Aus der
Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und dem
An-Institut der Medizinischen Hochschule Hannover IPF PharmaCeuticals GmbH
Charakterisierung von antiosteoporotischen Aktivitäten und Faktoren im Tiermodell der ovarektomierten beziehungsweise gastrektomierten Ratte als
Osteoporose-Modell
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Susanne Stephan aus Freiburg im Breisgau
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Michael Fehr
Prof. Dr. Dr. Wolf-Georg Forssmann
1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Fehr 2. Gutachter: Prof. Dr. Hans-Otto Hoppen Tag der mündlichen Prüfung: 02. Juni 2004
Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Einleitung und Zielsetzung 09
2. Literaturübersicht 11
2.1 Allgemeine Grundlagen des Knochengewebes 11
2.1.1 Knochenaufbau 11
2.1.2 Osteozyten 13
2.1.3 Osteoklasten 15
2.1.4 Osteoblasten 16
2.2 Knochenstoffwechsel 17
2.3 Magen und Knochenstoffwechsel 19
2.4 Tiermodelle 21
2.4.1 Die ovarektomierte Ratte 21
2.4.2 Die gastrektomierte Ratte 24
2.5 Substanzen mit osteoanaboler Wirkung 26
2.5.1 Parathyrin (Parathormon, PTH) 26
2.5.2 Östrogen (17-β-Östradiol, EB2B) 27
3. Material und Methoden 29
3.1 Präparation und Peptidextraktion aus Schweinemagen 29
3.1.2 Ultrafiltration 30
3.2 Humanes Hämofiltrat 30
3.3 Chromatographische Methoden 31
3.3.1 Kationenaustausch Chromatographie 31
3.3.2 Umkehrphasenchromatographie 32
3.3.3 Aufreinigung einer osteoanabolen Aktivität aus dem Ultrafiltrat der
Schweinemagenfundusmukosa 32 3.3.4 Aufreinigung einer osteoanabolen Aktivität aus Hämofiltrat 33
3.4 Zellkultur 34
3.4.1 Knochenmarkstammzellgewinnung 34
3.4.2 Kultivierung der Knochenmarkstammzellen (BMSC) 34
UProben und KontrollenU 35
3.4.3 Kultivierung von ROS-17/2.8 Zellen 35
UProben und KontrollenU 37
3.4.4 Zellvitalität (WST-1) 37
3.4.5 Alkalische Phosphatase von Osteoblasten 37
3.4.6 Hemmung von Aktivitäten mit dem Rezeptorantagonisten Mifepriston 38 3.4.7 Dosisabhängigkeit von Dexamethason, EB2B, Hydrokortison und Prednisolon auf
ROS-17/2.8 Zellen 38
3.5 Hydrolyse von Peptiden mit Proteasen (Subtilisin) 39
3.6 Tiermodell der ovarektomierten Ratte 39
3.6.1 Tiermaterial 39
3.6.2 Haltung, Pflege und Fütterung der Tiere 40
3.6.3 Injektionsmethoden 40
UTechnik der subkutanen InjektionU 40
UTechnik der intraperitonealen InjektionU 41
3.6.4 Technik der retrobulbären Blutentnahme 41
3.7 Beschreibung der Versuchsdurchführung 42
3.7.1 Gruppeneinteilung 42
3.7.2 Tägliche subkutane Injektion 42
3.7.3 Gewichtsbestimmung 43
3.7.4 Blutentnahme 43
3.7.5 Radiologische Untersuchung der Ratten 43
3.7.6 Intraperitoneale Tetrazyklin- und Kalzein-Injektion 44
3.7.7 Präparation der Knochen 46
UMaterialentnahmeU 46
UFeinpräparationU 46
3.7.8 Radiologische Beurteilung der Ossa femori 46
3.7.9 Dichtebestimmung der Ossa femori nach dem Prinzip der Mohr-Waage 47
3.7.10 Transillumination der Calvariae 47
3.7.11 Anfertigung von Dünnschliffen 47
UFemurdünnschliffeU 48
UCalvariendünnschliffeU 48
3.7.12 Fluoreszensmikroskopie 48
3.7.13 Messung des Calvariendurchmessers 49
3.7.14 Methoden zur Bestimmung von Serumparametern 49
UGesamtkalziumbestimmung IU 49
UGesamtkalziumbestimmung IIU 50
UQuantifizierung von OsteokalzinU 51
3.8 Tiermodell der gastrektomierten Ratte 51
3.8.1 Tiermaterial 51
3.8.2 Operationsmethode 52
3.8.3 Haltung, Pflege und Fütterung der Tiere 53
3.8.4 Beschreibung der Versuchsdurchführung 54
3.8.5 Präparation der Knochen 54
3.8.6 Radiologische Untersuchung der Ossa femori und Calvariae 55 3.8.7 Dichtebestimmung nach dem Prinzip der Mohr-Waage 55
3.8.8 Transillumination der fixierten Calvariae 55
3.8.9 Anfertigung von Dünnschliffen der Calvariae 55
3.8.10 Durchmesser der Calvariae 56
3.8.11 Bestimmung von Serumparametern 56
UGesamtkalziumbestimmungU 56
3.9 Statistische Auswertung 56
4. Ergebnisse 59
4.1 Identifizierung und Aufreinigung osteoanaboler Aktivitäten aus
Schweinemagenschleimhaut 59 4.2 Identifizierung und Aufreinigung osteoanaboler Aktivitäten aus humanem
Hämofiltrat 60
4.3 Enzymatische Subtilisinhydrolyse 62
4.4 Hemmung der Aktivitäten mit dem Steroidrezeptorantagonisten Mifepriston 64 4.5 Dosisabhängigkeit von Dexamethason, EB2B, Hydrokortison und Prednisolon auf
ROS-17/2.8 Zellen 66
4.6 Auswertung der Ovarektomie-Studie 66
4.6.1 Verlauf der Körpergewichte während der Studie 67
4.6.2 Beschreibung der radiologischen Untersuchung 68
URadiologische Untersuchung der Ratten am 23. Tag der StudieU 68
URadiologische Beurteilung der präparierten FemuraU 68
4.6.3 Betrachtung der Femurdichte 70
4.6.4 Transillumination der Calvariae 71
4.6.5 Fluoreszenzmikroskopie der Femurdünnschliffe 71
4.6.6 Messung des Calvariendurchmessers 72
4.6.7 Auswertung der Serumparameter 73
UBestimmung des Gesamtkalziumgehaltes in RattenserumU 73
UGesamtkalziumwerte an Tag 49 mit der Kalzium II-MethodeU 75
UBestimmung von OsteokalzinU 77
4.7 Ergebnisse der Gastrektomie-Studie 79
4.7.1 Gewichtsverlauf und Futteraufnahme 80
4.7.2 Radiologische Untersuchung der präparierten und fixierten Ossa femori und
Calvariae 82
4.7.3 Dichtebestimmung der Femura nach Gastrektomie 84
4.7.4 Transillumination der Calvariae 85
4.7.5 Durchmesser der Calvariae 87
4.7.6 Gesamtkalziumbestimmung 87
5. Diskussion 89
6. Zusammenfassung 105
7. Summary 107
8. Literaturverzeichnis 109
9. Anhang 130
9.1 Abbildungsverzeichnis 130
9.2 Tabellenverzeichnis 134
Abkürzungsverzeichnis
1,25-(OH)B2BDB3B 1,25-Dihydroxycholekalziferol (Vitamin DB3B)
a.-p. anterio-posterior
Abb Abbildung
ACN Acetonitril
AP alkalische Phosphatase
BLC „bone lining cells“
BMSC „bone marrow stem cells”
BMP „bone morphogenetic proteins“
Dexa Dexamethason
E Extinktion
EB2B Östradiol-17-beta
ECL-Zellen „enterochromaffin-like cells“
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA „enzyme-linked immunosorbant assay“
ESI „electrospray ionization“
ETOH Ethanol
Fa Firma
FSD „functional secretory domain“
Fr Fraktion
GLS Gebrauchslösung
GX Gastrektomie
HCL Salzsäure
HF Hämofiltrat
HFäq Hämofiltratäquivalent
HPLC „high-performance-liquid-chromatography”
hPTH humanes Parathyrin (Parathormon) IATA „international air transport association“
IEC „ion-exchange-chromatography”
IGF „insulin-like growth factor“
IL Interleukin
IPF Institut für Peptid-Forschung
KM Körpermasse Mäq Magenäquivalent M-CSF „macrophage colony stimulating factor“
MEM „minimum essential medium”
MgClB2B Magnesiumchlorid
MMP Matrix-Metallo-Proteinase MS Massenspektrometrie NaB2BHPOB4B Dinatriumhydrogenphosphat NaCl Natriumchlorid
NaHB2BPOB4B Natriumdihydrogenphosphat NMR-Spektroskopie „nuclear magnetic resonance spectroscopy”
OB Osteoblast
OD optische Dichte
OK Osteoklast OPG Osteoprotegerin OVX Ovarektomie OZ Osteozyt
PNPP Paranitrophenylphosphat RANK „receptor activator of nuclear factor kappa B“
RANKL „receptor activator of nuclear factor kappa B ligand“
RB „ruffled border“
RL Resorptionslakune ROS-Zellen Rattenosteosarkoma Zellen
RPC „reversed-phase-chromatography“
RPMI Medium „roswell park memorial institute medium“
STD Standard
STH somatotropes Hormon
SZ „sealing zone“
TGF-β „transforming growth factor beta“
VE-Wasser vollentsalztes Wasser
WST-1 Tetrazolium Salt (4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]- 1,3-benzene disulfonate)
1. Einleitung und Zielsetzung
Beim Menschen nimmt während des Wachstums die Knochenmasse zu und erreicht ihr Maximum im Alter von ca. 25 Jahren, um dann ab Ende 30 wieder abzunehmen (RODAN et al., 2002). Frauen erfahren eine beschleunigte Abnahme der Knochenmasse 5-10 Jahre nach der Menopause, gefolgt von einem langsamen Knochensubstanzverlust (MELTON 1995; RIGGS u. MELTON 1986; STEPAN et al., 1987). Diese späte Phase wird auch bei Männern ab dem Alter von 40 Jahren beobachtet. Die Abnahme der Knochenmasse mit zunehmendem Alter kann zum Krankheitsbild der Typ-I-Osteoporose (postmenopausale Osteoporose = high-turnover Osteoporose) (RIGGS et al., 2003) führen. Die Typ-I-Osteoporose ist nicht nur gekennzeichnet durch eine Abnahme der Knochenmasse sondern durch einen Wandel in der Mikroarchitektur des Knochens, welcher die Zerbrechlichkeit und das Risiko von Frakturen erhöht (ÅKESSON 2003). Der Knochenmasseverlust beruht auf einem Ungleichgewicht zwischen Knochenresorption und -aufbau (RODAN et al., 2002). Osteoporose assoziierte Frakturen entstehen vorwiegend an Hüfte, Wirbel, Oberschenkelhals (JAP et al., 2001) und können schon durch geringe Traumata verursacht werden (ÅKESSON 2003).
In den letzten 20 Jahren sind viele Medikamente zur Behandlung der Osteoporose auf dem Arzneimittelmarkt erschienen. Zu den wichtigsten gehören die Östrogene (EB2B), die direkt antiresorptiven Substanzen, zu denen die Bisphosphonate und die selektiven Östrogenrezeptor-Modulatoren gehören, sowie Parathyrin (Parathormon = PTH). Diese Stoffgruppen reduzieren effektiv den Knochensubstanzverlust und senken das Frakturrisiko (ÅKESSON 2003). Sie haben aber auch unerwünschte Nebenwirkungen, z. B. ein erhöhtes Brustkrebs- oder Gebärmutterkrebsrisiko bei der Behandlung mit EB2B (ROSSOUW et al., 2002). PTH verursacht einen sehr hohen Kostenaufwand bei der Therapie (ÅKESSON 2003), und bei täglicher oraler Einnahme von bestimmten Bisphosphonaten können gastrointestinale Erosionen entstehen (SCHNITZER et al., 2000; BROWN et al., 2002). Es ist deshalb nach wie vor von großem Interesse, neue Substanzen mit osteoanabolen Eigenschaften zu isolieren und zu charakterisieren, um sie als mögliche Medikamente weiter zu entwickeln.
Daß der Magen eine wichtige Rolle im Kalziumhaushalt spielt, die unabhängig von Kalzitonin ist, wurde zuerst von SCHULAK und KAPLAN (1974, 1975) beschrieben. Weitere Versuche von PERSSON et al.
(1989, 1991) und HÅKANSON et al. (1990a) an Ratten und Hühnern bestärkten die Annahme, daß der säureproduzierende Teil des Magens Bildungsort eines unbekannten Peptides ist, welches als Gastrokalzin bezeichnet wird. Dieses noch nicht näher charakterisierte Peptidhormon verursacht nach
Freisetzung durch den Transport von zirkulierendem Kalzium in den Knochen eine mögliche Stabilisierung desselben, aber auch eine temporäre Hypokalzämie.
Um Medikamente oder noch präklinisch zu entwickelnde Substanzen auf ihre osteoanabole Wirksamkeit in vivo zu testen, ist das Tiermodell der ovarektomierten Ratte geeignet, da es ein gutes Abbild der postmenopausalen Osteoporose beim Menschen darstellt (WRONSKI et al., 1985; YAMAZKI u. YAMAGUCHI 1989; KALU 1991; THOMPSON et al., 1995). Für diese Arbeit ergaben sich vor dem Hintergrund der Annahme, daß ein unbekanntes Peptid aus der Magenschleimhaut osteoanabole Wirkung haben soll, folgende Fragen:
1. Läßt sich das postulierte Peptidhormon Gastrokalzin in aufgereinigtem Extrakt aus Schweinemagen, mit Hilfe eines in vitro Testes nachweisen?
2. Gibt es eine zirkulierende Form des Gastrokalzins in humanem Hämofiltrat?
3. Wenn ja, welche Wirkung haben diese beiden Substanzen auf den Knochenstoffwechsel in dem Tiermodell der ovarektomierten Ratte?
Die Gastrektomie (GX) einer Ratte führt zur Osteopenie (KLINGE et al., 1995; RÜMENAPF et al., 1997;
LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; MÜLBAUER et al., 1998; GEPP et al., 2000; STENSTRÖM et al., 2000;
SURVE et al., 2001a,b). LEHTO-AXTELIUS et al. (1998) folgern, daß dieses etablierte Tiermodell den pathologischen Zustand der Gastrektomie-induzierten-Osteoporose beim Menschen widerspiegelt.
Diese Osteopenie unterscheidet sich in einigen Punkten von der durch eine Ovarektomie induzierten (siehe Abschnitt 2.4.2), weshalb von einem unterschiedlichen Entstehungsmechanismus ausgegangen wird (SURVE et al., 2001a, b). Für die vorliegende Arbeit stellten sich folgende Fragen:
1. Lassen sich die von KLINGE et al., RÜMENAPF et al., LEHTO-AXTELIUS et al., MÜHLBAUER et al. und SURVE et al. gezeigten Effekte bei jungen und adulten Tieren reproduzieren ?
2. Ist das Gastrektomie-Modell als Osteoporose-Modell geeignet?
Es wurde ein Gastrektomie-Modell mit verschiedenen Altersgruppen durchgeführt, bei dem die Tiere keine Testsubstanzen injiziert bekommen haben. Im Vordergrund stand daher nicht die Testung des Wirkungspotentials von Substanzen, sondern Entstehungsort und Ausprägungsgrad der Osteopenie bei diesen Tieren.
2. Literaturübersicht
2.1 Allgemeine Grundlagen des Knochengewebes 2.1.1 Knochenaufbau
Im engeren Sinn kommen dem Knochengewebe (Textus osseus) zwei Aufgaben zu. Es ist mechanisches Stütz- und metabolisches Stoffwechselorgan (LIEBICH 1993). Histologisch kann man zwei Arten von Knochengewebe unterscheiden. Den Geflecht- oder Faserknochen (Os membranaceum reticulofibrosum) und den Lamellenknochen (Os membranaceum lamellosum). Der Geflecht- oder Faserknochen bildet eine Vorstufe des Lamellenknochens (NICKEL et al., 1992; LIEBICH 1993;
BUCKWALTER et al., 1996). Er bleibt zeitlebens nur im knöchernen Labyrinth des Ohrs, im äußeren Gehörgang und an den Ansatzstellen größerer Sehnen erhalten (LIEBICH 1993). Weiter unterscheidet man bestimmte Knochenformen. Die Röhrenknochen (Ossa longa), zu ihnen gehört der Oberschenkelknochen (Os femoris, Femur) und das Schienbein (Os tibia, Tibia). Kurze Knochen (Ossa brevia), zu ihnen gehören die Wirbel (Ossa vertebrae) und platte Knochen (Ossa plana), zu ihnen gehören zahlreiche Kopfknochen z. B. das Schädeldach (Calvaria) (NICKEL et al., 1992;
BUCKWALTER et al., 1996).
Im Knochengewebe sind vier verschiedene Zelltypen zu unterscheiden. Osteozyten (OZ), Osteoklasten (OK), Osteoblasten (OB) und Bone Lining Cells (BLC) (BUCKWALTER et al., 1996; SANDY u.
ODGREN 2002). Über die Funktion der BLC ist bisher nicht viel bekannt. Sie sind inaktiv. Sandy und Odgren (2002) spekulieren, daß es sich um Vorläuferzellen der OB handeln könnte. Auf die Funktion der anderen Zelltypen des Knochens wird in den nachfolgenden Abschnitten eingegangen. OZ und OB produzieren und mineralisieren die Knochenmatrix (SANDY u. ODGREN 2002), welche zu ca. einem Drittel aus organischen Komponenten und zu ca. zwei Dritteln aus anorganischem Material besteht (NICKEL et al., 1992). Der organische Anteil setzt sich zu 95% aus Kollagenfasern Typ I zusammen.
Die restlichen 5% verteilen sich auf Proteoglykane und kollagenfreie Peptide (SANDY u. ODGREN 2002). Der anorganische Anteil besteht zu 85% aus Kalziumphosphat, welches als Hydroxylapatit gebunden ist und 10% bestehen aus Kalziumkarbonat. Der Rest verteilt sich auf Magnesiumphosphat und Kalziumfluorid (NICKEL et al., 1992).
Knochen werden von einer Knochenhaut (Beinhaut, Periosteum) umhüllt. Sie besteht aus zwei Teilen.
Der äußeren derbfibrösen Schicht (Stratum fibrosum) und einer tiefen, lockeren, zellreichen Schicht
(Stratum cambium). Das Kambium ist reich an Nervenfasern und Blutgefäßen. Quer zur Längsachse des Knochens zweigen von den Blutgefäßen des Kambiums sogenannte Volkmann-Kanäle ab, die in die Havers-Gefäße münden. Die Fibrosa des Periostes ist über Sharpey-Fasern mit dem Knochenmantel verbunden. Konzentrisch geschichtete Knochenblättchen umgeben als äußere Generallamellen den gesamten Umfang des Knochens. Innere Generallamellen kleiden die Markhöhle (Cavum medullare) aus. Dazwischen sind die Osteone (Havers-Systeme) zu finden. Sie bilden die strukturelle Grundlage des Knochens. Jedes Osteon hat einen Zentralkanal (Havers-Kanal), der mesenchymales Bindegewebe, ein Blutgefäß (Havers-Gefäß) und Nerven enthält. Um den Havers- Kanal befinden sich konzentrisch angeordnete Knochenlamellen (Havers-Lamellen, Speziallamellen).
Die Speziallamellen bestehen aus kollagenen Fasern und aus Knochenmatrix, in ihnen sind die Osteozyten in kleinen Knochenhölen liegend eingebettet. Die Kollagenfasern sind spiralförmig, gegensinnig angeordnet und verleihen dem gesamten Knochen einen hohen Grad an Elastizität, Druck- und Zugfestigkeit. Im Inneren des Knochens befindet sich die Markhöhle (Cavum medullare), welche das Knochenmark (Medulla ossium rubra) beherbergt. Das Mittelstück von Röhrenknochen (Schaft, Diaphyse) besteht aus einem starken Knochenmantel (Substantia compacta). Die Knochenenden (Epiphysis proximalis und distalis) bestehen aus einer dünneren Knochenrinde (Substantia corticalis) mit der darunter liegenden Schwammsubstanz (Substantia spongiosa). Die Spongiosa kann aus Röhrchen, Blättchen oder Bälkchen bestehen (Spongiosa tubulosa, lamellosa, trabekulosa). Die kleinen Hohlräume der Spongiosa bilden den sekundären Markraum (Cellulae medullares), dieser steht mit der großen Markhöhle in Verbindung (NICKEL et al., 1992; LIEBICH 1993;
BUCKWALTER et al., 1996).
Abb. 1: Schematische Darstellung eines Ausschnittes aus der Substantia compacta der Diaphyse eines Röhrenknochens (nach LIEBICH 1993).
2.1.2 Osteozyten
Der OZ ist der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Knochengewebe (PARFITT 1977). Er ist in der mineralisierten Knochenmatrix lokalisiert und hat sternförmige Gestalt. Der Zellkörper liegt in einer Knochenlakune. Von ihm strahlen Zytoplasmaausläufer in Knochenkanälchen (Canaliculi ossei) in alle Richtungen (LIEBICH 1993). Sie gewährleisten den Stofftransport sowie den -austausch und dienen der Kommunikation sowohl zwischen den OZ selbst als auch zwischen OZ und dem Knochenmark (KAMIOKA et al., 2001). Das so aufgebaute Osteozytennetzwerk ist an 2 Systeme gekoppelt, ein intra- und ein extrazelluläres (NIJWEIDE et al., 2002).
Der OZ entwickelt sich aus mesenchymalen Stammzellen über Osteoprogenitorzellen aus OB. Der Differenzierungsmechanismus ist unklar (AUBIN et al., 1995). MAROTTI (1996) spekulierte, daß OZ über ein inhibitorisches Signal OB in direkter Nachbarschaft dazu bringen, ihre osteoblastäre Funktion einzustellen und zu OZ zu differenzieren. IMAI et al. (1998) stellen fest, daß der OZ über einen
Osteoblast Stimulating Factor-1 (OSF-1 auch heparin-binding, growth-associated molecule = HB-GAM) seine Differenzierung steuert. Die Lebensspanne eines Osteozyten ist bestimmt durch den Knochen- Turnover. Wird ein OZ durch Resorption freigelegt, unterliegt er der Apoptose (NOBLE et al., 1997).
Auch eine Mangelversorgung an Nährstoffen (BURGER u. KLEIN-NULEND 1999; VERBORGT et al., 2000), EB2B-Verlust (TOMKINSON et al., 1998) oder eine chronische Glukokortikoidbehandlung (WEINSTEIN et al., 1998) kann zur Osteozytenapoptosis führen.
OZ tragen nicht den Hauptanteil der Knochenmatrixsynthese, da sie nur wenige Organellen besitzen, die für die Matrixproduktion und -sekretion notwendig sind (NIJWEIDE et al., 2002). MIKUNI-TAKAGAKI et al. (1995) mutmaßen, daß OZ an der Reifung und Mineralisierung der Matrix, sowie am Umbau von Matrixmolekülen Anteil nehmen, um eine Mineralisierung in ihrer direkten Umgebung zu verhindern. Sie produzieren unter anderem Osteokalzin und Osteonektin, welche ebenfalls den Grad der Kalzifizierung und den Aufbau der Knochenmatrix beeinflussen (AARDEN et al., 1996). Auf ihrer Oberfläche können OZ PTH- (VAN DER PLAS et al., 1994) und intrazellulär Vitamin DB3B-Rezeptoren (BOIVIN et al., 1987) exprimieren. PTH beeinflußt vor allem die Informationsübertragung zwischen den OZ durch Regulierung des Konnexin-43-Gens und der Gap-Junctions (SCHILLER et al., 1992; DONAHUE et al., 1995). Dem Vitamin DB3B wird eine ähnliche Funktion zugeschrieben (NIJWEIDE et al., 2002). Weiter können sie EB2B-, (BRAIDMAN et al., 1995) Androgen-, und Glukokortikoid-Rezeptoren (ABU et al., 1997, 2000) exprimieren.
Osteozyten werden in jüngster Zeit eine wichtige Rolle als streßempfindliche Mechanosensoren in der Steuerung und Regulierung des Knochenstoffwechsels zugeschrieben (FORWOOD et al., 1998; TERAI et al., 1999; HUISKES et al., 2000; SMIT u. BURGER 2000). Streßauslöser ist die Menge an Flüssigkeit, welche extra- und intrazellulär durch den Knochen fließt. Der Druck des Durchflusses reguliert die Stärke des Knochens (COWIN et al., 1991), indem eine Erhöhung dieses Druckes zu einem Knochenauf- und eine Verringerung zu einem Knochenabbau führt (BURGER u. KLEIN-NULEND 1999). Der Durchfluß führt gleichzeitig zur Änderung von Ionenkonzentrationen und damit zu Potentialänderungen (POLLACK et al., 1984; SALZSTEIN u. POLLACK 1987) an der Zellmembran.
Ionenfluß und Zellberührung (hier durch den Flüssigkeitsdurchfluß) sind starke Modulatoren des Zellverhaltens (INGBER 1991). OZ sind wichtige Zellen bei der biomechanischen Regulation der Knochenmasse und -struktur (COWIN et al., 1991; MULLENDER u. HUISKES 1997).
2.1.3 Osteoklasten
OK sind multinukleäre Riesenzellen die aus hämatopoetischen Stammzellen hervorgehen (SUDA et al., 1992, 1999). Eine promyeloische Vorläuferzelle kann sich in OK, Makrophagen oder dendritische Zellen differenzieren, in Abhängigkeit von vorhandenen stimulierenden Faktoren. Für die Differenzierung in eine Osteoklastenvorläuferzelle, weiter in einen einzelligen OK, der dann mit anderen fusioniert und aktiviert wird, sind bestimmte Stimulanzien notwendig. Dazu gehört der Macrophage-Colony Stimulating Factor (M-CSF), der Rezeptoraktivator des NF-κB Liganden (RANKL auch tumor necrosis factor-related activation-induced cytokine (TRANCE), Osteoprotegerin Ligand (OPGL) oder Osteoclast Differentiation Factor (ODF) genannt) und Interleukin-1 (IL-1) (YASUDA et al., 1998; KONG et al., 1999; SUDA et al., 1999; UDAGAWA et al., 1999). OB produzieren den membrangebundenen oder gelösten Osteoklastenaktivator RANKL (LANCEY et al., 1998), der mit dem entsprechenden Rezeptor RANK der OK kommuniziert (YASUDA et al., 1998; TAKAHASHI et al., 2002). SIMONET et al. (1997) postulierte, daß OB einen osteoklasteninhibierenden Faktor produzieren, der Osteoprotegerin (OPG) genannt wird.
Seine hemmende Wirkung besteht in der Verhinderung der RANK-RANKL Bindung, indem OPG selbst an RANKL bindet (HSU et al., 1999). Dadurch kontrollieren OB die Differenzierung von OK (siehe Abschnitt 2.1.4).
Die wichtigste und einzige Aufgabe von OK ist es, Knochen zu resorbieren. Dies ist notwendig während des Wachstums, des ständig stattfindenden Umbaus und zur Regulierung der Kalziumhomöostase (VÄÄNÄNEN u. ZHAO 2002). JONES und BOYDE (1976) sagen aus, daß OK die zu resorbierende Stelle durch Retraktion der BLC und Entfernung des Osteoids über membrangebundene Matrix-Metallo-Proteinasen (MMPs) der OB (SAKAMOTO u. SAKAMOTO 1982; CHAMBERS et al., 1985) erkennen. Während eines Resorptionszyklus legt sich der aktivierte OK auf die zu resorbierende Knochenmatrix, verändert seine Polarität und bildet dadurch verschiedene Membranstrukturen, die für den Resorptionsprozeß wichtig sind (LAKKAKORPI u. VÄÄNÄNEN 1996; VÄÄNÄNEN et al., 2000). Mit Hilfe von extrazellulären Integrin-Matrix-Rezeptoren heftet sich der OK an die Resorptionsfläche (NESBITT et al., 1993). Zu den gebildeten Membranstrukturen gehört die Functional Secretory Domain (FSD), die sich im Zentrum der Basalmembran auf dem OK befindet (SALO et al., 1996). Der Kontakt zur Resorptionsfläche wird über die sogenannte Ruffled Border (RB) hergestellt, welche das
„Resorptionsorgan“ des OK bildet (PALOKANGAS et al., 1997). Die RB enthält im äußeren Bereich Protonenpumpen, die für ein saures Milieu im Resorptionsbereich sorgen. Im Zentrum finden Endo- und Exozytose statt. Die Sealing Zone (SZ) trennt die RB von der Basalmembran (VÄÄNÄNEN u. ZHAO 2002) und hat gleichzeitig kontrollierende Funktion über die Diffusion von Substanzen aus der
entstandenen Resorptionslakune (RL) (STENBECK u. HORTON 2000). Durch das saure Milieu in der entstehenden RL werden die Hydroxylapatitkristalle aus dem Knochengewebe herausgelöst (VÄÄNÄNEN et al., 1990). Im Anschluß wird mit Hilfe von Kathepsin-K (INAOKA et al., 1995; DRAKE et al., 1996) und MMP-9 (TEZUKA et al., 1994; OKADA 1995) das Osteoid enzymatisch abgebaut. Die Abbauprodukte werden vom OK endozytiert, in Klastosomen (VÄÄNÄNEN u. ZHAO 2002) weiter abgebaut und in Richtung FSD transportiert (SALO et al., 1997; VÄÄNÄNEN et al., 2000). Ein OK kann mehrere Resorptionszyklen durchlaufen (LAKKAKORPI u. VÄÄNÄNEN 1996) und unterliegt dann der Apoptose (VÄÄNÄNEN u. ZHAO 2002).
2.1.4 Osteoblasten
OB sind kuboidal geformte Zellen mit einem runden Zellkern. Sie liegen in einer einzelligen Schicht auf Knochenoberflächen (periostal und/oder endostal), an denen Knochenaufbau stattfindet (LIEBICH 1993; MARKS u. ODGREN 2002). Von der mineralisierten Knochenmatrix sind sie durch eine dünne Schicht unmineralisierter Matrix getrennt (MACKIE 2003).
OB differenzieren aus multipotenten mesenchymalen Stammzellen in Progenitorzellen, Präosteoblasten, Osteoblasten und zum Teil weiter in Osteozyten. Für diesen Differenzierungsweg sind eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, Hormonen, Wachstumsfaktoren, Zytokine, antiproliferative Proteine, Matrixproteine und selbstregulierende Mechanismen der OB notwendig (MAROTTI 1996; IMAI et al., 1998; AUBIN u. TRIFFT 2002). Zu den Transkriptionsfaktoren gehört Cbfa (core binding factor 1 oder Runx2), welcher die Bildung von Osteokalzin reguliert (SCHINKE u. KARSTENY 2002). PTH stimuliert z. B. die Differenzierung von Osteoprogenitorzellen (HOCK et al., 2002). Weitere OB- Differenzierungssubstanzen sind IL-11, 1,25(OH)B2BDB3B, EB2B, Glukokortikoide, Prostaglandine, Transforming Growth Factor-β, oder Leptin (VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996; SUDA et al., 1999; LINDBERG et al., 2002; AUBIN u. TRIFFT 2002). AUBIN et al., (1995) zeigten in vivo, daß Osteoprogenitorzellen in ihrem Differenzierungsstadium sogenannte Knochenknötchen (bone nodules) bilden. In dieser Phase stoppt die Proliferation und es werden charakteristische Osteoblastenmarker wie die alkalische Phosphatase (AP), Bone-Sialoprotein (BSP), Osteokalzin, Kollagen Typ I und Osteopontin expremiert.
OB spielen die zentrale Rolle in der Regulierung der Skelettarchitektur. Ihre wichtigste Aufgabe ist es, Knochenmatixproteine zu produzieren und zu sezernieren (MARKS u. ODGREN 2002; MACKIE 2003).
Dazu gehört Kollagen Typ I, aber auch nichtkollagene Proteine wie Proteoglykane, Glykoproteine und γ-carboxylierte Proteine (ROBEY 2002). Nichtkollagene Proteine sind z. B. Dekorin und Biglykan, welche die Kollagenfibrillengenese regulieren (MACKIE 2003), sowie Fibronektin, Osteonektin und
Mitglieder der Thrombospondin Familie, welche die Adhäsion, Migration, Proliferation und/oder Differenzierung der Knochenzellen regulieren (MACKIE u. RAMSEY 1996; ROBEY 2002). Einfluß auf die Knochengestaltung nehmen OB auch über die Regulierung der knochenresorbierenden OK, einerseits durch die Produktion des Rezeptoraktivators des NF-κB Liganden RANKL, welcher an den RANK-Rezeptor von OK bindet und so die OK-Aktivität steuert (LANCEY et al., 1998; YASUDA et al., 1998; UDAGAWA et al., 1999; TAKAHASHI et al., 2002) und andererseits durch die Produktion von OPG und M-CSF (SIMONET et al., 1997; YASUDA et al., 1998). OPG kann an RANKL binden und verhindert auf diesem Weg die RANK-RANKL Interaktion, die für eine OK-Differenzierung genauso notwendig ist wie M-CSF (HSU et al., 1999; SUDA et al., 1999). Einige OB werden in die Knochenmatrix eingebettet und können letztendlich zu Osteozyten werden (MAROTTI 1996; IMAI et al., 1998). Ihre Osteoidproduktion stellen sie daraufhin ein (MAROTTI 1996 ), oder sie unterliegen der Apoptose (JILKA et al., 1999).
2.2 Knochenstoffwechsel
Der Knochen unterliegt zeitlebens einer gewissen Dynamik (Knochen-Turnover), da durch exo- und endogene Einflüsse Ab-, Auf- und Umbauvorgänge stattfinden (NICKEL et al., 1992). Das Stoffwechselgeschehen wird hauptsächlich durch ein komplexes Zusammenwirken hormoneller und nutritiver Faktoren gesteuert. Wichtige Hormone, welche die Synthese der Knochenmatrix beeinflussen sind Somatotropin, Thyroxin, Androgene, EB2B und Glukokortikoide. Zu den Hormonen und Vitaminen, welche die Mineralisierung beeinflussen gehören PTH, Kalzitonin, Vitamin DB3B, A und C. Auch mechanische Belastungen wie Zug, Druck und Schwerkraft sowie chemische (Sauerstoffspannung, lokaler pH) und elektrische Einflüsse (bioelektrische Potentiale) regulieren den Turnover (REINACHER 1999)
USomatotropin (STH)U ist ein in der Hypophyse gebildetes Wachstumshormon das für die normale Ausreifung des Knochens nötig ist. Sein Mangel bewirkt hypophysären Zwergenwuchs und ein Überschuß Riesenwuchs (ØRTOFT et al., 1999; REINACHER 1999; OLNEY 2003).
USchilddrüsenhormoneU sind wichtig für eine physiologische Gestaltung des Knochens. Ein Mangel verursacht hypothyreoten Zwergenwuchs, ein Überschuß verursacht demnach Wachstumsbeschleunigung (REINACHER 1999).
UAndrogene und EUBU2UB fördern das Knochenwachstum und veranlassen beim noch wachsenden Knochen den Epiphysenfugenschluß. Ein Mangel kann beim Tier in unterschiedlicher Ausprägung zu einem übermäßigen Wachstum der Röhrenknochen unter Beibehaltung der jugendlichen Beckenproportionen führen (REINACHER 1999). Ein Wegfall der EB2B führt bei Frauen und weiblichen Ratten zur Ausbildung einer Osteoporose. EB2B sind an der Regulierung einiger Knochenzellen beteiligt (siehe Abschnitt 2.5.2) (VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996; ANDERSSON et al., 2002; KAVUNCU et al., 2003; RIGGS et al., 2003).
UGlukokortikoideU führen bei länger andauerndem Überschuß, sei er exo- oder endogener Ursache, zur Hemmung der Kollagensynthese und zur Ausbildung einer Osteoporose (ØRTOFT u. OXLUND 1988;
TRUNER et al., 1995; ØRTOFT et al., 1999; REINACHER 1999).
UPTHU aus der Nebenschilddrüse ist das wichtigste Hormon des Knochenstoffwechsels. Im physiologischen Ablauf wird es bei einer Hypokalzämie oder niedrigen Vitamin-DB3B-Spiegeln gebildet und ausgeschüttet. Es führt zur Freisetzung von Kalzium aus dem Knochen, das zum Teil gegen Natrium und Kalium ausgetauscht wird, damit nicht im gleichen Umfang Phosphat abgegeben wird. In der Niere bewirkt PTH eine Hemmung der Phosphatrückresorption und eine verminderte Kalziumausscheidung (LANG 1995; REINACHER 1999).
UKalzitoninU wird in den parafolikulären Zellen der Schilddrüse gebildet. Die Bildung und Ausschüttung erfolgt bei einer Hyperkalzämie und hemmt die Osteoklastenaktivität. Kalzitonin erhöht die Kalzium- und Phosphatausscheidung der Niere (MOSEKILDE et. al., 1994; REINACHER 1999; WALLACH et al., 1999; KAVUNCU et al., 2003).
UVitamin DUBU3UB ist das wichtigste Vitamin des Knochenstoffwechsels. Es wird als Ergosterin oder 7-Dehydrocholesterin im Darm resorbiert und nach mehreren Umwandlungsschritten in Haut und Leber in der Niere zur biologisch aktivsten Form 1,25-Dihydroxycholecalciferol (1,25(OH)B2BDB3B) oxidiert. Es erhöht die enterale Kalziumresorption und vermindert die renale Kalzium- und Phosphatausscheidung.
Im Knochen führt es zur Mineralisierung des Osteoides. Bei Anwesenheit von PTH unterstützt Vitamin DB3 Bdie Kalziumfreisetzung. Hohe Serumkonzentrationen an PTH, Prolaktin, EB2B sowie eine Hypokalzämie oder Hypophosphatämie fördern die Bildung von Vitamin DB3 B(LINDGREN u. LINDHOLM 1979; LINDGREN u. DELUCA 1982; FAUGERE et al., 1986; BOIVIN et al., 1987; REINACHER 1999).
UVitamin AU beeinflußt den Turnover und ist essentiell für die normale Knochengestaltung (REINACHER 1999; JIMENEZ et al., 2001).
UVitamin CU ist für die Synthese des Kollagens der Matrix notwendig (OGAWARA et al., 1997;
REINACHER 1999).
UTransforming Growth Factor-β (TGF-β)U beeinflußt die Proliferation und Differenzierung der OB (MARIE 1997; REINACHER 1999; BLUMENFELD et al., 2002).
UInsulin-like Growth Factor (IGF)U stimuliert die Knochenbildung unter anderem durch Regulierung von OPG und RANKL (MARIE 1997; REINACHER 1999; BLUMENFELD et al., 2002; RUBIN et al., 2002).
Für den Knochenstoffwechsel ist es wichtig, daß alle essentiellen Knochenbestandteile in ausreichendem und richtigem Mengenverhältnis zur Verfügung stehen (REINACHER 1999).
Letztendlich sind noch nicht alle Wechselbeziehungen der beeinflussenden Faktoren und Wirkungen bekannt. Auch gibt es viele oben nicht genannte Faktoren und Wirkungen, die Einfluß auf den Knochenstoffwechsel nehmen (siehe Abschnitt 2.3).
2.3 Magen und Knochenstoffwechsel
Verschiedene Studien dokumentieren, daß durch intravenöse Gaben unterschiedlicher Konzentrationen von humanem Gastrin, Schweinegastrin, Pentagastrin und Gastrin-17 eine kurzzeitige (30-60 min) Hypokalzämie in Ratten und Schweinen hervorgerufen wird (CARE et al., 1971 a, b; COOPER et al., 1971, 1972a, b; SCHULAK u. KAPLAN 1974, 1975; KAPLAN et al., 1977; KLEMENTSCHITSCH et al., 1979; KRISHNAMRA u. LIMLOMWONGSE 1981; LIMLOMWONGSE u. KRISHNAMRA 1981;
PERSSON et al., 1989, 1991; HÅKANSON et al., 1990). Der hypokalzämische Effekt von humanem Gastrin läßt sich auch an Ratten demonstrieren, die einer Thyroparathyroektomie unterzogen worden sind (SCHULAK u. KAPLAN 1974, 1975; KAPLAN et al., 1977; KRISHNAMRA u. LIMLOMWONGSE 1981; LIMLOMWONGSE u. KRISHNAMRA 1981; PERSSON et al., 1989, 1991; HÅKANSON et al., 1990). SCHULAK und KAPLAN (1974, 1975) stellen Aufgrund dieser Ergebnisse die These auf, daß der hypokalzämische Effekt von Gastrin kalzitoninunabhängig ist. Er ist ebenfalls unabhängig von Niere, Nebenniere, Pankreas, Dünn- und Dickdarm und wird nicht von einer Hypophosphatämie begleitet
(SCHULAK u. KAPLAN 1974, 1975). Eine Teil- (75%ige) oder Totalgastrektomie hebt den hypokalzämischen Effekt von Gastrin auf (SCHULAK u. KAPLAN 1975; KAPLAN et al., 1977).
KRISHNAMRA und LIMLOMWONGSE (1981) mutmaßen, daß der hypokalzämische Effekt von Gastrin nicht durch eine Hemmung der enteralen Kalziumaufnahme entsteht. Er ist auch nicht die Folge eines verstärkten Abtransportes des Serumkalziums nach enteraler Resorption. Gastrin beeinflußt die Kalziumhomöostase des Körpers in der Weise, daß es die Kalziumfreisetzung aus einem, möglicherweise mehreren Geweben unterdrückt. LIMLOMWONGSE und KRISHNAMRA (1981) postulieren, daß Gastrin direkt die Freisetzung von Kalzium aus Knochengewebe hemmt. Im Gegensatz dazu zeigen PERSSON et al. (1989, 1991) und HÅKANSON et al. (1990a) an, daß der hypokalzämische Effekt von Gastrin eine Folge seiner indirekten Wirkung auf den Knochenstoffwechsel ist. Gastrin stimuliert die Freisetzung eines Peptides aus der säureproduzierenden Magenschleimhaut.
Dieses Peptid wird als Gastrokalzin bezeichnet (PERSSON et al., 1989) und fördert den Einbau von Kalzium in den Knochen bei Ratten (PERSSON et al., 1989; HÅKANSON et al., 1990a) und Hühnern (PERSSON et al., 1991).
Die Aufnahme des Kalziums vom Blut in den Knochen bewirkt eine Zunahme des Kalziumgehaltes in der Knochenasche (HÅKANSON et al., 1990a; PERSSON et al., 1991) und führt zu einem Anstieg der Osteoklastenzahl in den Tibiarollhöckern bei der Ratte (HÅKANSON et al., 1990a).
Da endogenes Gastrin dieselbe hypokalzämische Wirkung hat wie exogenes (HÅKANSON et al., 1990a; PERSSON et al., 1991) folgern HÅKANSON et al. (1990b), daß die Hypokalzämie beider Wirkstoffe durch denselben Mechanismus entsteht.
Die endokrinen Zellen der Fundusschleimhaut bei der Ratte bestehen zu 65% aus enterochromaffin- ähnlichen (ECL) Zellen (HÅKANSON et al., 1976). Ihr Wachstum wird über die Serumgastrinkonzentration beeinflußt (TIELEMANS et al., 1989, 1990). LARSSON et al. (2000) stellen fest, daß Gastrokalzin in den ECL-Zellen produziert wird und daß es sich bei Gastrokalzin auch um das Peptid Ghrelin handeln könnte. Ghrelin ist ein Peptid aus der Magenschleimhaut, welches durch Wachstumshormon (Growth-Hormone, GH = STH) gesteuert wird (KOJIMA et al., 1999). Gegen die Ghrelin-Theorie spricht auch, daß Ghrelin in den chromogranin-A/pankreastatin-immunreaktiven Zellen (A-like Zellen) der Magenschleimhaut produziert wird und diese Zellen nicht gastringesteuert sind (DORNONVILLE DE LA COUR et al., 2001).
Eine Gastrektomie oder Fundektomie hebt die indirekte hypokalzämische Wirkung von exogenem (SCHULAK u. KAPLAN 1975; KAPLAN et al., 1977; HÅKANSON et al., 1990a; PERSSON et al., 1991) und endogenem Gastrin auf (HÅKANSON et al., 1990a; PERSSON et al., 1991). Fundektomierte und gastrektomierte Ratten haben ein geringeres Knochenaschegewicht (HÅKANSON et al., 1990a;
PERSSON et al., 1993) und ein geringeres Trabekelvolumen in der Tibia (PERSSON et al., 1993) als nichtoperierte Tiere.
Weitere Informationen über die Gastrektomie bei der Ratte und der Entstehung einer Osteopenie sind in Abschnitt 2.4.2 nachzulesen.
2.4 Tiermodelle
2.4.1 Die ovarektomierte Ratte
KALU (1991) postuliert, daß ein Osteoporose-Tiermodell mit Tieren durchgeführt werden sollte, die aufgrund eines spontanen oder induzierten Sexualhormonverlustes Knochenmasse verlieren. Die Charakteristika und Folgeerscheinungen dieses Knochensubstanzverlustes sollen in einem oder mehreren Punkten mit denen übereinstimmen, die bei der postmenopausalen Osteoporose bei Frauen zu finden sind.
Das Modell der ovarektomierten Ratte ist als Modell für die postmenopausale Osteoporose im Menschen anerkannt (BARON et al., 1984; WRONSKI et al., 1985, 1986; YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989; KIMMEL et al., 1990; KALU 1991; MILLER u. WRONSKI 1993; MOSEKILDE et al., 1993;
THOMPSON et al., 1995; LI et al., 1997 ) und wird angewandt (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989). Die Ergebnisse verschiedener Studien sind schwer vergleichbar, da in vielen Studien die Versuchsbedingungen nicht einheitlich gewählt sind, wie z.B. das Alter der Tiere und/oder die Dauer der Experimente sowie die Meßmethoden (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989). So liegt das Alter der Ratten verschiedener Studien zwischen 3 Wochen und 2 Jahren. Ratten im Alter von 3 Wochen sind sehr jung, und Ergebnisse müssen kritisch beurteilt werden aufgrund ihres enormen Wachstums gekoppelt mit hohen Modeling- und Remodelingraten (KALU 1991). Ratten im Alter von 2 Jahren haben einen altersbedingten langsameren Knochenstoffwechsel (WRONSKI et al., 1989b; THOMPSON et al., 1995) und altersbedingte Krankheiten sind daher zu erwarten (KALU 1991).
Die Ovarektomie verursacht in Ratten eine Osteopenie (SAVILLE 1969; AITKEN et al., 1972;
LINDGREN et al., 1979, 1982; KALU 1984; FAUGERE et al., 1986; MOSEKILDE et al., 1993;
THOMPSON et al., 1995; SURVE et al., 2001a, b). Histomorphologische Untersuchungen von WRONSKI et al. (1985, 1986, 1987, 1988b, 1989b) zeigen, daß diese Osteopenie mit einem erhöhten Knochenumsatz einhergeht. In ovarektomierten Ratten wird ein biphasischer Verlauf des Knochensubstanzverlustes im Femur (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989; LI et al., 1997), in der
proximalen Tibiametaphyse (WRONSKI et al., 1989b) und in den Wirbeln (WRONSKI et al., 1989a;
MOSEKILDE et al., 1993) beobachtet. An der Tibia ist er gekennzeichnet durch eine schnelle Anfangsphase mit dem größten Knochenmasseverlust (0,82% pro Tag), sie dauert ca. 3 Monate. Es folgt eine ca. 5-6 Monate anhaltende Plateauphase der Stabilisierung. Während dieser Zeit bleibt die Knochenmasse annähernd konstant. Die letzte Phase ist gekennzeichnet durch einen langsamen Knochensubstanzverlust (0,08% pro Tag), sie dauert ca. 9 Monate (WRONSKI et al., 1989b). Der Femur erfährt einen ähnlichen Verlauf in Bezug auf sein Längenwachstum (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989) und sein Spongiosavolumen (LI et al., 1997). Frauen erfahren in der ersten Zeit nach der Menopause ebenfalls eine erste schnelle Phase des Knochensubstanzverlustes, gefolgt von einer langsameren (RIGGS u. MELTON 1986; STEPAN et al., 1987).
Langzeitstudien an Ratten von WRONSKI et al. (1988b) belegen, daß die erste Phase des Knochensubstanzverlustes zeitgleich mit der maximalen Erhöhung des Knochen-Turnover abläuft. Bei der Frau sind nach der Menopause Knochensubstanzverlust und erhöhter Turnover ebenfalls parallel zu finden (STEPAN et al.,1987).
Die Entwicklung einer Osteopenie bei Ratten ist deutlicher an Knochen mit einem hohen Anteil an Spongiosa zu beurteilen, z.B. an der Tibia (WRONSKI et al., 1986; DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et al., 2003) oder am Femur (KIMMEL et al., 1990; GEUSENS et al., 1990). Das Spongiosavolumen der proximalen Tibiametaphyse ist fünf Wochen nach einer Ovarektomie im Vergleich zu Kontrolltieren halbiert. Histologisch zeigen sich Osteoklasten und Osteoblasten, die in ihrer Anzahl vermehrt und größer sind als im gesunden Knochengewebe. Daraus resultiert die Annahme, daß Knochenresorption und –aufbau in stärkerem Umfang stattfinden. Das trotz dieses erhöhten Ab- und Aufbaus von Knochengewebe das Spongiosavolumen abnimmt, ist ein Hinweis darauf, daß der Knochenumsatz zugunsten des Abbaus verschoben ist (WRONSKI et al., 1985, 1986; RODEBUSH et al., 1993;
DEMPSTER et al., 1995; THOMPSON et al., 1995).
Ein ähnlicher Mechanismus wird für die Entstehung der postmenopausalen Osteoporose bei der Frau vermutet (HEANEY et al., 1978). GRUBER et al. (1986) zeigen, daß die Osteoklastenaktivität in postmenopausalen Patienten höher ist als die der Osteoblasten.
Die letzte, langsame Phase des Knochenabbaus mit einem zeitgleichen Anstieg des Knochenstoffwechsels wird auch bei erwachsenen Kontrolltieren ab dem Alter von ca. 12 Monaten in der Tibia beobachtet. Dies wird als physiologischer Alterungsprozess im Knochenstoffwechsel von Ratten gedeutet (WRONSKI et al., 1989b; THOMPSON et al., 1995). Ein Vergleich des Knochenaufbaus von Spongiosagewebe zwischen acht und zwölf Wochen alten Ratten zeigt, daß die jüngeren Tiere eine 5fach höhere Aufbaurate und eine 1,5fach schnellere Mineralisierungsrate zeigen
als die älteren Tiere. Während der normalen Skelettentwicklung in Ratten sinkt der Knochen-Turnover merklich (BARON et al., 1984) ab. Dieses Phänomen hängt auch mit einer Veränderung des Knochenmarkes zusammen. Wachsende Ratten zeigen rotes Knochenmark in der Tibia auf, während ausgewachsene Tiere überwiegend gelbes Fettmark besitzen (WRONSKI et al., 1986). Knochen mit rotem Knochenmark weisen im Allgemeinen eine größere Turnoverrate an den Trabekeln auf, als Knochen mit gelbem Fettmark (WRONSKI et al., 1980, 1981). Die höchste Knochenmasse erreichen Ratten in einem Alter von 10 Monaten (KIMMEL 2002).
Die Ovarektomie von Ratten führt neben der Osteopenie zu einem übermäßigen Anstieg der Körpermasse (SAVILLE 1969; AITKEN et al., 1972; LINDGREN et al., 1979, 1982; KALU 1984;
WRONSKI et al., 1985, 1986; GEUSENS et al., 1990; THOMPSON et al., 1995). Übergewicht schützt partiell die langen Röhrenknochen vor einer Abnahme des Spongiosavolumens und der Ausbildung einer Osteopenie, wie sie in gewichtskontrollierten ovarektomierten Ratten entsteht (WRONSKI et al., 1987). ROUDEBUSH et al. (1993) folgern daraus, daß dieser Gesichtspunkt die Ergebnisse von pharmakologischen Studien mit dem Modell der ovarektomierten Ratte manipulierbar macht. In Berichten über fettleibige postmenopausale Frauen konnte eine Verminderung des Knochensubstanzverlustes und ein verringertes Frakturrisiko beobachtet werden (DANIELL 1976). Dem Übergewicht wird ein protektiver Stimulus zugeschrieben, in dem der Knochenaufbau an den langen Röhrenknochen durch den größeren „Druck“ der Körpermasse gefördert wird (WRONSKI et al., 1985, 1987). TAKEDA et al. (2002) beschreiben, daß nicht die Körpermasse sondern freigesetztes Leptin aus Fettzellen die Knochenmasse kontrolliert.
Die Symptome des Knochenverlustes im Ovarektomie-Modell der Ratte gleichen in vielen Aspekten denen des postmenopausalen Knochensubstanzverlustes beim Menschen (WRONSKI et al., 1989b;
Kalu et al., 1989, 1991). Dazu gehört z. B. der Spongiosavolumenverlust durch Abnahme der Trabekelanzahl in den langen Röhrenknochen (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989; WRONSKI et al., 1989b; MILLER u. WRONSKI 1993; LI et al., 1997; DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et al., 2003) und in den Wirbeln (WRONSKI et al., 1989a, 1999; MOSEKILDE et al., 1993) sowie der Anstieg des Knochenstoffwechsels mit Begünstigung der Resorption (WRONSKI et al., 1985, 1986; THOMPSON et al., 1995). Weitere Parallelen sind der biphasische Verlauf des Knochensubstanzverlustes mit einer schnellen Anfangsphase (YAMAZAKI u. YAMAGUCHI 1989; WRONSKI et al., 1989a, b; LI et al., 1997) und die Protektion der langen Röhrenknochen durch Fettleibigkeit (WRONSKI et al., 1985, 1987). Ein weiterer wichtiger Aspekt ist das positive Ansprechen der Ratte auf diverse Medikamente der Osteoporosetherapie beim Menschen (KALU 1991; KIMMEL 2002). Dazu gehören die EB2B (WRONSKI et al., 1988a; SCHMIDT et al., 2000; ANDERSSON et al., 2002; DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et al.,
2003), PTH (WRONSKI et al., 1993; MOSEKILDE et al., 1994; ANDERSSON et al., 2002) oder die Bisphosphonate (ANDERSSON et al., 2002). Weitere Vorteile des Modells sind, daß es ohne großen Aufwand unter standardisierten Bedingungen in kurzer Zeit durchgeführt werden kann und daß das Rattenskelett viele Ähnlichkeiten mit dem menschlichen aufweist (z. B. lamellären Knochenaufbau, Remodeling in den Spongiosaanteilen). Ratten zeigen jedoch auch Unterschiede zum menschlichen Knochenstoffwechsel (z. B. geringeres intrakortikales Remodeling) (LI u. MOSEKILDE 1995).
Veränderungen der Serumparameter wie z. B. Gesamtkalzium, ionisiertes Kalzium, Phosphat, PTH, Osteokalzin oder die alkalische Phosphatase sind bei der Ratte je nach Studie nicht, kaum oder doch zu sehen. Die Gründe für diese unterschiedlichen Werte sind noch unklar und machen eine Standardisierung des Tiermodells hinsichtlich dieser Parameter notwendig (KALU 1991). THOMPSON et al. (1995) empfehlen, wachsende Ratten im Alter von 3 Monaten für dieses Modell zu wählen, da sie durch eine Ovarektomie schneller eine Osteopenie mit ausgeprägteren Symptomen (Spongiosavolumenverlust, Knochen-Turnover) entwickeln, als ältere Tiere.
2.4.2 Die gastrektomierte Ratte
Die chirurgische Entfernung des Magens (Gastrektomie, GX) führt bei jungen Ratten zu einer Osteopenie (PERSSON et al., 1993; KLINGE et al., 1995; STENTSTRÖM et al., 1995, 2000;
RÜMENAPF et al., 1997; MÜHLBAUER et al., 1998; LEHTO-AXTELIUS et al., 1998, 2002a; GEPP et al., 2000; SURVE et al., 2001a, b). Anfänglich mutmaßten verschiedene Autoren, daß eine mangelhafte Kalziumfreisetzung aus dem Nahrungsbrei, durch den Wegfall der Magensäure, für die Entstehung der Osteopenie verantwortlich ist (AXELSON et al., 1991; PERSSON et al., 1993). PERSSON et al., (1993) konnten jedoch durch eine alleinige Hemmung der Magensäuresekretion keine Osteopenie hervorrufen.
Auch demonstrieren verschiedene Arbeiten, daß eine Kalziumsupplemention den Knochensubstanzverlust nicht verhindern kann (KLINGE et al., 1995; RÜMENAPF et al., 1997;
WOJTYZKA et al., 1998; LEHTO-AXTELIUS et al., 2002a). Ein auf andere Weise verursachtes Kalzium-Defizit verursacht eine ähnliche Osteopenie wie sie durch eine GX entsteht (LEHTO-AXTELIUS et al., 2002a). SURVE et al. (2002) nehmen an, daß durch eine GX der Transport von Kalzium in das Knochengewebe verschlechtert ist. Äthiologisch ausgeschlossen sind ebenfalls ein Vitamin-D-Defizit (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998), sekundärer Hyperparathyreodismus (RÜMENAPF et al., 1997; WOJTYZKA et al., 1998; GEPP et al., 2000), die Operationsmethode zur Wiederherstellung des Verdauungstraktes und ein Vitamin-BB12B-Defizit (WOJTYZKA et al., 1998). Der Pathoentstehungsmechanismus einer Osteopenie nach einer Gastrektomie ist nach wie vor unklar
(RÜMENAPF et al., 1996; SURVE et al., 2001a). Der Magen beeinflußt die Knochenmasse eventuell durch das hypothetische Hormon Gastrokalzin (PERSSON et al., 1989; RÜMENAPF et al., 1997) aus den ECL-Zellen der Magenschleimhaut (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998, 2002), oder durch eine Störung im Vitamin D- oder Säure-, Basenhaushalt (WOJTYZKA et al., 1998).
Auf die Heilung eines Knochendefektes hat die Gastrektomie keine Wirkung (ZELLIN et al., 2002). Eine Teil-(Antrum-, Fundus-) oder Totalgastrektomie hat deutlichen Einfluß auf die Ausprägung der Osteopenie. Die Totalgastrektomie bewirkt eine starke Ausprägung von Symptomen, im Vergleich zur Fundektomie, während eine Antrektomie kaum Auswirkungen auf den Knochenaufbau hat (PERSSON et al., 1993; RÜMENAPF et al., 1997; LEHTO-AXTELIUS et al., 1998). 10-30% der Fundusmagenschleinhaut reichen aus, um Knochen vor der Entstehung einer Osteopenie zu schützen (LEHTO-AXTELIUS et al., 2002b).
An den Calvariae stellt sich der Knochenmasseverlust am deutlichsten dar (KLINGE et al., 1995;
LEHTO-AXTELIUS et al., 1998, 2002a; SURVE et al., 2001a, b). Er kann begleitet sein von einer Knochendickenabnahme (KLINGE et al., 1995) oder ohne diese (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998;
SURVE et al., 2001a) auftreten. Histologisch sind große mit Knochenmark gefüllte Sinusoide zu erkennen, die konfluieren und nicht transparent sind. Die Vaskularisierung des Gewebes ist erhöht (KLINGE et al., 1995; LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; SURVE et al., 2001a).
Eine Gastrektomie hat keinen Effekt auf das Längenwachstum von Knochen (LEHTO AXTELIUS et al., 1998; MÜHLBAUER et al., 1998). Sie führt zu einer Verminderung des Knochenaschegewichtes, begleitet von einer Minderung des Kalzium-, Magnesium- und Phosphatgehaltes in den langen Röhrenknochen (HÅKANSON et al., 1990; PERSSON et al., 1993; RÜMENAPF et al., 1997; GEPP et al., 2000; STENSTRÖM et al., 2000; SURVE et al., 2001b; ANDERSSON et al., 2002; ZELLIN et al., 2002) und den Wirbeln (ANDERSSON et al., 2002). Das Knochengewicht (PERSSON et al., 1993;
RÜMENAPF et al., 1997; ZELLIN et al., 2002) und das Spongiosavolumen (PERSSON et al., 1993;
RÜMENAPF et al., 1997; LEHTO-AXTELIU 1998; SURVE et al., 2001 a, b; ANDERSSON et al., 2002) sind reduziert. Insgesamt ist der osteoporotische Effekt auf die Kortikalis kleiner als auf die trabekulären Anteile des Knochens (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; MÜHLBAUER et al., 1998; ANDERSSON et al., 2002). Das Gleichgewicht zwischen Knochenaufbau und -abbau hat sich zugunsten der Resorption verschoben (LEHTO-AXTELIUS et al., 1998; MÜHLBAUER et al., 1998).
Nach einer GX wird vermehrt Magnesium und Phosphor enteral sowie zyklisches Adenosinmonophosphat renal ausgeschieden (RÜMENAPF et al., 1996). Im Serum sind die Gehalte von Gastrin (RÜMENAPF et al., 1997; MÜHLBAUER et al., 1998), 25-Hydroxy Vitamin DB3B und von 1,25-Dihydroxy Vitamin DB3B verringert (RÜMENAPF et al., 1997).
Ein Vergleich des Schweregrades der Osteopenie nach einer GX oder Ovarektomie zeigt folgende Ergebnisse: Die Osteopenie an Femur und Wirbeln ist bei beiden Eingriffen ähnlich ausgeprägt (SURVE et al., 2001a; ANDERSSON et al., 2002). An den Calvariae und an der Kortikalis der langen Röhrenknochen sind im Gegensatz zur GX bei der Ovarektomie keine Veränderungen zu sehen (SURVE et al., 2001a, b).
Die Kombination einer Ovarektomie mit einer GX bewirkt bei der Spongiosaosteopenie geringgradig additive Effekte (Surve et al., 2001b). Da die Veränderungen an unterschiedlichen Knochen und Knochenregionen zu finden sind und beide Eingriffe zusammen kaum additive Wirkung zeigen, wird von einem unterschiedlichen Entstehungsmechanismus ausgegangen (SURVE et al., 2001a, b). Dafür spricht auch, daß beide Formen der Osteopenie auf PTH, EB2B und Alendronat (Bisphosphonat) unterschiedlich ansprechen. PTH- und EB2B-Therapie können den Trabekelverlust nach einer GX nicht verhindern, wohl aber nach einer Ovarektomie, während Alendronat bei beiden Eingriffen den Verlust verhindern kann (ANDERSSON et al., 2002). GEPP et al. (2000) postulieren, daß sich das Tiermodell der gastrektomierten Ratte eignet, um Knochenkrankheiten zu untersuchen, während SURVE et al.
(2001b) dieses Modell als Alternativmodell zur Erforschung der Osteoporose vorschlagen.
Eine Postgastrektomie-Osteoporose ist auch beim Menschen bekannt, dennoch ist ihr Mechanismus unklar (TOVEY et al., 1991). Zudem gibt es Studien, die gegenteilige Ergebnisse gezeigt haben (LIEDMANN et al., 1997). Die Notwendigkeit zur Durchführung einer Gastrektomie beim Menschen ist in den letzten Jahren deutlich angestiegen (RESCH et al., 1992; ZITTEL et al., 1997).
2.5 Substanzen mit osteoanaboler Wirkung 2.5.1 Parathyrin (Parathormon, PTH)
PTH ist wichtig zur Regulation der Kalziumhomöostase. Bei einer Hypokalzämie sorgt es dafür, daß der physiologische Zustand schnell wieder hergestellt wird, indem mobiles Kalzium aus den Knochenspeichern freigesetzt wird. Seine nativ zirkulierende Form besteht aus 84 Aminosäuren. Um einen metabolischen Effekt zu erzielen, genügen die Fragmente 1-38 (WHITFIELD et al., 2000). Die biologisch aktive Form hPTH 1-37 wurde 1997 erstmalig von HOCK et al. (1997) aus Hämofiltrat isoliert.
Mitte der 70er Jahre erkannte man, daß PTH mit seiner osteoanabolen Wirkung ein erfolgversprechendes Medikament gegen die Osteoporose sein könnte (REEVE et al., 1976). Danach folgten eine Vielzahl von Studien an Tieren und Menschen.
Heute ist bekannt, daß intermittierende Gaben von PTH osteoanabole Wirkung, vor allem auf die Spongiosaanteile des Knochens haben (KIMMEL et al., 1993; SHEN et al., 1993; WRONSKI et al., 1999; ANDERSSON et al., 2002). Kontinuierliche Infusionen dagegen bewirken katabole Prozesse (WHITFIELD et al., 2000; ANDERSSON et al., 2002), die sich an der Kortikalis zeigen können (HODSMAN et al., 2000). Es gibt allerdings auch Studien, die im Bereich der Kortikalis anabole Effekte beschrieben haben (WRONSKI u. YEN 1994; HODSMAN et al., 2000; SAMNEGÅRD et al., 2001). Bei intermittierender Anwendung wird PTH eine effektivere osteoanabole Wirkung zugeschrieben als EB2B
oder Bisphosphonaten (WRONSKI et al., 1993). Auch die Kombination von PTH 1-34 mit EB2B hat additive Wirkung in Bezug auf eine osteoanabole Wirkung (SHEN et al., 1993). Kimmel et al. (1993) zeigen darüber hinaus, daß synthetisches PTH eine potentere Wirkung hat als rekombinantes hPTH 1-84. In einer großen Anzahl von Studien mit Ratten kann für PTH eine osteoanabole Wirkung nachgewiesen werden (REEVE et al., 1976; KIMMEL et al., 1993; WRONSKI et al., 1993, 1999; SAMNEGÅRD et al., 2001; ANDERSSON et al., 2002). Daher wurde synthetisches hPTH 1-37 von der IPF PharmaCeuticals GmbH als Positivkontrolle in dieser Arbeit verwendet.
2.5.2 Östrogen (17-β-Östradiol, EB2B)
EB2B ist nicht nur wichtig für einen physiologischen Reproduktionsablauf, seine Wirkung erstreckt sich auch auf viele nicht reproduktionsbezogene Prozesse. So spielt es eine wichtige Rolle während des Knochenwachstums und bei Erwachsenen in der Regulation des Knochenstoffwechsels (VÄÄNÄNEN u.
HÄRKÖNEN 1996). Ein EB2B-Verlust im Körper, ob er chirurgisch induziert ist oder physiologisch auftretend nach der Menopause, kann zum Krankheitsbild der Typ-I-Osteoporose führen (RIGGS et al., 2003). Da EB2B vor allem an der Regulation der trabekulären Knochenmineraldichte beteiligt ist (LINDBERG et al., 2002), sind bei der Typ-I-Osteoporose die trabekulären Knochenstrukturen am meisten betroffen (DA PAZ et al., 2001; KAVUNCU et al., 2003). EB2B reguliert eine Vielzahl von Genen am Knochen, die für den Knochenstoffwechsel von großer Wichtigkeit sind, dazu gehören Zytokin gesteuerte Gene, Wachstumsfaktor gesteuerte und Knochenmatrix gesteuerte Gene (LINDBERG et al., 2002). Östrogenrezeptoren sind auf OK (PENSLER et al., 1990) und OB (ERIKSEN et al., 1988) lokalisiert worden. Eine Inhibierung der Osteoklastendifferenzierung wird über das Absinken der Interleukin-11 und 6 (IL-11 und IL-6) Spiegel gesteuert, welche EB2B reguliert sind. Ob EB2B eine direkte oder indirekte Wirkung auf Osteoblasten hat ist nicht geklärt (VÄÄNÄNEN u. HÄRKÖNEN 1996).
Die Unterdrückung des Knochensubstanzverlustes durch 17-β-Östradiol wurde in vielen Studien mit Hilfe des Tiermodells der ovarektomierten Ratte nachgewiesen (WRONSKI et al., 1988a; SCHMIDT et
al., 2000; DA PAZ et al., 2001; ANDERSSON et al., 2002; KAVUNCU et al., 2003). Im Gegensatz dazu gibt es Studien, die von Teil- oder Mißerfolgen bei der Therapie mit EB2B gegen den Knochenverlust bei der ovarektomierten Ratte berichten (SIMS et al., 1996; ABE et al., 1993). Da 17-β-Östradiol in einer Vielzahl von Studien eine osteoanabole Wirkung nachgewiesen werden konnte, wurde es neben PTH als Positivkontrolle in dieser Arbeit verwendet.
3. Material und Methoden
3.1 Präparation und Peptidextraktion aus Schweinemagen
103 entleerte, gewaschene und zentrifugierte Schweinemägen (56 kg Gewebe) wurden über die Firma Enders aus der Kuttelei des Schlachthofes Gleidingen (Hannover, D) auf Brucheis gekühlt in das IPF transportiert. Hier wurde mit Fleischermessern und Einmalskalpellen (CutfixP®P Surgical Disposable Scalpel, Fa. B. Braun, AesculapP®P) der Magen in Fundus- und Pylorusbereich getrennt und die Schleimhaut vom Fundusanteil für die weitere Aufarbeitung abpräpariert. Der Präparationsbereich ist in Abb. 2 durch einen quadratisch markierten Bereich dargestellt.
Abb. 2: Präparationsbereich am Schweinemagen (nach NICKEL et al., 1987).
Zusätzlich wurde der Bereich der Pars nonglandularis (Abb. 2, Nr. 2) sauber abgeschnitten. Die Präparation ergab eine Gewebemasse von 7,66 kg. Diese wurde für 15 min in 95-100 °C heißer 1 M Essigsäure gekocht (1 kg Gewebe + 1,5 Liter 1 M Essigsäure). Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde der Kochansatz (ca. 1 kg Gewebe + 1,5 Liter Kochlösung) im Waring Blendor auf Stufe 3 für 2 min homogenisiert. Die homogenisierte Lösung wurde mit 1 M Essigsäure auf 35 Liter verdünnt und der pH Wert mit 25%iger Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Zur Peptidextraktion wurde die pH-korrigierte
Lösung über Nacht bei 0 °C schwach gerührt. Das Abtrennen der Zellmasse erfolgte durch eine 15minütige Zentrifugation bei 4 °C mit einer Sigma SK 10 Zentrifuge (Rotor Nr.: 12500, g = 17000, Sigma Laborzentrifugen). Das Überstandsvolumen (32 Liter) wurde zweimal filtriert, da das Zentrifugat trübe war und einen hohen Fettanteil aufwies. Die erste Filtration mit wurde mit einem Tiefenfilter (Seitz-Bio 40, Fa. SeitzSchenk Filtersystems) und 3-4 mm Precoat als Filterhilfsmittel (FH-1500, Fa.
SeitzSchenk Filtersystems) durchgeführt. Die zweite Filtration wurde ohne Precoat sonst identisch der ersten durchgeführt. Es ergab sich ein Filtrationsvolumen von 31 Litern.
3.1.2 Ultrafiltration
Zur Proteinabreicherung wurde das Filtrat 50 und 10 kDalton ultrafiltriert und diafiltriert. Zum Einsatz kamen 4 hintereinandergeschaltete 50 kDalton-PS-Ultrasart Platten Module (Sartorius) mit einer Fläche von 4 x 0,1 mP2P und ein 10 kDalton-Ultrasart Platten Modul (Sartorius) mit einer Fläche von 0,1 mP2P in einer Sartocon Mini Ultrafiltrations-Anlage (Sartorius). Die Anlage wurde mit einer Zahnradpumpe (Verder GmbH) auf 75% Leistung (ca. 260 Liter/h) betrieben. Das Permeatvolumen von 39,3 Litern wurde zur Hälfte für die weitere Aufarbeitung auf eine Vydac C18 Kartusche aufgetragen (siehe Abschnitt 3.3.3).
3.2 Humanes Hämofiltrat
Zur Isolierung und Aufreinigung neuer osteoanaboler Peptide wurde humanes Hämofiltrat aus dem Nephrologischen Zentrum Niedersachsens, in Hannoversch–Münden, bezogen. Aus diesem humanen Nebenprodukt, das bei der Behandlung von niereninsuffizienten Patienten anfällt, isoliert die IPF PharmaCeuticals GmbH biologisch aktive Formen von Peptiden. Die Aufarbeitung von Hämofiltrat ist in Abschnitt 3.3.4 beschrieben.
3.3 Chromatographische Methoden
Die Aufreinigung und damit die Auftrennung von Peptidgemischen erfolgte mit Hilfe von Kationenaustausch- (Ion-Exchange-Chromatography, IEC) und Umkehrphasenchromatographie (Reversed-Phase-Chromatography, RPC) an HPLC-Anlagen.
Der präparative IEC-Lauf wurde an einer Autopilot Anlage von PerSeptive Biosystems durchgeführt. Die im Durchlauf befindlichen ungebundenen Peptide wurden bis zur weiteren Verwendung in einem geeigneten Behältnis aufgefangen und gebundene Peptide mit 0,5 M Ammoniumacetatlösung eluiert.
Die Trennung wurde durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm verfolgt.
Die präparativen RPC-Läufe wurden an den HPLC–Anlagen BioCad 60 (PerSeptive Biosystems), und Septech™ (Merck) durchgeführt. An die Septech™ Anlage ist ein Detektor von Merck/ Hitachi L-4000 A angeschlossen. Die Fraktionierung erfolgte manuell. Bei Verwendung des BioCad 60 erfolgte eine automatisierte Fraktionierung mit dem Fraktionssammler Advantec SF-2120 (Advantec Toyo Kaisha).
Die RPC-Aufreinigungen erfolgten generell mit einem steigenden Anteil an Laufmittel B. Die Trennungen der Peptide wurden detektiert durch Messung der Absorption bei 280 und 214 nm.
3.3.1 Kationenaustausch Chromatographie
Für den IEC-Lauf wurde folgende Säule mit Füllung und folgendes Puffersystem verwendet:
Säule: Vantage VA 250 (AmiconP®P, 25 x 8,4 cm; 3,4 L Fa. Millipore) Säulenfüllung: KatEx Fractogel TSK SP 650 M (Merck)
Puffer A: VE-Wasser (vollentsalztes Wasser) Puffer B: 0,5 M Ammoniumacetat pH ca. 7,0 Die Herstellung von Puffer B erfolgte mit VE-Wasser.
Auf pH 2,5 korrigiertes Hämofiltrat wurde mit VE-Wasser bis auf eine Leitfähigkeit von ≤ 6 mS/cm verdünnt. Dieses wurde auf den Kationenaustauscher mit einer Fließrate von 1,80 L/min aufgetragen.
Batcheluiert wurde mit Puffer B, Fluß 1,0 L/min.
3.3.2 Umkehrphasenchromatographie
Bei der RPC wurden die Proben direkt oder 1+10 mit Puffer A verdünnt auf die Säule aufgetragen. Bei der Hämofiltrataufarbeitung wurde die Auftragslösung vorher durch einen 0,45 µm Membranfilter (Schleicher & Schuell) filtriert. Folgende Säulen wurden für die präparative RPC verwendet:
Tabelle 1: Säulen und –füllmaterialien für die RPC.
Säule & Säulenfüllung Hersteller Pharmacia Source FineLine 4,7 L, 20 x 15 cm
15 RPC (1000 Å, 15 µm) Pharmacia, Freiburg, D PrepPakP®P Kartusche 4,7 x 30 cm,
Vydac ™ C18 (300 Å, 10µm) Waters, Milford, MA, USA
Zur Herstellung der Puffer wurde VE-Wasser verwendet. Als organisches Lösungsmittel wurde Acetonitril der Firma Merck eingesetzt. Das Acetonitril entsprach der Reinheitsstufe „isocratic grade“.
Vor seiner Verwendung wurde das Laufmittel B für 10 min im Heliumstrom entgast. Die verwendeten Puffer waren:
Laufmittel A: Laufmittel B:
10 mM HCL 80% (v/v) Acetonitril in 10 mM HCL
3.3.3 Aufreinigung einer osteoanabolen Aktivität aus dem Ultrafiltrat der Schweinemagenfundusmukosa
Zur Isolierung einer osteoanabolen Aktivität aus Schweinemagenfundusmukosa für die in vivo Studie, wurde ein chromatographischer Aufreinigungsschritt (RPC) mit Fraktionierung durchgeführt (siehe Tabelle 2). Die Auswahl der aktiven Fraktion erfolgte in vitro mit ROS-17/2.8 Zellen durch den alkalische-Phosphatase-Test (siehe Abschnitt 3.4.5).
Auf die C18 Säule wurden 19,7 Liter Permeat aufgetragen. Das entspricht einer Äquivalentmenge von 3,85 kg Fundusmukosa = 50 Schweinemagenäquivalent.
Tabelle 2: Säulen und –füllmaterialien für die Schweinemagenaufarbeitung.
Säulen &
Säulenfüllung Laufmittel Gradient Fließrate Fraktio- nierung RPC
PrepPakP®P Kartusche 4,7 x 30 cm, Vydac ™ C18 (300 Å, 10µm)
A: 10 mM HCL B: 80% (v/v) ACN
in 10 mM HCL
0-40% B in 1500 ml 40-60% B in 400 ml 60-100% B in 150 ml
100% B für 150 ml 100-0% B in 100 ml
0% B für 400ml
40 ml/min 42 x 50 ml
Von Fraktion 33 wurden 120 Aliquots á 0,11 Magenäquivalent in 1,5 ml Eppendorfgefäßen entnommen und für die Durchführung der in vivo Studie lyophilisiert (Typ LDC-1, Alpha 2-4, Fa. Christ).
3.3.4 Aufreinigung einer osteoanabolen Aktivität aus Hämofiltrat
Zur Isolierung einer osteoanabolen Aktivität aus Hämofiltrat zur Durchführung der in vivo Studie, wurden drei chromatographische Aufreinigungsschritte durchgeführt. Die Auswahl der Fraktion erfolgte in vitro mit Knochenmarkstammzellen. Die verwendeten Säulen und -füllmaterialien, Puffersysteme, Gradienten, Fließraten und die Art der Fraktionierung sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3: Säulen und –materialien für die Hämofiltrataufarbeitung.
Säulen &
Säulenfüllung Laufmittel Gradient Fließrate Fraktio- nierung
1 IEC
Vantage VA 250 (AmiconP®P), Fractogel TSK 3,4 L SP 650 (M) 25 x
8,4 cm
HF und VE-Wasser Batchelution mit 5-8 L 0,5 M
Ammoniumacetat 1,0 L/min 1350 L Durchlauf gesammelt
2 RPC
Pharmacia Source FineLine 4,7 L 15 RPC, 15 x 20 cm, (1000 Å, 15 µm)
A: 10 mM HCL B: 80% (v/v) ACN
in 10 mM HCL
0 % B für 390 ml 0-60% B in 21600 ml 60-95% B in 1590 ml 95-0% B in 990 ml
0% B für 6900 ml
300 ml/min 48 x 600 ml
3 RPC
PrepPakP®P Kartusche 4,7 x 30 cm, Vydac ™ C18 (300 Å, 10 µm))
A: 10 mM HCL B: 80% (v/v) ACN
in 10 mM HCL
0-40% B in 1500 ml 40-60% B in 400 ml 60-100% B in 150 ml
100% B für 150 ml 100-0% B in 100 ml
0% B für 400ml
40 ml/min 42 x 50 ml
Von Fraktion 32 aus dem 3. Aufreinigungsschritt wurden 60 Aliquots á 82,5 ml Hämofiltratäquivalent und 60 Aliquots mit der zehnfachen Menge in 1,5 ml Eppendorfgefäßen zur Durchführung der in vivo Studie entnommen und lyophilisiert (Typ LDC-1, Alpha 2-4, Fa. Christ).
