Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2009
© 2009 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany
ISBN 978-3-941703-44-5
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net
dem Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover
Die Bedeutung der Substantia nigra pars reticulata für die Temporallappenepilepsie
Pharmakologische Manipulation und elektrophysiologische Messung
These
zur Erlangung des Grades eines
Doctor of Philosophy - Ph.D.-
im Fachgebiet Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Kathrin Töllner
aus Bremen
Hannover 2009
Prof. Dr. C. Grothe (Co-Supervisorin) Prof. Dr. G. Bicker (Co-Supervisor)
1. Gutachten: PD Dr. M. Gernert
(Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover)
Prof. Dr. C. Grothe
(Institut für Neuroanatomie der Medizinischen Hochschule Hannover)
Prof. Dr. G. Bicker
(Institut für Tierökologie und Zellbiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover)
2. Gutachten: Prof. Dr. U. Ebert
(Abbott GmbH & Co. KG, Neuroscience Research GGRP, Ludwigshafen)
Datum der mündlichen Prüfung: 23.10.2009
Fördernde Institution: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GE 1103/6-1)
Für meine Eltern
2.1 Epilepsie ____________________________________________________ 3 2.1.1 Definition und Bedeutung__________________________________ 3 2.1.2 Temporallappenepilepsie __________________________________ 5 2.1.3 Pharmakoresistenz _______________________________________ 6 2.1.4 Kindling als Modell für pharmakoresistente
Temporallappenepilepsie___________________________________ 8 2.2 Substantia nigra pars reticulata ________________________________ 12 2.2.1 Anatomie und Physiologie ________________________________ 12 2.2.2 Anfallsmodulation durch die Substantia nigra pars reticulata___ 14 2.2.3 Elektrophysiologische Studien_____________________________ 16 2.2.4 Pharmakoresistenz auf der Ebene nigraler GABAerger Neurone_ 18 2.3 Valproat ____________________________________________________ 19 2.3.1 Anwendung und Bedeutung_______________________________ 19 2.3.2 Valproat in Tiermodellen für Epilepsie_______________________ 20 2.3.3 Pharmakokinetik und Pharmakodynamik____________________ 21 2.3.4 Chronobiologie__________________________________________ 22 3 Zielsetzung und Arbeitshypothesen________________________23 4 Material und Methoden __________________________________25 4.1 Tiere _______________________________________________________ 25 4.2 Kindling-Prozedur____________________________________________ 26 4.2.1 Elektrodenimplantation___________________________________ 26 4.2.2 Kindling-Protokoll_______________________________________ 30 4.2.2.1 Anfallsparameter _________________________________________ 30 4.2.2.2 Nachentladungsschwelle vor der Kindling-Prozedur ____________ 33 4.2.2.3 Aufkindeln _______________________________________________ 33 4.2.2.4 Nachentladungsschwelle nach der Kindling-Prozedur___________ 34 4.3 Valproat-Selektion ___________________________________________ 35
4.3.1 Bestimmung der antikonvulsiven Wirksamkeit von Valproat im Kindling-Modell__________________________________________ 35
4.3.1.4 Auswertung ______________________________________________ 42 4.4 Elektrophysiologische Untersuchung nigraler GABAerger Neurone __ 43
4.4.1 Herstellung von Einzelzellableitelektroden___________________ 43 4.4.2 Präparationsgänge_______________________________________ 43 4.4.3 Überwachung der Vitalparameter___________________________ 46 4.4.4 Elektrophysiologische Ableitung mit Valproat-Injektion________ 47 4.4.4.1 Kontrollversuche mit Natriumchloridlösung ___________________ 51 4.4.4.2 Versuche zum Einfluss der Chronobiologie ___________________ 51 4.4.5 Datenanalyse ___________________________________________ 52
4.4.5.1 Entladungsrate ___________________________________________ 53 4.4.5.2 Entladungsmuster: Interspike-Intervall-Histogramme ___________ 53 4.4.5.3 Entladungsmuster: Bursts und Oszillationen __________________ 55 4.5 Histologische Aufarbeitung der Gehirne _________________________ 60
4.5.1 Perfusion_______________________________________________ 60 4.5.2 Elektrodenlokalisationsbestimmungen______________________ 61 4.5.2.1 Kindlingelektrode _________________________________________ 61 4.5.2.2 Einzelzellableitelektrode ___________________________________ 62 4.6 Statistische Auswertung ______________________________________ 63 5 Ergebnisse____________________________________________64
5.1 Kindling-Entwicklung _________________________________________ 64 5.2 Valproat-Selektion ___________________________________________ 67 5.2.1 Elektrodenlokalisation____________________________________ 67 5.2.2 Vorversuche zur Valproat-Selektion ________________________ 69 5.2.2.1 Valproat-Plasmakonzentration ______________________________ 69 5.2.2.2 Vorlaufzeit _______________________________________________ 71 5.2.2.3 Nebenwirkungen__________________________________________ 71 5.2.3 Hauptversuche der Valproat-Selektion ______________________ 73
5.2.3.1 Antikonvulsive Wirksamkeit von Valproat im Kindling-Modell ____ 73
5.3 Elektrophysiologische Untersuchung nigraler GABAerger Neurone __ 79 5.3.1 Elektrodenlokalisation____________________________________ 79 5.3.2 Veränderung elektrophysiologischer Parameter unter Valproat:
Korrelation mit der Valproat-Selektion_______________________ 82 5.3.2.1 Entladungsrate ___________________________________________ 82 5.3.2.2 Entladungsmuster: Interspike-Intervall-Histogramm-Parameter ___ 88 5.3.2.3 Entladungsmuster: Bursts und Oszillationen __________________ 91 5.4 Sonstige Ergebnisse _________________________________________ 94
5.4.1 Nebenwirkungen von Valproat im Verlauf der Selektion________ 94 5.4.2 Kontrollversuche mit Natriumchloridlösung in der
elektrophysiologischen Messung___________________________ 97 5.4.3 Chronobiologische Einflüsse auf die elektrophysiologische
Messung________________________________________________ 98 6 Diskussion ___________________________________________101
6.1 Valproat-Selektion __________________________________________ 101 6.2 Veränderung elektrophysiologischer Parameter nigraler GABAerger
Neurone unter Valproat und Korrelation mit der Valproat-Selektion__ 108 6.3 Sonstige Ergebnisse ________________________________________ 121 6.3.1 Nebenwirkungen von Valproat im Verlauf der Selektion_______ 121 6.3.2 Kontrollversuche mit Natriumchloridlösung in der
elektrophysiologischen Messung__________________________ 122 6.3.3 Chronobiologische Einflüsse auf die elektrophysiologische
Messung_______________________________________________ 122 6.4 Schlussbetrachung _________________________________________ 124 7 Zusammenfassung_____________________________________126 8 Summary_____________________________________________128 9 Literaturverzeichis_____________________________________130 10 Anhang _____________________________________________149
10.1.2 Stereotaktische Operation ______________________________ 149 10.1.3 Kindling-Prozedur und Valproat-Selektion_________________ 149 10.1.4 Valproat-Analytik______________________________________ 150 10.1.5 Elektrophysiologische Untersuchung_____________________ 151 10.1.6 Histologische Aufarbeitung _____________________________ 152 10.2 Puffer und Lösungen _______________________________________ 153 10.2.1 Perfusion und histologische Färbungen___________________ 153 10.2.2 Valproat-Analytik______________________________________ 155 10.3 Färbeprotokolle____________________________________________ 157 10.4 Rohdaten und Darstellungen weiterer Auswertungen ____________ 158 10.4.1 Kindling-Entwicklung __________________________________ 158 10.4.2 Vorversuche zur Valproat-Selektion ______________________ 160 10.4.3 Antikonvulsive Wirksamkeit von Valproat im Kindling-Modell_ 161 10.4.4 Entladungsrate________________________________________ 164 10.4.5 Entladungsmuster: Interspike-Intervall-Histogramm-Parameter164 10.4.6 Entladungsmuster: Bursts und Oszillationen_______________ 165 10.4.7 Kontrollversuche mit Natriumchloridlösung________________ 166 10.4.8 Chronobiologie________________________________________ 168 Publikationen___________________________________________170 Erklärung______________________________________________172 Danksagung____________________________________________173
ADD Nachentladungsdauer (afterdischarge duration) ADT Nachentladungssschwelle (afterdischarge threshold) aSNr anteriore Subregion der Substantia nigra pars reticulata BCRP Breast Cancer Resistance Protein
BLA basolaterale Amygdala
bzw. beziehungsweise
ca. zirka (circa)
°C Grad Celsius
cADD kumulative Nachentladungsdauer (cumulative afterdischarge duration)
cf. vergleiche (confer)
CO2 Kohlenstoffdioxid
cSD kumulative Anfallsdauer (cumulative seizure duration)
d.h. das heißt
EC50 hier: effektive („therapeutische“) Plasmakonzentration EEG Elektroenzephalogramm
EKG Elektrokardiogramm et al. und andere (et alii, et aliae, et alia) etc. und so weiter (et cetera)
g Gramm
GABA γ-Aminobuttersäure
ggf. gegebenenfalls
GST Schwelle zum Erreichen eines generalisierten Anfalls (generalized seizure threshold)
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high pressure liquid chromatography)
HRP Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase) Hz Hertz
i.d.R. in der Regel
i.m. intramuskulär i.p. intraperitoneal i.v. intravenös
ILAE Internationale Liga gegen Epilepsie (International League against Epilepsy)
ISI Interspike-Intervall
ISIH Interspike-Intervall-Histogramm
MEZ Mitteleuropäische Zeit mg Milligramm
Min., Min Minute/Minuten
mm Millimeter
mmHg Millimeter-Quecksilbersäule mod. modifiziert
MRP Multi-Drug-Resistenz-Protein ms Millisekunde/Millisekunden NaCl Natriumchlorid
OP Operation PHT Phenytoin
post-ADT „post-kindling“-Nachentladungsschwelle (d.h. nach der Kindling-Prozedur)
post-GST „post-kindling“-Schwelle zum Erreichen eines
generalisierten Anfalls (d.h. nach der Kindling-Prozedur) pSNr posteriore Subregion der Substantia nigra pars reticulata
SD Anfallsdauer (seizure duration)
Sek., Sek Sekunde/Sekunden
SEM Standardfehler (standard error of the mean)
SN Substantia nigra
SNc Substantia nigra pars compacta SNl Substantia nigra pars lateralis SNr Substantia nigra pars reticulata SS Anfallsschwere (seizure severity) Tab. Tabelle
TLE Temporallappenepilepsie
u.a. unter anderem
usw. und so weiter
vgl. vergleiche VPA Valproat
vs. gegen (versus)
WDS „Wet Dog Shakes“
μA Mikroampere μg Mikrogramm μm Mikrometer
1 Einleitung
Epilepsien betreffen Schätzungen zufolge weltweit etwa 50 Millionen Menschen (DUNCAN et al., 2006). Sie stellen bei Mensch, Hund und Katze die häufigste chronische neurologische Erkrankung dar (LÖSCHER, 1994). Die häufigste Anfallsform beim Menschen ist der komplex-fokale Anfall. 70-80% dieser Anfälle beginnen im Temporallappen (CHANG und LOWENSTEIN, 2003). Diese Form von Anfällen tritt bei der sogenannten Temporallappenepilepsie (TLE) auf.
Während etwa 30-40% aller Epilepsiepatienten pharmakoresistent sind (KWAN und BRODIE, 2000), beträgt dieser Prozentsatz bei der TLE sogar 60-70% (LEPPIK, 1992). Als pharmakoresistent wird ein Patient bezeichnet, wenn zwei nacheinander über einen adäquaten Zeitraum hinweg in ihrer maximal tolerierbaren Dosis applizierte Antiepileptika nicht mindestens zu einer Anfallsreduktion um 50% führen (REGESTA und TANGANELLI, 1999). Es wird vermutet, dass es sich bei der Pharmakoresistenz um einen multifaktoriellen Prozess handelt (KWAN und BRODIE, 2002; LÖSCHER und POTSCHKA, 2002; REGESTA und TANGANELLI, 1999), bei dem sowohl genetische Faktoren als auch krankheits- und arzneimittelbezogene Mechanismen von Bedeutung sind (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a).
Gegenwärtig werden mehrere Hypothesen als Ursachen der Pharmakoresistenz bei Epilepsien diskutiert (REGESTA und TANGANELLI, 1999; REMY und BECK, 2006;
SCHMIDT und LÖSCHER, 2005):
1. Laut der Transporter-Hypothese verhindert die Überexpression sogenannter Multidrug-(Efflux-)Transporter an der Blut-Hirn-Schranke, dass im Gehirn- gewebe ausreichende Konzentrationen verabreichter Antiepileptika erreicht werden.
2. Die Target-Hypothese nimmt an, dass genetisch bedingte oder erworbene Veränderungen der molekularen Angriffspunkte („Targets”) der Antiepileptika zu verminderten pharmakodynamischen Effekten führen.
3. Der Netzwerk-Hypothese nach entwickeln sich genetisch oder krankheits- bedingt epileptische Netzwerke, die sich strukturell und/oder funktionell bei pharmakoresistenten und -sensitiven Patienten unterscheiden.
Ein Tiermodell für die Untersuchung pharmakoresistenter TLE ist das „Phenytoin- Nonresponder-Modell“ (LÖSCHER und RUNDFELDT, 1991; RUNDFELDT et al., 1990), bei dem weibliche, amygdala-gekindelte Wistar-Ratten entsprechend ihrer individuellen Sensitivität gegenüber der antikonvulsiven Wirkung von Phenytoin (PHT) in PHT-Responder, PHT-Nonresponder und variable PHT-Responder eingeteilt werden. Ein Nonresponder in diesem Modell entspricht einem pharmakoresistenten Epilepsiepatienten. Es wurde bereits gezeigt, dass solche Sensitivitätsunterschiede teilweise auf andere Antiepileptika, wie zum Beispiel Valproat (VPA), übertragbar sind (LÖSCHER et al., 1993).
Beim Amygdala-Kindling und in verschiedenen anderen Tiermodellen für TLE spielen die Basalganglien, insbesondere die GABAergen (γ-Aminobuttersäure) Neurone der Substantia nigra pars reticulata (SNr), eine zentrale Rolle. Sie sind an der Anfallsausbreitung beteiligt und können rückwirkend fokale Aktivitäten im limbischen System modulierend beeinflussen (DEPAULIS et al., 1994; DERANSART und DEPAULIS, 2002). Sie üben so eine GABA-vermittelte, endogene anfalls- modulierende Funktion aus („seizure gating function“; GALE et al., 2008).
Aus elektrophysiologischen Studien an naiven Ratten ist bekannt, dass das Antiepileptikum Valproat (VPA) die Entladungsrate GABAerger Neurone in der SNr senkt (ROHLFS et al., 1996). Bei amygdala-gekindelten Ratten ist die Fähigkeit von VPA, die nigrale Entladungsrate zu senken, im Mittel signifikant reduziert (GERNERT et al., 2004). Der Kindling-Prozess verändert offensichtlich die Sensitivität nigraler GABAerger Neurone gegenüber VPA. Es stellt sich die Frage, ob es individuelle Unterschiede in der VPA-Sensitivität gibt, und ob sich hier möglicherweise Pharmakoresistenz auf der Ebene nigraler GABAerger Neurone widerspiegelt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es somit, einerseits gekindelte Ratten entsprechend dem PHT-Nonresponder-Modell mit dem Antiepileptikum VPA zu selektieren und andererseits einen hypothetischen Zusammenhang zwischen der antikonvulsiven Wirksamkeit von VPA im Amygdala-Kindling-Modell und der VPA-Sensitivität nigraler GABAerger Neurone in Form einer Veränderung von Entladungsrate und Entladungsmuster zu untersuchen, um so Erkenntnisse über die Rolle der SNr für die pharmakoresistente TLE zu gewinnen.
2 Kenntnisstand 2.1 Epilepsie
2.1.1 Definition und Bedeutung
Der Begriff Epilepsie stammt von dem altgriechischen Wort „epilepsis“ = „der Anfall, der Überfall“ ab. Die Internationale Liga gegen Epilepsie (International League against Epilepsy; ILAE) und das internationale Büro für Epilepsie (International Bureau for Epilepsy; IBE) definieren Epilepsie als „eine Störung des Gehirns, die durch eine dauerhafte Neigung zur Entwicklung epileptischer Anfälle sowie durch die neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und sozialen Konsequenzen dieses Zustandes charakterisiert ist“ (FISHER et al., 2005). Ein epileptischer Anfall ist das
„vorübergehende Auftreten von […] Symptomen einer abnormalen exzessiven oder synchronen neuronalen Aktivität im Gehirn“ (FISHER et al., 2005). Somit bezeichnet der Begriff Epilepsie verschiedene Erkrankungen und Syndrome mit zerebraler Funktionsstörung.
Epilepsien betreffen Schätzungen zufolge weltweit etwa 50 Millionen Menschen (DUNCAN et al., 2006), also fast 1% der Weltbevölkerung. Sie nehmen direkt nach Schlaganfällen Platz 2 in der Häufigkeit neurologischer Erkrankungen ein (BROWNE und HOLMES, 2001). Bei den Haustieren ist vor allem der Hund von Epilepsien betroffen, seltener die Katze. Wie auch beim Menschen stellen sie hier die häufigste chronische neurologische Erkrankung dar (LÖSCHER, 1994). Um eine Epilepsie erfolgreich behandeln zu können, ist eine korrekte Diagnose notwendig, denn die zu wählende Therapie hängt maßgeblich von der Art des epileptischen Syndroms und der epileptischen Anfälle ab (BROWNE und HOLMES, 2001). Eine Kommission der ILAE klassifiziert epileptische Syndrome und Anfälle anhand folgender Merkmale:
Anfallsmuster, Ursache, Alter bei Krankheitsbeginn, auslösende Faktoren und elektroenzephalographische Befunde.
Beim Anfallsmuster unterscheidet man fokale (synonym: partielle) und generalisierte Anfälle. Fokale Anfälle nehmen ihren Ursprung in einer umschriebenen Gehirnregion (Fokus) und äußern sich klinisch als unwillkürliche Bewegungen einzelner Muskel-
gruppen. Sie können einfach-fokal (ohne Bewusstseinsstörung) oder komplex-fokal (mit Bewusstseinsstörung) auftreten und sekundär generalisieren, d.h. die epileptogenen Entladungen greifen vom Fokus auf beide Hemisphären über. Bei primär generalisierten Anfällen tritt die epileptische Aktivität von Anfallsbeginn an in beiden Großhirnhemisphären auf (FISHER et al., 2005).
Klinisch werden primär und sekundär generalisierte Anfälle in tonische, klonische, tonisch-klonische, myoklonische und atonische Krämpfe sowie Absencen („Abwesenheit“; kurze Bewusstseinspause mit anschließender Amnesie) eingeteilt (WESTBROOK, 2000). Neben den fokalen und generalisierten Epilepsien gibt es weitere spezielle Syndrome wie den Status epilepticus (anhaltender epileptischer Zustand oder Serie von Anfällen ohne Bewusstseinswiedererlangung) sowie nicht- klassifizierbare Epilepsien.
Etwa 30% der Epilepsien sind „symptomatisch“, d.h. die Epilepsie tritt als Folge einer bekannten oder vermuteten Erkrankung des zentralen Nervensystems auf (HAUSER, 1997). Weitere 30% sind „mutmaßlich symptomatisch“ oder „kryptogen“.
Auch hier wird eine ZNS-Pathologie als Ursache angenommen, die aber gegenwärtig nicht identifiziert werden kann. „Idiopathisch“ hingegen bedeutet, dass der Epilepsie keine andere Grunderkrankung vorangeht. Hier ist der Beginn oft altersabhängig und man vermutet eine genetische Ursache (ENGEL, 2006).
Die für Epilepsien angenommenen Ursachen auf zellulärer Ebene sind vielfach und noch nicht vollständig aufgeklärt. Postuliert werden u.a. ein Ungleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Neurotransmission, Veränderungen der Expression und Funktion von Rezeptoren, die Entwicklung „epileptischer“ Ionen- kanäle, funktionelle Neuronenveränderungen, die Entstehung „epileptischer“ Netz- werke in und zwischen Hirnregionen und morphologische Veränderungen wie hippokampale Sklerose oder das Aussprießen von Axonen (COULTER, 2001;
DALBY und MODY, 2001; MCNAMARA, 1999; OLSEN et al., 1992).
Auslösende Faktoren einer Epilepsieerkrankung mit Entstehung vor dem 20.
Lebensjahr sind perinatale Hirnschäden, angeborene Entwicklungsstörungen des Gehirns sowie genetische und neurometabolische Schädigungen. Bei älteren
Menschen sind vor allem zerebrovaskuläre Schädigungen und Tumore ursächlich beteiligt.
In der Veterinärmedizin versucht man eine Einteilung epileptischer Anfälle in Anlehnung an die Klassifikation für die Humanmedizin vorzunehmen. So findet man auch bei Hund und Katze „symptomatische“, „kryptogene“ und „idiopathische“
Epilepsien. Es treten ebenfalls fokale und primär oder sekundär generalisierte Anfälle auf. Die Diagnose ist hier jedoch aufgrund der Abhängigkeit von den Beobachtungen des Tierhalters, und da EEG-Ableitungen in der veterinärmedizinischen Neurologie bisher nicht routinemäßig durchgeführt werden, deutlich schwieriger (BERENDT und GRAM, 1999; CHANDLER, 2006; SMITH BAILEY und DEWEY, 2009). Am häufigsten werden bei Hund und Katze primär oder sekundär generalisierte Anfälle mit tonisch-klonischer Krampfaktivität diagnostiziert (LECOUTEUR und CHILD, 1989).
2.1.2 Temporallappenepilepsie
Die häufigste Anfallsform beim Menschen ist der komplex-fokale Anfall. Er tritt sowohl beim Menschen (GASTAUT et al., 1975; HAUSER et al., 1993) als auch bei Hund und Katze (LÖSCHER, 1994) mit oder ohne sekundäre Generalisierung auf.
70-80% der komplex-fokalen Anfälle beginnen im Temporallappen, insbesondere im Hippokampus, in der Amygdala und im parahippokampalen Kortex (CHANG und LOWENSTEIN, 2003). Diese Form von Anfällen tritt beim Menschen bei der Temporallappenepilepsie (TLE) auf. Bei den meisten von TLE betroffenen Patienten wird angenommen, dass eine initiale Schädigung mit struktureller Veränderung des Gehirns (Fieberkrämpfe, Status epilepticus, Enzephalitis, Trauma etc.) nach einer Latenzzeit von etwa fünf bis zehn Jahren zu der Entwicklung spontaner motorischer Krämpfe geführt hat (ENGEL, 1993).
2.1.3 Pharmakoresistenz
Die Definition des Begriffs pharmakoresistent ist uneinheitlich und umstritten. Im weitesten Sinne ist jede Form der Epilepsie pharmakoresistent, denn alle verwendeten Antiepileptika unterdrücken lediglich die klinische Symptomatik, also das Anfallsgeschehen. Sie wirken daher palliativ und verändern nicht die zugrunde liegende Pathophysiologie der Epilepsien (LÖSCHER et al., 2009). In der Humanmedizin wird ein Patient im Allgemeinen als pharmakoresistent betrachtet, wenn zwei Antiepileptika, die bei der entsprechenden Epilepsieform als Mittel der ersten Wahl indiziert sind, nacheinander über einen adäquaten Zeitraum hinweg in ihrer maximal tolerierbaren Dosis appliziert zu keiner Anfallsfreiheit oder zu keiner Anfallsreduktion um mindestens 50% führen (REGESTA und TANGANELLI, 1999).
Diese Definition wird zum Teil auch als relative Pharmakoresistenz betrachtet, während eine absolute Pharmakoresistenz das Nicht-Ansprechen auf sechs Antiepileptika bedeutet (SCHILLER und NAJJAR, 2008).
Die Wahrscheinlichkeit einer Resistenzentwicklung hängt u.a. von der Epilepsieform ab. Während etwa 30-40% aller Epilepsiepatienten pharmakoresistent sind (KWAN und BRODIE, 2000), beträgt dieser Prozentsatz bei der TLE sogar 60-70% (LEPPIK, 1992). Weiterhin gelten als prädisponierend (REGESTA und TANGANELLI, 1999):
Anfälle im ersten Lebensjahr, eine hohe Anfallsfrequenz vor Beginn der Behandlung, Fieberkrämpfe in der Kindheit, Verletzungen der Hirnstruktur, kortikale Fehlbildungen, Abnormalitäten in Elektroenzephalogramm (EEG) und neuro- logischem Status sowie eine Familiengeschichte im Hinblick auf Epilepsien.
Es wird vermutet, dass es sich bei der Pharmakoresistenz um einen multifaktoriellen Prozess handelt (KWAN und BRODIE, 2002; LÖSCHER und POTSCHKA, 2002;
REGESTA und TANGANELLI, 1999). Gegenwärtig werden mehrere Hypothesen diskutiert (REGESTA und TANGANELLI, 1999; REMY und BECK, 2006; SCHMIDT und LÖSCHER, 2005):
1. Die Transporter-Hypothese postuliert eine Überexpression sogenannter Multidrug-(Efflux-)Transporter an der Blut-Hirn-Schranke, die eine ausreichende Antiepileptika-Konzentration im Gehirngewebe verhindert.
2. Die Target-Hypothese nimmt an, dass genetisch bedingte oder erworbene Veränderungen der molekularen Angriffspunkte (“Targets”) von Antiepileptika zu verminderten pharmakodynamischen Effekten führen.
3. Der Netzwerk-Hypothese nach entwickeln sich genetisch oder krankheits- bedingt epileptische Netzwerke, die sich strukturell und/oder funktionell bei pharmakoresistenten und -sensitiven Patienten unterscheiden.
Die Mechanismen intrinsischer oder erworbener Pharmakoresistenz bei verschiedenen Hirnerkrankungen werden gegenwärtig in drei Kategorien unterteilt (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a):
(a) Genetische Faktoren wie Polymorphismen, die zu Veränderungen im Metabolismus eines Medikaments oder zu modifizierten Zielstrukturen oder Transportern für ein Medikament führen;
(b) krankheitsbezogene Mechanismen wie die Entstehungsursachen einer Krankheit, ihre Progression unter Pharmakotherapie, neurodegenerative Veränderungen im epileptischen Fokus und/oder Netzwerkmodifikationen, Veränderungen bei der Arzneimittelaufnahme ins Gehirn sowie Veränderungen der Zielstrukturen eines Medikaments;
(c) arzneimittelbezogene Mechanismen wie funktionelle Toleranz (Verlust der therapeutischen Effizienz) oder metabolische Toleranz (Induktion von metabolisierenden Enzymen oder Efflux-Transportern) sowie ineffektive Wirkmechanismen eines Medikaments.
Die meisten Patienten mit pharmakoresistenter Epilepsie sind nicht nur gegen ein Antiepileptikum, sondern gegen mehrere, meist sogar gegen alle Antiepileptika resistent (REGESTA und TANGANELLI, 1999). Bisher wurde davon ausgegangen, dass Patienten, die während der ersten Monotherapie mit einem Antiepileptikum nicht erfolgreich behandelt werden konnten, nur eine maximal 10%ige Chance haben, auf ein anderes Antiepileptikum anzusprechen (LÖSCHER und POTSCHKA, 2002). Neuere Langzeitstudien haben gezeigt, dass etwa 17% der Patienten durch Verabreichung eines weiteren Antiepileptikums anfallsfrei werden können, auch wenn sich bei ihnen zuvor zwei bis fünf Medikamente als ineffizient erwiesen hatten (SCHILLER und NAJJAR, 2008).
Die Folgen einer schwer behandelbaren Epilepsie können gravierend sein: Die Mortalitätsrate bei pharmakoresistenten Epilepsiepatienten ist gegenüber pharmakosensitiven vier- bis siebenmal höher (SPERLING, 2004). Trotz der Einführung neuer Antiepileptika hat sich die Situation für Patienten mit schwer behandelbaren Epilepsien nicht verbessert (LÖSCHER, 2002b). Viele Forschungsansätze konzentrieren sich daher auf morphologische und funktionelle Veränderungen innerhalb des Hippokampus, die die Entstehung einer pharmako- resistenten TLE begünstigen. So ist auch die chirurgische Resektion des epileptischen Fokus im Temporallappen eine alternative Behandlung für pharmakoresistente Patienten, sofern dieser Gewebsbereich genau identifiziert werden kann (FOLDVARY et al., 2001). Dennoch bewirkt eine solche Resektion keine vollständige Heilung: Die meisten Patienten müssen im Anschluss zur Anfallskontrolle mit Antiepileptika behandelt werden (LÖSCHER und SCHMIDT, 2006).
2.1.4 Kindling als Modell für pharmakoresistente Temporallappenepilepsie
Ein Tiermodell für die Untersuchung der pathophysiologischen Mechanismen der Epileptogenese und zur Erprobung neuer Therapieansätze ist das elektrische Kindling-Modell. Dieses Modell wurde erstmals von GODDARD et al. (1969) beschrieben. Es war ursprünglich entwickelt worden, um Lernvorgänge und Gehirnplastizität unter dem Einfluss subkonvulsiver elektrischer Stimulationen an Ratten zu untersuchen. Wiederholte elektrische Stimulationen über eine chronisch implantierte, unilaterale Reiz- und Ableitelektrode („Kindlingelektrode“) im Bereich des limbischen Systems führen zu fokalen epileptischen Anfällen, die bei Fortführung der zumeist täglichen Stimulationen in Dauer und Schwere zunehmen und so sekundär generalisieren. Die Anfallsschwere wird basierend auf Amygdala- Stimulationen nach RACINE (1972) in fünf Stadien eingeteilt (Tab. 4.1; Seite 31). Bei den Stadien I bis III handelt es sich um fokale Krampfaktivität, die dem klinischen Bild vom komplex-fokalen Anfall des Menschen gleicht. Die Stadien IV und V
entsprechen sekundär generalisierter Krampfaktivität. Neben der an Schwere zunehmenden motorischen Krampfaktivität, nehmen auch die paroxysmalen EEG- Veränderungen („Nachentladungen“) an Dauer und Amplitude zu. Zudem sinkt die Stimulationsstromstärke, die zur Auslösung einer Nachentladung im EEG benötigt wird („Nachentladungsschwelle“) während des Kindling-Prozesses (LÖSCHER, 1997). Als Lokalisation für die Kindlingelektrode werden neben der basolateralen Amygdala (BLA) verschiedene weitere Regionen des limbischen Systems, u.a. der piriforme Kortex (LÖSCHER und EBERT, 1996), der Hippokampus (MCINTYRE et al., 1999) oder der „perforant path“ (MARU et al., 2002), verwendet.
Der Begriff Kindling (englisch: „to kindle“ = entflammen) wird sowohl für den fortschreitenden Verlauf der Epileptogenese als auch für den dadurch erreichten permanenten Zustand erhöhter Anfallsbereitschaft verwendet. Die Empfindlichkeit des Gehirns gegenüber dem Stimulus steigt kontinuierlich an bis sie einen Punkt erreicht, an dem diese Empfindlichkeit permanent geworden ist. Hier werden die Tiere als vollgekindelt bezeichnet (MCNAMARA, 1984; MORIMOTO et al., 2004). Die erhöhte konvulsive Empfindlichkeit bleibt über Monate hinweg erhalten und spiegelt somit die durch den Kindling-Prozess eingeleiteten, permanenten Gehirn- veränderungen wider (GODDARD et al., 1969; SATO et al., 1990).
Studien im Kindling-Modell, aber auch in anderen Epilepsiemodellen, haben gezeigt, dass Anfälle zu strukturellen und elektrophysiologischen Veränderungen (u.a.
Aussprießen von Moosfasern, Induktion NMDA-vermittelter synaptischer Übertragung, progressive Neurodegeneration) im Hippokampus führen, die in einer Zunahme der Erregungsbereitschaft resultieren und die zum Teil auch im Resektionsgewebe von Humanpatienten mit komplex-fokaler Epilepsie beobachtet wurden (SUTULA, 1990). Elektrophysiologische Veränderungen konnten im Kindling- Modell auch für fokusferne Gehirnregionen wie die Basalganglien gezeigt werden (BONHAUS et al., 1991; FEDROWITZ et al., 2002; GERNERT et al., 2004; KÜCKER und GERNERT, 2008; NOLTE et al., 2006). Das Kindling-Phänomen ist jedoch nicht auf die Ratte beschränkt; es wurde auch für weitere Spezies wie Maus, Hund und Katze und für einige nicht-menschliche Primaten beschrieben (RACINE, 1978). Auch
beim Menschen wurden kindling-ähnliche Phänomene beobachtet (MORRELL, 1985;
SRAMKA et al., 1977).
LÖSCHER et al. (1986) schlugen erstmalig vor, Amygdala-Kindling von Ratten als Modell für Pharmakoresistenz zu verwenden. Im Vergleich mit dem Maximalen- Elektroschock-Test konnte gezeigt werden, dass gekindelte Anfälle schlechter mit den getesteten Antiepileptika (mit Ausnahme von Benzodiazepinen) behandelbar waren. Außerdem war die Behandlung fokaler gekindelter Anfälle weniger erfolgreich als die generalisierter; eine Situation wie sie auch beim Humanpatienten vorliegt (LÖSCHER et al., 1986). In der Folge wurde das „Phenytoin-Nonresponder-Modell“
etabliert, indem gezeigt wurde, dass weibliche, amygdala-gekindelte Ratten eines Wistar-Auszuchtstamms individuell unterschiedlich stark auf die antikonvulsive Wirkung des Antiepileptikums Phenytoin (PHT) ansprachen (LÖSCHER und RUNDFELDT, 1991; LÖSCHER et al., 1993; RUNDFELDT et al., 1990). Die Wirksamkeit von PHT wurde anhand des Anstiegs der Stromstärke zur Auslösung einer Nachentladung im EEG bei vollgekindelten Tieren beurteilt: Ein PHT- Responder zeigte als Antwort auf die intraperitoneale Injektion von PHT einen Anstieg der Nachentladungsschwelle um mindestens fünf 20%-Stufen im Vergleich zum Kontrollwert. Ein PHT-Nonresponder zeigte keinen bzw. einen Anstieg der Nachentladungsschwelle um höchstens 20%. Bei einem variablen PHT-Responder konnte keine Konstanz in der Wirkung von PHT ausgemacht werden. Aus zunächst insgesamt etwa 200 getesteten Ratten wurden 20% als PHT-Responder, 20% als PHT-Nonresponder und 60% als variable Responder charakterisiert (COULTER et al., 2002).
PHT-Responder, -Nonresponder und variable -Responder unterschieden sich nicht in ihrer Kindling-Entwicklung, der Dauer und Schwere der vollgekindelten Anfälle oder der Lokalisation ihrer Kindlingelektroden. Die PHT-Plasmakonzentrationen aller Tiere lagen im oder über dem „therapeutischen Bereich“ und unterschieden sich nicht zwischen den Subgruppen (EBERT et al., 1999). Es bestand kein Unterschied bei der Ausprägung von PHT-induzierten Nebenwirkungen zwischen PHT-Respondern und -Nonrespondern. Beide Subgruppen von Wistar-Ratten zeigten im Maximalen- Elektroschock-Test unter PHT den gleichen Anstieg der Schwelle zur Auslösung
eines generalisierten Anfalls (LÖSCHER, 1997). Nach selektiver Verpaarung von PHT-Respondern einerseits und -Nonrespondern andererseits, konnte weder in der ersten noch in der zweiten Generation der Nachkommen eine erhöhte Anzahl des entsprechenden Respondertyps gefunden werden. Lediglich die individuelle Antwort auf PHT war bei den PHT-Respondern verstärkt, bei den PHT-Nonrespondern vermindert. So scheint die PHT-Sensitivität zwar genetisch determiniert, folgt aber keinem einfachen Vererbungsschema (EBERT und LÖSCHER, 1999). Männliche Ratten zeigten einen höheren Prozentsatz an PHT-Respondern und einen geringeren Prozentsatz an PHT-Nonrespondern. Einflüsse durch den weiblichen Zyklus konnten ausgeschlossen werden (EBERT et al., 1994). Der in anderen Anfallsmodellen gefundene saisonale Einfluss auf die antikonvulsive Wirksamkeit von Antiepileptika (LÖSCHER und FIEDLER, 1996; LÖSCHER und FIEDLER, 2000) konnte für das Kindling-Modell mit PHT nicht gezeigt werden (WLAZ und LÖSCHER, 1993).
Es wurde weiterhin untersucht, ob das PHT-Nonresponder-Modell auf verschiedene Inzucht-Rattenstämme übertragbar sei: Nur beim Brown-Norway-Stamm konnte eine bedeutsame Anzahl an PHT-Nonrespondern charakterisiert werden (CRAMER et al., 1998). Der Auszuchtstamm Sprague-Dawley erwies sich als nicht geeignet für eine PHT-Selektion (LÖSCHER et al., 1998b).
2.2 Substantia nigra pars reticulata
2.2.1 Anatomie und Physiologie
Die Substantia nigra (SN; Latein: „schwarze Substanz“) erhielt ihren Namen aufgrund des hohen Gehalts an Melanin in den Perikaryen der dopaminergen Neurone dieser Gehirnregion (TREPEL, 2008). Anatomisch wird die SN zum Mesenzephalon gezählt. Funktionell gehört sie zu den Basalganglien, einer Gruppe von Kern- gebieten, die u.a. eine wichtige Funktion bei der Regulation der Motorik ausüben.
Beim Säugetier zählen zu diesen Kerngebieten das Striatum, der Nucleus accumbens, das Tuberculum olfactorium, der Globus pallidus, der Nucleus subthalamicus sowie die SN (SMEETS et al., 2000). Das dorsale Striatum des Nagers (nachfolgend als Striatum bezeichnet) lässt sich beim Primaten in Nucleus caudatus und Putamen unterteilen. Der mediale Anteil des Globus pallidus des Primaten entspricht dem Nucleus entopeduncularis des Nagers, der laterale Anteil dem gesamten Globus pallidus (SMITH et al., 1998). Anhand ihrer Zytoarchitektur wird die SN in drei Regionen unterteilt (HANAWAY et al., 1970; Abb. 2.1): die Substantia nigra pars compacta (SNc), die Substantia nigra pars reticulata (SNr) und die Substantia nigra pars lateralis (SNl).
2 1
3
4
5
6
7
8
9
10 8
9
7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7
7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7
7
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3
2
1
0
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10 -10Bregma-150 -5
5 5
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The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates6th EditionPaxinos & Watson
Abb. 2.1: Regionen der Substantia nigra (hier: SNR = Substantia nigra pars reticulata, SNCD = dorsaler Teil der Substantia nigra pars compacta; SNL = Substantia nigra pars lateralis).
Koronalschnitt Rattenhirn, mod. nach PAXINOS und WATSON (2007).
Beim Menschen wird die Bedeutung der SN für die Kontrolle von Bewegungen und Körperhaltungen insbesondere durch die Symptomatik neurodegenerativer Erkrankungen dieser Region, wie dem Morbus Parkinson, deutlich. Darüber hinaus spricht man der SN eine Rolle bei der Verarbeitung afferenter Sinnesimpulse und über ihre Verbindungen zum limbischen System einen Einfluss auf psychische Vorgänge zu (TREPEL, 2008).
Die SNr macht den größten Teil der SN aus. Beim Menschen ist sie anatomisch und funktionell mit dem medialen Anteil des Globus pallidus vergleichbar (TREPEL, 2008). Sie stellt zusammen mit dem medialen Anteil des Globus pallidus beim Menschen bzw. zusammen mit dem entopedunkulären Nukleus bei der Ratte die Ausgangstrukturen der Basalganglien dar. Etwa 90% der Neurone der SNr verwenden als Transmitter GABA (γ-Aminobuttersäure), die anderen 10% Dopamin.
Bei der Ratte kann die SNr funktionell in eine anteriore (aSNr) und eine posteriore (pSNr) Subregion unterteilt werden (GERNERT et al., 2004; SHEHAB et al., 1996;
VELÍSKOVÁ und MOSHÉ, 2006).
Das Striatum erhält als Eingansstruktur der Basalganglien glutamaterge Afferenzen aus motorischen und sensorischen Arealen des Kortex, dopaminerge Afferenzen aus der SNc und multimodale sensorische glutamaterge Afferenzen aus dem Thalamus.
Die GABAergen Neurone der SNr erhalten auf zwei Wegen Eingänge aus dem Striatum: Der direkte, monosynaptische striato-nigrale Weg resultiert in einer GABA- vermittelten Inhibition nigraler Neurone. Der indirekte, oligosynaptische Weg vermittelt unter Zwischenschaltung des Globus pallidus und des subthalamischen Nukleus eine glutamaterge Aktivierung (BOLAM et al., 2000). Nigrale Informationen werden an motorische Kerngebiete des Thalamus (z. B. Nucleus ventromedialis), den superioren Colliculus und den pedunkulopontinen Nukleus weitergeleitet (BOLAM et al., 2000). Die SNr und der pedunkulopontine Nukleus üben rückwirkend einen modulatorischen Einfluss auf das limbische System aus (MCNAMARA et al., 1984; SHIN et al., 1987).
2.2.2 Anfallsmodulation durch die Substantia nigra pars reticulata
Abb. 2.2: Epileptische Anfallsaktivität folgt spezifischen anatomischen Bahnen, die normalerweise u.a. motorische Funktionen vermitteln (GALE et al., 2008; LOTHMAN et al., 1991; MCNAMARA, 1984). Die Abbildung zeigt mögliche Wege der Anfallsausbreitung bei der Temporallappenepilepsie. Sie gibt stark vereinfacht die Verbindungen zwischen dem limbischen System (orange), kortikalen Regionen (dunkelblau), den Basalganglien (gelb) sowie den Zielregionen der Basalganglien (grün) wieder (rote Pfeile: GABAerge Transmission; blaue Pfeile: glutamaterge Transmission; graue Pfeile: verschiedene Neurotransmitter). Epileptische Anfallsaktivität, die im limbischen System entsteht, breitet sich innerhalb des limbischen Systems aus und kann andere Regionen mit einbeziehen. Innerhalb der Basalganglien spielt die Substantia nigra pars reticulata (SNr) als Ausgangsstruktur im Hinblick auf die Ausbreitung und Modulation epileptischer Anfallsaktivität aus dem limbischen System eine bedeutende Rolle (GALE et al., 2008). Mod. nach LÖSCHER et al. (2008).
Im Kindling-Modell, aber auch in einer Vielzahl anderer experimenteller Epilepsiemodelle, spielen die Basalganglien und hier insbesondere die GABAergen Neurone der SNr eine zentrale Rolle. Sie sind an der Anfallsausbreitung beteiligt und
können rückwirkend fokale Aktivitäten im limbischen System modulierend beeinflussen (DEPAULIS et al., 1994; DERANSART und DEPAULIS, 2002; Abb.
2.2). Die SNr und weitere Basalganglienstrukturen besitzen die Fähigkeit, ein breites Spektrum konvulsiver und nicht-konvulsiver Anfälle beeinflussen zu können, unabhängig davon, ob es sich um tonische oder klonische, fokale oder generalisierte, elektrisch- oder chemisch-induzierte Anfälle handelt. Diese Besonderheit macht die SNr mit den ihr assoziierten Hirnregionen interessant für potentielle therapeutische Ansätze.
Bereits 1978 konnte bei amygdala-gekindelten Ratten während eines generalisierten Anfalls eine erhöhte 2-Desoxyglukose-Aufnahme in nigralem Gewebe, also ein Hinweis auf iktale Hyperaktivität nigraler Neurone, gezeigt werden (ENGEL et al., 1978). Seit fast 30 Jahren ist bekannt, dass sich unterschiedliche experimentell ausgelöste Anfälle durch die pharmakologische Verstärkung der GABAergen Inhibition innerhalb der SNr reduzieren oder unterdrücken lassen (u.a. DEPAULIS et al., 1988; GALE und IADAROLA, 1980; GALE et al., 2008; GARANT und GALE, 1986; LE GAL LA SALLE et al., 1983; MCNAMARA, 1984; SPERBER et al., 1989;
WINDELS und KIYATKIN, 2004; ZHANG et al., 2008). GALE (1988) postulierte, dass die SNr im Epilepsiegeschehen eine endogene anfallsmodulierende Funktion einnimmt („seizure gating function“): Verschiedene Regionen im Mittelhirn und Hirnstamm, die antikonvulsive Effekte vermitteln können, stehen unter inhibitorischer Kontrolle nigraler GABAerger Efferenzen („nigrales inhibitorisches System“). Durch die serielle GABAerge Verschaltung innerhalb der Basalganglien kann ein antikonvulsiver Effekt durch pharmakologische oder elektrische Manipulation erwartet werden bzw. wurde beobachtet, wenn diese Manipulation zu einer Hemmung der nigralen GABAergen Projektionsneurone führt bzw. führte. Diese Hemmung kann entweder direkt oder aber indirekt via Aktivierung striataler GABAerger Projektionsneurone oder Abschwächung afferenter subthalamischer exzitatorischer Verbindungen geschehen und resultiert letztendlich in der Enthemmung efferenter Zielregionen der SNr (DEPAULIS et al., 1994; GALE et al., 2008) und erhöht damit beispielsweise die Schwelle zur Auslösung eines epileptischen Anfalls.
Der antikonvulsive Effekt wird also durch die Enthemmung nigraler Efferenzen vermittelt (BOLAM et al., 2000; DENIAU und CHEVALIER, 1985). Dementsprechend wirkten lokale bilaterale Mikroinjektionen des GABAA-Rezeptorantagonisten Bicucullin in die nigralen Zielregionen superiorer Colliculus und pedunkulopontiner Nukleus antikonvulsiv, Injektionen des GABAA-Rezeptoragonisten Muscimol hingegen prokonvulsiv (DEAN und GALE, 1989; DEPAULIS et al., 1990; OKADA et al., 1989; REDGRAVE et al., 1992).
Neuere Studien machen deutlich, dass die SNr hinsichtlich ihrer Funktion im Anfallsgeschehen nicht als einheitliche Struktur betrachtet werden kann: Je nach Tiermodell, Stamm, Alter oder Geschlecht sind die Subregionen der SNr unterschiedlich pathologisch am Anfallsgeschehen beteiligt und unterscheiden sich somit in ihrem anfallsmodulierenden Einfluss (GALANOPOULOU et al., 2003;
GERNERT et al., 2004; GERNERT und LÖSCHER, 2001; MOSHÉ et al., 1994;
MOSHÉ et al., 1995; RAVIZZA et al., 2003; SPERBER et al., 1987; VELÍŠEK et al., 2005; VELÍSKOVÁ et al., 1998; VELÍŠKOVÁ und MOSHÉ, 2001; WAHNSCHAFFE und LÖSCHER, 1990b).
2.2.3 Elektrophysiologische Studien
BONHAUS et al. (1986) konnten anhand extrazellulärer in vivo-Einzelzellableitungen zeigen, dass nigrale GABAerge Neurone bei amygdala-gekindelten, aber nicht bei naiven Ratten, während eines gekindelten Anfalls verstärkt burst-artig feuern. Diese burst-artigen neuronalen Entladungen waren nicht mit motorischen Krämpfen korreliert (BONHAUS et al., 1991). Zwei bis drei Wochen nach einem gekindelten Anfall unterschied sich das nigrale Aktivitätsmuster gekindelter Ratten jedoch nicht mehr von dem naiver Tiere (WASZCZAK et al., 1988).
GERNERT et al. (2004) konnten zeigen, dass putative nigrale GABAerge Neurone gekindelter Ratten auch interiktal, 24 Stunden nach einem Anfall, ein gegenüber naiven Ratten verstärkt burst-artiges Entladungsmuster aufwiesen. Zudem war die nigrale GABAerge Entladungsrate gekindelter Tiere signifikant gegenüber der von naiven Tieren erhöht. Eine Zuordnung der abgeleiteten Neurone zu den Subregionen
der SNr machte deutlich, dass diese Hyperaktivität nur bei Neuronen in der pSNr auftrat. Das veränderte Entladungsmuster war sowohl in der anterioren als auch in der posterioren Subregion beobachtet worden. Da in der früheren elektrophysiologischen Untersuchung eine Unterteilung der SNr in Subregionen nicht vorgenommen wurde (WASZCZAK et al., 1988), ist nicht auszuschließen, dass subregionen-spezifische Langzeitveränderungen in dieser Studie unentdeckt blieben.
Die beobachteten Aktivitätsveränderungen in der SNr könnten durch eine veränderte Aktivität nigraler Afferenzen verursacht werden: Eine Untersuchung der Spontanaktivität subthalamischer glutamaterger Neurone bei gekindelten Ratten 24 Stunden nach einem Anfall zeigte keine signifikante Erhöhung der subthalamischen Entladungsrate, aber ein verstärkt burst-artiges Entladungsmuster (FEDROWITZ et al., 2002). Bei einigen Humanpatienten mit pharmakoresistenter, inoperabler Epilepsie konnte eine hochfrequente tiefe Hirnstimulation des subthalamischen Nukleus die Anfallshäufigkeit vermindern (BENABID et al., 2002; CHABARDES et al., 2002). Das Striatum übt über direkte und indirekte striato-nigrale Projektionen einen starken Einfluss auf die SNr aus (DELONG und WICHMANN, 2007; PARENT und HAZRATI, 1995). Es gibt bereits Hinweise aus Studien in Epilepsiemodellen, dass das Striatum an epilepsie-induzierten Netzwerkveränderungen beteiligt ist (LÖSCHER et al., 2006; LÖSCHER und SCHWARK, 1987). Erst kürzlich konnte in einer elektrophysiologischen Studie im Amygdala-Kindling-Modell der Ratte eine veränderte Aktivität striataler Neurone gezeigt werden (KÜCKER und GERNERT, 2008). Projektionsneurone im anterioren Striatum ipsilateral zur Kindlingelektrode wiesen vermehrt unregelmäßige Entladungen, jene kontralateral zur Kindlingelektrode erhöhte spontane Entladungsraten auf.
Eine gestörte Informationsmodulation der SNr bei gekindelten Ratten müsste sich auch in nachgeschalteten Regionen bemerkbar machen: Der traditionellen Sichtweise nach wird der superiore Colliculus als die Efferenz der SNr betrachtet, die die Anfallsmodulierung der SNr weitergibt (GALE, 2004; GARANT und GALE, 1987).
Doch anatomische Untersuchungen ergaben, dass nigro-tektale Projektionen bei der Ratte ihren Ursprung vor allem in der anterioren (und ventralen) Subregion der SNr nehmen (BECKSTEAD et al., 1981; GERFEN et al., 1982), während die pSNr, in der
sich die kindling-induzierten Aktivitätsveränderungen zeigten (GERNERT et al., 2004), vor allem zum pedunkulopontinen Nukleus projiziert (LEE et al., 2000).
NOLTE et al. (2006) konnten zeigen, dass amygdala-gekindelte Ratten gegenüber naiven Kontrolltieren 24 Stunden nach einem Anfall erniedrigte Entladungsraten pedunkulopontiner Neurone aufweisen. Zudem war das pedunkulopontine Entladungsmuster vermehrt burst-artig und unregelmäßig und die pedunkulopontine Oszillationsfrequenz in Richtung niedriger Frequenzen verschoben.
2.2.4 Pharmakoresistenz auf der Ebene nigraler GABAerger Neurone
In elektrophysiologischen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die systemische Applikation des Antiepileptikums Valproat (VPA) bei naiven Ratten die Entladungsrate nigraler GABAerger senkt (ROHLFS et al., 1996). Ebenso wird die Entladungsrate nigraler GABAerger Neurone amygdala-gekindelter Ratten signifikant durch VPA reduziert (GERNERT et al., 2004). In letztgenannter Studie fiel nach Zuordnung der abgeleiteten Neurone zu den Subregionen der SNr auf, dass Neurone in der aSNr bei amygdala-gekindelten Tieren durch VPA signifikant weniger in ihrer Entladungsrate vermindert worden waren als jene in der aSNr bei naiven Kontrolltieren. Diese Befunde gaben Anlass zu der Hypothese, dass der Kindling- Prozess die Sensitivität nigraler Neurone gegenüber pharmakologischen Manipulationen (möglicherweise subregionen-spezifisch) verändert, und dass sich hier Pharmakoresistenz in einem Modell für TLE auf der Ebene nigraler GABAerger Neurone widerspiegelt.
2.3 Valproat
2.3.1 Anwendung und Bedeutung
Abb. 2.3: Valproinsäure C8H16O2 (Quelle: http://www.drugbank.ca)
Valproinsäure wird meist in Form des verträglichen Salzes Natrium-VPA eingesetzt. Die chemische Bezeichnung der Valproinsäure lautet 2-Propyl-Pentansäure. Sie hat eine vergleichs- weise einfache chemische Struktur, die aus acht Kohlenstoffatomen aufgebaut ist und gehört zur Klasse der kurz- und verzweigtkettigen Fettsäuren (Abb. 2.3).
Valproinsäure wurde bereits 1882 zum ersten Mal synthetisiert (BURTON, 1882). Bis zu der zufälligen Entdeckung ihrer antikonvulsiven Wirksamkeit (MEUNIER et al., 1963) gab es jedoch keine klinische Verwendungsmöglichkeit. Die genannte Arbeitsgruppe hatte VPA als Lösungsmittel zur Testung der antikonvulsiven Wirksamkeit schwerlöslicher Khellin-Derivate bei pentylentetrazol-induzierten Anfällen benutzt. Es wurde festgestellt, dass die Vehikelkontrolle die gleiche antikonvulsive Wirksamkeit hatte wie die getesteten Verbindungen. Diese Beobachtung konnte auf die antikonvulsiven Eigenschaften von VPA zurückgeführt werden. Kurz darauf wurden die ersten klinischen Studien mit Natrium-VPA publiziert (CARRAZ et al., 1964). Es wurde 1967 in Frankreich, 1973 in Großbritannien, 1978 in den USA und bis heute in mehr als 100 Ländern zur Behandlung von Epilepsie in der Humanmedizin zugelassen.
VPA ist ein Breitspektrum-Antiepileptikum. In diversen klinischen Studien und im klinischen Einsatz wurde seine Wirksamkeit in Mono- und Kombinations-Therapien bei verschiedenen Anfallsformen wie tonisch-klonischen und myoklonischen Anfällen, fokalen Anfällen, Absencen und bei der Behandlung des Status epilepticus gezeigt (cf. DAVIS et al., 1994, und PERUCCA, 2002). Darüber hinaus wirkt VPA analgetisch in der Migräne-Prophylaxe, bei neuropathischem Schmerz und trigeminaler Neuralgie, stabilisierend bei bipolaren Störungen und Schizophrenie,
neuroprotektiv bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen und wird gegen verschiedene Krebsformen in Mono- oder Kombinationstherapien eingesetzt (ROGAWSKI und LÖSCHER, 2004).
Für den Einsatz in der Tiermedizin ist VPA eher ungeeignet. Während die Eliminationshalbwertszeit für VPA beim Menschen etwa 8-10 Stunden beträgt, dauert sie beim Hund lediglich 1,7 ± 0,37 und bei der Katze 4,9 ± 1,0 Stunden (FREY und LÖSCHER, 2007). Diese kurze Wirkungsdauer macht es unmöglich, mit einer dem Tierhalter zumutbaren Dosierungshäufigkeit ausreichende Plasmakonzentrationen aufrecht zu erhalten. Seit einigen Jahren jedoch wird VPA auch beim Tier zur Therapie des Status epilepticus eingesetzt.
2.3.2 Valproat in Tiermodellen für Epilepsie
VPA hat sich bei der Ratte im Pentylentetrazol-Modell für Absencen und myoklonische Anfälle (KUPFERBERG, 1980; SWINYARD, 1964), im Maximalen- Elektroschock-Test für generalisierte tonisch-klonische Anfälle sowie im Kindling- Modell für komplex-fokale Anfälle als Modell für TLE als antikonvulsiv erwiesen (LÖSCHER et al., 1986). Im Amygdala-Kindling-Modell der Ratte war die Nachentladungsschwelle unter VPA erhöht, die Dauer dieser Nachentladung verkürzt sowie die Anfallsschwere und -dauer vermindert (LÖSCHER und HÖNACK, 1993).
Für den Status epilepticus konnte bei der Maus eine Wirksamkeit gezeigt werden (HÖNACK und LÖSCHER, 1992).
Mit wenigen Ausnahmen erwies sich VPA in elektrophysiologischen Messungen sowohl in in vitro- als auch in in vivo-Modellen als effektiv darin, epileptiforme neuronale Entladungen zu unterdrücken (cf. LÖSCHER, 2002a). Es wurde zudem gezeigt, dass die systemische Applikation von VPA bei naiven Ratten (ROHLFS et al., 1996) und bei gekindelten Ratten (GERNERT et al., 2004) die Entladungsrate nigraler GABAerger Neurone senkt.
Neben dem antikonvulsiven Effekt konnte im Kindling-Modell (SILVER et al., 1991) und im Kainat-Modell (BOLANOS et al., 1998) auch eine antiepileptogene Wirkung gezeigt werden. VPA reguliert eine Reihe von Faktoren, die in Mechanismen
involviert sind, die das Überleben einer Zelle steuern und so einen neuroprotektiven oder neurotrophen Effekt vermitteln. Dies sind u.a. CREB (cAMP responsive element binding protein), BDNF (brain derived neurotrophic factor) und MAP (mitogen activated protein kinase; MANJI et al., 2000).
2.3.3 Pharmakokinetik und Pharmakodynamik
VPA erfährt nach Applikation eine rasche Verteilung in alle Körperkompartimente. Es wird schnell in das Gehirn aufgenommen, indem es neben passiver Diffusion auch den aktiven Transport nutzt. Ein Anionentauscher im Endothelium der Gehirnkapillaren vermittelt etwa zwei Drittel der Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität von VPA (LEVY et al., 2002). Es konnte gezeigt werden, dass VPA im Gegensatz zu vielen anderen Antiepileptika kein Substrat für die Multi-Drug-Resistenz-Proteine MRP1, MRP2 und BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) sowie für den Multi- Drug-Transporter p-Glykoprotein ist (BACHMEIER und MILLER, 2005; BALTES et al., 2007; CERVENY et al., 2006). Für diese Efflux-Transporter wird eine Beteiligung an der Pharmakoresistenz bei Epilepsien angenommen (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a; LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b). Für die Resistenzvermittlung bei VPA werden die genannten Transporter somit derzeit ausgeschlossen. VPA wird durch mikrosomale Glukoronid-Konjugation, mitochondriale ß-Oxidation und Cytochrom-P450-abhängige ω-Oxidation metabolisiert (DAVIS et al., 1994; LEVY et al., 2002; ZACCARA et al., 1988).
Die antikonvulsive Wirkung von VPA lässt sich in ‚frühe Effekte’, die unmittelbar nach der Applikation einer ersten effektiven Dosis einsetzen und in ‚späte Effekte’ einteilen (LÖSCHER, 2002a). Während einer länger andauernden Behandlung nimmt die antikonvulsive Wirksamkeit von VPA ohne Veränderungen der Konzentrationen in Blutplasma oder Gehirngewebe zu (LÖSCHER et al., 1988; LÖSCHER et al., 1989a;
LÖSCHER und HÖNACK, 1995). Dieser ‚späte Effekt’ von VPA wird auch bei Humanpatienten mit Epilepsie beobachtet (DAVIS et al., 1994).
Die Wirksamkeit von Antiepileptika wird im Allgemeinen durch vier Hauptmechanismen erklärt (u.a. HUGUENARD, 1999; LÖSCHER und SCHMIDT, 2006; REMY et al., 2003; SILLS und BRODIE, 2001; WAUGH und GOA, 2003):
(a) Blockade spannungsabhängiger Natrium-Kanäle oder Modulation thalamischer T-Typ-Kalzium-Kanäle;
(b) Verstärkung inhibitorischer GABAerger Transmission;
(c) Hemmung exzitatorischer glutamaterger Transmission sowie
(d) Modulation synaptischer Freisetzung von Neurotransmittern, z. B. durch direkte Interaktion mit SV2A (synaptic vesicles protein).
Die antikonvulsive Wirkung von VPA scheint vor allem über die Verstärkung GABAerger Transmission vermittelt zu werden (LÖSCHER, 1999).
2.3.4 Chronobiologie
Es ist bekannt, dass bei Labortieren trotz konstanter Haltungsbedingungen (wie u.a.
Hell-Dunkel-Zyklus, Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit) saisonale Schwankungen physiologischer Prozesse stattfinden (KIANK et al., 2007; NELSON et al., 1995; SUMOVA et al., 2004; VAZQUEZ et al., 2007). Die größten Schwankungen sind bei Labornagern zwischen den Jahreszeiten Sommer und Winter auszumachen. Ein Erklärungsansatz hierfür ist die Existenz eines „externen Zeitgebers“, der die Tiere trotz konstanter Laborbedingungen beeinflusst (GWINNER, 1986). So könnten u.a. saisonale Veränderungen im geomagnetischen Feld, dessen Stärke im Sommer zu- und im Winter abnimmt, „zeitgebend“ wirken (BARTSCH et al., 1994).
Eine solche saisonale Rhythmik beeinflusst auch pharmakologische Experimente (BEUTHIN und BOUSQUET, 1970; BRUGUEROLLE et al., 1988; KALSER und KUNIG, 1969; LÖSCHER et al., 1997). LÖSCHER und FIEDLER (1996) fanden bei Labormäusen im Jahresverlauf unterschiedliche Sensitivitäten für elektrisch- und chemisch-induzierte Anfälle. Für VPA konnte im Pentylentetrazol-Modell bei der Maus eine saisonale Veränderung der antikonvulsiven Wirksamkeit festgestellt werden (LÖSCHER und FIEDLER, 2000).
3 Zielsetzung und Arbeitshypothesen
60-70% der Patienten mit TLE sind trotz der Entwicklung zahlreicher neuer Antiepileptika in den vergangenen Jahren pharmakoresistent (LEPPIK, 1992;
LÖSCHER, 2002b). Ein Großteil der Ursachenforschung konzentriert sich auf fokusnahe Gebiete, obwohl bekannt ist, dass während gekindelter Anfälle zahlreiche (auch fokusferne) Strukturen des limbischen Systems, der Basalganglien und des Hirnstamms aktiviert sind (LÖSCHER und EBERT, 1996; LÖSCHER et al., 1996;
MCNAMARA, 1986; SATO et al., 1990). Es ist daher dringend erforderlich, die Pathophysiologie pharmakoresistenter Epilepsien mit Blick auf das gesamte epileptische Netzwerk einschließlich fokusferner Regionen in geeigneten Tiermodellen weiter zu erforschen. Der SNr wird bereits seit Jahrzehnten eine GABA-vermittelte endogene anfallsmodulierende Funktion zugesprochen (DEPAULIS et al., 1994; DERANSART und DEPAULIS, 2002; GALE, 1988; GALE et al., 2008). Basierend auf bestehenden Daten wurden folgende Arbeitshypothesen formuliert:
1. Im Ratten-Kindling-Modell der TLE lassen sich robuste interindividuelle Unterschiede in der Wirkungsstärke des Antiepileptikums VPA auf die Nachentladungsschwelle feststellen (VPA-Sensitivität).
2. Die Ausprägung der VPA-Sensitivität individueller Ratten im Kindling-Modell ist mit der Wirkungsstärke von VPA auf die Entladungsrate nigraler GABAerger Neurone dieser Ratten korreliert.
3. Die individuelle VPA-Sensitivität im Kindling-Modell ist zudem mit der Veränderung des Entladungsmusters dieser Neurone durch VPA korreliert.
Zunächst wurde untersucht, ob eine Selektion von Ratten im Amygdala-Kindling- Modell mit VPA ähnlich dem „PHT-Nonresponder-Modell“ von LÖSCHER und RUNDFELDT (1991) die Charakterisierung von pharmakoresistenten und -sensitiven Subgruppen ermöglicht.
Nachdem in einer vorangegangenen Studie unserer Arbeitsgruppe bei amygdala- gekindelten Ratten eine geringere Reduktion der Entladungsrate GABAerger Neurone in der aSNr durch VPA gegenüber naiven Kontrolltieren gezeigt worden war
(GERNERT et al., 2004), wurde der Frage nachgegangen, ob sich hier möglicherweise Pharmakoresistenz auf der Ebene nigraler GABAerger Neurone widerspiegelt: Bei Tieren, deren individuelle VPA-Sensitivität zuvor im Kindling- Modell charakterisiert worden war, wurde mittels extrazellulärer in vivo- Einzelzellableitung der Effekt von VPA auf die Entladungsrate nigraler GABAerger Neurone gemessen. Da die zeitliche Kodierung neuronaler Signale möglicherweise eine wichtigere Repräsentation der Informationsübertragung in neuronalen Systemen liefert als die Entladungsrate (FERSTER und SPRUSTON, 1995) und Veränderungen neuronaler Entladungsmuster mehr und mehr an Bedeutung für die Pathophysiologie von Basalganglienerkrankungen gewinnen (GATEV et al., 2006;
WICHMANN und DELONG, 2006), sollte zudem der Effekt von VPA auf das Entladungsmuster nigraler Neurone VPA-selektierter Tiere untersucht werden.
Im PHT-Nonresponder-Modell von LÖSCHER und RUNDFELDT (1991) war kein Unterschied in der Kindling-Entwicklung zwischen PHT-Respondern und PHT- Nonrespondern gefunden worden. LÖSCHER und FIEDLER (2000) konnten zeigen, dass die antikonvulsive Wirksamkeit von VPA auf pentylentetrazol-induzierte Anfälle bei Mäusen jahreszeitlichen Schwankungen unterliegt. So stellten sich für die vorliegende Studie folgende weitere Fragen:
- Gibt es eine Korrelation zwischen individueller Kindling-Entwicklung und individueller VPA-Sensitivität im Kindling-Modell?
- Gibt es eine Korrelation zwischen individueller Kindling-Entwicklung und der Wirkungsstärke von VPA auf die Entladungsrate nigraler GABAerger Neurone?
- Ist der Effekt von VPA auf nigrale GABAerge Neurone jahreszeitabhängig?
Die im Rahmen dieser Ph.D.-Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über die Rolle der SNr für die pharmakoresistente TLE sollten zu einem verbesserten Verständnis der zugrunde liegenden Pathophysiologie führen und damit die Bedeutung des Basalgangliennetzwerkes als Angriffspunkt für mögliche neue Therapieansätze hervorheben.
4 Material und Methoden
Hinweis: Im Anhang befinden sich eine Auflistung verwendeter Substanzen und Geräte sowie deren Bezugsquellen, die Herstellungsprotokolle verwendeter Lösungen und die Protokolle verwendeter Färbungen, soweit diese nicht bereits im Text genannt werden.
Die vorliegende Studie setzt sich aus vier Abschnitten zusammen (Abb. 4.1):
1. Kindling-Prozedur 2. Valproat-Selektion
3. Elektrophysiologische Untersuchung 4. Histologische Aufarbeitung
Abb. 4.1: Experimentelle Abschnitte der Studie.
4.1 Tiere
Für die Versuche wurden weibliche Wistar-Ratten der Versuchstierzucht Harlan Winkelmann, Borchen, verwendet. Die Versuchstiere wurden in drei Chargen bestellt. Aus einem anderen Versuch der Arbeitsgruppe konnte eine vierte Charge mit Tieren gleicher Herkunft und Haltungsweise hinzugefügt werden. Die Ratten hatten ein Ankunftsgewicht von 200-220 g. Die Haltung erfolgte einzeln in
Makrolonkäfigen des Typs III mit einer Einstreu aus Weichholzgranulat. Die Ratten erhielten eine Standardnagerdiät und Leitungswasser ad libitum. Futter wurde einmal wöchentlich nachgefüllt, Wasser zweimal wöchentlich erneuert. Die Ratten wurden bei einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden (Hellphase von 6-18 Uhr MEZ), bei einer Umgebungstemperatur von 22-24°C und einer Luftfeuchtigkeit von 50-60%
gehalten. Einmal pro Woche wurden die Ratten in saubere Käfige mit frischer Einstreu umgesetzt. Dies geschah in ausreichendem zeitlichen Abstand zu den Versuchen, um eine Beeinflussung der Ratten direkt vor dem Experiment zu vermeiden. Im Tierstall wurden nur weibliche Ratten gehalten. Zutritt hatten ausschließlich Experimentatoren und Tierpfleger. Den Ratten wurde nach ihrer Ankunft eine etwa einwöchige Akklimatisierungsphase gewährt, bevor mit den invasiven Eingriffen begonnen wurde.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Tierversuche wurden durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), Dezernat 33, unter dem Aktenzeichen 33.9-42502-04-04/861 am 29.09.2004 genehmigt (Verlängerung der Genehmigung am 15.08.2007 und 07.10.2008).
4.2 Kindling-Prozedur
4.2.1 Elektrodenimplantation
Die stereotaktische Implantation der Kindlingelektroden in die rechte BLA erfolgte etwa eine Woche nach Ankunft der Tiere. Die Tiere wurden mit Chloralhydrat (360 mg/kg; gelöst in 0,9%iger Natriumchloridlösung; Injektionsvolumen: 10 ml/kg i.p.) anästhesiert und mit Buprenorphinhydrochlorid (0,045 mg/kg; Temgesic® 1:1 verdünnt mit 0,9%iger Natriumchloridlösung; dann 0,3 ml/kg i.m.) analgesiert. Die Narkosetiefe wurde anhand des Zwischenzehenreflexes überprüft. Zur Erhaltung der notwendigen Narkosetiefe erfolgte bei Bedarf eine Nachinjektion mit einem Drittel der Initialdosis von Chloralhydrat.
Die Kopfbehaarung im Operationsfeld wurde mit einer Schere entfernt. Zur Fixierung des Schädels wurden die Tiere mithilfe von Ohrstiften in den Gehörgängen und einer Oberkieferhalterung in einen stereotaktischen Apparat eingespannt. Der stereotaktische Atlas nach PAXINOS und WATSON (2007) diente zur Bestimmung der Koordinaten für die Trepanation der Schädeldecke und die Implantation der Kindlingelektrode. Die Oberkieferhalterung des Stereotakten wurde auf 3,3 mm ventral der Interaurallinie eingestellt, damit Bregma (rostraler Kreuzungspunkt der Schädelknochennähte) und Lambda (kaudaler Kreuzungspunkt) entsprechend der Darstellung im Atlas auf gleicher Höhe lagen. Die Kopfhaut des Operationsfeldes wurde mit 70%igem Ethanol desinfiziert und in rostrokaudaler Richtung auf einer Länge von etwa 2 cm inzisiert. Nach Entfernung der Faszien und des Periosts unter Schonung der angrenzenden Muskulatur wurde die Schädeloberfläche zur deutlicheren Darstellung der Knochennähte mit 35%iger Wasserstoffperoxidlösung betupft. Um einer Wundinfektion vorzubeugen, wurde der Wundbereich während der Operation wiederholt mit einer wässrigen Lösung von Ethacridinlactat gesäubert.
Abb. 4.2: Darstellung der Lokalisationen der Kindlingelektrode sowie der Erdungs- und Fixationsschrauben auf dem Rattenschädel. Mod. nach PAXINOS und WATSON (2007).