Aus dem Institut für Zoologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde
der Medizinischen Hochschule Hannover
_____________________________________________________________________
Untersuchungen
zu trophischen und protektiven Effekten neurotropher Faktoren (Brain-derived neurotrophic factor, Glial cell line-derived neurotrophic factor), des Glukocorticoids Dexamethason sowie
elektrischer Stimulation auf kultivierte Spiralganglienzellen der Ratte
INAUGURAL–DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Patrick Wefstaedt
aus Hannover
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung:
PD Dr. rer. nat. K.-H.- Esser (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
PD Dr. med. T. Stöver (Medizinische Hochschule Hannover)
1. Gutachter:
PD Dr. rer. nat. K.-H. Esser PD Dr. med. T. Stöver 2. Gutachter:
Prof. Dr. rer. nat. G. Bicker
Tag der mündlichen Prüfung: 24.05.2006
Meinen Eltern sowie Braxa und Felix
in Dankbarkeit und Anerkennung gewidmet
Ziel
Der wahre Meister hat kein Ziel.
Er steht morgens auf, verrichtet seine Arbeit, isst und trinkt, und nachts schläft er.
Befindet er sich auf der tieferen Stufe, ein Ziel haben zu wollen,
erklärt er nachträglich das, was gerade ist, als sein Ziel.
Das macht heiter, denn damit hat er immer sein Ziel erreicht.
(Janosch)
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS VON EIGENEN VORTRÄGEN, POSTERN UND
VERÖFFENTLICHUNGEN ____________________________________________ 9
VERZEICHNIS DER IM TEXT VERWENDETEN WICHTIGSTEN
ABKÜRZUNGEN ___________________________________________________ 11 1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG ________________________________ 15
2 LITERATURÜBERSICHT________________________________________ 19 2.1 Das Hörorgan der Säugetiere___________________________________________ 19 2.1.1 Die Hörschnecke (Cochlea) ______________________________________________ 19 2.1.2 Das Spiralganglion (Ganglion spirale) _____________________________________ 20 2.1.3 Physiologie der Schallaufnahme und –weiterleitung im Hörorgan ______________ 21 2.1.4 Der Krankheitskomplex der Hörminderungen und Ertaubungen_______________ 22 2.1.4.1 Die unterschiedlichen Formen der Hörminderung ____________________________ 22 2.1.4.2 Schädigung des Spiralganglions in Folge initialer Haarzellschädigung ____________ 23 2.1.4.3 Die Therapie chronischer Innenohrschwerhörigkeiten mit künstlichen
Innenohrprothesen (Cochlea-Implantaten, CI) _______________________________ 24 2.2 Wirkungen ausgesuchter neurotropher Faktoren im Innenohr_______________ 26
2.2.1 Beschreibung der wichtigsten Funktionen des Brain-derived Neurotrophic
Factors (BDNF)________________________________________________________ 26 2.2.2 Expression von BDNF und TrkB in der Cochlea_____________________________ 28 2.2.3 In vivo-Wirkungen von BDNF im Innenohr_________________________________ 29 2.2.4 In vitro-Wirkungen von BDNF auf Spiralganglienzellen ______________________ 30 2.2.5 Beschreibung der wichtigsten Funktionen des Glial Cell Line-derived
Neurotrophic Factors (GDNF)____________________________________________ 31 2.2.6 Expression von GDNF/ GFRα-1 und Ret in der Cochlea ______________________ 33 2.2.7 Effekte von GDNF auf Spiralganglienzellen in vivo___________________________ 34 2.2.8 Effekte von GDNF auf Haar- und Spiralganglienzellen in vitro_________________ 35 2.3 Glukocorticoide ______________________________________________________ 35
2.3.1 Das Glukocorticoid Dexamethason und seine wichtigsten Wirkungen ___________ 35 2.3.2 Spezielle Wirkungen von Glukocorticoiden im Innenohr______________________ 36 2.4 Effekte elektrischer Wechselfeld-Stimulation auf Spiralganglienzellen _______ 38
2.4.1 Einflüsse elektrischer Stimulation auf Spiralganglienzellen in vivo______________ 38 2.4.2 Effekte elektrischer Stimulation und Depolarisation auf neuronale Zellen und
Spiralganglienzellen in vitro______________________________________________ 41 2.4.3 Apparative Anforderungen an eine Zellkulturkammer zur elektrischen
Stimulation von neuronalen Zellen in vitro__________________________________ 44 3 MATERIAL UND METHODEN ____________________________________ 48 3.1 Material ____________________________________________________________ 48
3.1.2 Antikörper____________________________________________________________ 48 3.1.3 Primer________________________________________________________________ 49 3.1.4 Zelllinien______________________________________________________________ 49 3.1.5 Tiere und Tierhaltung___________________________________________________ 50 3.1.6 Beschreibung der Zellkulturkammer zur elektrischen Stimulation von
Spiralganglienzellen in vitro______________________________________________ 51 3.2 Methoden ___________________________________________________________ 56
3.2.1 Herstellung von Lösungen und Medien_____________________________________ 56 3.2.2 Zellkultur vereinzelter Spiralganglienzellen_________________________________ 58 3.2.2.1 Beschichtung der 96-Multiwell-Platten_____________________________________ 58 3.2.2.2 Dissektion der Cochlea und Gewinnung der Spiralganglienzellen ________________ 58 3.2.2.3 Spiralganglienzell-Vereinzelung und Einsaat ________________________________ 59 3.2.2.4 Fixierung vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen _________________________ 61 3.2.2.5 Auswertung des Spiralganglienzellüberlebens _______________________________ 61 3.2.2.6 Vermessung der Spiralganglienzell-Neuritenlängen ___________________________ 62 3.2.3 Zellkultivierung von NHDF-Fibroblasten __________________________________ 63 3.2.4 RT-PCR Untersuchungen________________________________________________ 64 3.2.4.1 Durchführung der Zellkulturversuche für nachfolgende RT-PCR-Experimente______ 64 3.2.4.2 Allgemeine Darstellung des Versuchsprinzips der semiquantitativen RT-PCR ______ 64 3.2.4.3 RNA-Isolation aus kultivierten Spiralganglienzellen __________________________ 64 3.2.4.4 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration _________________________ 65 3.2.4.5 DNase I-Verdau genomischer DNA _______________________________________ 66 3.2.4.6 cDNA-Synthese _______________________________________________________ 67 3.2.4.7 Durchführung der Polymerasekettenreaktion (PCR)___________________________ 68 3.2.4.8 Agarose-Gelelektrophorese ______________________________________________ 71 3.2.4.9 Photodokumentation und Auswertung der Agarose-Gele _______________________ 72 3.2.5 Immuncytochemische Methoden__________________________________________ 72 3.2.5.1 Immunperoxidase-Methoden_____________________________________________ 73 3.2.5.2 Immunfluoreszenzmethoden _____________________________________________ 74 3.2.6 Vorversuche zur Charakterisierung der entwickelten Zellkulturkammer zur
elektrischen Stimulation von Spiralganglienzellen___________________________________ 75 3.2.6.1 Temperaturmessung und Bestimmung des pH-Wertes des Kulturmediums nach
elektrischer Stimulation _________________________________________________ 75 3.2.6.2 Ermittlung der effektiven Stromstärke (Ieff) und der elektrischen Feldstärke in den
Kultivierungskammern _________________________________________________ 76 3.2.6.3 Evaluierung möglicher Zellschädigungen nach Kultivierung unter elektrischer
Stimulation mittels Durchflusszytometrie ___________________________________ 77 3.2.7 Elektrische Stimulation kultivierter Zellen _________________________________ 80 3.2.7.1 Inbetriebnahme der Apparatur zur elektrischen Stimulation kultivierter Zellen ______ 80 3.2.7.2 Kultivierung von Fibroblasten unter elektrischer Stimulation ___________________ 81 3.2.7.3 Elektrische Wechselfeldstimulation von Spiralganglienzellen in vitro_____________ 82
4 ERGEBNISSE_________________________________________________ 84 4.1 Überleben vereinzelter Spiralganglienzellen nach 48 h in vitro unter
Zusatz von GDNF, BDNF und Dexamethason _____________________________ 84 4.2 Einfluss von GDNF, BDNF und Dexamethason auf das
Neuritenauswachsverhalten von 48 h kultivierten vereinzelten
Spiralganglienzellen __________________________________________________ 87
4.3 Auswirkungen von GDNF, BDNF und Dexamethason auf den Zelldurchmesser und die Anzahl der Neuritenverzweigungen von
48 h kultivierten vereinzelten Spiralganglienzellen _________________________ 89 4.4 Genexpression von GDNF/BDNF und deren Rezeptoren unter Gabe
neurotropher Faktoren in kultivierten Spiralganglienzellen _________________ 91 4.5 Proteinexpression von GFRα-1, Ret und TrkB in Anwesenheit von BDNF
und GDNF kultivierten Spiralganglienzellen _____________________________ 94 4.6 Vorversuche zur Evaluierung der Funktionsfähigkeit der Zellkulturkammer
zur elektrischen Stimulation von Spiralganglienzellen ______________________ 97 4.6.1 Untersuchung der elektrischen Feldstärke unter Kultivierungsbedingungen _____ 97 4.6.2 Wasserstoffionenkonzentration (pH-Wert) des Kulturmediums unter
elektrischen Stimulationsbedingungen_____________________________________ 97 4.6.3 Ergebnisse zum Temperaturverhalten unter Stimulationsbedingungen__________ 98 4.6.4 Durchflußzytometrische Bestimmung von Zellschädigungen an elektrisch
stimuliert kultivierten Fibroblasten________________________________________ 99 4.7 Effekte einer elektrischen Stimulation auf das Spiralganglienzellüberleben
nach einer Kulturdauer von 48 h_______________________________________ 101 4.8 Auswirkungen einer elektrischen Stimulation auf das Neuriten-
auswachsverhalten elektrisch stimuliert kultivierter Spiralganglienzellen_____ 103 4.9 Einflüsse einer elektrischen Stimulation auf den Spiralganglienzell-
durchmesser sowie die Anzahl der Verzweigungen ausgewachsener
Neuriten nach 48 h in vitro____________________________________________ 104 5 DISKUSSION ________________________________________________ 106 5.1 Bewertung der verwendeten Methode einer Kultivierung von vereinzelten
Spiralganglienzellen _________________________________________________ 106 5.2 Effekte von GDNF, BDNF und Dexamethason auf das Spiralganglien-
zellüberleben in vitro_________________________________________________ 107 5.3 Auswirkungen von GDNF, BDNF und Dexamethason auf das
Neuritenauswachsverhalten kultivierter Spiralganglienzellen _______________ 108 5.4 Genexpression in Anwesenheit von BDNF/GDNF kultivierter
Spiralganglienzellen _________________________________________________ 110 5.5 Proteinexpression in Anwesenheit von BDNF/GDNF kultivierter
Spiralganglienzellen _________________________________________________ 112 5.6 Konstruktion und Ausführung der Kammer zur elektrischen Stimulation
kultivierter Zellen ___________________________________________________ 114 5.7 Beurteilung der Eignung der entwickelten Kulturkammer zur elektrischen
5.8 Auswirkungen einer elektrischen Stimulation auf das Überleben und
Auswachsverhalten kultivierter Spiralganglienzellen ______________________ 117 5.9 Rückschlüsse für eine zukünftige Therapie sensorineuraler
Innenohrschwerhörigkeiten im Rahmen der Versorgung mit
Cochlea-Implantaten_________________________________________________ 120 6 ZUSAMMENFASSUNG ________________________________________ 122 7 SUMMARY __________________________________________________ 125 8 LITERATURVERZEICHNIS _____________________________________ 128
9 ANHANG ___________________________________________________ 147 9.1 Reagenzien und Lösungen ____________________________________________ 147 9.2 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien _______________________________ 149 9.3 Geräte _____________________________________________________________ 151 DANKSAGUNG ___________________________________________________ 154 ERKLÄRUNG ____________________________________________________ 156
Verzeichnis von eigenen Vorträgen, Postern und Veröffentlichungen
Teile der vorliegenden Dissertationsarbeit wurden bereits veröffentlicht oder sind zur Veröffentlichung eingereicht.
Vorträge, Poster und publizierte Vortragskurzfassungen (abstracts):
• WEFSTAEDT. P., WISSEL, K. RIEGER, H. u. T. STÖVER (2004):
Untersuchungen zum protektiven Effekt Neurotropher Faktoren auf Spiralganglienzellkulturen
in: 75. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren- Heilkunde, Kopf- und Halschirurgie, Bad Reichenhall 2004 (Vortrag)
Laryngorhinootologie 83 HNO Informationen 29
• WEFSTAEDT, P., SCHEPER, V., LENARZ, T. u. T. STÖVER (2005):
Vorstellung einer Zellkulturkammer zur elektrischen Stimulation von Spiralganglienzellen (SGZ)
in: 76. Jahresversammlung der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-Ohren- Heilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie, Erfurt 2005 (Poster mit Kurzvortrag) HNO Informationen 30
• PAASCHE, G., WEFSTAEDT, P., LENARZ, T. u. T. STÖVER (2005):
Electrical stimulation of spiral ganglion cell cultures
in: 42nd Workshop on Inner Ear Biology (IEB), Tübingen 2005 (Poster) Abstract Book 181(P80)
Zur Veröffentlichung eingereichte Publikationen:
• STÖVER, T., SCHEPER, V. DIENSTHUBER, M. u. P. WEFSTAEDT (2005):
Untersuchungen zum Neuritenwachstum in vitro durch BDNF und GDNF in Kombination mit Dexamethason auf kultivierte Spiralganglienzellen
Laryngorhinootologie
Publikationen in Vorbereitung:
• WEFSTAEDT, P., PAASCHE, G., LENARZ, T. u. T. STÖVER (2006):
Patterned electrical stimulation: Enhanced survival of auditory neurons in vitro?
Neuroreport
Veröffentlichte Publikationen:
• WEFSTAEDT, P., SCHEPER, V. LENARZ, T. u. T. STÖVER (2005):
Brain-derived neurotrophic factor/glial cell line-derived neurotrophic factor survival effects on auditory neurons are not limited by dexamethasone.
Neuroreport 16, 2011-2014
An der Planung und Durchführung aller in diesen Studien dargestellten Ergebnisse hatte der Autor dieser Dissertationsarbeit maßgeblichen Anteil. Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Veröffentlichungen dargestellten Ergebnisse in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere Ergebnisse ergänzt.
Verzeichnis der im Text verwendeten wichtigsten Abkürzungen
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Complex Ak Antikörper
Aliquots aliquote Teile, gleiche Anteile einer Probe
APAAP Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phosphatase ART Artemin
Aqua dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Aqua tridest. Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser) BDNF Brain-derived neurotrophic factor
Bp Basenpaare bzw. beziehungsweise
CaMK- Ca2+/Calmodulin abhängige Kinase CCD Charge-coupled device
cDNA complementary DNA (komplementäre DNA)
ca. cirka
°C Grad Celsius
Chamber-Slides Objekträger mit Kammern für Zellkulturzwecke (4´ = 4 Kammern; 8´= 8 Kammern) CI Cochlea-Implantat
cm centimeter
CNTF Ciliary Neurotrophic Factor D Dalton (1,66018 x 10-24 g) DAB Diaminobenzidin
dB Dezibel
DEPC Diethylpyrocarbonat
DEPC-H2O Diethylpyrocarbonat behandeltes Wasser
DMEM Zellkulturmedium (Dulbecco´s modified eagle medium) dNTP Nukleotidgemisch aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DNase I Deoxyribonuclease I
DRG Dorsal root ganglion E Elektrische Feldstärke El. Stim. Elektrisch stimuliert
EABR Electrically evoked auditory brainstem response EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay et al. et alii (und andere)
FACScan® Fluorescence Activated Cell Scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Firma Becton Dickinson, Heidelberg)
FBS Fetal Bovine Serum FGF-1 Fibroblast growth factor-1 FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL-1, -2, -3 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm; FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm)
for forward
FSC Forward Scatter (Vorwärtsstreulicht), ein Messparameter des FACScan®
G Gauge
g Gramm
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat- dehydrogenase GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor GFRα-1-4 GDNF family receptor 1-4
ggf. gegebenenfalls
gmean geometric mean (geometrischer Mittelwert) h hora (Stunde)
HBSS Hanks balanced salt solution
Hz Hertz
H+L schwere (H=heavy) und leichte (L=light) Immunglobulinketten
I Stromstärke
IgG Immunglobulin G JNK Jun N-terminale Kinase kDa Kilodalton (103 Dalton) kg Kilogramm
l Liter
LAB/LSAB Labeled (Strept-) Avidin-Biotin
LAVES Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit log dekadischer Logarithmus
TTX Tetrodotoxin µ mikro (x 10-6) µA Mikroampere
µg Mikrogramm
µl Mikroliter µs Mikrosekunde m milli (x 10-3)
M mol/l
mA Milliampere
MACS Magnetic cell sorting MEM minimum essential medium
mg Milligramm Min. Minuten ml Milliliter mmol Millimol
mRNA Messenger RNA (Boten RNA) MW Mittelwert (arithmetischer Mittelwert) n Stichprobenumfang
ng Nanogramm
NGF Nerve Growth Factor
NHDF Normale humane dermale Fibroblasten ns nicht signifikant
NTN Neurturin
NT-3/4/5 Neurotrophin-3/4/5 nm Nanometer (1x10-9 m) NO Stickstoffmonoxid NPG Nodose-petrosal ganglion
Nr. Nummer
NS Normalserum NTF Neurotrophic factor o.g. oben genannt OD Optische Dichte
P Probability (Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen)
PAP Peroxidase-Anti-Peroxidase p75NTR p75 Neurotrophin Receptor
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
pg Pikogramm (10-12 Gramm)
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase
PJ Propidiumjodid PLC Phospholipase C pmol Pico Mol (10-12 Mol) PSP Persephin
Ret Rearranged during transformation
rev reverse
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
ROS reactive oxigen species
rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute) RT Reverse Transkription
RT-PCR Polymerasekettenreaktion mit vorgeschalteter reverser Transkription
s Sekunde
s.e.m. Standard error of the mean (Standardfehler) SFM Serumfreies Medium
SGZ Spiralganglienzelle s.o. siehe oben
SPF spezifisch pathogen-frei
SSC Side Scatter (Seitwärtsstreulicht), ein Messparameter des FACScan® Tab. Tabelle
TBE Tris-Borat-EDTA
TGFβ Transforming Growth Factor β TrkA/B/C Tyrosinkinase-Receptor A/B/C TNF Tumornekrosefaktor
TierSchG Tierschutzgesetz
U Spannung
u.a. unter anderem
Well eine Vertiefung in einer Mikrotiterplatte
V Volt
v.a. vor allem
x g multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2) z. B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
1 Einleitung und Zielsetzung
Hörminderungen und Ertaubungen sind in der Regel morphologisch mit einem Verlust der inneren und äußeren Haarzellen assoziert, in dessen Folge auch die Spiralganglienzellen (SGZ) degenerieren (ALTSCHULER et al. 1999). Für eine optimale Versorgung mit elektrischen Innenohrprothesen (Cochlea-Implantaten, CI) ist neben einer möglichst großen Anzahl vitaler Spiralganglienzellen eine enge Nerv-Elektroden-Interaktion anzustreben (GANTZ et al. 1993). Aus diesem Grunde ist es das Ziel, ungewollte Nebeneffekte der Cochlea-Implantat-Operation, wie implantationsbezogene Entzündungsprozesse oder Bindegewebsbildung im Bereich der inserierten Elektrode, auf ein Minimum zu reduzieren.
Mögliche Kandidaten für eine derartige therapeutische Intervention im Innenohr sind zum einen Glukocorticoide (z.B. Dexamethason), wohingegen sich neurotrophe Faktoren und auch eine elektrische Stimulation als interessante Behandlungsoptionen für eine SGZ-Protektion und evtl. sogar das Aussprossen von Spiralganglienzellneuriten darstellen.
Neurotrophe Faktoren spielen in der Entwicklung und im Erhalt des zentralen und peripheren Nevensystems eine wichtige Rolle. Im Bereich der Innenohrforschung wurden in den letzten Jahren verschiedenste Faktoren in vivo auf ihr Potential untersucht, Spiralganglienzellen und auch Haarzellen vor einer Degeneration nach Ototoxin- (MILLER et al. 1997; KUANG et al.
1999) oder Lärm-induziertem (YLIKOSKI et al. 1998; SHOJI et al. 2000a; SHOJI et al.
2000b) Hörverlust zu schützen. Im Falle von BDNF (STAECKER et al. 1996a; HEGARTY et al. 1997; MILLER et al. 1997) und GDNF (YLIKOSKI et al. 1998; KUANG et al. 1999) konnten protektive Effekte auf Spiralganglienzellen nachgewiesen werden. Für BDNF konnte gezeigt werden, dass sogar eine verzögerte Gabe nach experimenteller Ertaubung von Meerschweinchen zu einem verbesserten Spiralganglienzellüberleben im Vergleich zu einer Kontrollgruppe führte (GILLESPIE et al. 2004). Ähnliche Effekte hinsichtlich eines verbesserten SGZ-Überlebens konnten auch in Zellkulturuntersuchungen festgestellt werden, in denen vereinzelte postnatale Spiralganglienzellen in Anwesenheit von GDNF (YLIKOSKI et al. 1998; QUN et al. 1999), BDNF (MALGRANGE et al. 1996; MOU et al. 1997) und anderen Faktoren wie FGF-1 kultiviert wurden (ALETSEE et al. 2000; ALETSEE et al.
2003).
Glukocorticoide wie Dexamethason wurden bisher erfolgreich in klinischen Studien zur Behandlung von Tinnitus (CESARANI et al. 2002) und immunvermitteltem Hörverlust eingesetzt (PARNES et al. 1999). Im Tierversuch konnte nachgewiesen werden, dass
(HIMENO et al. 2002) Hörverlust einsetzenden Haarzellverlust und die daraus resultierende Hörschwellenerhöhung signifikant verringern konnte. Neben den bekannten trophischen Effekten von BDNF wird auch für GDNF eine wachstumsfördende Wirkung auf Spiralganglienzellneuriten vermutet. Daneben erscheint eine kumulative Wirkungsweise für eine kombinierte Applikation der Einzelfaktoren sowohl hinsichtlich eines verbesserten Spiralganglienzellüberlebens als auch eines verbesserten Auswachsverhaltens der Spiralganglienzellneuriten wahrscheinlich. Mögliche protektive oder sogar toxische Effekte von Glukocorticoiden auf Spiralganglienzellen im Sinne eines verstärkten oder verminderten Neuritenauswachsverhaltens bzw. Spiralganglienzellüberlebens wurden bisher nicht untersucht. Inwieweit eine Kultivierung in Anwesenheit neurotropher Faktoren wie BDNF oder GDNF zu einer veränderten Gen- und Proteinexpression dieser Faktoren und ihrer Rezeptoren in Spiralganglienzellen führt, ist bisher unklar.
Entsprechend der dargestellten Sachverhalte ergeben sich für die vorliegende Arbeit folgende zu bearbeitenden Zielsetzungen:
• Untersuchung möglicher toxischer und protektiver Effekte von BDNF, GDNF und Dexamethason bei alleiniger Applikation und in Kombination miteinander auf dissoziierte Spiralganglienzellkulturen der Ratte
o Ermittlung der jeweils optimalen Konzentrationen der genannten Substanzen hinsichtlich eines optimalen Spiralganglienzellüberlebens
• Untersuchung der Effekte von BDNF, GDNF und Dexamethason bei alleiniger Applikation und in Kombination miteinander hinsichtlich der Beeinflussung des Neuritenauswachsverhaltens vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen der Ratte
o Ermittlung der jeweils optimalen Konzentrationen der genannten Substanzen bezüglich eines optimalen Neuritenauswachsverhaltens kultivierter Spiralganglienzellen
o Untersuchung des Einflusses der genannten Substanzen auf den Spiralganglienzelldurchmesser und die Verzweigungen ausgewachsener Neuriten
• Untersuchung des Einflusses einer Applikation der neurotrophen Faktoren GDNF und BDNF auf die Gen- und Proteinexpression der genannten Faktoren und ihrer Faktoren an kultivierten Spiralganglienzellen der Ratte
o Kann man mRNA der entsprechenden Gene in kultivierten Spiralganglienzellen nachweisen und ist eine Quantifizierung möglich?
o Ist ein Nachweis der Rezeptoren TrkB, GFRα-1 und Ret an kultivierten Spiralganglienzellen auf Proteinexpressionsebene möglich und gibt es unterschiedliche Lokalisationen der Expression?
Mögliche protektive Effekte einer elektrischen Stimulation auf Spiralganglienzellen wurden bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen im Tierexperiment nach experimenteller Ertaubung untersucht. Die in diesen Studien dargestellten Ergebnisse stellen sich nicht einheitlich dar, so dass eine abschließende Bewertung einer elektrischen Stimulation als protektiver Stimulus für Spiralganglienzellen in vivo bisher nicht getroffen werden kann (HARTSHORN et al. 1991;
SHEPHERD et al. 1994). Im Gegensatz dazu konnte in Zellkulturversuchen mit Spiralganglienzellen demonstriert werden, dass eine elektrische Dauerdepolarisation die Überlebensrate dieser Zellen deutlich steigern konnte (HEGARTY et al. 1997). Weitere Ergebnisse von HEGARTY et al. (1997) zeigen, dass durch diese Zelldepolarisation ein autokriner Wirkmechanismus neurotropher Faktoren induziert wird, der letztendlich zu einem verbesserten Spiralganglienzellüberleben führt. Diese Beobachtungen legen die Schlussfolgerung nahe, dass ein derartiger Wirkmechanismus einer vermehrten Freisetzung neurotropher Faktoren mit daraus resultierendem verbesserten Spiralganglienzellüberleben auch durch eine elektrische Stimulation in vitro ausgelöst werden könnte.
Tierversuche zur Untersuchung der Effekte unterschiedlicher Substanzen und auch einer elektrischen Stimulation auf Zellen des Innenohres sind ausgesprochen aufwendige und lang andauernde Eingriffe. Aufgrund der Schwere der Eingriffe sind diese Versuche oftmals mit unvermeidlichen Schmerzen, Leiden und Schäden der Versuchstiere verbunden. Aus diesem Grunde war es ein Hauptziel der vorliegenden Arbeit ein Zellkultursystem zu etablieren, das es ermöglicht anhand von Primärkulturen dissozierter Spiralganglienzellen wirksame Stimulationsparameter (Therapeutika/ elektrische Stimulation) bereits im Vorfeld der Durchführung von Tierversuchen zu definieren.
Neben den oben genannten Fragestellungen ergeben sich aus den beschriebenen Gegebenheiten für die vorliegende Arbeit folgende Zielsetzungen:
• Entwicklung, Bereitstellung und Evaluierung einer geeigneten Zellkulturkammer zur
Untersuchung der Effekte unterschiedlicher Parameter einer elektrischen Stimulation auf kultivierte Spiralganglienzellen der Ratte
• Untersuchung der Effekte ausgewählter Stimulationsparameter einer elektrischen Stimulation auf das in vitro-Spiralganglienzellüberleben und Neuriten- auswachsverhalten alleine und in Kombination mit dem neurotrophen Faktor BDNF
2 Literaturübersicht
2.1 Das Hörorgan der Säugetiere
Das Hörorgan der Säugetiere lässt sich anatomisch einteilen in das aus dem äußeren Gehörgang (Meatus acusticus externus) und der Ohrmuschel (Auricula) bestehende äußere Ohr, das Mitttelohr (Auris media) und das Innenohr (Auris interna).
Das Mittelohr ist vom äußeren Ohr durch das Tommelfell (Membrana tympani) getrennt und besteht aus der luftgefüllten Paukenhöhle (Cavum tympani), den drei Gehörknöchelchen (Ossicula) Hammer (Malleus), Amboss (Incus) und Steigbügel (Stapes) sowie der Hörtrompete (Tuba auditiva).
Das innere Ohr besteht zum einen aus dem Gleichgewichtsorgan (Vestibularapparat) und zum anderen aus dem eigentlichen inneren Hörorgan, der Hörschnecke (Cochlea).
2.1.1 Die Hörschnecke (Cochlea)
Die Cochlea besteht beim Menschen aus einem 2,75 (NADOL 1988) und bei der Ratte aus einem 2,2 Windungen (BURDA et al. 1988) umfassenden knöchernen Hohlraumsystem, das schneckenförmig um die Schneckenspindel (Modiolus) herum verläuft.
In der Cochlea verlaufen drei übereinander liegende Flüssigkeitsräume, von denen die oben gelegene Vorhoftreppe (Scala vestibuli) am Runden Fenster beginnt (Fenestra cochleae) und über das Helikotrema mit der am ovalen Fenster (Fenestra vestibuli) endenden Paukentreppe (Scala tympani) in Verbindung steht. Zwischen diesen beiden mit dem Liquor cerebrospinalis entstammender kaliumarmer Perilymphe gefüllten Scalen liegt die im Querschnitt dreieckige mit Endolymphe gefüllte Scala media (Ductus cochlearis). Diese ist durch die Reißnersche Membran (Membrana vestibularis) von der Scala vestibuli und durch die Basilarmembran von der Scala tympani getrennt. Die seitliche Begrenzung der Scala media bildet die Stria vascularis, durch die die Versorgung der Scala media mit kaliumreicher Endolymphe erfolgt.
Das Cortische Organ (Organum spirale; Corti Organ) ist auf der zwischen einer knöchernen Leiste am Modiolus (Lamina spiralis ossea) und dem Ligamentum spirale verlaufenden Basilarmembran (Lamina basilaris) lokalisiert und besteht aus den mit Stereovilli versehenen Haarsinneszellen und den sie in ihrer Lage erhaltenden Stützzellen. Die modiolusseitige Begrenzung des Corti Organs erfolgt durch den Limbus spiralis osseae, dessen oberer Rand (Labium limbi vestibulare) die Ansatzstelle für die Tektorialmembran (Membrana tectoria) bildet. Unterhalb dieser Tektorialmembran bilden besonders kräftig ausgebildete Stützzellen
den Cortischen Tunnel. Axial des Cortischen Tunnels befinden sich die inneren Haarzellen, während sich peripher die in drei Reihen angeordneten äußeren Haarzellen befinden.
2.1.2 Das Spiralganglion (Ganglion spirale)
Im Modiolus befindet sich ein feiner Knochenkanal (Canalis spiralis cochleae) der das Ganglion spirale enthält (Abb. 1). Dessen Ganglienzellen entsenden ihre peripheren Fortsätze zum Cortischen Organ, während sich die zentralen Neuriten als Fasern zum Nervus cochlearis des Nervus vestibulocochlearis (VIII. Hirnnerv) vereinigen.
Das Spiralganglion wird zu ca. 95% von bipolaren myelinisierten Typ I-Ganglienzellen und zu ca. 5% von pseudounipolaren unmyelinisierten Ganglienzellen vom Typ II gebildet (ROMAND u. ROMAND 1987). Typ I-Ganglienzellen der Ratte sind mit einem mittleren Durchmesser von 18 µm etwas größer als Typ II-Ganglienzellen (13 µm) (BICHLER 1984).
Funktionell repräsentieren die Typ I-Zellen größtenteils die afferente Versorgung der inneren Haarzellen, wohingegen den Typ II-Zellen die afferente Versorgung der äußeren Haarzellen zukommt (RUBEL u. FRITZSCH 2002).
Abb. 1: Darstellung eines Querschnitts durch eine Windung der Cochlea zur Verdeutlichung der Lokalisation des Spiralganglions (modifiziert nach BLOOM und FAWCETT (1975)).
2.1.3 Physiologie der Schallaufnahme und –weiterleitung im Hörorgan
Das vom menschlichen Ohr aufgelöste Frequenzspektrum liegt in einem Bereich von 13 – 16000 Hz (NADOL 1988), das wahrnehmbare Frequenzspektrum der Ratte im Bereich von 1000 –- 59000 Hz (BURDA et al. 1988). Der maximal verarbeitbare Intensitätsumfang des Schallreizes (dynamische Breite) beider Spezies liegt bei 120 – 130 dB.
Der Vorgang physiologischen Hörens beginnt mit dem Auftreffen der Schallwellen auf das Trommelfell. Das Trommelfell wird ausgelenkt und die Kraft über die
Gehörknöchelchenkaskade auf das ovale Fenster übertragen, so dass durch Volumenverschiebungen der Perilymphe eine Wanderwelle entsteht, die in der Scala vestibuli entlang der Windungen der Cochlea über das Helicotrema und in der Scala tympani zurück zum runden Fenster läuft. Durch diese Wanderwelle kommt es in Abhängigkeit von der Schallfrequenz zu einer maximalen Auslenkung der Basilarmembran an verschiedenen Orten der Cochlea (VON BEKESY 1953). Das Amplitudenmaximum liegt bei hohen Frequenzen im Bereich der Basis und bei tiefen Frequenzen im Bereich der Apex (Tonotopieprinzip nach HELMHOLTZ (1875)). Im Bereich des Amplitudenmaximums der Wanderwelle kommt es zu einer Verschiebung zwischen Tektorialmembran und Basilarmembran. Durch diesen Verschiebungsprozess werden die Stereovilli der äußeren Haarzellen ausgelenkt und dadurch eine Erregung dieser Rezeptorzellen ausgelöst (ZENNER et al. 1988). Eine Erregung der äußeren Haarzellen führt nachfolgend zu einem gerichteten Flüssigkeitsstrom zwischen der Lamina reticularis und der Tektorialmembran wodurch schließlich auch die inneren Haarzellen erregt werden und depolarisieren (ZENNER et al. 1988). Nach Freisetzung von vermutlich Glutamat als Neurotransmitter (JANSSEN et al. 1991; OESTREICHER et al.
2002) kommt es zur Auslösung von Aktionspotentialen in den afferenten Fasern der Spiralganglienzellen. Die Aktionspotentiale werden über den Hörnerven weitergeleitet und erreichen schließlich über die Anteile der zentralen Hörbahn die Hörrinde..
2.1.4 Der Krankheitskomplex der Hörminderungen und Ertaubungen
2.1.4.1 Die unterschiedlichen Formen der Hörminderung
Hörminderungen und Ertaubungen stellen einen Krankheitskomplex von zunehmender Bedeutung dar. Allein in Deutschland sind ca. 8% der Erwachsenen von Hörminderungen betroffen (BERGMANN u. ELLERT 2000). Hörminderungen lassen sich abhängig von Ihrer Lokalisation in Schallleitungsschwerhörigkeiten und in Schallempfindungsschwerhörigkeiten unterteilen. Im Falle der Schallleitungsschwerhörigkeiten ist die Ursache der Erkrankung im Mittel- oder Außenohr lokalisiert, während die Ursache von Schallempfindungs- schwerhörigkeiten im Innenohr lokalisiert ist. An dieser Stelle soll nur auf die Schallempfindungsschwerhörigkeiten (sensorineuralen Schwerhörigkeiten) eingegangen werden, da sich die vorliegende Arbeit hauptsächlich mit einem verbesserten Erhalt von Spiralganglienzellen beschäftigt.
Die sensorineuralen Schwerhörigkeiten lassen sich in Abhängigkeit der geschädigten Zellen weiter unterteilen in sensorische Schwerhörigkeiten (Schädigung der Haarzellen), neurale (Schädigung des Hörnervs, von Spiralganglienzellen) sowie zentrale Schwerhörigkeiten (Lokalisation der Schwerhörigkeit in Zellen der zentralen Hörbahn).
Ätiologisch lassen sich Schwerhörigkeiten in angeborene sowie erworbene Schädigungen des Hörorgans einteilen.
Angeborene also hereditäre Schwerhörigkeiten haben ihre Ursache in Defekten bestimmter Gene (LALWANI et al. 1994; MANOLIS et al. 1999) und den entsprechenden Genprodukten.
Man unterscheidet dabei zwischen syndromalen und nichtsyndromalen Ausprägungen hereditärer Hörschädigungen. Im Falle der syndromalen angeborenen Hörstörungen sind oftmals strukturelle Proteine des Innenohres betroffen, die eine wichtige Rolle für den morphologischen Erhalt des Cortischen Organs spielen (BARKER et al. 1990; ANDERSON et al. 2000).
Erworbene Hörschädigungen sind ätiologisch auf unterschiedlichste exogene Einflüsse zurückzuführen, denen eine intitiale Schädigung der Haarzellen gemeinsam ist. Noxen, die zu einer derartigen Schädigung führen können, sind zum einen ototoxische Medikamente wie beispielsweise Aminoglycosid-Antibiotika (ZENNER u. SCHACHT 1986) oder Cisplatin (OZTURAN et al. 1996) und zum anderen eine Lärmexposition der Haarzellen (PLINKERT u. DE MADDALENA 1996; ZENNER 1999).
2.1.4.2 Schädigung des Spiralganglions in Folge initialer Haarzellschädigung Nach initilialer Schädigung der Haarzellen kommt es im Gefolge von Hörminderungen und Ertaubung auch zu einem Zugrundegehen der Spiralganglienzellen. Als in vivo-Modell zur Untersuchung der Effekte einer Ertaubung auf zellulärer Ebene hat sich die medikamentöse Ertaubung mittels Aminoglycosid-Antibiotika und auch eine durch Lärmexposition induzierte Hörschädigung durchgesetzt. Der durch Aminoglycosid-Antibiotika verursachte Haarzellverlust schreitet dabei von der Basis bis zur Apex der Cochlea voran (WU et al.
2002). Ihre ototoxische Wirkung entfalten Aminoglycosid-Antibiotika dabei zum einen durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (reactive oxigen species, ROS) die über die Bildung freier Radikale letztendlich zur Apoptose der Haarzellen führen (PRIUSKA u. SCHACHT 1995). Zum anderen sollen Aminoglycoside über eine Aktivierung der Stickstoffmonoxid (NO)-Synthase zu einer erhöhten NO-Produktion führen, was letztendlich wiederum zur
Bildung freier Radikale führt, welche zunächst eine Haarzellschädigung und in der Folge deren Apoptose verursachen (TAKUMIDA et al. 1999). Auch nach Lärmexposition konnten die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (OHINATA et al. 2000) und die Bildung reaktiver Stickstoffspezies (reactve nitrogen species, RNS) (YAMASHITA et al. 2004) als Startpunkte für eine einsetzende Haarzell-Schädigung identifiziert werden, so dass aus diesen Ergebnissen geschlossen wurde, dass sowohl Lärmschädigung als auch Aminoglycosid-Exposition über identische Signalwege ihre toxische Wirkung im Innenohr entfalten (KOPKE et al. 1999).
Die Degeneration von Spiralganglienzellen als Folgeerscheinung von initialem Haarzellverlust nach kochleärer Exposition einer Noxe ist in verschiedenen humanen und tierexperimentellen Studien gut dokumentiert (JOHNSSON et al. 1981; KOITCHEV et al.
1982; SONE et al. 1998; DODSON u. MOHUIDDIN 2000). In tierexperimentellen Studien konnten DODSON (1997) sowie DODSON und MOHUIDDIN (2000) eine einsetzende Apoptose großer Teile der Spiralganglienzellpopulation schon innerhalb weniger Stunden nach intrakochleärer Aminoglycosid-Injection nachweisen. Diese apoptotischen Prozesse waren offenbar eng korreliert mit einer Durchtrennung der afferenten Innervation der Haarzellen. Als Mechanismus für den einsetzenden Spiralganglienzellverlust schlugen DODSON (1997) sowie DODSON und MOHUIDDIN (2000) eine neurotoxische Wirkung von Glutamat in Folge der Durchtrennung der Afferenzen vor. Derartige toxische Effekte von Glutamat auf Spiralganglienzellen konnten schon früher demonstriert werden (JANSSEN et al. 1991; PUEL et al. 1994). Neben diesen toxischen Glutamat-Effekten erscheint es als gesichert, dass die Hauptursache für die einsetzende Spiralganglienzellapoptose zum einen in dem fehlenden elektrischen Stimulus im Sinne fehlender ankommender Aktionspotentiale liegt und zum anderen der neurotrophe Stimulus der Haarzellen auf die Spiralganglienzellen als Folge des Haarzelluntergangs fehlt (DODSON 1997; KANZAKI et al. 2002).
Ein Hauptaugenmerk der vorliegenden Arbeit lag daher in der Untersuchung möglicher protektiver und trophischer Effekte der neurotrophen Faktoren BDNF und GDNF sowie einer elektrischen Stimulation auf Spiralganglienzellen.
2.1.4.3 Die Therapie chronischer Innenohrschwerhörigkeiten mit künstlichen Innenohrprothesen (Cochlea-Implantaten, CI)
Künstliche Innenohrprothesen führen durch die Möglichkeit der Wiedererlangung des Sprachverständnisses nach erfolgter Implantation ggf. zu einer gesteigerten Lebensqualität
hörgeminderter oder ertaubter Patienten. Das Cochlea-Implantat besteht aus mehreren Einzelkomponenten die miteinander in Verbindung stehen: Einem im Ohrbereich zu tragendem Mikrophon, einem Sprachprozessor, einer externen Sendespule sowie einer Cochlea-Implantat-Elektrode (JAEKEL et al. 2002).
Über das Mikrophon wird akustische Information aufgenommen und über ein Kabel dem Sprachprozessor zugeleitet. Hier werden die akustischen Signale unter Filterung, Komprimierung und Entrauschung in elektrisch kodierte Informationen umgewandelt. Über ein Kabel und die subkutan hinter dem Mastoid lokalisierte Sendespule wird diese Information durch elektromagnetische Induktion an die intrakochleär implantierte Mehrkanalelektrode weitergeleitet. Diese Elektrode wird über eine Cochleostomie in die Scala tympani eingeführt und möglichst modiolus- und damit spiralganglienzellnah positioniert. Durch diesen engen Nerv-Elektroden-Kontakt und die hochfrequente pulsatile Verabreichung der elektrischen Signale über die verschiedenen Elektrodenkontakte kann eine selektive Stimulation der einzelnen Fasern des Hörnerven erreicht werden. Nach Weiterleitung der Information über die zentrale Hörbahn wird schließlich im auditorischen Cortex der Höreindruck erzeugt.
Obwohl der durch die Cochlea-Implantate erzeugte Höreindruck durch die Entwicklung spezieller Stimulationsstrategien und weiterentwickelter Elektroden stark verbessert werden konnte (HELMS u. MÜLLER 1999), ist die Qualität des Hörens implantierter Patienten noch weit von der des physiologischen Hörens entfernt. Gründe für diese Tatsache liegen unter anderem in einer mangelhaften Nerv-Elektroden-Kontaktierung durch Bindegewebsbildung und Entzündungsprozesse nach der Implantation der Elektrode. Des Weiteren ist eine erfolgreiche Cochlea-Implantat-Versorgung maßgeblich von der Anzahl erregbarer Spiralganglienzellen abhängig (GANTZ et al. 1993; PFINGST u. SUTTON 1983). Für eine therapeutische Intervention im Innenohr mit dem Ziel der Unterdrückung von Bindegewebswachstum und Entzündungsprozessen in Folge der Elektroden-Implantation bilden Glukocorticoide (z.B. Dexamethason) interessante Therapieoptionen, wohingegen sich neurotrophe Faktoren und auch eine elektrische Stimulation hypothetisch als Interventionen eignen, um eine fortschreitende Spiralganglienzell-Apoptose aufzuhalten und möglicherweise sogar ein dirketes Aufwachsen von Spiralganglienzellneuriten auf die CI-Elektrode zu induzieren.
Aus diesem Grunde sollten in der vorliegenden Arbeit neben der Untersuchung der Effekte neurotropher Faktoren und einer elektrischen Stimulation auch die Auswirkungen einer Glukocorticoid-Verabreichung auf kultivierte Spiralganglienzellen untersucht werden.
2.2 Wirkungen ausgesuchter neurotropher Faktoren im Innenohr
2.2.1 Beschreibung der wichtigsten Funktionen des Brain-derived Neurotrophic Factors (BDNF)
BDNF bildet zusammen mit dem Nerve Growth Factor (NGF), dem Neurotrophin-3 (NT-3) sowie dem Neurotrophin 4/5 (NT-4/5) die Gruppe der Neurotrophine. Nach der ersten Beschreibung von BDNF 1982 (BARDE et al. 1982) gelang bereits 1989 die Klonierung und heterologe Expression (LEIBROCK et al. 1989). Die Synthese von BDNF erfolgt zunächst als Präproform mit insgesamt 239 Aminosäuren und einem Molekulargewicht von 32 kDa, das mature Peptid besteht aus 119 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 14 kDa (MOWLA et al. 2001). Die Mitglieder der Neurotrophin-Familie binden an zwei unterschiedliche Arten von Zelloberflächenrezeptoren. Zum einen binden alle Vertreter dieser Gruppe mit niedriger Affinität an den p75NT-Rezeptor, der zur Familie der Tumor Nekrose Faktoren-Rezeptoren gehört. Zum anderen bindet jedes der Neurotrophine mit hoher Affinität an einen von drei bekannten Tyrosinkinase-Rezeptoren (TrkA, TrkB, TrkC (Abb. 2)), wobei auch Kreuzreaktivitäten vorkommen (HUANG u. REICHARDT 2001).
.
Abb. 2: Darstellung der unterschiedlichen Bindungsaffinitäten (schwarzer Pfeil
= hohe Affininät, gestrichelter Pfeil = niedrige Affinität) der Neurotrophine NGF, BDNF, NT-3 und NT-4 für die Tyrosinkinase-Rezeptoren TrkA, TrkB und TrkC sowie fü den gemeinsamen Rezeptor p75NTR (Abbildung modifiziert nach HEFTI (1999)).
BDNF bindet mit hoher Affinität an den TrkB-Rezeptor, wohingegen die beiden anderen Rezeptoren keine nennenswerte Affinität für BDNF besitzen. Eine Bindung von BDNF an den TrkB-Rezeptor bewirkt nach initialer Dimerisierung zweier Rezeptoren eine Phosphorylierung der intrazellulären Tyrosinreste und eine Aktivierung unterschiedlicher Signalkaskaden (HUANG u. REICHARDT 2001). Die drei wichtigsten Signalwege werden mit der Aktivierung der Phospholipase C (PLC), der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) oder von Ras initiiert und regulieren zum Teil (Ras, PI3K) die Transkription verschiedener Gene, unter anderem einer GABA(A)-Rezeptor-Untereinheit (BULLEIT u. HSIEH 2000).
BDNF spielt als Vertreter der Gruppe der Neurotrophine eine essentielle Rolle in der Entwicklung, dem Erhalt und der Funktion verschiedener neuronaler Zellen im zentralen und peripheren Nervensystem. BDNF wird bereits in frühen Entwicklungsstadien von Nervenzellen exprimiert, die höchste Expression tritt aber erst postnatal auf (IVANOVA u.
BEYER 2001). Im adulten Gehirn wird die höchste Expression von BDNF im Hippocampus und Hypothalamus gefunden (SILHOL et al. 2005).
Für neuronale Vorläuferzellen konnte BDNF als ein wichtiger Differenzierungsfaktor identifiziert werden, der unter anderem eine erhöhte Proliferation der Vorläuferzellen bedingt (BARNABE-HEIDER u. MILLER 2003). Modulierende Wirkungen hat BDNF auf die Neurotransmitterfunktion (CELADA et al. 1996) und auf die synaptische Transmission (KANG u. SCHUMAN 1995). Neben einer Vielzahl anderer Wirkungen u.a. auf die Langzeitpotenzierung im visuellen Cortex und im Hippocampus (AKANEYA et al. 1997) konnte für BDNF und seinen korrelierenden Rezeptor TrkB nach künstlich induzierten Hirnverletzungen eine erhöhte mRNA-Expression in den betroffenen Hirnarealen nachgewiesen werden (MERLIO et al. 1993).
2.2.2 Expression von BDNF und TrkB in der Cochlea
Als ein Vertreter der Neurotrophine spielt BDNF neben NT-3 eine bedeutende Rolle in der Entwicklung und Differenzierung von Spiralganglienzellneuronen (STAECKER et al. 1996b).
So konnte für Mäuse mit einem Defekt des BDNF-Rezeptors TrkB festgestellt werden, dass die Spiralganglienzellpopulation um bis zu 15% gegenüber der Population in Wildtypmäusen erniedrigt war (MINICHIELLO et al. 1995; SCHIMMANG et al. 1995). SILOS-SANTIAGO et al. (1997) fanden bei TrkB(-/-)/TrkC(-/-) Maus-Mutanten (fehlender TrkB/C Geno- und Phänotyp) sogar ein fehlende Ausbildung des Spiralganglions. Verschiedene Arbeitsgruppen demonstrierten in vivo mittels in situ Hybridisierung und immunhistochemischer Techniken die Expression von BDNF und TrkB in inneren und äußeren Haarzellen bzw.
Spiralganglienzellen (ERNFORS et al. 1992; YLIKOSKI et al. 1993; SCHECTERSON u.
BOTHWELL 1994; WHEELER et al. 1994; GILLESPIE et al. 2004).
MOU et al. (1997) konnten mittels Immunfluoreszenznachweis eine Expression des TrkB- Rezeptors auf Proteinebene auch in vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen nachweisen.
Eine Untersuchung mit postnatalen und adulten Maus-Mutanten mit fehlender TrkB- bzw.
BDNF-Expression zeigte, dass im Falle der postnatalen Altersstufe die afferente Innervation der äußeren Haarzellen im apikalen Bereich der Cochlea ausblieb, wohingegen die Nervenfasern im basalen Bereich erhalten blieben (SCHIMMANG et al. 2003). Die gleiche Studie zeigte für adulte Mäuse einen genau umgekehrten Phänotyp mit einer erhaltenen Haarzellinnervation im Bereich der Apex und einen Innervationsverlust in den basalen Anteilen der Cochlea. ADAMSON et al. (2002) demonstrierten, dass in Anwesenheit von
BDNF kultivierte Spiralganglienzellneurone unabhängig von ihrer kochleären Herkunft, bezüglich der Ionenkanalzusammensetzung und des elektrophysiologischen Verhaltens Eigenschaften basaler kochleärer Neurone aufwiesen, während NT-3 in den Zellen ein apikales Verhalten bezüglich der genannten Merkmale induzierte.
Im Rückenmark von Hühnerembryos konnte vor kurzem eine Herabregulation des TrkB- Rezeptors nach BDNF-Applikation demonstriert werden (GIBBONS u. BAILEY 2005).
Hypothetisch kommt es auch in Spiralganglienzellen durch die Applikation neurotropher Faktoren wie BDNF zu einer veränderten Gen- und Proteinexpression. Eine Aufgabenstellung dieser Arbeit war daher, BDNF und den entsprechenden Rezeptor TrkB auf Genexpressions- bzw. Proteinebene in Spiralganglienzellen nachzuweisen und soweit möglich, eine Quantifizierung der Genexpression durchzuführen.
2.2.3 In vivo-Wirkungen von BDNF im Innenohr
Bei Vögeln konnte nachgewiesen werden, dass nach Lärm- oder Ototoxin-induzierter Hörschädigung eine spontane Regeneration der Spiralganglienzellen erfolgte (PIRVOLA et al. 1997; SALVI et al. 1998). In den gleichen Studien konnte gezeigt werden, dass diese Regeneration mit einer erhöhten mRNA und Proteinexpression von BDNF und auch NT-3 in Spiralganglienzellen einherging (PIRVOLA et al. 1997; SALVI et al. 1998). Aus diesen Ergebnissen konnte geschlossen werden, dass hohe NTF-Konzentrationen im Innenohr für eine Regeneration sowohl der Haar- als auch der Spiralganglienzellen nach Hörschädigungen zwingend erforderlich sind. MILLER et al. (1997) und RUAN et al. (1999) demonstrierten nach Verabreichung von BDNF ins Innenohr (über osmotische Pumpen) ein verbessertes Haar- und Spiralganglienzellüberleben nach Kanamycin-induzierter Innenohrschädigung im Vergleich zu einer Kontrollgruppe.
In jüngeren tierexperimentellen Studien konnten nach Aminoglykosid- (LALWANI et al.
2002; NAKAIZUMI et al. 2004) und Lärm-induziertem Verlust (ZHAI et al. 2002) der Haarzellen durch adenoviralen Gentransfer von BDNF ein signifikant verbessertes Spiralganglienzellüberleben festgestellt werden. MAETA und ANNIKO (2003) konnten protektive Effekte nach direkter BDNF-Applikation ins Innenohr nach Hörminderung in Folge von Pseudomonas aeruginosa exotoxin A-Exposition demonstrieren. Auch durch eine verzögerte Verabreichung von BDNF nach Aminoglycosid-induziertem Hörverlust in Meerschweinchen konnte ein signifikant erhöhtes Spiralganglienzellüberleben im Vergleich zu einer mitgeführten Kontrollgruppe bewirkt werden (GILLESPIE et al. 2004;
YAMAGATA et al. 2004). Zu ähnlichen Ergebnissen, einem verbesserten Spiralganglienzellüberleben, kamen auch andere in vivo-Studien, in denen nach experimenteller Ertaubung entweder eine Kombination von BDNF und CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) mittels osmotischer Pumpen (SHINOHARA et al. 2002; YAMAGATA et al. 2004) ins Innenohr appliziert wurde oder aber BDNF mittels adenoviraler Vektoren in Spiralganglienzellen transfiziert wurde (NAKAIZUMI et al. 2004). Erst vor kurzem konnte demonstriert werden, dass nach Aminoglykosid-induzierter Ertaubung von Meerschweinchen eine elektrische Stimulation in Kombination mit BDNF-Gabe die Anzahl überlebender Spiralganglienzellen sowohl im Vergleich zu einer Kontrollgruppe als auch im Vergleich zu einer Gruppe mit alleiniger BDNF-Gabe signifikant erhöht (SHEPHERD et al. 2005).
2.2.4 In vitro-Wirkungen von BDNF auf Spiralganglienzellen
PIRVOLA et al. (1992) konnten für Spiralganglienzellen der Ratte demonstrieren, dass BDNF sowohl das Spiralganglienzellüberleben als auch das Auswachsen von Neuriten aus kultivierten Spiralganglienzellexplantaten fördern kann. Weitere Effekte von BDNF wurden neben den SGZ-Explantaten auch an dissoziierten SGZ untersucht (LEFEBVRE et al. 1994;
MALGRANGE et al. 1996). In einer frühen Studie mit dissoziierten Spiralganglienzellen konnte festgestellt werden, dass BDNF das Spiralganglienzellüberleben um den Faktor 3 im Vergleich zu einer mitgeführten Kontrollgruppe verbessert und hinsichtlich der protektiven Wirksamkeit effektiver als NT-3 war (ZHENG et al. 1995). In Bezug auf eine bestmögliche SGZ-Protektion von BDNF in vitro konnte von verschiedenen Arbeitsgruppen demonstriert werden, dass BDNF-Konzentrationen von 50 ng bis 100 ng/ml das SGZ-Überleben optimal beeinflussen (ZHENG et al. 1995; HEGARTY et al. 1997; MOU et al. 1997). Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine Kombinationsstimulation vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen mit BDNF sowohl mit CNTF (HARTNICK et al. 1996) als auch mit LIF (MARZELLA et al. 1999) synergistisch hinsichtlich eines verbesserten Spiralganglienzellüberlebens in vitro wirkt.
In einer Studie mit kultivierten postnatalen Cochleaexplantaten konnten auch im Falle einer in vitro-Exposition mit Aminoglykosid-Antibiotika (LALWANI et al. 2002) oder Cisplatin (GAO 1999) protektive Effekte durch BDNF bzw. eine Kombination von BDNF mit D- Methionin (GABAIZADEH et al. 1997) auf Spiralganglienzellen nachgewiesen werden.
Neben dem Nachweis protektiver Effekte einer exogenen Gabe von BDNF zeigten LALWANI et al. (2002) außerdem, dass auch ein adenoviraler Gentransfer von BDNF in
organotypische Cochleaexplantate und vereinzelte Spiralganglienzellen deren Überleben bei Kultivierung in Anwesenheit von Amikacin signifikant im Vergleich zu einer Kontrollgruppe verbessern konnte. Erst vor kurzem konnten RASK-ANDERSEN et al. (2005) eine Beteiligung von BDNF bei der Ausdifferenzierung adulter neuronaler Vorläuferzellen in mature Spiralganglienzellen des Menschen und auch des Meerschweinchens demonstrieren.
Sowohl für BDNF als auch GDNF (2.2.8) konnte in den beschriebenen Studien eine protektive und z.T. trophische Wirkung auf Sprialganglienzellen nachgewiesen werden. Ob eine kombinierte Verabreichung beider Faktoren zu einem additiven Effekt hinsichtlich eines verbesserten Spiralganglienzellüberleben bzw. Neuritenauswachsverhalten führt wurde bisher nicht untersucht und wurde daher als eine Zielsetzung der vorliegenden Arbeit definiert.
2.2.5 Beschreibung der wichtigsten Funktionen des Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factors (GDNF)
GDNF bildet innerhalb der Transforming Growth Factorβ- (TGFβ-) Superfamilie mit den verwandten Proteinen Neurturin (KOTZBAUER et al. 1996), Artemin (BALOH et al. 1998) und Persephin (MILBRANDT et al. 1998) eine eigene Familie.
GDNF wird als eine 211-Aminosäurenvorstufe synthetisiert, nachfolgend in ein 134- Aminosäuren umfassendes Protein prozessiert und durch die Ausbildung zweier Disulfidbindungen dimerisiert (LIN et al. 1993). Das mature Protein hat als Homodimer ein Molekulargewicht von 32 bis 45 kDa. GDNF induziert durch eine Bindung an den GDNF Family Rezeptorα-1 (GFRα-1) und die Rezeptor Tyrosin Kinase Ret verschiedene Signalkaskaden. Einige dieser Signalwege beeinhalten PLC γ/AKT, RAS-MAPK-ERK (induziert die Phosphorylierung von CREB) und JNK (Jun N-terminale Kinase) (AIRAKSINEN et al. 1999). Neben den genannten Signalwegen existiert noch eine Ret- unabhängige Signalververschaltung über den GFRα-1 Rezeptor, der über eine Aktivierung von Src Kinasen, eine Phosphorylierung der PLC γ und Produktion von IP3 eine Freisetzung von intrazellulärem Ca2+ bewirkt (PEZESHKI et al. 2001). Neben der hochaffinen Bindung an seinen spezifischen Rezeptor GFRα-1 (JING et al. 1996; TRUPP et al. 1998) ist GDNF in der Lage mit geringerer Affinität an den Neurturin Rezeptor GFRα-2 zu binden (SANICOLA et al. 1997; BALOH et al. 1998). Eine schematische Darstellung der bevorzugten Bindungen der Liganden der GDNF-Familie mit den bisher bekannten Kreuzreaktivitäten findet sich in Abbildung 3. Eine Bindung von Persephin an GFRα-4 konnte bisher nur bei Vögeln
GDNF erfolgt auch im Falle von Neurturin, Artemin und Persephin eine sekundäre Aktivierung von Ret.
Abb. 3: Darstellung der Bindungsaffinitäten der neurotrophen Faktoren GDNF, Neurturin (NTN), Artemin (ART) und Persephin für die Rezeptoren GFRα1-4 sowie die gemeinsame Rezeptorkomponente RET. Abbildung modifiziert nach AIRAKSINEN und SAARMA (2002).
GDNF wurde ursprünglich aus einer von der Ratte stammenden glialen Zelllinie (B49) isoliert und als Überlebensfaktor sowohl für dopaminerge Neurone des Mittelhirns (LIN et al. 1993) als auch spinaler Motoneurone (HENDERSON et al. 1994) identifiziert. Aufgrund dieser neuroprotektiven Eigenschaften insbesondere auf dopaminerge Neurone wurde GDNF als ein Kandidat für eine mögliche spätere humane Morbus-Parkinson-Therapie in verschiedenen Tiermodellen näher untersucht (OPPENHEIM et al. 1995; TOMAC et al. 1995; YAN et al.
1995; GASH et al. 1996) und wird inzwischen aufgrund der erwiesenen Wirksamkeit in diesen Tiermodellen in ersten humanen Studien eingesetzt (GILL et al. 2003; NUTT et al.
2003). Ergänzend zu den genannten neuroprotektiven Effekten konnten für GDNF trophische Effekte auf eine Vielzahl neuronaler Zellen unterschiedlichster Entwicklungsstadien sowohl des peripheren als auch des zentralen Nervensystems nachgewiesen werden (HENDERSON et al. 1994; TRUPP et al. 1995; BUJ-BELLO et al. 1995). Derartige trophische Effekte
konnten unter anderem für cholinerge und noradrenerge Neurone nachgewiesen werden (ARENAS et al. 1995; OPPENHEIM et al. 1995; WILLIAMS et al. 1996). Im Weiteren spielt GDNF eine herausragende Rolle für die embryonale Nierenentwicklung (HELLMICH et al.
1996) und die Entwicklung des enterischen Nervensystems (SANCHEZ et al. 1996).
2.2.6 Expression von GDNF/ GFRα-1 und Ret in der Cochlea
Neben den beschriebenen neurotrophen Effekten von GDNF auf eine Vielzahl zentraler und peripherer neuronaler Zellen konnte mittels in-situ-Hybridisierung in postnatalen und adulten Ratten eine mRNA-Expression von GDNF in inneren und zum Teil auch äußeren Haarzellen, nicht aber in Spiralganglienzellen nachgewiesen werden (YLIKOSKI et al. 1998; QUN et al.
1999). Im Gegensatz dazu konnten MALGRANGE et al. (1998) mittels RT-PCR keine Expression von GDNF in der Cochlea postnataler Ratten nachweisen.
Eine Expression der GDNF-Rezeptoren konnte auf mRNA-Ebene im Falle von GFRα-1 ausschließlich in Spiralganglienzellen und im Falle von Ret in keiner kochleären Lokalisation nachgewiesen werden (YLIKOSKI et al. 1998; QUN et al. 1999). Abweichend davon demonstrierten KUANG et al. (1999) mittels Immunfluoreszenz- und Immunperoxidasefärbung an histologischen Cochleaschnitten der Ratte eine vorhandene Proteinexpression der Rezeptorkomponente Ret in der Peripherie von Spiralganglienzellen, nicht aber in Haarzellen. STÖVER et al. (2001) wiesen sowohl GDNF als auch die entsprechenden Rezeptoren GFRα-1 und Ret auf Proteinebene mittels Immunfluoreszenz- Nachweisen in Spiralganglienzellen nach. Auf Genexpressions-Ebene konnte GDNF-mRNA und mRNA der entsprechenden Rezeptoren mittels semiquantitativer RT-PCR nachgewiesen werden (STÖVER et al. 2000; STÖVER et al. 2001). Ein Vergleich der gefundenen mRNA- Expression zeigte für GDNF eine höhere Expression im Modiolus als in einem Kontrollgewebe, der Substantia Nigra (STÖVER et al. 2001). Ret war niedriger exprimiert und die mRNA-Level von GFRα-1 lagen auf gleichem Niveau wie in der Substantia Nigra (STÖVER et al. 2001). NAM et al. (2000) untersuchten mittels Western Blot die Effekte eines lärminduzierten Hörverlusts auf die Proteinexpression von GDNF in der Ratten-Cochlea. Die Proteinexpressionslevel lagen 2-4 h nach Lärmexposition auf gleichem Level wie in der Kontrollgruppe, wohingegen nach 8 h eine signifikante Hochregulation stattfand, die nach 12 h wieder auf normale Intensitäten abfiel (NAM et al. 2000). Mittels quantitativer Real-Time PCR zeigten STANKOVIC und CORFAS (2003) eine vorhandene Expression von GDNF in der Cochlea, die um den Faktor 4,9 höher lag als die von NT-3, jedoch signifikant niedriger
ausfiel als die von BDNF.
Ein Nachweis von GDNF und den korrelierenden Rezeptoren Ret und GFRα-1 wurde bisher an kultivierten Spiralganglienzellen nicht durchgeführt. Eine entsprechende Untersuchung auf Genexpressions- und Proteinebene sollte aus diesem Grunde Teil dieser Arbeit sein.
2.2.7 Effekte von GDNF auf Spiralganglienzellen in vivo
In einer Studie zur Untersuchung der protektiven Wirksamkeit einer GDNF-Applikation ins Innenohr vor oder nach Lärm-Exposition von Meerschweinchen konnte demonstriert werden, dass GDNF offensichtlich bei einer Applikation während oder kurz nach Hörschädigung einen maximalen protektiven Effekt auf innere und äußere Haarzellen entfaltet (KEITHLEY et al. 1998). Nach einer längeren Pause zwischen Hörschädigung und GDNF-Verabreichung konnten dagegen keine protektiven Effekte mehr festgestellt werden (KEITHLEY et al.
1998). KUANG et al. (1999) demonstrierten am Meerschweinchen einen verdoppelten Haarzellerhalt im Vergleich zu einer Kontrollgruppe nach initialer Schädigung durch Cisplatin oder eine Kombination aus Kanamycin und Ethacrynsäure nach GDNF Infusion in die Scala tympani oder ins Mittelohr mittels osmotischer Pumpen. Eine andere Arbeitsgruppe konnte mit einer ähnlichen Versuchsgestaltung zeigen, dass eine Verabreichung von GDNF ins Innenohr mittels osmotischer Pumpen nach lärminduziertem Hörverlust zu einem signifikant erhöhten Spiralganglienzellerhalt im Vergleich zu einer Kontrollgruppe führte (YLIKOSKI et al. 1998). In einer späteren Studie mit lärmexponierten Meerschweinchen konnten Shoji et al. (2000a) für GDNF eine dosisabhängige haarzellprotektive Wirkung feststellen, wenn die Substanz über die Scala tympani infundiert wurde. Dabei zeigte sich ein maximaler protektiver Effekt bei 100 ng/ml, wobei eine höhere Dosis von 1 µg/ml offenbar toxische Effekte auf die Haarzellen entfaltete (SHOJI et al. 2000a). Auch nach einem adenoviralem Gentransfer konnte eine protektive Wirksamkeit von GDNF sowohl auf Haarzellen (YAGI et al. 1999; SUZUKI et al. 2000; KAWAMOTO et al. 2001) als auch auf Spiralganglienzellen (YAGI et al. 2000) nach kochleärer Lärm- oder Aminoglycosid- Exposition nachgewiesen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass ein kombinierter Gentransfer von GDNF mit TGFβ-1 nach Aminoglycosid-induziertem Hörverlust (KAWAMOTO et al. 2003) einen verbesserten Haarzellerhalt bewirkte als ein Gentransfer der Einzelfaktoren. In einer jüngeren Studie konnte außerdem gezeigt werden, dass eine Kombination einer elektrischen Stimulation mit einem adenoviralen Gentransfer von GDNF
Spiralganglienzellerhalt bewirken konnte als eine alleinige elektrische Stimulation oder GDNF-Applikation (KANZAKI et al. 2002).
2.2.8 Effekte von GDNF auf Haar- und Spiralganglienzellen in vitro
GDNF ist sowohl für dissoziierte Spiralganglienzellen und Spiralgangleinzellexplantate als auch für Haarzellen ein potenter Überlebensfakor. An vereinzelten Spiralganglienzell- Kulturen aus späten embryonalen Ratten (embryonaler Tag 17, 21) und postnatalen Ratten im Alter von 7 Tagen konnte gezeigt werden, dass GDNF in einer Konzentration von 100 pg/ml das Spiralganglienzellüberleben nach einer Kulturdauer von 48 h im Vergleich zu einer Kontrollgruppe signifikant verbessern konnte (YLIKOSKI et al. 1998; QUN et al. 1999). In der frühen postnatalen Phase entfaltet GDNF dabei offenbar eine größere Wirksamkeit als in den letzten Embryonaltagen (YLIKOSKI et al. 1998; QUN et al. 1999). Ein signifikant verbessertes Haarzellüberleben konnte an organotypischen Cochleaexplantaten demonstriert werden, die für drei Tage unter Exposition der Ototoxine Neomycin oder Cisplatin kultiviert wurden (KUANG et al. 1999). Im Falle der Neomycin-Exposition erwies sich dabei eine GDNF-Konzentration von 10 ng/ml und im Falle der Cisplatin Exposition eine Konzentration von 0,1 ng/ml als maximal effektiv für ein verbessertes Haarzellüberleben (KUANG et al.
1999). Ebenso wie für BDNF konnte auch für GDNF eine ausdifferenzierende Wirkung auf kultivierte adulte menschliche und auch Vorläuferzellen von Meerschweinchen- Spiralganglienzellen nachgewiesen werden (RASK-ANDERSEN et al. 2005).
Obwohl GDNF-Effekte auf Spiralganglienzellen untersucht wurden, sind die optimalen in vitro wirksamen Konzentrationen bisher ebenso unzureichend belegt wie die Untersuchung möglicher trophischer – also das Auswachsen von Neuriten fördernde – Effekte einer GDNF- Gabe auf Spiralganglienzellen. Aus diesem Grunde sollten mit der vorliegenden Arbeit die Effekte höherer GDNF-Konzentrationen sowie die Effekte einer Kombination von GDNF mit BDNF auf kultivierte Spiralganglienzellen untersucht werden.
2.3 Glukocorticoide
2.3.1 Das Glukocorticoid Dexamethason und seine wichtigsten Wirkungen Glukocorticoide sind C21-Steroide (Pregnan-Derivate) die in der Nebennierenrinde ausgehend von Cholesterol über Progesteron als eine Zwischenstufe synthetisiert werden. Bei Dexamethason handelt es sich um ein synthetisches Glukocorticoid, das die antiphlogistische
