Dotterkugel, wo sie mit der Dottermembran verbunden sind. Dadurch wird die Dotterkugel stabilisiert, wobei eine Drehung um die Längsachse gewährleistet bleibt, damit die Keimscheibe stets oben liegt. Die Abgrenzung des Eiklars zur Eischale bildet die zweischichtige Schalenhaut. Sie spaltet sich am stumpfen Pol des Eies auf und bildet die Luftkammer (Schnorr,
Das Eiklar stellt ein Flüssigkeitsreservoir dar, schützt das Eigelb vor mechanischer Einwirkung und enthält antibakterielle Stoffe (Ternes et al., 1994).
Calcium, Magnesium, Eisen, Kupfer und Zink sind im Eiklar nur in geringer Konzentration vorhanden, ebenso Thiamin, so dass für diese Substanzen das Eiklar vermutlich keine Speicherfunktion erfüllt (Waheed et al., 1985).
2.1.1.3 Eigelb
Abbildung 1: Schematischer Aufbau des Eies nach Schnorr (Schnorr, 1996) mit Änderungen nach Ternes (Ternes et al., 1994)
Das Eigelb (= Dotter) entsteht während der Bildung des Eies aus der weiblichen Eizelle und enthält daher einen Zellkern und ist von einer Zellmembran umgeben (Ternes et al., 1994). Laut Schnorr (1996) besteht die Dottermembran (Vitellinmembran (Burley und Vadehra, 1989)) von Innen nach Außen aus vier
Schichten, dem Plasmalemm, der Lamina perivitellina, der Lamina continua und der Lamina extravitellina. Mineki und Kobayashi (1997) dagegen konnten in elektronenmikroskopischen Aufnahmen nur drei Schichten der Dottermembran darstellen. Das im Inneren enthaltene Dotter besteht zu 3 % aus dem Bildungsdotter (weiß), einem Überbleibsel aus der frühen Phase der Dotterentwicklung, und zu 97 % aus dem Nahrungsdotter (gelb). Sie unterscheiden sich erheblich in Morphologie, chemischer Zusammensetzung und in ihren physikalischen Eigenschaften.
Das weiße Dotter besteht aus der etwa 6 mm großen, kugeligen Latebra (Dotterbett), die sich in der Mitte des Dotters befindet und dem Latebrahals, der zapfenförmig in das Dotter hineinragt. Der Latebrahals erweitert sich an der Dotterperipherie zum Panderkern, auf dem der abgeflachte Zellkern ruht.
Der Zellkern und das ihm umgebende Bildungsplasma bilden die Keimscheibe (Schnorr, 1996). Laut Schlesinger (1958) befindet sich auch eine dünne Schicht weißen Dotters direkt unterhalb der Dottermembran.
Das gelbe Dotter nativer Eier wird während der Dotterbildung in konzentrischer Schichtung um die Latebra angeordnet, welche bei uneinheitlicher Fütterung durch unterschiedliche Einlagerung von Pigmenten oder durch Färben, zu erkennen ist. In 3 - 4 Tage alten embryonierten Eiern dagegen, lässt sich diese Schichtung durch Färben nicht mehr darstellen (Grau, 1976). Morphologische Unterschiede des Eigelbs, die die Ringstruktur auch erklären könnten, konnten von Mineki und Kobayashi (1997) in elektronenmikroskopischen Aufnahmen an nativem Eigelb nicht festgestellt werden.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Eigelbpartikel
Das Eigelb kann als eine Suspension aus Partikeln in einer wässrigen Lösung aus Proteinen (Livetinen) bezeichnet werden (Abbildung 2) (Ternes et al., 1994). Bereits mit dem Lichtmikroskop sieht man die Dotterkugeln (=Kügelchen, Dotterkügelchen, engl.: spheres). Ihre Größe schwankt im weißen Dotter zwischen 4 und 75 µm und sie enthalten wenige, als Tröpfchen (engl.:
droplets) bezeichnete, Partikel. Im gelben Dotter dagegen sind sie 15 bis 150 µm groß und enthalten Tröpfchen in größerer Anzahl (Ternes et al., 1994). In elektronenmikroskopischen Aufnahmen stellten sich die Dotterkugeln polyedrisch dar (Woodward und Cotterill, 1987). Sie sind von einer Membran umgeben und enthalten eine Matrix aus einer wässrigen NaCl-Lösung (Ternes et al., 1994). Die Tröpfchen in den Dotterkugeln konnten auch von Bellairs (1961) dargestellt werden. Sie charakterisierte Dotterkugeln ohne, mit einer einschichtigen und mit einer mehrschichtigen Membran. Außerdem vermutete
sie, dass die Matrix außerhalb der Dotterkugeln des gelben und weißen Dotters eine ähnliche Beschaffenheit wie die Matrix in ihrem Inneren aufweist.
Die Dotterkugeln sind fragile Gebilde, die durch Belastungen wie Rühren, Verdünnen und Zentrifugieren zerstört werden. Burly und Vadehra (1989) beschreiben noch eine andere Art der Dotterkugeln, die unlöslich und gegenüber mechanischer Belastung stabiler sind.
Eine detaillierte Untersuchung und Beschreibung des Eigelbs und den enthaltenen Partikeln präsentierten Mineki und Kobayashi (1997). Sie fertigten sowohl trans- als auch rastereletronenmikroskopische Aufnahmen verschiedener Regionen des Eigelbs an. Sie konnten eine Struktur des nativen Eigelbs aus dicht gepackten polyedrischen Dotterkugeln bestätigen. Diese unterschieden sich in ihrer Größe und in ihrem Inhalt. Eine Schicht direkt unter der Dottermembran unterschied sich morphologisch erheblich von dem weiter Innen liegenden Eigelb. In dieser Rindenschicht identifizierten sie kleine 8 bis 12 µm große Dotterkugeln, sowie Öltröpfchen. In den Dotterkugeln identifizierten sie 0,3 bis 2,5 µm große Granula. Aufgrund ihrer strukturellen Charakteristika vermuteten sie, dass diese Strukturen sich noch in einem früheren Entwicklungsstadium befinden, außerdem schienen sie sich in Lösung zu befinden. Diese Ergebnisse bestätigen die Vermutung von Schlesinger (1958) dass sich unter der Dottermembran eine Schicht weißen Dotters befindet. In dem direkt darunter liegenden Dotter waren die Dotterkugeln mit etwa 22 µm Durchmesser kleiner als die weiter im Inneren liegenden, mit etwa 60 µm Durchmesser. Die in ihnen enthaltenen Partikel, die Granula, hatten einen Durchmesser von 0,25 - 1,75 µm. Die Außen liegenden kleineren Dotterkugeln enthielten größere Granula, als die größeren Dotterkugeln im Inneren des Eigelbs. Durch Anfärben konnten sie zeigen, dass die Granula aus 4 nm großen Proteinpartikeln bestehen. Die Dotterkugeln hatten eine glatte Oberfläche und entgegen den Angaben von Bellairs (1961), konnten sie keine
Membranstrukturen identifizieren. Zwischen den Dotterkugeln befanden sich, aufgrund ihrer Beschaffenheit und Anfärbbarkeit, Öltröpfchen.
Die Größe der Granula wird auch von anderen Autoren mit einem Durchmesser von 0,2 und 2 µm angegeben (Bellairs, 1961; Causeret et al., 1991; Chang et al., 1977a). Durch Ultrazentrifugation des Eigelbs sedimentieren diese, während der Überstand als Plasma bezeichnet wird. Die Proteine der Ganula bestehen zu etwa 12 % aus Low-Density-Lipoprotein, zu 16 % aus Phosvitin und zu 70 % aus Lipovitellin, welches auch als HDL (High-Density-Lipoprotein) der Granula bezeichnet wird.
Durch Zugabe von NaCl-Lösung, können die Granula in Untereinheiten aufgebrochen werden (Chang et al., 1977b; Garland und Powrie, 1978; Ternes et al., 1994). Die beiden flotierenden Schichten (VLDL-Fraktionen) enthalten Myelinpartikel und die Low-Density-Lipoproteine (LDL) der Granula, während die drei sedimentierenden Schichten den Phosvitin-Lipovitellin-Komplex enthalten (Ternes et al., 1994). Das Phosvitin ist ein Phosphoglykoprotein und das Lipovitellin (HDL) ein Phospholipoprotein. Bei der Dotterbildung wird das Metalltransportprotein des Huhns, das Vitellogenin, zu Phosvitin und Lipovitellin gespalten und eingelagert (Ternes et al., 1994).
Das durch Zentrifugation gewonnene Plasma kann durch erneute Zentrifugation in zwei weitere Fraktionen getrennt werden. In der wässrigen Phase sind Proteine, die Livetine, gelöst. Die darüber flotierende Schicht enthält Low- Density-Lipoproteine, mit einem Durchmesser von 23 bis 50 nm. Durch geeignete Trennverfahren (Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese) ließen sich molekulare Unterschiede in den einzelnen Eigelbfraktionen erkennen, so dass ein a- und ß-Phosvitin und ein a- und ß- Lipovitellin (HDL) in den Granula und ein a, ß und ?- Livetin im Plasma charakterisiert wurden. Das d-Livetin und das Apo-Vitellinin machen jeweils nur 2 % der Livetinfraktion aus (Ternes et al., 1994).
Tabelle 1: Zusammensetzung des Eigelbs
Eigelb
Granula Plasma
Low- Density- Lipoprotein
Phosvitin Lipovitellin (HDL)
Livetine Low-
Density- Lipoprotein a-Phosvitin ß-Phosvitin a- LV ß- LV a-L ß-L ?-L d-L Apo-1
HDL= High-Density-Lipoprotein LV= Lipovitellin
L= Livetin
1 = Apo-Vitellinin
Die Low-Density-Lipoproteine des Plasmas sind kugelige Partikel, deren Kern aus neutralen Lipiden von einer Membran aus Proteinen und Phospholipiden umschlossen ist. Die Low-Density-Lipoproteine der Granula sind diesen in ihrer Zusammensetzung ähnlich.
In der Literatur werden die Low-Density-Lipoproteine des Eigelbs zum Teil auch als Very-Low-Density-Lipoproteine bezeichnet, wobei es sich um dieselbe Fraktion handelt. Diese kontroverse Bezeichnung resultiert daraus, dass Lipoproteine im menschlichen Serum mit derselben Dichte wie die Lipoproteine des Eigelbs als Very-Low-Density-Lipoproteine bezeichnet werden (Biagi, 1964; Ternes et al., 1994).
2.1.2 Mineralstoffgehalt
Der Eisen-, Kupfer- und Zinkgehalt im Ei wird durch eine Erhöhung des Gehaltes in der Fütterungsration der Henne nicht wesentlich erhöht. Hohe Gehalte an Kupfer und Zink in der Futterration der Henne führen im Gegenteil zu einem deutlichen Rückgang der Legeleistung (Richards, 1997).
Untersucht man Eier derselben Henne ist der Mineralstoffgehalt relativ konstant, kann sich aber von Huhn zu Huhn dagegen deutlich unterscheiden (Manson et al., 1993). Zu diesen Ergebnissen kamen Manson et al. (1993) als sie die Mineralstoffgehalte in Eiklar und Eigelb bestimmten und die Varianzen des
Mineralstoffgehaltes in den Eiern einzelner Hennen mit denen der Gesamtpopulation verglichen.
Tabelle 2: Gehalt und Schwankung einiger Mineralstoffe im Ei
Fraktion Mineralstoff Ø Gehalt
Variations- bereich
Variations- koeffizient
Reproduzier- barkeit
µg/g µg/g % t
Eigelb Calcium 2550 2080- 3130 8,1 0,36
Magnesium 240 210- 260 7,5 0,19
Eisen 150 100- 180 11,8 0,64
Eiklar Calcium 180 90- 260 19,9 0,13
Magnesium 120 90- 140 12,7 0,57
t= Varianzen zwischen einzelner Hennen/(Varianz zwischen und Varianz innerhalb der Hennen) nach Manson et al. (1993)
Die Autoren geben an, dass ein Wert von t > 0,3 eine signifikante Abweichung in der Varianz der Werte zwischen den Hennen und von ein und derselben Henne bedeutet. Für Calcium und Eisen im Eigelb schwanken die Gehalte zwischen den Hennen, sind aber in Eiern derselben Henne relativ konstant. Dies gilt ebenso für Magnesium im Eiklar. Für die anderen Mineralstoffgehalte ist die Schwankung im Gehalt von Eiern verschiedener Hennen genauso groß wie die Schwankung in Eiern derselben Henne.
Die Verteilung der Mineralstoffe im Plasma und der Granula des Eigelbs wurde mit Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt und durch die Dialysierbarkeit ermittelt inwieweit die Elemente an Proteine gebunden sind (Wakamatu et al., 1982b).
Eine Übersicht zum Gehalt, der Verteilung und der Dialysierbarkeit ist in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Gehalt, Verteilung und Dialysierbarkeit der Mineralstoffe in Eigelbfraktionen
Mineralstoff Fraktion Gehalt Verteilung
Dialysier- barkeit
µg/g Tr. M. % %
Gesamteigelb 2720
Plasma 580 16,7 98,3
Calcium
Granula 9880 83,3 1
Gesamteigelb 260
Plasma 110 32,1 45,5
Magnesium
Granula 790 67,9 5,1
Gesamteigelb 100
Plasma In Spuren 1
Eisen
Granula 480 99 22,9
Nach Wakamatu et al. (1982a)
Anhand dieser Ergebnisse sind die im Plasma enthaltenen Ionen weniger stark an Proteine gebunden als Ionen in den Granula. Besonders Calcium und Magnesium scheinen in der Granulafraktion überhaupt nicht in freier Form vorzukommen, während Calcium fast vollständig in freier Form und Magnesium gut zur Hälfte in freier Form im Plasma vorliegt. Eisen ist zu einem Großteil in den Granula vorhanden und dort zu 80 % in gebundener Form, wobei andere Autoren eine Bindung von über 90 % angeben (Richards, 1997; Ternes et al., 1994).
Im Rahmen der Untersuchung von Hennen mit einem Gendefekt wurde von Grau und Roudybush (1979b) der Mineralstoffgehalt in den Fraktionen der Eier von Kontrolltieren gemessen. Ihre Ergebnisse sind in den Kapiteln über die einzelnen Mineralstoffe angegeben (siehe 2.3 und 2.4). Eine Übersicht über Mineralstoffangaben verschiedener Autoren ist nachfolgend aufgeführt.
Tabelle 4: Mineralstoffgehalt im gesamten Ei
Mineralstoffgehalt in µg/g Feuchtsubstanz
Quelle Calcium Magnesium Eisen Kupfer Zink
Everson & Sounders 1957 540 90 21 1,7 13
Cook & Briggs 1973 540 110 23 - -
Cotteril 1977 590 124 23 6 15
Souci 1986 560 120 21 - 13,5
Mineralstoffgehalt in µg/g Trockenmasse
Quelle Calcium Magnesium Eisen Kupfer Zink
Everson & Sounders 1957* 2077 346 81 6,5 50
Cook & Briggs 1973* 2053 418 87,5 - -
Cotteril 1977* 2332 490 90,9 23,7 59,3
Souci 2000 1900 460 88 2,38 50
* berechnet nach der von den Autoren angegebenen Trockenmasse
Tabelle 5: Mineralstoffgehalt im Eigelb
Mineralstoffgehalt in µg/g Feuchtsubstanz
Quelle Calcium Magnesium Eisen Kupfer Zink
Everson & Sounders 1957 1470 130 56 2,5 38
Cook & Briggs 1973 1410 160 55 - -
Cotteril 1977 1360 124 59 1,3 38
Souci 1986 1400 160 72 - 38
Mineralstoffgehalt in µg/g Trockenmasse
Quelle Calcium Magnesium Eisen Kupfer Zink
Grau 1979 - 177 69,4 20,3 46,9
Wakamatu 1982 2720 260 100 - -
Everson & Sounders 1957* 2905 257 110,7 4,9 75,1
Cook & Briggs 1973* 2883 327 112,5 - -
Cotteril 1977* 2677 244 116 2,6 74,8
Souci 2000 2820 280 140 - 1,5
Romanoff 1967 2900 780 150 4,8
* berechnet nach der von den Autoren angegebenen Trockenmasse
Tabelle 6: Mineralstoffgehalt im Eiklar
Mineralstoffgehalt in µg/g Feuchtsubstanz
Quelle Calcium Magnesium Eisen Kupfer Zink
Everson & Sounders 1957 60 110 3 4 -
Cook & Briggs 1973 90 90 1 - -
Cotteril 1977 90 124 - 2 -
Mineralstoffgehalt in µg/g Trockenmasse
Quelle Calcium Magnesium Eisen Kupfer Zink
Everson & Sounders 1957* 492 902 24,6 32,8 -
Cook & Briggs 1973* 726 726 8,1 - -
Cotteril 1977* 841 1159 - 18,7 -
Souci 2000 840 720 9 - 62
Romanoff 1967 850 1500 33,3 3,4
* berechnet nach der von den Autoren angegebenen Trockenmasse
2.1.3 Technologische Behandlung von Eigelb
Zur technologischen Behandlung des Eigelbs gehört das Erhitzen, Kühlen, Trocknen und das Versetzen mit Zutaten. Diese Verfahren werden zum Konservieren, bei der Verarbeitung von Eigelbprodukten, zur Veränderung der technofunktionellen Eigenschaften, oder auch zur Beeinflussung des Nähr- und Genußwertes des Eigelbs genutzt.
2.1.3.1 Gefrieren
Der Gefrierpunkt für Eigelb liegt bei durchschnittlich -0,601 °C. Um eine Säurebildung, mikrobielles Wachstum, Verfärbungen und Veränderungen des Geschmacks zu vermeiden, muss ein langsames Gefrieren verhindert werden.
Daher werden Schnellgefrierverfahren bei -40 °C und hoher Luftgeschwindigkeit eingesetzt.
Beim langsamen Einfrieren und Auftauen von Eigelb erhöht sich, aufgrund struktureller Veränderungen, die Viskosität. Diese zumeist irreversible
Temperatur eine längere Zeit gelagert wird. Bei niedrigeren Temperaturen reicht eine kürzere Lagerdauer. Beim schnellen Gefrieren bei niedrigeren Temperaturen kann eine Gelbildung verhindert werden. Um eine Gelbildung zu vermeiden, können außerdem 10 bis 50 % Saccharose, 0,15 % Papain oder 4 % Kochsalz sowie Phospholipase A zugesetzt werden. Die Gelbildung kann aber nicht nur durch Zusätze, sondern auch durch mechanische Einwirkungen, wie Homogenisieren verhindert werden. Bei der Gelbildung spielen offenbar die Lipovitelline und die Low-Density-Lipoproteine eine Rolle. Der Gefrierprozess bewirkt einen Wasserverlust im Eigelb, so dass die Proteine ihre Hydrathülle verlieren. Außerdem findet eine Konzentration von Proteinen und Salzen in der restlichen flüssigen Phase statt. Durch diese Bedingungen wird eine Umlagerung und Aggregation von Lipoproteinen begünstigt. Die strukturellen Veränderungen können in elektronenmikroskopischen Aufnahmen dargestellt werden. Nicht gefrorenes Eigelb weist ein feines Netzwerk mit kleinen Hohlräumen auf. Nach dem Gefrieren und Wiederauftauen erscheint es als ein gröberes Netzwerk mit größeren Hohlräumen. Mit der Weitmaschigkeit der Struktur ist die Zunahme der Viskosität korreliert. Die Ursache der Gelbildung liegt offenbar in dem Plasma des Eigelbs, da dieses beim Einfrieren bei -8 °C ein Gel bildet, wohingegen eine Granulasuspension in Wasser dies nicht tut.
Eine Gelbildung der Granula findet allerdings ebenfalls statt, wenn bei der Behandlung die Granula zerstört werden, so dass die Low-Density-Lipoproteine frei werden. Die aggregierten Proteine konnten als Low-Density-Lipoproteine identifiziert werden, allerdings sollen auch Livetine an der Aggregation beteiligt sein (Ternes et al., 1994).
Bislang wird deshalb die thermische Trocknung des Eigelbs im industriellen Maßstab bevorzugt. Aber auch bei der thermischen Behandlung werden die technofunktionellen Eigenschaften des Eigelbs verändert, so dass die Nutzung dieser Eigelbpulver in Eigelbprodukten nur eingeschränkt möglich ist.
Gegenüber frisch hergestellten Produkten haben diese Produkte zudem einen
veränderten Genusswert. Um die technofunktionellen Eigenschaften frischer Eigelbprodukte zu simulieren müssen andere Zusätze wie Emulgatoren oder Stabilisatoren zugefügt werden. Von Ternes und Dautel (2007) wurde daher ein Gefriertrocknungsverfahren entwickelt bei dem die technofunktionellen Eigenschaften des Eigelbs erhalten bleiben. Das Verfahren ist unter 3.1.3 näher beschrieben.
2.1.3.2 Zutaten
Durch den Zusatz von Salz (NaCl) wird die Löslichkeit der Proteine der Granula, durch Zerstörung der Struktur der Granula, erhöht (Causeret et al., 1992; Hasiak et al., 1972; Ternes et al., 1994; Ternes, 1991).
Der Zusatz von Salz führt zu einer höheren Dialysierbarkeit von Calcium. Die Differenz von 17,4 % Dialysierbarkeit ohne Zusatz zu 35,4 % mit Zusatz, legt nahe, dass 18 % des gebundenen Calciums freigesetzt werden. Vermutlich werden Calciumionen aus den Phosphor-Calcium-Brücken des Phosvitin- Lipovitellin-Komplexes verdrängt und somit die Granula destabilisiert. Die Dialysierbarkeit von Eisen konnte dagegen nicht erhöht werden.
Der Zusatz von EDTA zur Granulafraktion führt zu einer fast vollständigen Dialysierbarkeit von Calcium (99,6 %) und Eisen (94 %), da diese an EDTA gebunden werden (Causeret et al., 1992). Ein Zusatz von 0,02 M Citronensäure führte ebenfalls zu einer leichten Erhöhung, wohingegen für 1 M NaCl Lösung kein Effekt festgestellt werden konnte (Albright et al., 1984). Durch die Destabilisierung der Granula und den Verlust der Calcium- und Eisenionen erhöhte sich die Löslichkeit der Proteine der Granula.
Die Dialysierbarkeit der Ionen und die Struktur der Granula kann auch durch Zusatz von Ionen beeinflusst werden. So führt die Zugabe großer Mengen Calciumchlorid (CaCl2) zur Destabilisierung der Granula, während eine
Phosphatbindungsstellen und die Struktur der Granula gegenüber NaCl wird stabilisiert (Causeret et al., 1992).
Auch in Mayonnaise ist Eigelb vorhanden und ein Zusatz von Ascorbinsäure, hat Einfluss auf den Gehalt an freien Eisenionen in Mayonnaise haben, wie von Jacobsen et al. (1999) festgestellt wurde. Der Gehalt an Eisen im Präzipitat und in der Emulsionsphase wurde gegen den Gehalt in der wässrigen Phase gemessen. Je größer der Zusatz von Ascorbinsäure, desto mehr Eisen konnte in der wässrigen Phase gefunden werden, während gleichzeitig der Gehalt in den anderen beiden Phasen abnahm. Der Zusatz von Ascorbinsäure betrug zwischen 2,27 und 22,7 mM bei verschiedenen pH-Werten. Der größte Effekt konnte bei niedrigen pH-Werten beobachtet werden. Eine pH-Wert-Absenkung mit Essigsäure hatte dagegen keinen solchen Effekt. Ascorbinsäure reduziert an Phosvitin gebundene, sowie freie Eisen-(III)-Ionen, zu Eisen-(II)-Ionen und bindet Eisenionen in beiden Oxidationsstufen (Jacobsen et al., 2001). Diese Ergebnisse decken sich mit Studien, die für Eigelbpulver durchgeführt wurden.
Wird Eigelbpulver mit Ascorbinsäure oder Ascorbinsäure-6-Palmitat versetzt, kann für beide Zusätze eine Freisetzung von Eisen-(II)-Ionen aus dem Eisen- (III)-Phosvitin-Komplex festgestellt werden (Nielsen et al., 2000). Durch weitere Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass Eisen-(III)-Ionen wesentlich stärker an Phosvitin gebunden sind als Eisen-(II)-Ionen (Grogan und Taborsky, 1986).
2.1.3.3 pH-Wert
Bei pH 6,3, der dem des nativen Eigelbs von 6,0 (Burley und Vadehra, 1989) in etwa entspricht, bilden Lipovitellin, Phosvitin und Low-Density-Lipoproteine in den Granula einen unlöslichen Komplex. Bei einem pH-Wert unter 4,2 werden vermutlich die Ionenbrücken aufgebrochen und bei über pH 6,3 führt wahrscheinlich die Zunahme von elektrostatischer Abstoßung durch negativ
beiden Fällen nimmt dadurch die Löslichkeit der Proteine der Granula zu (Causeret et al., 1992; Hasiak et al., 1972; Ternes et al., 1994). Wird der pH- Wert anschließend wieder auf den ursprünglichen Wert gebracht, vermindert sich die Löslichkeit wieder. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen allerdings, dass die Granula dabei irreversibel zerstört werden (Causeret et al., 1991).
Bei Absenkung des pH-Wertes mit Citronensäure unter pH 2,5 zeigt Eigelb eine deutliche Gelbildung, die bei pH 3,5 beginnt (Guerrero et al., 2004).
Studien zur Eisenbindung von Phosvitin haben gezeigt, dass eine Absenkung von pH 6,5 auf pH 3 keinen Einfluss auf an Eisen gebundenes Phosvitin hat (Castellani et al., 2004).
2.1.3.4 Trocknung
In Fabrikationsanlagen für Eiprodukte wird Eigelb mittels Sprühtrocknung getrocknet. Es gibt die Möglichkeit der Zentrifugenverstäubung und die Hochdruck- (Nozzle-) Verstäubung (Ternes et al., 1994). Bei diesen Trocknungsverfahren werden die Eigelbproteine thermisch geschädigt.
Die Möglichkeit der Gefriertrocknung besteht ebenfalls. Die Nachteile dieser Methode sind der hohe Energieaufwand, der hohe apparative Aufwand und die Gefahr der Beeinträchtigung der technofunktionellen Eigenschaften des Eies.
Der Trockensubstanzgehalt des Eiklars beträgt 13,1 ± 8 % und im Eigelb 52,4 ± 1,9 % (Ternes et al., 1994).
2.2 EMBRYONALENTWICKLUNG
2.2.1 Entwicklung des Embryos
Die Entwicklung des Embryos im Hühnerei beträgt von der Ablage eines befruchteten Eies bis zum Schlupf eines Kükens 22 Tage (Burley und Vadehra, 1989).
Schon direkt nach der Befruchtung im Infundibulum (lat. Trichter) des Eileiters der Henne bildet sich durch Furchung aus dem Zellkern die mehrschichtige Keimscheibe (Blastoderm) (Schnorr, 1996). Dabei ruht die Keimscheibe auf dem Panderkern, steht also in direktem Kontakt zum weißen Dotter. Direkt vor der Eiablage besteht die Keimscheibe schon aus etwa 60 000 Zellen, aus denen sich der Embryo und die extraembryonalen Gewebe bilden (siehe Abbildung 1).
Zu den extraembyronalen Strukturen werden die Dottersackmembran, die Eiklarmembran, die Chorionmembran, die Allantoismembran, die Chorioallantoismembran, die Amnionmembran, die Vitellinmembran (Eigelbmembran) und die Schalenmembran gezählt. Die Vitellinmembran wird bei der Befruchtung von den Spermatozoen durchbrochen und wird während der ersten 3 bis 4 Tage durch die Entwicklung des Embryos so stark geschädigt, dass sie am animalen Pol, d.h. in der Nähe der Keimscheibe reißt (Burley und Vadehra, 1989). Durch die Eiablage wird die weitere Embryonalentwicklung kurzfristig unterbrochen und erst während des Brütens fortgesetzt. Von der Keimscheibe aus umwächst die Dottersackmembran, direkt unter der Vitellinmembran, das Dotter. Bereits nach 2 ½ Tagen haben Blutgefäße die Dottermembran durchsetzt, so dass der durch die Dottersackepithelzellen phagozytierte Dotter dem Embryo zugeführt wird (Schnorr, 1996). Am neunten Tag schließt sich die dreischichtige Dottersackmembran und bildet so den Dottersack. Um die Kontaktfläche zum Dotter zu erhöhen, besitzt die innere Schicht Ausstülpungen die in das Eigelb ragen. Über den Ductus
vitellointestinalis ist der Embryo mit der Dottersackmembran verbunden. In der Dottersackmembran sind verschiedene Enzyme aktiv, die das aufgenommene Dotter verstoffwechseln. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase beispielsweise ist am 5. bis 7. Tag und die Aktivität der sauren Phosphatase am 9. bis 12. Bebrütungstag am höchsten. Die Tatsache, dass weder Phosvitin noch Lipovitellin im embryonalen Blut gefunden wurden, legt nahe, dass diese beiden Proteine bereits in der Dottersackmembran verstoffwechselt werden. In der Spätphase der Inkubationszeit vermischen sich Eiklar und Eigelb und Ovalbumin aus dem Eiklar akkumuliert in der Granulafraktion (Burley und Vadehra, 1989).
Die Amnionmembran wird nach 30 Stunden Inkubationszeit gebildet und umschließt den Embryo als flüssigkeitsgefüllter Sack, in dem der Embryo schwimmt. Er hat die Aufgabe den Embryo vor mechanischen Einwirkungen zu schützen. Die Chorioallantoismembran ist eine zusammengesetzte Membran aus der Chorionmembran und der Allantoismembran. Die Chorionmembran wächst zur selben Zeit wie die Amnionmembran, wohingegen die Allantoismembran erst am zweiten Tag gebildet wird. Die beiden Membranen fusionieren und umgeben am 11. oder 12. Tag der Embryonalentwicklung den Embryo und die Amnionhöhle. Wie die Amnionmembran sind sie stark mit Blutgefäßen durchsetzt. Der Chorionteil der Membran liegt der Eischale an und ist für den Sauerstoffaustausch und die Aufnahme von Calciumionen und dessen Transport zuständig. Der innere Allantoisteil der Membran übernimmt den Flüssigkeits- und ebenfalls den Ionentransport. Die beiden Membranen sind über den Urachus (Nabel) mit dem Embryo verbunden (Burley und Vadehra, 1989).
Das Eiklar verliert während der Inkubationszeit vor allem Flüssigkeit und erst in der letzten Woche etwa ein Drittel seiner Proteine, die in das Dotter übergehen.
Dephosphoryliertes Ovalbumin kann ab dem 18. Tag im embryonalen Blut nachgewiesen werden (Burley und Vadehra, 1989).
Abbildung 3: Schematische Aufbau eines Embryo am 10 bis 11 Bebrütungstag (Schnorr, 1996)
Somit zeigt das Eiinnere eines befruchteten Hühnereies bereits nach wenigen Tagen einen charakteristischen Aufbau: Die Kalkschale mit Schalenhaut schließt das Eiinnere ein. Die zweischichtige Schalenhaut trennt sich am stumpfen Pol und bildet eine Luftkammer. Unter der Eischalenhaut liegt das Eiklar, welches rundherum das Chorion umschließt. Im Chorion liegen die Allantois, die über den Allantoisstiel mit dem Embryo verbunden ist, sowie der Dottersack und die Amnionhöhle, die den Embryo schützend umgibt (Schnorr, 1996).
2.2.2 Verbleib der Mineralstoffe während der Embryogenese
Während der Embryonalentwicklung werden die Granula von den Endodermalzellen der Dottersackmembran durch Endozytose aufgenommen (Juurlink und Gibson, 1973; Lambson, 1970; Mobbs und McMillan, 1979).
des Hühnerembryos an und identifizierte die aufgenommenen Granula in den Zellen (Bellairs, 1958). In den Granula bilden an Phosvitin und Lipovitellin gebundene Eisen-, Kupfer- und Zinkionen mit Calciumionen einen Komplex.
Werden die Mineralstoffe nicht vorher abgelöst, würden sie bei der Endozytose der Granula ebenfalls aufgenommen werden. Das in Phagosomen aufgenommene Phosvitin und Lipovitellin wird in diesen abgebaut, so dass die gebundenen Mineralstoffe freigesetzt würden.
Neben diesem intrazellulären Eigelbabbau wird ein extrazellulärer Eigelbabbau diskutiert, der von Freeman und Vince (1974) zusammengefasst wurde: Vom zweiten Tag der Embryonalentwicklung an können Hinweise auf eine extrazelluläre Verstoffwechselung des Eigelbs festgestellt werden. Die Endodermalzellen der Dottersackmembran setzen Enzyme frei und nehmen die Abbauprodukte wieder auf. Das gesamte aufgenommene Material wird über den Blutkreislauf zum Embryo transportiert. Es wurden bislang drei proteolytische Enzyme gefunden, die an der Hydrolyse von Proteinen beteiligt sind. Da diese auch in unembryonierten Eiern gefunden wurden, werden sie schon bei der Eibildung ins Ei eingelagert. Die Proteinaseaktivität ist ab dem vierten Tag feststellbar und erhöht sich während der Embryogenese weiter. Dadurch werden Aminosäuren freigesetzt. Ab dem 6. Inkubationstag werden diese auch aktiv durch ein Transportsystem aufgenommen. Bis zum 13. Tag der Inkubation werden die Granula stetig abgebaut und ein Transfer von Protein-Stickstoff aus dem Eigelb in den Embryo ist zu verzeichnen. Die Konzentration gelöster Proteine nimmt auch durch die Vermischung von Eiklar und Eigelb zu. Für Phosphat konnte belegt werden, dass es durch eine Phosphoproteinphosphatase, die im Endoderm und im Eigelb gefunden wurde, freigesetzt wird (Freeman und Vince, 1974).
Je nach Bedarf des Embryos werden Mineralstoffe entweder in der Dottersackmembran gespeichert oder in das Blutplasma abgegeben, damit sie
insbesondere für Zink bestätigt werden (Richards und Steele, 1987). Ein größerer Teil des aufgenommenen Eisens wird direkt in der Dottersackmembran für den Aufbau von Erythrozyten verwendet (Simkiss, 1991). Kurz vor dem Schlupf (21. Tag) können in der Dottersackmembran wesentlich höhere Mineralstoffgehalte als im Eigelb gemessen werden. Metallothionein, als Zink und Kupfer bindendes und Ferritin als Eisen bindendes Protein können in der späten Embryonalphase in der Dottersackmembran nachgewiesen werden. Ihnen wird daher auch eine Speicherfunktion zugesprochen. Transferrin, Albumin und a-Fetoprotein werden dagegen in der Eigelbmembran zum Transport von Mineralstoffen gebildet, die dann mit dem Blut über den Vitellin-Kreislauf zum Embryo transportiert werden. Auf diese Weise kann eine große Menge an Spurenelementen in der Dottersackmembran gespeichert werden und der Embryo seinen Bedürfnissen entsprechend mit diesen versorgt werden. Diese Vermutung legen Schwankungen im Mineralstoffgehalt wie auch im Gehalt der Mineralstofftransportproteine während der Embryonalentwicklung nahe. Die Regulation über die Dottersackmembran gewährleistet, dass eine Unterversorgung oder eine Überversorgung an in hohen Konzentrationen toxisch wirkenden Spurenelementen vermieden wird. Bei der Messung der Gehalte an Spurenelementen im sich entwickelnden Embryo fallen eine hohe Konzentration am fünften Tag und ein Abfallen der Konzentration an den darauf folgenden Tagen auf. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die Entwicklung der Dottersackmembran am fünften Tag noch nicht abgeschlossen ist und sie daher ihre regulatorische Funktion noch nicht vollständig erfüllen kann.
Möglicherweise ist aber auch ein höherer Bedarf an Spurenelementen die Ursache für die höhere Konzentration am fünften Tag.
Calcium wird in der späten Phase der Embryonalentwicklung zusätzlich über die Eischalenmembran und die Chorioallantoismembran aufgenommen.
Experimente mit der Chorioallantoismembran bestätigten dies und legen den Schluss nahe, dass zwei Calciumpumpen, eine für jede Zellschicht in der
Membran, enthalten sein müssen (Moriarty, 1973). Bis zum 9. oder 10. Tag der Embryogenese werden 85- 95 % des Calciumbedarfs des Embryos durch das in den Granula gespeicherte Calcium gedeckt. Danach werden Calciumionen aus der Eischale mobilisiert (Johnston und Comar, 1955). Dass die Anwesenheit der Eischale während der Inkubation einen Einfluss auf den Mineralstoffgehalt im Hühnerembryo hat, konnte durch Untersuchungen an schalenlosen Eiern bestätigt werden. Die Mineralstoffgehalte im Embryo und im Gesamtei an Calcium, Magnesium, Kalium und Natrium wurden zwischen dem 8. und 21.
Tag bestimmt. Der Calcium- und Magnesiumgehalt in Embryos, die ohne Eischale inkubiert wurden, war wesentlich niedriger als der Gehalt in der Kontrollgruppe. Während der Calciumgehalt im Gesamtei in der Kontrollgruppe stetig anstieg, war er für die schalenlosen Embryos sehr niedrig.
Dies ist ein Hinweis darauf, dass Calciumionen während der Embryonalentwicklung aus der Eischale mobilisiert werden. Während allerdings der Calciumgehalt deutlich unterschiedliche Werte, sowohl im Embryo als auch im Gesamteiinhalt aufwies, konnte kein so deutlicher Unterschied für den Magnesiumgehalt festgestellt werden. Es wird daher angenommen, dass Magnesium sowohl aus der Eischale als auch den Granula mobilisiert wird (Dunn und Boone, 1977).
Welche Rolle die Chorioallantoismembran bei der Versorgung des Embryos mit anderen Mineralstoffen spielt, ist noch nicht hinreichend aufgeklärt. Eine Aufnahme von aufgetragenen Metallsalzen konnte zumindest bestätigt werden.
Außerdem wird Metallothionein in der Membran synthetisiert an das das aufgenommene Zink gebunden wird. Ob allerdings Spurenelemente aus der Eischale und der Eischalenmembran in vivo aufgenommen werden, ist unklar.
Durch die Vermischung von Eiklar und Eigelb während der Embryogenese, wird auch an Transferrin gebundenes Eisen aus dem Eiklar in der Synthese von roten Blutkörperchen genutzt. Für die Amnionmembran konnte bislang keine
Rolle in der Verstoffwechselung von Spurenelementen festgestellt werden (Richards, 1997).
Der Gehalt von Kupfer, Eisen, Magnesium und Zink vom 5. bis zum 18.
Inkubationstag nimmt, gegen das Embryogewicht aufgetragen, ab. Eine Erklärung dafür wäre, dass das Wachstum des Embryos die Mineralstoffaufnahme übersteigt. Wird hingegen der absolute Gehalt im Embryo und im gesamten Ei bestimmt, kann ein Transfer von Mineralstoffen angenommen werden (Dewar et al., 1974).
2.3 MENGENELEMENTE
Zu den Mengenelementen werden Calcium, Phosphor, Magnesium, Kalium, Natrium, Chlor und Schwefel gezählt, da jedes von ihnen in einer Konzentration von mehr als 50 mg pro kg Körpermasse im Organismus vorhanden ist (Engelhardt und Breves, 2000).
2.3.1 Calcium
2.3.1.1 Biologische Bedeutung
Bei einem erwachsenen Individuum sind 99 % des gesamten Calciumgehaltes als apatitische Calciumphosphate im Knochen lokalisiert und sorgen für dessen Stabilität (Engelhardt und Breves, 2000). Fehlt das Calcium im Knochen werden diese brüchig, dies wird auch als Osteoporose bezeichnet. Die restlichen Calciumionen des Organismus erfüllen wichtige Aufgaben bei der Signalübertragung in den Nerven, bei der Muskelkontraktion, bei der Hormonproduktion, im Flüssigkeitshaushalt, bei der Herzmuskelkontraktion und bei der Blutgerinnung (Tolonen, 1990).
2.3.1.2 Vorkommen im Ei
Im Ei kommt Calcium vor allem im Eigelb vor (Tabelle 7) und dort vor allem in den Granula (Tabelle 8). Die Dialysierbarkeit gibt an, wie viel Prozent der Calciumionen in freier Form vorkommen. Fast alle Calciumionen in den Granula sind in einem Komplex aus Lipovitellin und Phosvitin gebunden. Die im Plasma vorkommenden Calciumionen liegen dagegen fast vollständig in freier Form vor.
Tabelle 7: Calciumgehalt im Ei
_______
µg/g in der Feuchtsubstanz _________ µg/g Tr. M.
1 2 3 4 5
Calcium Gesamtei n.a. n.a. n.a. n.a. 1900
Eigelb 1180 1390 630- 2150 1360 2820
Eiklar 150 70 70- 290 90 840
1: nach Manson et al. (1993), Erste Messreihe 2: nach Manson et al. (1993), Zweite Messreihe 3: nach Shenstone (1968)
4: nach Cotterill et al. (1977)
5: Mineralstoffgehalt nach Souci et al. (2000) n.a.: nicht angegeben
Tabelle 8: Verteilung und Dialysierbarkeit der Calciumionen im Ei
µg/g Tr. M. Verteilung in % Nicht dialysierbar in %
Calcium Eigelb 2720 - -
Granula 9880 83,3 99,0
Plasma 580 16,7 1,7
Mineralstoffgehalt nach Wakamatu et al. (1982a)
Eine weitaus größere Calciumreserve als das Eigelb ist die Eischale, welche etwa 10 % des Eigewichtes ausmacht. Die in ihr zu 95 % enthaltenen anorganischen Calciumsalze bestehen zu 98 % aus Calciumcarbonat und zu weniger als 1 % aus Magnesiumcarbonat und Tricalciumphosphat (Burley und Vadehra, 1989; Ternes et al., 1994). Grob geschätzt enthält eine durchschnittliche Eischale von etwa 6 g einen Calciumanteil von etwa 2,5 g.
Dieser Wert von 2 bis 2,5 g Calcium für die Calcifizierung der Eischale wird
Die Eischale ist somit die größte Calciumreserve im Ei. Die Calciumionen im Eigelb sind vor allem in den Granula lokalisiert und dort zu 99 % an Proteine gebunden (Tabelle 5). Die Calciumionen im Eigelb werden während der ersten 10 Tage der Embryonalentwicklung als Calciumquelle genutzt (Causeret et al., 1991; Johnston und Comar, 1955). In diesen ersten Tagen ist der Abfall der Calciumkonzentration im Eigelb und Eiklar proportional zum Anstieg des Calciumgehaltes im Embryo. Nach dem siebten Tag steigt der Calciumgehalt im Eigelb bis zum 19. Tag stärker an. Vergleicht man außerdem den Calciumgehalt des gesamten Eiinhaltes am Anfang der Inkubation mit dem Gesamtcalciumgehalt am Ende der Inkubationszeit, dann lässt sich eine Erhöhung um 400 % verzeichnen, die eine Calciummobilisation aus der Eischale vermuten lässt.
Eine Zusammenfassung zur Calciummobilisation aus der Eischale präsentierten Glaser und Piehler (1934). Demnach diffundiert vom Embryo gebildetes Kohlendioxid (CO2) zur Eischale, wo sich aus dem unlöslichen Calciumcarbonat (CaCO3) lösliches Calciumhydrogencarbonat (Ca(HCO3)2) bildet, welches wieder zum Embryo diffundiert. Ab dem siebten Tag der Embryonalentwicklung steigt der Calciumgehalt der Eischalenmembran stark an und erreicht ein Maximum kurz vor dem Schlupf. Nach dem 9. Tag der Embryonalentwicklung berührt die Allantoismembran die Eischalenmembran (Burley und Vadehra, 1989) und man könnte annehmen, dass von den sie durchziehenden Blutgefäßen nicht nur CO2 abgegeben, sondern auch Calciumcarbonat aufgenommen wird (Romanoff und Romanoff, 1967). Die Anwesenheit von Calciumcarbonat in der Membran konnte durch Versuche mit Bariumhydroxid (Ba(OH)2) bestätigt werden. Während der Embryogenese können Erosionen in der Eischale und eine Vergrößerung der Poren beobachtet werden, die die Annahme einer Calciumabsoprtion aus der Eischale erhärten.
Die Vergrößerung der Poren ist darüber hinaus auch notwendig für den Gasaustausch (Romanoff und Romanoff, 1967).
Insgesamt werden 78 bis 82 % des Calciumsbedarfs des Embryos durch die Eischale gedeckt und der Rest durch die Calciumionen in den Granula. Obwohl die Chorioallantoismembran stark mit Blutgefäßen durchsetzt ist und einen direkten Kontakt zum Embryo hat, soll das aufgenommene Calcium zunächst in die Granula gelangen und von dort zum Embryo transportiert werden, da der Calciumgehalt in den Granula ab dem 15. Inkubationstag stark ansteigt (Burley und Vadehra, 1989).
2.3.2 Magnesium
2.3.2.1 Biologische Bedeutung
Magnesium ist zu 60 % im Knochen und der Rest hauptsächlich in den Zellen, vor allem Muskelzellen und Organen, lokalisiert (Oberleas et al., 1999). In Zellen werden Magnesiumionen für die Zellatmung, die Zellteilung und Enzymproduktion benötigt und für die Aufrechterhaltung der Funktion der Zellmembran.
In den Muskeln werden Magnesiumionen für die Muskelkontraktion benötigt, so dass ein Magnesiummangel zu Muskellähmungen führen kann. Sie erfüllen außerdem wichtige Funktionen im Herzmuskel und sind für einen niedrigen Blutdruck verantwortlich.
Eine weitere wichtige Funktion scheinen Magnesiumionen bei der Immunabwehr zu erfüllen, da offenbar weniger Antikörper gebildet werden, wenn weniger Magnesium mit der Nahrung aufgenommen wird. In Patientenstudien war die Milderung der Symptome von immunologisch bedingten Erkrankungen wie Allergien und Asthma scheinbar mit einer erhöhten Magnesiumaufnahme korreliert. Außerdem konnte ein reduzierter Histamingehalt im Blut festgestellt werden (Tolonen, 1990).
Eine chronische Unterversorgung an Magnesium führt außerdem zu Calciumablagerungen in weichem Gewebe und Blutgefäßen, wohingegen eine schwere akute Unterversorgung zu Gefäßerweiterung, Haarausfall, Zyanose, Übererregbarkeit und Krämpfen führt, die letztlich auch tödlich sind. Umgekehrt führt eine zu hohe Magnesiumkonzentration im Blut zur Erweiterung der Blutgefäße, Durchfall, Blutdruckabfall, Störung des zentralen Nervensystems, Atem- und Herzstillstand. Vergiftungsfälle durch eine hohe Magnesiumaufnahme mit der Nahrung sind bislang nicht bekannt (Oberleas et al., 1999).
2.3.2.2 Vorkommen im Ei
Magnesium ist in allen Kompartimenten des Eies (Tabelle 9; Tabelle 10; Tabelle 11), inklusive Eischale, vorhanden. Für die Embryonalentwicklung benötigtes Magnesium wird aus den Granula und zu 23,5 % aus der Eischale mobilisiert (Burley und Vadehra, 1989). Letzteres konnte durch Untersuchungen an schalenlosen Embryos bestätigt werden (Dunn und Boone, 1977).
Tabelle 9: Magnesiumgehalt im Ei
_______
µg/g in der Feuchtsubstanz _______ µg/g Tr. M.
1 2 3 4 5
Magnesium Gesamtei n.a. n.a. n.a. n.a. 460
Eigelb 110 140 130 120 280
Eiklar 100 140 100 120 720
1: nach Manson et al. (1993), Erste Messreihe 2: nach Manson et al. (1993), Zweite Messreihe 3: nach Shenstone (1968)
4: nach Cotterill et al. (1977)
5: Mineralstoffgehalt nach Souci et al. (2000) n.a.: nicht angegeben
Tabelle 10: Magnesiumgehalt in Eigelbfraktionen
µg/g Tr. M.
Magnesium Eigelb 177
Granula 749
Plasma 73,7
Lipide d. Granula 45,2
Mineralstoffgehalt nach Grau und Roudybush (1979a)
Tabelle 11: Verteilung und Dialysierbarkeit der Magnesiumionen im Ei
µg/g Tr. M Verteilung in % Nicht dialysierbar in %
Magnesium Eigelb 260 - -
Granula 790 67,9 94,9
Plasma 110 32,1 54,5
Mineralstoffgehalt und Verteilung nach Wakamatu et al. (1982a)
Die Dialysierbarkeit in Tabelle 11 gibt an, wie viele Magnesiumionen frei, dass heißt ungebunden, in den Fraktionen des Eigelbs vorkommen. In den Granula liegen demnach fast alle und im Plasma 50 % der Magnesiumionen in gebundener Form vor.
2.4 SPURENELEMENTE
Spurenelemente kommen in einer Konzentration von unter 100 mg/kg Trockenmasse im Organismus vor. Dazu gehören Elemente wie Eisen, Kupfer, Zink, Mangan, Iod, Molybdän, Selen, Fluor, Brom, Chrom, Kobalt und Silizium, für die ein essentieller Effekt im Organismus nachgewiesen werden konnte. Für andere im Organismus vorkommende Elemente konnte kein positiver oder essentieller Effekt in niedrigen Konzentrationsbereichen nachgewiesen werde. Allen Spurenelementen ist gemein, dass sie in größeren Konzentrationen toxisch auf den Organismus wirken (Engelhardt und Breves, 2000).
Richards trug die Gehalte für Eisen, Kupfer und Zink zusammen und stellte sie als absoluten Gehalt in einem 58 Gramm Ei einander gegenüber. Von diesen
Tabelle 12: Absoluter Spurenelementgehalt im Ei
Eigelb Eiklar µg in 19 g µg in 34 g
Eisen 1017 53
Zink 571 5
Kupfer 37 10
nach Richards (1997)
Es wird deutlich, dass im Eigelb wesentlich höhere Gehalte an Eisen-, Kupfer- und Zink vorhanden sind, als im Eiklar. Im Eigelb werden also diese Mineralstoffe gespeichert.
2.4.1 Eisen
2.4.1.1 Biologische Bedeutung
Eisenionen sind vor allem im Hämoglobin der roten Blutkörperchen lokalisiert, außerdem im Myoglobin des Muskels und in Organen und im Knochenmark.
Das Eisenion im Hämoglobin der roten Blutkörperchen bindet Sauerstoff und ist somit für dessen Transport verantwortlich. Außerdem ist Eisen in Enzymen vorhanden (Tolonen, 1990). Dazu gehören Cytochromoxidase, Peroxydasen, Katalasen, Dehydroxygenasen, NADH-Cytochrom-Reduktase und Xanthinoxidase. Neben Sauerstofftransport spielt Eisen beim Elektronentransport und Energieumsatz eine Rolle (Engelhardt und Breves, 2000).
Die Notwendigkeit der Eisenionen für die Entwicklung des aviären Embryos wurde bereits 1968 von Savage experimentell bestimmt (Savage, 1968). Dass Eisenionen essentiell für die Entwicklung von Zellen sind, konnte ebenfalls durch Untersuchung an Zellkulturen bestätigt werden. Die Anwesenheit von Eisen, ob drei- oder zweiwertig, in freier Form oder an Transferrin gebunden, machte das Wachstum der Zellkulturen erst möglich. In Abwesenheit von
Eisenionen war das Wachstum bei allen Zellkulturen spärlich oder fand nicht statt. Untersucht wurden Zellkulturen aus Hühnermuskel-, Hühnerherz-, Hühnerretinapigment-, Hühnerfibroblasten- und Hühnerspinalnervenzellen. Der genaue Aufnahmemechanismus in die Zelle von freien und an Transferrin gebundenen Eisenionen ist allerdings noch unklar, wobei eine an einen Rezeptor gekoppelte Aufnahme diskutiert wird (Saito et al., 1982).
Wichtigstes Symptom eines Eisenmangels ist eine Anämie, also ein Erythrozytenmangel. Dieser führt letztlich auch zu einem Sauerstoffmangel des Organismus. Ein Eisenmangel führt aber auch zu Schleimhautveränderungen im Magen und im Darm und verringert die Aufnahme von Vitamin B12.
Im Zwölffingerdarm werden Eisen-(II)-Ionen durch ein Eisentransportprotein aktiv resorbiert. Eisen-(III)-Ionen werden durch eine Ferroxidase zu Eisen-(II)- Ionen reduziert (Schümann und Weiss, 2002). Der niedrige pH-Wert im Zwölffinderdarm begünstigt die Lösung von Eisensalzen und damit deren Resorption (Engelhardt und Breves, 2000). Aufgrund des bedarfsorientierten Aufnahmemechanismus im Darm und der generell geringen Bioverfügbarkeit von Eisen, ist eine Vergiftung durch oral aufgenommenes Eisen unwahrscheinlich, kommt aber bei Aufnahme hoher Konzentrationen löslicher Eisensalze vor. Die Symptome sind charakteristisch für Vergiftungen und schließen Erbrechen, Magenkrämpfe, Schock, Atemnot und generalisierte Muskelkrämpfe ein. Charakteristisch ist außerdem schwarzer Durchfall (Oberleas et al., 1999).
2.4.1.2 Vorkommen im Ei
Die im Ei vorkommenden Eisenionen sind vor allem im Eigelb lokalisiert (Tabelle 13) und dort in der Granulafraktion (Tabelle 14 und Tabelle 15).