É Botrytis-TestsbeiderTraubenannahme

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Michael Fischer und Hanns-Heinz Kassemeyer, Staatliches Weinbauinstitut Freiburg, Freiburg (D) Andrea Wosnitza, Caroline Freye-Minks und Renate Loewe, LOEWE Biochemica GmbH, Sauerlach (D)

Michael.Fischer@wbi.bwl.de

Der Grauschimmel,Botrytis cinerea, befällt eine Vielzahl von Kulturpflanzen, darunter Beerenobst, Gemüse und Zierpflanzen. Auf geeignetem Gewebe wie der Oberflä- che von Weinbeeren verbreitet sich der Pilz rasch mit Hilfe ungeschlechtlich gebildeter Konidien (Abb. 1, 2).

Botrytis bildet unter natürlichen Bedingungen soge- nannte extrazelluläre Phenoloxidasen aus, die ins Medi- um abgegeben werden. Der Hauptvertreter dieser En- zymgruppe, die Laccase, ist verantwortlich für die uner- wünschte Oxidation und damit das Braunwerden des Mosts. Vor allem Trauben roter Rebsorten müssen we- gen der verlängerten Kontaktzeit weitestgehend frei von Botrytis-Befall sein. Ein schneller und gezielter Nach- weis des Pilzes bei der Traubenannahme ist aber nicht ohne weiteres möglich.

Seit Jahren ist es erklärtes Ziel der Weinwirtschaft, eine prozessbegleitende Kontrolle der Laccase- beziehungsweise derBotrytis-Konzentration über alle Phasen der Weinkelterung zu gewährleisten. In einem gemein- samen Forschungsprojekt des Staatlichen Weinbauin- stituts Freiburg mit der Firma LOEWE Biochemica wurden nun zwei serologische Testverfahren (ELISA und Lateral Flow Schnelltest) entwickelt, die eine schnelle und zuverlässige Beurteilung des Leseguts bei der Trau- benannahme und sogar im Weinberg erlauben.

Ein Befall der Beeren durchBotrytis cinereawar bis- lang ungenau oder nur durch bezüglich Gerätschaften und vom Arbeitseinsatz her aufwendige Analysen nachweisbar:

▪ Hervorzuheben ist vor allem die weithin geübte Er- fassung mittels Bonitur (Schadensausmass wird visuell abgeschätzt); dabei wird aber nur der äusserlich sichtbare Befall erfasst, Aussagen über Enzymaktivi- täten sind nicht möglich.

Botrytis-Tests bei der Traubenannahme

Mit Graufäule(Botrytis)infiziertes Lesegut führt immer wieder zu unerfreulichen Diskussionen bei der Traubenannahme. Es besteht ohne Zweifel ein ausgewiesener Bedarf für ein verlässliches und schnelles Diagnoseverfahren zur Erfassung des Befallsgrades. Auf der Basis vonBotrytis-

spezifischen Antikörper-Reaktionen wurden zwei neue Testsysteme entwickelt, die je nach Verfügbarkeit von Geräten und Zeit eine etwas aufwendigere, genaue Bestimmung des

Fäulnisanteils oder dann eine rasche Abschätzung auf Teststreifen erlauben. Gemäss den Angaben der Autoren haben beide Verfahren ihre Praxistauglichkeit bewiesen.

Abb. 1:Botrytis cinerea,Versuchsprobe: zahlreiche eiförmige Konidien.

Abb. 2:Botrytis cinerea, befallene Beere: dunkle Hyphenstränge und zahlrei- che helle Konidienköpfchen.

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▪ Eine weitere Möglichkeit ist der Nachweis über die Bestimmung der Laccase-Aktivität («Syringaldazin- test») in den Proben. Das gelbe Substrat Syringalda- zin wird dabei von der Laccase (wenn vorhanden) zum rötlichen Chinon oxidiert. Die Messung erfolgt photometrisch über die Extinktionszunahme bei 530 nm.

▪ Der Nachweis über die Infrarot-Spektroskopie («Gra- peScan»). Nach aufwendiger Kalibrierung des Geräts können im Most Inhaltsstoffe wie Glucose, Fructose oder auch Glycerin erfasst werden; die genaue Korre- lation mit dem tatsächlichen Befallsgrad durchBo- trytisist aber umstritten.

Serologische Testverfahren

Serologische Testverfahren (das sind Verfahren, die auf Immunreaktionen beruhen) gelten als zuverlässige Me- thoden zur Diagnostik einer Vielzahl von Pflanzenpa- thogenen (Viren, Pilze, Bakterien). Die hier vorgestell- ten Tests basieren auf einem neuen und spezifischen Antiserum gegenBotrytis cinerea. Das Prinzip des Nach- weises beruht auf der stabilen Wechselwirkung zwischen Antigen (hierBotrytis cinerea; Mycel, Konidien, Proteinen) und dem homologen Immunglobulin (IgG, Antikörper). Das Antigen in der befallenen Probe bildet dabei eine Brücke zwischen dem an eine Festphase ge- bundenen Immunoglobulin und einem Enzym-markierten Antikörper. Dieses Konjugat ermöglicht über eine nachgeschaltete Farbreaktion den quantitativen Nachweis und damit die Beurteilung der Befallsstärke (Abb. 3).

Im Lauf der Arbeiten kristallisierten sich zwei Test- methoden zum Botrytis-Nachweis heraus:

Cocktail-ELISA

Dieses klassische Testverfahren ermöglicht zuverlässig und dokumentierbar eine quantitative Abschätzung des Botrytis-Befalls. Es ist für die Beurteilung des Leseguts nach der Ernte oder aber auch für die Abschätzung eines latenten Befalls schon im Weinberg geeignet und bietet sich damit als Werkzeug für das Qualitätsmanagement an.

Der Test kann in einem ELISA-Labor mit der vorhan- denen Ausstattung durchgeführt werden. Als erster Ar- beitsschritt wird derBotrytis-spezifische Antikörper auf

eine 96-Loch-Mikrotiterplatte gebunden und vier Stun- den bei 37 °C inkubiert. Danach werden die Most- oder Maischeproben zusammen mit dem Enzym-markierten Antikörper aufgetragen. Am nächsten Morgen wird die farblose Substratlösung zugegeben, die bei Vorhanden- sein des Antigens in einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Nach etwa ½ bis 1 Stunde kann der Farbumschlag spektrofotometrisch gemessen oder visuell bewertet werden. Je intensiver die Blaufärbung, desto höher ist der Befall mitBotrytis(Abb. 4). Das Verfahren eignet sich besonders für Massentests, da gleichzeitig 96 Proben (oder nacheinander ein Vielfaches davon) analysiert werden können. Bei Auftrag der Proben am Abend liegen die Er- gebnisse im Verlauf des nächsten Morgen vor.

Lateral Flow Schnelltest

Der Lateral Flow Test ermöglicht eine Beurteilung des Botrytis-Befalls innerhalb weniger Minuten. Der Test kann ohne Vorkenntnisse und Laborausstattung vor Ort durchgeführt werden. Auch bei diesem Testverfahren werdenBotrytis-spezifische Antikörper eingesetzt. Die Basis des Lateral Flow Tests bildet eine Nitrocellulose- membran, die zum Schutz vor mechanischen Einflüs- sen in eine Plastikkassette eingebracht ist (Abb. 5). Die- ses Design erweist sich als besonders robust in der prak- tischen Anwendung unter Arbeitsbedingungen in der Weinkellerei oder im Weinberg.

Die vorbereitete Probe (aus Trauben, Most, Maische) wird durch die Probenauftragsöffnung pipettiert und bringt den rot gefärbtenBotrytis-spezifischen Antikör- per in Lösung. BeiBotrytis-Befall entsteht ein Immun- komplex aus Antigen und Antikörper, der zur Testlinie wandert. Er wird dort festgehalten (immobilisiert) und bildet eine scharfe rote Bande aus. Ist in der Probe kein Antigen enthalten, bildet sich kein Komplex und es kann keine rote Testlinie entstehen. Abbildung 5 illustriert die einfache Durchführung des Tests.

Obwohl eine quantitative Auswertung des Lateral Flow Tests derzeit nicht möglich ist, kann mit einiger Er- fahrung der Befallsgrad doch abgeschätzt werden: Er- scheint eine starke Testlinie innerhalb einer Minute, ist von einem starken Befall auszugehen. Erscheint sie innerhalb von zwei bis fünf Minuten, ist ein mittlerer Be- fall wahrscheinlich. Ist nach zehn Minuten nur eine Abb. 4: Farbentwicklung desBotrytis cinereaELISA nach 30 Min. Reaktionszeit. Blaue Positionen zeigen Be- fall an – eine visuelle Beurteilung ist leicht möglich.

Abb. 3: Prinzip des ELISA zum Nachweis vonBotrytis cinerea.

Mikrotiterplatte

Botrytis-spezifischer Antikörper Botrytis-Antigen

Enzymmarkierter Botrytis-spezifischer Antikörper

Detektion durch Farbreaktion:

spektrophotometrische Messung oder visuelle Beurteilung

Antikörper-Antigen-Konjugat Sandwich

Das

Probengefäss öffnen und

Traubensaft auffüllen 1.

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schwache Linie zu erkennen, liegt der Befall wohl unter 10%. Abbildung 6 zeigt eine Versuchsreihe mit bonitier- ten Trauben, die eine «halbquantitative» Aussage über den Befallsgrad zulässt.

Korrelation zwischen Bonitur und Nachweis In Voruntersuchungen konnte gezeigt werden, dass sich die hauptsächlichen Ausbreitungseinheiten des Pilzes, die Konidien, bis zu sehr niedrigen Konzentrationen fo- tometrisch nachweisen lassen (etwa 1000/ml; Abb. 7);

dies gilt auch für das zugehörige Mycel. Mit Einführung eines internen Proteinstandards ergeben sich erfolgver- sprechende Möglichkeiten zur Quantifizierung des Nachweises.

Zur weiteren Abklärung wurden Versuchsreihen mit Befallsstärken zwischen 0% und 100% durchgeführt (Be- fallsgrad bestimmt aus ausgezählten gesunden und befallenen Trauben). Die Proben mit definiertemBotrytis- Befall wurden im ELISA, im Lateral Flow und im Lacca- se-Enzymassay getestet. Dabei zeigt sich für alle getesteten Rebsorten (Blauburgunder, Riesling, Müller- Thurgau, Ruländer) eine gute Korrelation zwischen Bo- nitur und serologischem Nachweis (Abb. 8).

Der Test in der Praxis

Das neu entwickelte serologische Verfahren wurde in den letzten Jahren bei der Lese an verschiedenen Stand- orten in Deutschland und Frankreich in der Praxis er- probt. Von mehreren Hundert weissen und roten Sor- tenproben erwiesen sich etwa 30% als nachweisbar mit Botrytis belastet. Nicht unerwartet war ein Befall von weissen Sorten deutlich häufiger. Grundsätzlich waren alle Sorten betroffen, wenn auch in unterschiedlichem Ausmass. Der Bedarf für einen empfindlichenBotrytis- Nachweis ist demnach belegt.

Spezifität der Testmethoden

Beide Testmethoden – Cocktail-ELISA sowie Schnelltest – wurden intensiv auf ihre Spezifität fürBotrytis cinerea untersucht. Dazu wurde das Antiserum einerseits auf Stun-

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Abb. 6: Unterschiedlich stark befallene Trauben im Late- ral Flow Test (Streifen aus der Testkassette entfernt). Im Vergleich sind die Messergebnisse der ELISA Analyse angegeben.

OD 405 nm Botrytis-Befall nach visueller

ELISA Bonitierung

0.07 0%

0.37 10%

0.8 30%

> 3 100%

A en Be- h.

Abb. 5: Design und Durchfüh- rung desBotrytis cinereaLateral Flow Schnelltests.

Abb. 7: Gute Korrelation zwischen Konidienkonzentrati- on und serologischem Nachweis.

T C

4:Nach 2–10 Minuten das Testergebnis im Sichtfenster ablesen

Kontroll-Linie (C) und Test-Linie (T) sichtbar

= positives Ergebnis

nur Kontroll-Linie (C) sichtbar

= negatives Ergebnis Das pufferhaltige

Probengefäss öffnen und mit Most/Maische/

Traubensaft auffüllen

1. Mit der Pipette

gut mischen

2. Langsam 2–3 Tropfen

der Mischung auf die Probenauftragsöffnung geben

3.

C T

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

OD

Null 10² 10³ 10⁴ 10⁵ 10⁶

(Konidien/ml)

optischeDichte

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Apfel auch Pflan weite Schäd einer Chan seine Reaktion mit anderen Botrytis-Isolaten und nahe

verwandten Pilzen, andererseits auf zahlreiche rebenre- levante Pathogene und Saprophyten (Bakterien, Pilze, Hefen, die auf abgestorbenem Material leben) sowie auf die gängigsten im Weinbau verwendeten Spritzmittel (inkl. Botrytizide) getestet. Wir konnten in keinem Fall falsch-positive Neben- beziehungsweise Kreuzreaktio- nen beobachten.

Nachweisgrenze

Die Nachweisgrenze beider Testverfahren liegt sehr niedrig: Wir haben einen Positivstandard ausBotrytis ci- nerea-Mycel hergestellt und die Menge an löslichen Pilzproteinen quantitativ bestimmt. Der Cocktail-ELISA zeigte noch bei 150 µg/ml Pilzprotein eine positive Re- aktion. Beim Lateral Flow Test liegt sie etwas höher, bei zirka 300 µg/ml. Werden visuell bonitierte Trauben für den Nachweis herangezogen, ergibt sich für beide Test- verfahren eine Nachweisgrenze, die zwischen < 1 und

5% Botrytis-Befall liegt. ^■

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R É S U M É

Nos expériences ont confirmé que les nouveaux tests sé- rologiques qui ont été développés pour le dépistage de la pourriture grise pouvaient tous sans exception convenir pour le contrôle de la qualité du moût. Ils affichent en ef- fet une grande robustesse à l’encontre des résidus de pro- duits phytosanitaires et il ne se produit pas de réactions croisées avec d’autres micro-organismes présents dans le raisin. Le procédé ELISA est nettement plus précis que les contrôles de qualité conventionnels et il permet de dépis- ter même les quantités infimes du champignon.

Les avantages des tests résident 1) dans la possibilité de définir le degré d’infestation, 2) la capacité de traite-

ment élevée et 3) la spécificité et la sensibilité du dépis- tage. Un bémol dans l’optique de l’application pratique réside dans le fait qu’entre le prélèvement des échan- tillons et le résultat, il s’écoule plusieurs heures avec le test au cocktail ELISA. Le test express permet cependant de formuler un résultat semi-quantitatif en l’espace de quelques minutes.

Les deux procédés de test sont mûrs pour la pratique. Ils se trouvent dans le commerce et peuvent être obtenus auprès de la maison LOEWE Biochemica GmbH, Mühl- weg 2a, 82054 Sauerlach (D, Fax +49 (0)8104- 61648).

Dépistage de la pourriture grise à la réception du raisin

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fallsgrad und optischer Dichte in verschiedenen Reb- sorten.

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0% 1% 5% 10% 30% 50% 80% 100%

Blauburgunder Riesling-Silvaner

Grauburgunder Riesling Anzahl befallener Beeren in % SZOW6_09.qxd:Layout 1 12.3.2009 13:36 Uhr Seite 12