Aus der Klinik für Neurologie
der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
Einfluss der Hochfrequenzstimulation des Nucleus subthalamicus auf die
dopaminerge Transmission im Nucleus accumbens core und shell
zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät
Charité – Universitätsmedizin Berlin von
Christoph Lemke aus Bremen
Inhaltsverzeichnis Seite Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III 1. Zusammenfassung 1 Abstract 2 2. Einleitung 3
2.1 Das idiopathische Parkinsonsyndrom 4
2.2 Basalganglien 4
2.3 Pathophysiologie des idiopathischen Parkinsonsyndroms 7
2.4 Therapie des idiopathischen Parkinsonsyndroms 9
2.5 Hochfrequenzstimulation 9
2.6 Nebenwirkungen der HFS 11
2.7 Herleitung der Aufgabenstellung 13
3. Methodik 14
3.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen 14
3.2 Experimentelles Design 14
3.3 Chirurgische Eingriffe 15
3.4 Läsionen in der Substantia nigra pars compacta bzw. im ventralen Tegmentum 16
3.5 Mikrodialyse 16
3.6 Hochfrequenzstimulation 18
3.7 Quantitative Analysen der extrazellulären Konzentrationen von Dopamin und seiner
Metabolite 18
3.8 Histologische Befunde und Analysen 19
2.8.1 Fixierung und Präparation der Gehirne 19
2.8.2 Immunhistochemie - Kresylviolett-Färbung 20
2.8.3 Immunhistochemie – Tyrosinhydroxylase (TH)-Färbung 21
4. Ergebnisse
4.1 Platzierungen der Stimulationselektrode und der Mikrodialysesonde 23 4.2 Experimenteller Ansatz 1: Effekte der STN-HFS auf die dopaminerge Transmission im
NAc core 25
4.3 Experimenteller Ansatz 1: Effekte der STN-HFS auf die dopaminerge Transmission im
NAc shell 30
4.4 Experimenteller Ansatz 2: Effekte der STN-HFS auf die GABAerge Transmission im VTA 35 4.5 Experimenteller Ansatz 3: Einfluss der SNc und der VTA auf die dopaminerge Transmission nach STN-HFS im NAc 37
4.5.1 Immunhistochemie 37 4.5.2 Mikrodialyse 39 5. Diskussion 43 6. Literatur 50 7. Abbildungsverzeichnis 67 8. Danksagung 70 9. Eidesstattliche Erklärung 71
10. Anteilserklärung an etwaigen erfolgten Publikationen 72
Abkürzungsverzeichnis
6-OHDA 6-Hydroxydopamin
Abb. Abbildung
Ach Acetylcholin
ANOVA analyis of variance, Varianzanalyse
AP Anterior posterior
BG Basalganglien
CE COMT
coefficient of error, Fehlerkoeffizient Catechol-O-methylaminotransferase DA
DBS
Dopamin
Deep Brain Stimulation, Tiefenhirnstimulation DOPAC 3,4-Dihydrophenylessigsäure
EEC EPN
European Economic Community Nucleus entopeduncularis
GABA Gammaaminobuttersäure
Glu Glutamat
GPe Globus pallidus externus GPi Globus pallidus internus HFS Hochfrequenzstimulation
HPLC high performance liquid chromatography, Hochleistungsflüssigkeitschromatografie HVA homovanillic acid, Homovanillinsäure i.p. intra peritoneal
IPS Ideopathisches Parkinsonsyndrom ISPS Inhibitorisches postsynaptisches Peptid
KG Körpergewicht L-DOPA Levodopa LH lateraler Hypothalamus MAO-B Monoaminooxidase B MPTP NAc 1-Methyl-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin Nucleus accumbens
NIH National Institutes of Health (Bethesda, Maryland, USA)
6-OHDA 6-Hydroxydopamin
PET Positronen-Emissions-Tomografie
PS Parkinson-Syndrom
RM repeated measures, Wiederholungsmessung
SEM standard error of the mean, Standardfehler des Mittelwerts
SN Substantia nigra
SNc Pars compacta der Substantia nigra
STN Nucleus subthalamicus
Tab. Tabelle
TH Tyrosin-Hydroxylase
1. Zusammenfassung
Neben den positiven Auswirkungen der Hochfrequenzstimulation (HFS) des Nucleus subthalamicus (STN) auf die Therapie der L-Dopa-sensitiven motorischen Symptome des fortgeschrittenen IPS, zeigen klinische und tierexperimentelle Studien, dass die HFS des STN auch Einfluss auf nicht motorische Erscheinungen des Verhaltens hat. Dieser Einfluss könnte in der Einbindung des STN in ein Geflecht parallel verlaufender, funktionell abgetrennter Schaltkreise, welche kortikale und subkortikale motorische und limbische Regionen integrieren, begründet liegen.
In der vorliegenden Studie wurde der Effekt der akuten SNT-HFS auf Metabolismus und Transmission von Dopamin im Nucleus accumbens core und shell in narkotisierten Ratten unter Verwendung der in vivo Mikrodialyse untersucht. Die Ratten waren entweder nicht vorbehandelt oder selektiv vorbehandelt durch die Schädigung der Substantia nigra pars compacta oder des VTA.
STN-HFS führte dabei zu einem sofortigen und reversiblen Anstieg von Dopamin und seinen Metaboliten. Dieser Anstieg konnte hauptsächlich im NAc shell aber auch im NAc Core nachgewiesen werden. Die Erhöhung der Konzentration im NAc shell fiel dabei höher aus, als im NAc core. Gleichzeitig wurde beobachtet, dass die STN-HFS zu einer erniedrigten Konzentration von GABA in der VTA führte. Eine vorausgehende Läsion des SNc beeinflusste den Effekt der STN-HFS auf die DA-Transmission im Accumbens nicht. Die Auswirkung auf Metabolismus und Transmission konnte auch bei vorheriger Schädigung der Substantia nigra pars compacta (Snc) nachgewiesen werden. Bei vorheriger Schädigung des ventralen Tegmentums hingegen fielen die Werte unter die Nachweisgrenzen. Aus diesen Ergebnissen ist zu schließen, dass sich die STN-HFS signifikant auf die dopaminerge Transmission und den dopaminergen Metabolismus der motorisch-limbischen Nahtstellen auswirkt. Diese Ergebnisse könnten dazu beitragen, den gleichzeitigen Effekt der STN-HFS auf motorische und limbische Systeme zu erklären.
Abstract
Despite the benefit high frequency stimulation (HFS) of the subthalamic nucleus (STN) has on motor symptoms of Parkinson’s Disease (PD), accumulating data also suggest effects of STN-HFS on non-motor behavior. This may be related to the involvement of the STN in the limbic basal ganglia-thalamocortical loops. In the present study we investigated the effect of acute STN-HFS on neurotransmission in associated structures of these pathways, i.e. the nucleus accumbens (NAc) core and shell as well as the ventral tegmental area (VTA) using in vivo microdialysis. Experiments were performed in anaesthetized naïve rats and rats selectively lesioned in the substantia nigra pars compacta (SNc) or VTA. We demonstrate that: 1. STNHFS leads to an increase in DA in the NAc, 2., these effects are more pronounced in the NAc shell than in the NAc core, 3. STN-HFS leads to a decrease in GABA in the VTA, 4. preceding lesion of the SNc does not seem to affect the effect of STN-HFS on accumbal DA transmission whereas 5. preceding lesion of the VTA seems to prohibit further detection of DA in the NAc. We conclude that STNHFS signifcantly afffects neurotransmission in the limbic system, which might contribute to explain the non-motor effects of STN-HFS.
2 Einleitung
2.1 Das idiopathische Parkinsonsyndrom
Das idiopathische Parkinsonsyndrom (IPS) wurde erstmals im Jahre 1817 durch James Parkinson beschrieben. Es ist heute mit einer Prävalenz von ca. 100 – 200/100.000 Einwohner eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen in Deutschland. Diese Prävalenz steigt mit zunehmendem Alter kontinuierlich an (de Rijk et al. 2000).
Klinisch äußert sich IPS durch eine Symptomtrias, welche sich aus Rigor, einer Muskelsteifigkeit, Ruhetremor, einem Muskelzittern in Ruhe, und Bradykinese, einem insgesamt verlangsamten Bewegungsbild zusammensetzt. Außerdem zeigen sich eine gestörte Körperhaltung, Störungen der posturalen Reflexe und kognitive sowie psychische Veränderungen. Unter den psychiatrischen Störungen zählen dabei Depressionen mit ca. 40% zu den häufigsten Ereignissen (Aarsland et al. 2011).
Vegetative Krankheitszeichen sind gekennzeichnet durch eine vermehrte Talgproduktion im Gesicht (Seborrhoe; Salbengesicht) sowie Kreislauf-Regulationsstörungen, die sich beispielsweise in Schwindel bei raschem Aufstehen äußern. Typisch ist das Maskengesicht, ausgelöst durch eine Verarmung der Mimik, die sich im fortgeschrittenen Stadium in starren und ausdruckslosen Gesichtszügen widerspiegelt. Sprechstörungen zeigen sich in Form einer zunehmend leisen und monotonen Sprache. Von einer Festination wird dann gesprochen, wenn der Patient am Anfang eines Satzes stoppt, dann aber immer schneller wird.
Innervationsstörungen des Herzens und des Gastrointestinaltraktes können ebenfalls im Rahmen eines IPS auftreten (Alves et al. 2008; Jankovic 2008; Lerner et al. 2008).
Die Ursachen des IPS sind im Detail nicht geklärt. Genetische Faktoren, aber auch Umweltfaktoren werden als potentielle Auslöser der Erkrankung diskutiert. Darüber hinaus existieren Hypothesen, welche Störungen des Eisenstoffwechsels, der Radikalbildung, der Superoxidation sowie Veränderungen des Zellgerüsts als Ursache des Zelluntergangs heranziehen (Kienzl et al. 1995; Gerlach et al. 1996). Gleichwohl nicht als primäre Ursache ist die Rolle neurotoxischer Ereignisse gesichert.
2.2 Die Basalganglien
Das IPS ist eine neurodegenerativ verlaufende Systemerkrankung, die verschiedene Hirnregionen, aber auch das periphere und hier insbesondere das autonome Nervensystem befällt. Primär manifestiert sich IPS jedoch in den Basalganglien, die maßgeblich für die Steuerung der Motorik verantwortlich zeichnen. Dies beinhaltet die Regulation der unwillkürlichen Muskelbewegungen, des Muskeltonus sowie die Modifizierung der Willkürmotorik. Neuroanatomisch liegen unterhalb des Cortex die Kerngebiete Nucleus caudatus und Putamen (zusammengefasst als Striatum) sowie dem Pallidum mit dem Globus pallidus externus (GPe) und Globus pallidus internus (GPi), Dem Diencephalon wird der Nucleus subthalamicus (STN) und die Substantia nigra (Substantia nigra pars compacta (SNc) und Substantia nigra pars reticulata (SNr)) zugeordnet. Das Basalgangliensystem steht über exzitatorische und inhibitorische Regelkreise in enger Beziehung zueinander.
Da physiologischerweise Informationen aus dem Cortex über die Basalganglien zum Thalamus und von dort wieder zum Cortex geleitet werden, spricht man auch vom Basalganglien-thalamo-kortikalen Regelkreis.
Es handelt sich dabei um ein aus mindestens 6 Schleifen bestehendes Kontrollsystem; das die für die motorische, die kognitive (assoziative) und emotionale (limbische) Funktion verantwortlichen Areale miteinander verbindet. Für die Basalganglienanteile wird dabei ein doppelter Regelkreis postuliert (Abb. 1). Am Eingang dieses doppelten Regelkreises findet sich das Striatum. Es erhält Afferenzen aus dem prämotorischen und dem assoziativen Kortex. Diese Impulse sind glutamaterg und somit exzitatorisch. Das Striatum ist über zwei Neuronenbahnen, einen „direkten“ und einen „indirekten“ Weg mit dem internen Pallidumsegment (GPi) und der Substantia nigra pars reticulata (SNr), welche die Austrittsstruktur zum Thalamus darstellt, verbunden. Direkter und indirekter Weg sind antagonistisch zueinander.
Der „direkte Weg“ (striato-nigraler Weg) leitet inhibitorische, GABA-erge Impulse vom Striatum zum GPi. Die eigene inhibitorische Aktivität des Pallidum-Komplexes auf den Thalamus wird unterdrückt, so dass der Cortex aktiviert wird und seine Motorik-fördernde Funktion zum Tragen kommt.
Der „indirekte Weg“ (striato-pallidaler Weg) führt vom Striatum über die Umschaltstationen Globus pallidus externus (GPe) und Nucleus subthalamicus (STN) zum GPi. Über den Neurotransmitter Glutamat wird die Aktivität der Ausgangskerne (GPi/Substantia nigra)
gesteigert und so eine hemmende Wirkung (über GABA) auf den Thalamus und letztendlich den Cortex ausgelöst (Motorik hemmende Funktion).
Neuere Daten belegen die Existenz eines hyperdirekten Weges, bei dem der STN unter Umgehung des Striatums zusätzlich exzitatorische glutamaterge Afferenzen aus dem Cortex und Thalamus erhält (Nambu et al., 2002). Mittels dieser hyperdirekten Projektion können motorische Abläufe weiter reguliert werden.
Dopamin wirkt über zwei unterschiedliche Rezeptoren, den Rezeptortyp D1 und D2, auf die Striatumzellen. Ausgehend von der SNc induzieren dopaminerge Afferenzen über D1 eine Aktivierung von GPi über den direkten Weg. Über D2-Rezeptoren hingegen bewirkt Dopamin eine Hemmung von GPe über den indirekten Weg. Letztendlich fördert Dopamin so über beide Mechanismen die Aktivierung des Thalamus bzw. des Cortex (Motorik fördernde Funktion). Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass den Basalganglien nicht nur die Bewegungskontrolle obliegt, sondern auch im Rahmen von kognitiven und emotionalen Prozessen eine bedeutende Rolle zukommt (Obeso et al. 2008), die hier jedoch nicht näher angesprochen wurde.
Abb. 1: Funktionelle Basalganglien-Anatomie modifiziert nach Alexander und Crutcher (1990) unter normalen Bedingungen. Dargestellt ist der doppelte Regelkreis zwischen der Eingangsstruktur Striatum und der Ausgangsstruktur Globus pallidus internus (Gpi) bestehend aus dem „direkten Weg“: Striatum_GPi und dem „indirekten Weg“: Striatum_Globuspallidus externus (GPe)_Nucleus subthalamicus (STN)_GPi unter Berücksichtigung der Neurotransmitter. Das Dopamin aus der Substantia nigra pars compacta (SNc) wirkt über D1- und D2-Rezeptoren modulierend auf beide Wege.
2.3 Pathophysiologie des idiopathischen Parkinsonsyndroms
Der progrediente Untergang der Dopamin produzierenden Neurone der Substantia nigra wird als pathophysiologische Ursache für die motorischen Symptome des IPS angesehen. Durch den Dopaminmangel verschiebt sich das Gleichgewicht exzitatorischer und inhibitorischer Regelkreise der Basalganglien insofern, als der direkte Weg nicht mehr supprimiert, der indirekte Weg nicht mehr aktiviert wird. Über den direkten Weg wird vermehrt GABA ausgeschüttet und folglich GPi inhibiert. Über den indirekten Weg kommt es zu einer Abnahme der GPe-Aktivität und, dadurch ausgelöst, zu einer erhöhten Exzitation des GPi und der SNr. Beide Ereignisse sind mit einer Überaktivität des STN und verstärkten Hemmung thalamokortikaler Neurone gekoppelt. Die zunehmende Unterdrückung der Erregbarkeit thalamokortikaler Schaltkreise wird für viele motorische Symptome des IPS verantwortlich gemacht (Bernheimer et al. 1973; Fearnley und Lees 1991; Calabresi et al. 2006).
Neueren Untersuchungen zufolge treten die Zellveränderungen nicht ausschließlich in der Substantia nigra auf. Beschrieben ist die Degeneration von Zellen in aminergen Hirnstammkernen (z.B. Raphe-Kerne), im Nucleus basalis Meynert (cholinerg), in bestimmten kortikalen und hypothalamischen Arealen sowie in Ganglien des sympathischen und parasympathischen Nervensystems (Lang and Lozano 1998). Hervorgehoben werden soll die medial der Substantia nigra gelegene Zellpopulation der Area tegmentalis ventralis (VTA), die im Rahmen der vorliegendern Arbeit berücksichtigt wurde.
Der Zellverlust in weiteren Arealen könnte assoziierte Symptome aus dem psychiatrischen Formenkreis bedingen. Betroffen ist beispielsweise die Gedächtnisleistung, Aufmerksamkeit und Stimmungslage. Insgesamt ist das IPS somit als Multisystemerkrankung zu verstehen (Braak et al. 2002).
Abb. 2: Funktionelle Basalganglien-Anatomie modifiziert nach Alexander und Crutcher (1990) unter Parkinson-Bedingungen. Der striatale Verlust von Dopamin führt zu einer Verlagerung der Impulsgabe über den „indirekten Weg“: die vermehrte Inhibition des GPe führt zur Überaktivität des STN, der seinerseits den inhibitorischen Output des GPi zum Thalamus verstärkt. Die Folge ist eine reduzierte Aktivierung des Cortex.
2.4 Therapie des idiopathischen Parkinsonsyndroms
Die medikamentöse Therapie des IPS erfolgt zum einen durch die Gabe der Dopamin-Vorstufe Levodopa (L-Dopa). Levodopa vermag, im Gegensatz zu Dopamin, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Es wird am Wirkort in Dopamin umgewandelt. Der Dopaminspiegel im Striatum erhöht sich und kompensiert den pathologisch vorherrschenden Dopaminmangel. L-Dopa stellt durch die L-Dopa-Sensitivität des IPS auch gleichzeitig ein wichtiges diagnostisches Kriterium dar. Durch den sogenannten L-Dopa-Test lässt sich durch die Gabe von L-Dopa eine Verbesserung der Kardinalsymptome zeigen. Ein positiver Test stützt die Diagnose, beweist sie jedoch nicht.
Eine therapeutische Variante sieht vor, durch die Gabe von Dopamin-Agonisten die Wirkung des Dopamins nachzuahmen. Zur Verfügung stehen zwei Medikamentengruppen, aus Mutterkornalkaloiden gewonnene Ergot-Präparate (Bromocriptin, Lisurid, Pergolid) oder die Gruppe der Nicht-Ergot-Präparate (Ropinirol, Pramipexol).
Ein weiterer therapeutischer Ansatz verfolgt die Strategie, den Dopaminmangel durch die Hemmung des Dopamin-Abbaus im synaptischen Spalt auszugleichen. MAO-B-Hemmer blockieren das dopaminabbauende Enzym Monoaminooxidase-B (z.B. Selegilin, Rasagilin), während COMT-Hemmer das Enzym Catechol-O-Methyl-Transferase supprimieren (z.B. Entacapon).
Obwohl der Einsatz der genannten Substanzen die Lebenserwartung von Menschen mit IPS beträchtlich gesteigert hat, so verliert unter chronischer Anwendung die medikamentöse Therapie dennoch ihre Wirkung. Zusätzlich resultiert eine langjährige Behandlung mit L-Dopa in sogenannten Wirkungsfluktuationen. Diese zeichnen sich durch nachlassendes („wearing off“) oder wechselndes Ansprechen („on/off“), durch die Bewegungsblockade („freezing“) oder das Wirkversagen („no on“) aus.
2.5 Hochfrequenzstimulation
Nicht zuletzt auf Grund der Resistenzentwicklung unter medikamentöser Langzeittherapie ist in den letzten Jahren die Hochfrequenzstimulation (HFS) als neue Behandlungsoption entwickelt und etabliert worden (Limousin et al. 1998). Die Ausarbeitung des Konzeptes basierte auf der Beobachtung, dass sich im Rahmen des IPS die Entladungscharakteristik des STN verändert (Bergman et al. 2002).
Unter Behandlung mit MPTP entwickelten Affen ein dem IPS vergleichbares Krankheitsbild, begleitet von distinkten Abweichungen des Oszillationsmusters (Bergman et al. 1994; Langston et al. 1983; Raz et al. 1996, 2000; Ruskin et al. 2003; Goldberg et al. 2004; Rivlin-Etzion et al. 2006).
Die am Affenmodell herausgearbeitete Assoziation zwischen IPS und veränderter STN-Feuerungsaktivität wurde nachfolgend auch bei Parkinsonpatienten nachgewiesen (Steigerwald et al. 2008). Wichmann und Mitarbeiter wiederum konnten experimentell am MPTP-Modell aufzeigen, dass die Ausschaltung des STN durch Subthalamatomie zu einer signifikanten Verbesserung der Parkinsonsymptome führt (Wichmann et al. 1994).
Grundsätzlich lässt sich die Feuerungsaktivität der Neurone in Form oszillatorischer Muster aufzeichnen (Buzsaki et al 2012), wobei diese wiederum in unterschiedliche Frequenzbänder unterteilt werden, die in Phase, Frequenz und Amplitude in unterschiedlichster Art und Weise miteinander gekoppelt sein können (Jensen et al 2007). Das sogenannte Beta-Band mit Oszillationen zwischen 13-30 Hz (Referenz: Engel et al. 2010) ist nachweislich in die Regulation der motorischen Aktivität eingebunden (Khanna et al. 2014; Stein et al. 2013)
Typischerweise findet sich in IPS-Patienten unter Ruhebedingungen eine erhöhte Beta-Band-Oszillation (oszillatorische Synchronisation), (Woerd et al. 2014). Unter Therapie verringert sich die Amplitude von Oszillationen im Beta-Band (Kühn et al. 2009). Interessanterweise lassen sich auch hochfrequente Oszillationen innerhalb des STN um 300 Hz, insbesondere unter L-Dopa Therapie sowie unter Bewegung, detektieren (Foffani et al 2003). Ihre Bedeutung ist im Detail noch nicht klar. So existieren Berichte, nach denen die hochfrequenten Oszillationen auch ohne medikamentöse Therapie und unter Ruhebedingungen auftreten (Lopez-Azcarate et al. 2010, Homburger 2014).
Mittlerweile repräsentiert die HFS ein klinisch etabliertes Therapiekonzept bei zahlreichen neurologischen Erkrankungen. Neben der Behandlung des IPS und des essentiellen Tremors wird die HFS bei der generalisierten und segmentalen Dystonie sowie der fokalen Epilepsie eingesetzt. Weitere Therapiemöglichkeiten sind derzeit Gegenstand klinischer Fallstudien (z.B. Chorea Huntington). Technisch werden bei der HFS über eine stereotaktisch durchgeführte Operation Elektroden im Zielgebiet implantiert, welche über einen im Unterhautfettgewebe implantierten Schrittmacher stimuliert werden. Die Wirkung dieses Schrittmachers ist über ein separates Steuergerät variierbar. Bei der Therapie des IPS erfolgt die elektrische Stimulation im
Nucleus subthalamicus (STN-HFS). Gegebenenfalls kann auch eine Stimulation im GPi durchgeführt werden, insbesondere zur Reduktion von Dyskinesien. (The Deep-Brain Stimulation for Parkinson’s Disease Study Group, 2001). Die Impulsfrequenz beträgt grundsätzlich mehr als 100Hz.
Die Wirkmechanismen der STN-HFS sind zwar im Detail nicht klar. Kühn et al. konnten jedoch nachweisen, dass die mittels STN-HFS erzielte Verbesserung der Motorik von einer Suppression der Beta-Band-Aktivität begleitet ist (Kühn et al. 2008).
Angewendet wird die HFS entsprechend zur Verbesserung der L-Dopa sensitiven motorischen Symptome sowie bei Dyskinesien des fortgeschrittenen IPS (Benabid et al. 2000) und Motorfluktuationen austherapierter Patienten (Herzog et al. 2010).
Verschiedene Studien konnten eindrucksvoll die positiven Auswirkungen der HFS auf die genannten Parkinson-Symptome sowie die Lebensqualität der Patienten belegen. (Deuschl et al. 2006; Alamri et al. 2015).
Beachtenswert ist, dass unter HFS auch die L-Dopa-Dosis drastisch reduziert werden kann, was mit einer Abnahme der unter L-Dopa-Langzeittherapie induzierten Dyskinesien assoziiert ist (Abbruzzese et al. 2012).
2.6 Nebenwirkungen der HFS
Neben chirurgischen und systembedingten Komplikationen z.B. Dislokation der Elektroden (Benabid et al. 2009), sind insbesondere stimulationsbedingten Komplikationen anzuführen, die unter HFS zu beobachten sind. Hierzu zählen Dysarthrie, Gewichtszunahme und – neben einer initialen manischen Phase (Ulla et al. 2006) - Depressionen (Kleiner-Fisman et al. 2006). So beobachteten Temel et al. nach HFS deutliche Verhaltens- und Stimmungsänderungen unter den Parkinson-Patienten (Temel et al. 2007). In 8% der Fälle traten depressive Episoden auf (Temel et al. 2006). Eine drastische Erhöhung der Suizidrate unter HFS ist von zahlreichen Autoren belegt (Hilker et al. 2009; Okun et al. 2009; Strutt et al. 2012).
Die Ursachen für das Auftreten unerwünschter psychiatrischer Nebeneffekte sind im Einzelnen nicht geklärt. Zu berücksichtigen ist jedoch die Rolle des STN als zentraler Modulierungs- und
Verbindungskern im Verschaltungsnetzwerk der motorischen, assoziativen und emotionalen Schleifen (Thobois et al. 2010; Voon et al. 2008).
Wahrscheinlich werden unter HFS auch Anteile außerhalb des motorischen Regelkreises direkt beeinflusst, also auch die assoziativen und limbischen Schleifen. Es wird postuliert, dass das limbische System durch die HFS moduliert wird und dadurch die beobachteten psychiatrischen Symptome ausgelöst werden. PET-Studien ergaben diesbezüglich, dass STN-HFS die Aktivität im anterioren Cingulum und präfrontalen Kortex (Limousin et al. 1997; Ceballos-Baumann et al. 1999; Stefurak et al. 2003) sowie im temporalen und parietalen Kortex (Hilker et al. 2004) erhöht (bzw. anormales Hintergrundrauschen reduziert, Payoux et al. 2004). Die Veränderungen im limbischen System sind im Kontext mit Störungen im Neurotransmitter-Haushalt zu sehen (Bennett et al. 2011). Möglicherweise lassen sich Depressionen und repetitive Verhaltensweisen auf durch HFS induzierte Modulationen im serotonergen und dopaminergen System zurückführen (Koo et al. 2010; Creed et al. 2013).
Für die Hypothese spricht, dass das aus dem VTA stammende meso-striatale Dopamin, die Aktivität im limbisch-emotionalen System reguliert, und zwar über Projektionen zum ventralen Striatum und zum Ncl. accumbens (Stein et al. 2008). Grundsätzlich gilt jedoch, dass die Hintergründe, die zu den psychiatrischen Erscheinungsbildern führen, nicht vollständig geklärt sind.
2.7 Herleitung der Aufgabenstellung
Frühere experimentelle Studien ergaben, dass STN-HFS das extrazelluläre Niveau von GABA und Glutamat im Striatum und der Substantia nigra verändert (Windels et al. 2000; Bruet et al. 2003; Windels et al. 2003) sowie die Dopamin-Transmission im dorsolateralen Striatum von gesunden und hemiparkinsonischen Ratten erhöht. Es wird vermutet, dass dieser Effekt zur klinischen Verbesserung der Motorik sowie zur Herabsetzung der dopaminergen Medikation bei IPS-Patienten unter anhaltender STN-HFS beiträgt (Paul et al. 2000; Meissner et al. 2001; Meissner et al. 2003; Lee et al. 2006).
Gleichzeitig ist zu berücksichtigen, dass auf Grund der funktionalen Unterteilung des STN und seiner Integration in motorische und limbische Regelkreise die HFS möglicherweise
neurochemische Veränderungen im limbischen System hervorruft, welche mit denen unter HFS zu beobachtenden psychiatrischen Nebenwirkungen in Verbindung stehen könnten.
Die vorliegende Studie sollte den psychischen Aspekt in den Vordergrund rücken. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von STN-HFS auf die DAerge Transmission im NAc und die GABAerge Transmission im VTA als Bestandteil des limbischen Systems mithilfe von Mikrodialyse in vivo bei Ratten zu evaluieren. Um die Bahnen, entlang denen die STN-HFS-gebundenen Wirkung auf die DA-Transmission im NAc auftritt, genauer zu bestimmen, wurden zusätzlich zwei getrennte Gruppen in die Analyse einbezogen. In einer Gruppe sollten ausgewählte Tiere 6-Hydroxydopamin-(6-OHDA-)-Läsionen an der Pars compacta der Substantia nigra (SNc) erhalten; die andere Gruppe Läsionen am VTA vor Durchführung der STN-HFS und Mikrodialyse-Test.
3. Methodik
3.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen
Die durchgeführten Tierversuche oblagen den Bestimmungen des Tierschutzgesetzes § 8 Absatz 1 und wurden von der Senatsverwaltung für Gesundheit genehmigt. Die Zahl der Versuchstiere beschränkte sich auf die statistisch benötigte Mindestzahl; die operativen Eingriffe wurden so rasch wie möglich durchgeführt.
Für die Tierversuche wurden männliche Wistar-Ratten (n = 78; 280 bis 320 g zum Zeitpunkt des Experiments) des Stammes HSDWIN:WU verwendet. Bezugsquelle der Tiere war die Versuchstierzuchtanstalt H. Winkelmann, Borchen.
Die Haltung der Tiere erfolgte bis zum Zeitpunkt der Stimulationsversuche in standardisierten Käfigen in Gruppen von jeweils fünf Tieren. Die Versuchstiere wurden mit ALTROMIN 1324 Standard (Altromin, Lage) in pelletierter Form gefüttert. Wasser und Futter standen ad libidum zur Verfügung. Die Tiere unterlagen einem Tag-Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden (Helligkeitsphase von 6:00 bis 18:00 Uhr). Es herrschte eine konstante Temperatur von 18° C und die Luftfeuchtigkeit betrug etwa 50%. Alle Experimente wurden tagsüber und ausschließlich mit anästhesierten Ratten durchgeführt.
3.2 Experimentelles Design
Die Experimente erfolgten gestaffelt in 3 Ansätzen. Die Tiere (n=78) wurden dabei wie folgt den Versuchen zugeführt:
Versuchsansatz 1 (n=41 Tiere): Analysen zum Einfluss der STN-HFS auf die dopaminerge Transmission; Evaluation des extrazellulären DA. 2 Subgruppen:
Gruppe 1 (n=22): Analyse im NAc core (HFS-Gruppe: n=13; Kontrollgruppe: n=9).
Gruppe 2 (n=19): Analyse im NAc shell (HFS-Gruppe: n=12; Kontrollgruppe: n=7).
Versuchsansatz 2 (n=16 Tiere): Analysen zum Einfluss der STN-HFS auf die GABAerge Neurotransmission in der VTA (Evaluation des extrazellulären GABA).
HFS-Gruppe: n=8; Kontrollgruppe: n=8.
Versuchsansatz 3 (n=21 Tiere): Analysen zur Relevanz des SNc und der VTA als Modulatoren der dopaminergen Neurotransmission im NAc unter STN-HFS. 3 Subgruppen:
Gruppe 1 (n=8): Läsion der SNc durch 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) 2 Wochen vor HFS.
Gruppe 2 (n=8): Läsion der VTA durch 6-OHDA 2 Wochen vor HFS.
Gruppe 3 (n=5): Keine Läsion.
Probenentnahme im NAc core und NAc shell.
Das Probenmaterial wurde zur Ermittlung des extrazellulären DA, DOPAC, HVA und GABA Gehalts anschließend der HPLC zugeführt. Die in Versuchsansatz 3 gesetzten Läsionen wurden immunhistochemisch kontrolliert und quantifiziert.
3.3 Chirurgische Eingriffe
Nachdem die Ratten mit Chloralhydrat (400 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal; Merck, Darmstadt) narkotisiert wurden, erfolgte die Platzierung im stereotaktischen Operationsrahmen (David Kopf Instruments, Tujunga, USA). Die Tiere wurden dabei mittels Interauralstiften und einem Incisorstift in den Rahmen eingespannt. Die Narkose wurde während des gesamten Experiments aufrechterhalten. Die Tiefe der Narkose wurde durch Auslösen des Kornealreflexes überprüft. Konnte dieser ausgelöst werden, erfolgte die erneute intraperitoneale Applikation von Chloralhydrat. Die Ratten wurden während des gesamten Experiments durch eine Heizmatte (Temperature Control CMA 150, Stockholm, Schweden) warmgehalten. Die Körpertemperatur wurde mit einer rektal applizierten Messsonde überwacht (Sollwert: 37,5° Celsius) und über die Heizmatte gesteuert.
Nachdem die Kopfhaut rasiert und desinfiziert wurde, erfolgten der Hautschnitt und die Darstellung der Knochenhaut. Nach Freilegen des Bregmas wurden die Trepanationspunkte für die unter 2.2 gelisteten Zielgebiete eingestellt. Auf der Kalotte wurden die Zielpunkte markiert und im Anschluss mit einem Dentalbohrer (Durchmesser 1 mm) eröffnet.
Es wurde ein 2 cm langer Hautschnitt mittels Scherenschlag in der Mitte des Kopfes gemacht und die Schädeldecke freipräpariert. Zur Nullpunkteinstellung wurde die Spitze der Injektionskanüle auf das Bregma eingestellt. Anschließend wurde die Kanüle 4,4 mm nach posterior und 1,1 mm nach lateral ausgerichtet. Mit Hilfe eines Dentalbohrers wurde ein ca. 1 mm großes Loch in die Schädeldecke gebohrt. Im Anschluss wurden die Stimulationselektrode (SNEX 100, Rhode Medical Instruments, Woodland Hills, USA), die Mikrodialysesonde (CMA, Stockholm, Schweden) oder die Injektionskanüle anhand der Koordinaten nach dem Ratten-Hirnatlas von Paxinos und Watson im Zielgebiet platziert (Paxinos G, Watson C (1998) The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. San Diego).
3.4 Läsionen in der Substantia nigra pars compacta bzw. im ventralen Tegmentum
Die gezielte Läsion in der Substantia nigra pars compacta (SNc) bzw. im ventralen Tegmentum wurde zwei Wochen vor der HFS und Mikrodialyse gesetzt.
Die Läsion erfolgte bei den mit Pentobarbital (50 mg/kg i.p.; Sigma Aldrich, Taufkirchen) narkotisierten Tieren durch 7 µg 6-OHDA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), aufgelöst in 2 µl physiologischer Kochsalzlösung mit 0,1 % Ascorbinsäure. Die 6-OHDA-Lösung wurde stereotaktisch über eine 25 Gauge Kanüle aus rostfreiem Stahl, welche mit einer 20 µl Mikroliterspritze des Typs CR 400 -20 (Hamilton Company, Reno, USA) verbunden war, appliziert. Die Läsion wurde entweder in der linken SNc (A: -5,3; L: 2,3; V: -7,2) oder im linken VTA (A: -5,3; L: 0,6; V: -7,8) gesetzt. Zur Ermittlung der Koordinaten diente der stereotaktische Atlas nach Paxinos und Watson (Paxinos und Watson).
3.5 Mikrodialyse
Für die Mikrodialyse wurden Sonden vom Typ CMA 12 (für die simultane Kollektion; Membrandurchmesser 0.5 mm, Membranlänge 2 mm; CMA, Stockholm, Schweden) oder CMA 11 (für die separate Kollektion; Membrandurchmesser 0.24 mm, Membranlänge 2 mm; CMA, Stockholm, Schweden verwendet (Abb. 3)).
Abb. 3: Mikrodialysesonde (Abbildung der Firma CMA/Microdialysis AB, Stockholm, Schweden)
Als Dialysierflüssigkeit wurde eine der Extrazellularflüssigkeit der Ratte angepasste glukosefreie Pufferlösung [(cerebrospinal fluid; CSF)-Puffer] eingesetzt, mit folgender Zusammensetzung:
125 mM Natriumchlorid, 1 mM Calciumchlorid, 1mM Magnesiumchlorid, 0,5 mM Natrium-sulfat, 2,5 mM Kaliumchlorid, 27 mM Natriumhydrogencarbonat, 0,5 mM Natriumdihydrogen-phosphat, 2,4 mM DinatriumhydrogenNatriumdihydrogen-phosphat, 1 M Phosphorsäure.
Der zuführende Schenkel der Mikrodialysesonde wurde über einen Polyethylenschlauch mit einer Perfusorspritze verbunden, die zuvor im Ultraschallbad entlüfteten CSF-Puffer enthielt. Am abführenden Schenkel war ein gleichartiger Schlauch befestigt, der in einem kleinen Sammelgefäß endete. Die Mikrodialysesonden wurden mit einer konstanten Flussrate von 1,1 µl/min umspült.
Unter allgemeiner Anästhesie (400 mg/kg i.p.; Chloralhydrat, Merk, Darmstadt) wurden die Mikrodialysesonden entweder in den linken NAc core (1,6; L: 1,4; V: -7,4; CMA 11), den linken NAc shell (A: 1,6; L: 0,7; V: -7,7; CMA 11) oder – im Rahmen der Läsionsstudien - gleichzeitig im linken NAc core und shell (A: +1,7; L: 1,3; V: -8,2; CMA 12) implantiert.
Die erste Probeabnahme erfolgte 60 Minuten nach Implantation der Mikrodialysesonde. Die Dialysate wurden über 20 Minuten in eiswassergekühlten Eppendorf-Röhrchen, die als Vorlage je 5,5 µl 1 M Perchlorsäure enthielten, gesammelt und sofort im Anschluss mittels HPLC (Phenomenex, Aschaffenburg) analysiert. Die HPLC-Methodik ist unter 3.7 beschrieben.
3.6 Hochfrequenzstimulation
Bei allen narkotisierten Versuchstieren wurde eine konzentrische, bipolare Stimmulationselektrode (SNEX 100; Rhode Medical Instruments, Woodland Hills, CA, USA) im linken STN implantiert (A: -3,6; L: 2,5; V: -7,6) (Paxinos and Watson, 1998). Mit der HFS wurde begonnen, wenn mindestens vier konsekutive stabile, mittels Mikrodialyse (siehe 3.5) erhobene Basiswerte der zu messenden Parameter vorlagen. Als Impulsgenerator für die Stimulation wurde ein programmierbarer, isolierter Stimulator (A 13-65, Coulbourn Instruments, Allentown, USA) verwendet und ein konstanter Strommodus mit alternierenden Impulsen festgelegt. Folgende Stimulationsparameter wurden gewählt: Gleichstrom mit 300 µA, Frequenz 130 Hz, Pulsweite 60 µs, Stimulationsdauer 20 min. Die Überprüfung einer effektiven elektrischen Stimulation erfolgte durch ein parallel geschaltetes Oszilloskop (DSO 2211, Tektronix, Heerenveen, Niederlande). Die Probenentnahme erfolgte in 20minütigen Intervallen. 4 Proben wurden vor HFS, 1 Probe während der HFS und 5 Proben nach HFS entnommen.
3.7 Quantitative Analysen der extrazellulären Konzentrationen von Dopamin und seiner Metabolite
Die Analyse der extrazellulären Konzentrationen von Dopamin und seiner Metabolite 3,4-Dihydroxyphenylacetat (DOPAC) und Homovanillinsäure (HVA) erfolgte mit Hilfe der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC, high performance liquid chromatography) (Synergi 4µ Hydro-RP 80A, 150x2 mm, Phenomenex, Aschaffenburg).
Die mittels Mikrodialyse (siehe 3.5) gewonnenen Proben wurden mit der in den Eppendorfröhrchen vorgelegten Perchlorsäure gemischt. Ein Aliquot von 20 µl wurde über manuelle Probenaufgabeventile (RH 7725, Rheodyne, Cotati, USA) aufgetragen. Die chromatographische Trennung erfolgte an einer Säule des Typs Ultrasep ES 100 RP 18 (Sepserv, Berlin) (Korngröße 4 µm, Länge 125 mm, Durchmesser 2 mm bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml/min). Die mobile Phase wurde mit einer Pumpe des Typs Rheos 4000 (Flux Instruments, Basel, Schweiz) gefördert, wobei die Förderrate 250 µl/min betrug (Druck: ca. 170 bar).
Das Laufmittel für die HPLC hatte folgende Zusammensetzung: 100 mM Natriumhydrogenphosphat, 0,8 mM EDTA, 1,3 mM Octasulfonsäure, 30 g 2-Propanol/1000g Lösung, pH-Wert: 2,8.
Das an die Arbeitselektrode angelegte Potential betrug 0,8 Volt gegen die Ag/AgCl-Referenzelektrode. Die Detektion der Substanzen innerhalb der Probe erfolgte durch zwei in Reihe geschaltete, amperometrische, elektrochemische Messzellen (Zelle 1: Chromosystems Instruments & Chemicals GmbH, Typ 41000, München; Zelle 2: BAS LC-4C, Bioanalytical Systems Inc., West Lafayette, USA) bei den Strommessbereichen 5 nA (für Dopamin) und 50 nA (für die Dopaminmetabolite). Die aufgezeichneten Chromatogramme wurden über Berechnung der Peak-Flächen mit Hilfe der Software CSW 1.7 (DataApex Ltd., Prag, Tschechische Republik) ausgewertet.
Die Tageseichung und Kontrolle der Retentionszeiten erfolgte mit Hilfe von Standards für Dopamin, DOPAC und HVA.
3.8 Histologische Befunde und Analysen
Mit der histologischen Aufarbeitung der Rattengehirne wurden folgende Ziele verfolgt:
1. Verifikation der Lokalisation von Elektrode im STN und Mikrodialysesonde im NAc core bzw. shell.
2. Quantifizierung der 6-OHDA-Läsion durch Zellzählung der dopaminergen Neurone der SNc bzw. der VTA.
Die Gehirne wurden zunächst fixiert und später Kryostatschnitte der interessierenden Hirnregionen angefertigt. Anschließend erfolgte die entsprechende Färbung der Gehirne.
3.8.1 Fixierung und Präparation der Gehirne
Nach Abschluss der Mikrodialyse und HFS erfolgte die tiefe Betäubung der jeweiligen Versuchstiere mit Chloralhydrat (500 mg/kg KG in 0,9 % NaCl-Lösung). Den Tieren wurde der Thorax eröffnet und das Herz sowie die Aorta ascendens freigelegt. Der rechte Vorhof sowie die linke Kammer wurden inzidiert.
Über die eröffnete Kammer wurde eine Knopfkanüle bis in die Aorta ascendens vorgeschoben. Diese Kanüle war mit einer Förderpumpe verbunden. Die Perfusion erfolgte zuerst mit 80 ml PBS-Puffer und danach direkt im Anschluss mit 200 ml einer 4%-igen Paraformaldehydlösung.
Der PBS-Puffer war ein 0,1 M Phosphatpuffer mit 8 g/l Natriumchlorid, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,4 g/l Natriumdihydrogenphosphatmonohydrat und einem pH-Wert von 6,81.
Das Gehirn der Versuchstiere wurde nach Dekapitation aus dem Schädelknochen herauspräpariert. Anschließend erfolgte die Fixierung der Gehirne in einer 4%-igen Paraformaldehydlösung über 24 Stunden. Im Anschluss wurden die Gehirne zwecks Kryoprotektion in eine 20%-ige Saccharoselösung bei 4° C dehydriert. Die Proben konnten bei -80° C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt werden.
Die histologischen Präparate wurden folgendermaßen angefertigt: Das fixierte Gehirn wurde mit in Stickstoff gekühltem 2-Propanol (Merck, Darmstadt) auf Korkplättchen bei -80°C aufgefroren. Anschließend erfolgte die Anfertigung von koronaren Serienschnitten der entnommenen Gewebsstücke (SNc und der VTA – der Abstand zwischen den beiden Regionen betrug 240µm) mit einer Dicke von 40µm mit Hilfe eines Gefriermikrotoms (Cryostat 1800, Reichert-Jung). Jeder zweite Schnitt pro Schnittserie wurde der Kresylviolett-Färbung zugeführt (siehe 3.8.2). Jeder sechste Schnitt wurde immunhistochemisch nach dem Tyrosinhydroxylase (TH)-Färbeprotokoll gefärbt (siehe 3.8.3).Untersucht wurden Präparate von allen Tieren, denen zwei Wochen vor HFS 6-OHDA injiziert worden war (inklusive Kontrollen). Je Tier wurden Schnittserien der entnommenen Gewebsstücke (SNc und der VTA – der Abstand zwischen den beiden Regionen betrug 240µm) angefertigt (Schnittdicke: 40 µm), wobei jeder zweite Schnitt der Kresylviolett-Färbung zugeführt wurde (siehe 3.8.1). Jeder sechste Schnitt wurde immunhistochemisch nach dem TH-Färbeprotokoll gefärbt
3.8.2 Immunhistochemie - Kresylviolett-Färbung
Mikroskopische Analysen wurden durchgeführt, um die exakte Lage der Stimulationselektrode, Mikrodialysesonde und Injektionskanüle zu verifizieren. Dazu wurden die histologischen Präparate (siehe 3.8.1) der Regionen NAc (+2,9 bis +0,5), STN (3,4 bis 4,3), SNc (4,8 bis -6,3), und VTA (-4,52 bis -6,3) auf Objektträger aufgezogen und die Orientierungsschnitte nach dem Nissl-Protokoll gefärbt. Dazu wurden die Gewebeschnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe und im Anschluss in einer absteigenden Alkoholreihe dehydriert. Danach erfolgte die Färbung mit dem Nissl-Reagens (Kresylviolett, Merck, Darmstadt), 1%ig in Aqua dest.) und eine Spülung mit destilliertem Wasser. Der Färbevorgang endete in einer aufsteigenden Alkoholreihe und einer 15-minütigen Spülung in Xylol mit nachfolgender Lufttrocknung der Präparate. Abschließend wurden die Präparate in Entellan (Merk, Darmstadt) eingebettet und somit auf einem Deckglas fixiert.
3.8.3 Immunhistochemie – Tyrosinhydroxylase (TH)-Färbung
Das Ausmaß der durch 6-OHDA induzierten Gewebs-Läsionen wurde mit Hilfe der immunhistochemischen TH-Färbemethode bestimmt. TH steuert die Katecholaminsynthese und lässt sich entsprechend im Zellkörper und in den Axontermini von katecholaminergen Nervenzellen nachweisen (Nagatsu et al., 2000). Die durch 6-OHDA nicht zerstörten dopaminergen Neurone können somit durch die TH-Immunreaktion visualisiert und quantifiziert werden (siehe unten).
In einem ersten Schritt wurden die Präparate mit einem monoklonalen Maus-Anti-Ratten TH Antikörper inkubiert (Calbiochem, Bad Soden; verdünnt auf 1:500; 72h bei 4°C ). Nach einem 30minütigen Waschschritt in PBS erfolgte die Zugabe des zweiten, biotinylierten Antikörpers (Ziege anti-Maus, 1:200; 60 min bei 37°C).
Nach erneutem Waschen in PBS wurde der Avidin-Biotin-Komplex hinzugefügt (Sigma Chemie, Deisenhofen; 1:200, 60 min bei 37°C). Der Färbevorgang wurde abgeschlossen mit Diamino-benzidin (0,05% in 0,05M TBS (Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan)-Puffer (89 mM TRIS Base; 89 mM Borsäure; 2 mM EDTA-Na2; pH 8.0)) und 0,03%igem Wasserstoffperoxid
(3 min).
Nach Beendigung der Farbreaktion erfolgte dreimaliges Waschen mit Aquadest und das Aufziehen der frei flottierenden Schnitte. Sie wurden in einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert und anschließend mit Entellan eingedeckelt.
Zur quantitativen Analyse der gefärbten Neurone wurde die „optical fractionator“-Methode des halbautomatischen Stereologiesystems StereoInvestigator (MicroBrightfield, Colchester, VT, USA) verwendet. Der Aufbau beinhaltete eine Hitachi HV-C20A Videokamera, die an ein Leica DM-RXE Mikroskop gekoppelt war.
Positive Zellen, die den oberen oder seitlichen Rand des Zählrahmens überschritten, wurden nicht mitgezählt. Die Zellzahlen wurden als Prozentangaben in Relation zu dem unbeschädigten Gewebe der kontralateralen Seite ausgedrückt.
3.9 Auswertungen der Daten
In die Auswertungen wurden nur die Daten von Tieren einbezogen, bei denen die akkurate Lage der Instrumente mittels histologischer Präparation (siehe 3.8) nachgewiesen werden konnte.
Die Basislinie für die Mikrodialyseproben wurde über den Mittelwert der letzten vier gesammelten Dialysate vor Beginn der HFS bzw. vor der Schein–HFS definiert. Alle Messwerte wurden in Prozentangaben bezogen auf die Basislinie umgewandelt. Die Basislinie wurde als 100% definiert.
Die statistische Auswertung der extrazellulären Konzentration von Dopamin und seinen Metaboliten erfolgte mittels Two-Way-Anova-Test mit wiederholten Messungen. Die Stimulationstests (HFS versus Kontrolle) und Läsionsexperimente (VTA/SNc/Kontrolle) dienten der Bestimmung des „Between-Subjects“ Faktor, die zeitabhängig ermittelten Daten bei den wiederholten Messungen zur Bestimmung des „Within-Subjects“ Faktor. Bei statistisch signifikanten Unterschieden wurde anschließend ein Post-Hoc T-Test korrigiert für multiple Vergleiche nach der Methode von Holm Sidak durchgeführt. Ein Wahrscheinlichkeitsniveau von p < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Die Messwerte wurden als Mittelwert +/- Standardabweichung graphisch dargestellt. Die Basislinien-Werte wurden als fmol/20 µl Dialysat für DA und pmol/20 µl Dialysat für DOPAC und HVA angegeben.
4. Ergebnisse
4.1 Platzierungen der Stimulationselektrode und der Mikrodialysesonde
Für die Versuche wurden insgesamt 78 Tiere eingesetzt. Zur Auswertung kamen nur Tiere mit exakt gesetzter Elektrode innerhalb des STN. Abbildung 4A zeigt diesbezüglich repräsentativ die Mikrophotographie eines Koronarschnittes des STN einer Ratte mit korrekt implantierter Elektrode (Abb. 4 A). Das histologische Präparat demonstriert die Lokalisation der Elektrodenspitze im STN (Cresyl-Violett-Färbung).
Die nachfolgenden Abbildungen 4B bis 4G stellen schematische Rekonstruktionen der histologischen Schnitte dar. Die schwarzen Punkte symbolisieren jeweils die Lage der Elektrodenspitzen im Kerngebiet des STN. Seitlich angefügt finden sich Angaben zur Platzierung der Sonden, die mit Hilfe des Atlanten von Paxinos und Watson erfolgten.
Post mortem konnte die korrekte Lage für 13 Platzierung im NAc core (Abb. 4 B) histologisch gesichert werden sowie für 12 Platzierungen im NAc shell (Abb. 4 C), für 8 Platzierungen im VTA (Abb. 4 D), für 8 Platzierungen im NAc core/shell vor der Läsion im VTA (Abb. 4 E), für 8 Platzierungen im NAc core/shell vor Läsion der SNc (Abb. 4 F) und für 5 Platzierungen im VTA ohne vorherige Läsion (Abb. 4 G).
Abb. 4: Post-mortem-Histologie. A Repräsentative Mikroaufnahme der Spitze der Elektrode in Bezug zum Bregma in der koronaren Sektion nach Cresyl-Violett-Färbung (Verdichtung: kleines Insertionstrauma). B–G Schematische Rekonstruktion der Lage der Elektroden im STN von Versuchstieren des folgenden Experimentdesigns: B HFS, Mikrodialyse im NAc-core, C HFS, Mikrodialyse in NAc-shell, D HFS, Mikrodialyse im VTA, E HFS, Mikrodialyse in NAc-core-/vor Läsion des VTA, F: HFS, Mikrodialyse in NAc-core und -shell vor Läsion der SNc, G: HFS, Mikrodialyse im VTA, ohne vorherige Läsion.
Die Tiere mit korrekt implantierter Elektrode (n=78) wurden in folgende Gruppen unterteilt:
Gruppe 1/experimenteller Ansatz 1: Zur Analyse der Effekte der STN-HFS auf extrazelluläres DA wurden 41 Tiere eingesetzt. In Untergrupe 1 (n=13 für HFS, n=9 für die Kontrollen) erfolgte die Sammlung der Mikrodialyse-Proben im NAc core. Untergruppe 2 (n=12 für HFS, n=7 für die Kontrollen) beinhaltete Mikrodialyse-Proben entnommen aus dem NAc shell.
Gruppe 2/experimenteller Ansatz 2: Ermittelt wurde in diesem Fall die Effekte der STN-HFS auf extrazelluläres GABA im VTA. Die Studienpopulation bestand aus insgesamt 16 Tieren, 8 Tiere unter HFS sowie 8 Kontrolltiere.
Gruppe 3/experimenteller Ansatz 3: Gegenstand der Untersuchungen war es, modulatorische Effekte des SNc und der VTA auf die dopaminergen Neurotransmission im NAc unter STN-HFS zu evaluieren. Aus 21 Tieren wurden hierzu 3 Subgruppen gebildet:
Subgruppe 1 (n=8 Tiere): Läsion der SNc durch 6-OHDA zwei Wochen vor HFS. Subgruppe 2 (n=8 Tiere): Läsion der VTA durch 6-OHDA zwei Wochen vor HFS. Subgruppe 3 (n=5): Keine Läsion.
Die Probenentnahme erfolgte parallel sowohl im NAc core als auch im NAc shell.
4.2 Experimenteller Ansatz 1: Effekte der STN-HFS auf die dopaminerge Transmission im NAc core
Quantifiziert wurde nicht nur die Konzentration von DA, sondern auch die Konzentration der Hauptmetabolite HVA und DOPAC. Der Two-Way-Anova-Test mit wiederholten Messungen belegte diesbezüglich eine signifikante stimulations- und zeitabhängige Differenz der DOPAC- und HVA-, nicht jedoch der DA-Konzentration. Gleichermaßen ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen Stimulation und Scheinstimulation für DOPAC und HVA, aber nicht für DA. So induzierte die STN-HFS lediglich einen reversiblen, nicht signifikanten Anstieg des extrazellulären DA-Spiegels (max. 107.55 +/- 4.16) im Sinne eines Trends, im Vergleich zur Basislinie (F(12,129) = 2,59, p > 0,05; n=13) und den an unstimulierten Ratten ermittelten Werten (Abb. 5).
Abb. 5: Extrazelluläre Konzentration von Dopamin des NAc Core vor, während und nach HFS sowie Kontrolluntersuchungen. Die Werte sind als Mittelwerte und Standardfehler aufgetragen. Die HFS Stimulation erfolgte zwischen 0 und 20 Minuten. Sammelzeit und Probe waren methodisch bedingt 10 Minuten voneinander getrennt.
Zeit (t min) DA -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 ex tr acel lul ar DA ( % of ba sel ine ) 60 80 100 120 140 160 130 Hz (n=13) controls (n=7) E xtr az ellul äres DA (% d er B asi slin ie )
Abb. 6 und 7 hingegen demonstrieren eine durch STN-HFS ausgelöste signifikante und reversible Erhöhung des extrazellulären DOPAC- (max. 114,81 +/- 3,07; Abb. 6) sowie des extrazellulären HVA-Gehalts (max. 116,82 +/- 5,03; Abb. 7), verglichen zur jeweiligen Basislinie (DOPAC: F(12,129) = 18,97, t = 0-40 min, p < 0.05, n = 13; HVA: F(12,129) = 10,25, t = 20-60 min p < 0,05, n = 13) und verglichen zu den unstimulierten Kontrollen (t = 0-60 Minuten (DOPAC) bzw. t = 20-60 Minuten (HVA)). Die Basal-Konzentrationen der gemessenen Neurotransmitter im NAc core betrugen für DA 21,15 ± 1,05 fmol/20µl, für DOPAC 14,36 ± 0,35 pmol/20µl und für HVA 8,57 ± 0,37 pmol/20µl (MW +/- SD).
Abb. 6:
Extrazelluläre Konzentration von DOPAC des NAc Core vor, während und nach HFS sowie Kontrolluntersuchungen. Die Werte sind als Mittelwerte und Standardfehler aufgetragen. Der Stern (*) bzw. der Paragraph (§) markieren die signifikante Differenz gegenüber den Basiswerten bzw. den Kontrollen. § p < 0,05 versus Baseline, * p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe (post hoc Student-Newman-Keuls). Die HFS Stimulation erfolgte zwischen 0 und 20 Minuten. Sammelzeit und Probe waren methodisch bedingt 10 Minuten voneinander getrennt. DOPAC time (min) -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 ex tr acel lul ar Dopac (% of ba sel ine ) 60 80 100 120 140 160 130 Hz (n=13) controls (n=9) §* §* § § § Zeit (t min) E xtr az ellul äres D OPA C (% d er B asi slin ie ) *
Abb. 7: Extrazelluläre Konzentration von HVA des NAc Core vor, während und nach HFS sowie Kontrolluntersuchungen. Die Werte sind als Mittelwerte und Standardfehler aufgetragen. Der Stern (*) bzw. der Paragraph (§) markieren die signifikante Differenz gegenüber den Basiswerten bzw. den Kontrollen. § p < 0,05 versus Baseline, * p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe (post hoc Student-Newman-Keuls). Die HFS Stimulation erfolgte zwischen 0 und 20 Minuten. Sammelzeit und Probe waren methodisch bedingt 10 Minuten voneinander getrennt.
HVA time (min) -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 ex tr acel lul ar HV A ( % of ba sel ine ) 60 80 100 120 140 160 130 Hz (n=13) controls (n=9) E xtr az ellul äres H V A (% d er B asi slin ie ) Zeit (t min) §* §*
Bei den nicht stimulierten Kontrolltieren blieben die Konzentrationen von DA, DOPAC und HVA über den gesamten Verlauf des Versuchs stabil. Die Konzentrationen sanken nicht signifikant unter die Basislinien-Werte (DA: F(6,69) = 1,23, p > 0,05, n = 7; DOPAC: F(8,89) = 6,56, p < 0,05, n = 9; HVA: F(8,89) = 2,60, p < 0.05, n = 9; (Abb. 5 bis 10).
4.3 Experimenteller Ansatz 1: Effekte der STN-HFS auf die dopaminerge Transmission im NAc shell
Im Gegensatz zur Analyse des NAc core belegte der Two-Way-Anova-Test mit wiederholten Messungen eine signifikante stimulations- und zeitabhängige Differenz nicht nur der DOPAC- und HVA-, sondern auch der DA-Konzentration im NAc shell. Auch im Vergleich Stimulation und Scheinstimulation konnten signifikante Differenzen in der Konzentration sämtlicher Parameter, DA, DOPAC und HVA nachgewiesen werden. Abb. 8 verdeutlicht den signifikanten und reversiblen Anstieg von DA unter STN-HFS (max. 130; 12 +/- 7,13), verglichen zum Basalspiegel (DA basal = 37,47 ± 3,17 fmol/20µl; MW +/- SD; t = 0-60 Minuten) und den nicht-stimulierten Kontrollen (t = 20-60 Minuten). Baseline-Werte (DA: F(11,119) = 10,06, p < 0,05, t = 0-40 min, n=12.
Abb. 8: Extrazelluläre Konzentration von Dopamin des NAc Shell vor, während und nach HFS sowie Kontrolluntersuchungen. Die Werte sind als Mittelwerte und Standardfehler aufgetragen. Der Stern (*) bzw. der Paragraph (§) markieren die signifikante Differenz gegenüber den Basiswerten bzw. den Kontrollen. § p < 0,05 versus Baseline, * p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe (post hoc Student-Newman-Keuls). Die HFS Stimulation erfolgte zwischen 0 und 20 Minuten. Sammelzeit und Probe waren methodisch bedingt 10 Minuten voneinander getrennt.
Zeit (t min) E xtr az ellul äres DA (% d er B asi slin ie ) -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 60 80 100 120 140 160 130 Hz (n=12) controls (n=4) * §* §*
Den zeitlichen Verlauf der DOPAC-Konzentration (vor, während, nach HFS) im NAc shell dokumentiert Abb. 9. Analog zur Modulation des DA-Spiegels wurden signifikante und reversible Unterschiede der DOPAC-Konzentration zwischen Simulation (max: 129,81 +/- 5,16) und Scheinstimulation gemessen. Die Differenzen ergaben sich dabei in Bezug auf das basale Niveau mit DOPAC = 12,75 ± 1,08 pmol/20µl (MW +/- SD; t = 0-80 Minuten) sowie auf die unstimulierten Kontrollen (t = 0-120 Minuten). Basiswerte (DOPAC: F(6,69) = 1,26, p > 0.05, n = 7.
Abb. 9: Extrazelluläre Konzentration von DOPAC des NAc Shell vor, während und nach HFS sowie Kontrolluntersuchungen. Die Werte sind als Mittelwerte und Standardfehler aufgetragen. Der Stern (*) bzw. der Paragraph (§) markieren die signifikante Differenz gegenüber den Basiswerten bzw. den Kontrollen. § p < 0,05 versus Baseline, * p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe (post hoc Student-Newman-Keuls). Die HFS Stimulation erfolgte zwischen 0 und 20 Minuten. Sammelzeit und Probe waren methodisch bedingt 10 Minuten voneinander getrennt. Auch die Konzentration des Metaboliten HVA im NAc shell war signifikant und reversibel angestiegen (max: 126,99 +/- 4,14), und zwar sowohl gegenüber dem basalen HVA-Spiegel (6,63 ± 0,40 pmol/20µl; MW +/- SD; t = 0-100 Minuten) sowie gegenüber den unstimulierten Kontrollen (t = 0-120 Minuten; siehe Abb. 10 und Tab. 1). Basiswert HVA: F(6,69) = 7,62, p < 0,05, n = 7. §* §* -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 60 80 100 120 140 160 130 Hz (n=12) controls (n=6) §* §* * * E xtr az ellul äres DO PA C (% d er B asi slin ie ) Zeit (t min) §* §*
Zeit (t min)
Abb. 10: Extrazelluläre Konzentration von HVA des NAc Shell vor, während und nach HFS sowie Kontrolluntersuchungen. Die Werte sind als Mittelwerte und Standardfehler aufgetragen. Der Stern (*) bzw. der Paragraph (§) markieren die signifikante Differenz gegenüber den Basiswerten bzw. den Kontrollen. § p < 0,05 versus Baseline, * p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe (post hoc Student-Newman-Keuls). Die HFS Stimulation erfolgte zwischen 0 und 20 Minuten. Sammelzeit und Probe waren methodisch bedingt 10 Minuten voneinander getrennt.
-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 60 80 100 120 140 160 130 Hz (n=12) controls (n=6) E xtr az ellul äres H V A (% d er B asi slin ie ) §* §* §* §* §* *
Insgesamt waren die Basalwerte sämtlicher Parameter (DA, DOPAC und HVA) im NAc shell signifikant gegenüber dem Nac core erhöht (t-Test; p < 0,05) (Abb. 5 bis 10, Tab. 1). Bei den nicht stimulierten Kontrolltieren blieben die Konzentrationen von DA, DOPAC und HVA im NAc Shell stabil, die Konzentrationen sanken nicht signifikant unter die Basiswerte (DA: F(4,49) = 3,45, p < 0.05, n = 5; DOPAC: F(6,69) = 1,26, p > 0.05, n = 7; HVA: F(6,69) = 7,62, p < 0,05, n = 7 (Abbildung 6 und Tab. 1).
4.4 Experimenteller Ansatz 2: Effekte der STN-HFS auf die GABAerge Transmission im VTA
Die Studienpopulation bestand aus Ratten, 8 mit HFS behandelte Tiere versus 8 unbehandelte Kontrollen.
Anhand des Two-Way-Anova-Test mit wiederholten Messungen errechnete sich eine signifikante Differenz des extrazellulären GABA-Gehalts im VTA und zwar sowohl in Bezug auf die verschiedenen Stimulationen hinweg (F(1,84) = 52,68; p < 0,001), als auch in Abhängigkeit von der Zeit (F(6,84) = 11,4; p < 0,001). Zudem wurde eine signifikante Interaktion zwischen den Faktoren Stimulation/Schein-Stimulation und Zeit festgestellt (F(6,84) = 3,4; p < 0,005). Wie in Abbildung 11 dargestellt, senkte STN-HFS das extrazelluläre Niveau von GABA in der VTA signifikant im Vergleich zu den Basiswerten und zur Kontrollgruppe ohne Stimulation (t = 0-120; p < 0,05). Die Basislinien-Konzentrationen von GABA im VTA betrugen 4,35 ± 0,38 pmol/20 µl.
Auffällig war, dass die Basiswerte von stimulierten Tieren und Kontrollgruppe nicht stabil waren (ANOVA, HFS: F(3,39) = 15,04; p < 0,05); Kontrollgruppe: (F(3,39) = 11,825; p < 0,05)). Der erste Stimulationswert wich signifikant vom Mittelwert der Baseline sowie vom letzten Baseline-Wert ab. Dieser Befund legt nahe, dass die Abnahme von GABA infolge der HFS nicht die Fortsetzung eines Trends widerspiegelt, der während der Baseline-Probenentnahmen entstanden ist, sondern vielmehr als unabhängiges Ergebnis aufzufassen ist.
Abb. 11: Neurotransmission im ventralen tegmentalen Areal. Extrazelluläres GABA im VTA vor, während und nach STN-HFS. Baseline-Konzentrationen des VTA: 4,35 ± 0,38 pmol GABA/ µl. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben; p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe. Ausgefülltes Rechteck: Dauer der HFS, ausgefüllter Kreis: HFS des STN, umrandeter Kreis: Kontrollgruppe. §: p < 0,05 versus Basislinie, *: p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe.
Zeit (t min) E xtr az ellul äres GA B A ( % d er B asi slin ie )
4.5 Experimenteller Ansatz 3: Einfluss der SNc und der VTA auf die dopaminerge Transmission nach STN-HFS im NAc
Um die Beteiligung der SNc und der VTA in der Vermittlung potentieller Effekte der STN-HFS auf die dopaminerge Neurotransmission im NAc zu untersuchen, wurden 21 Ratten in drei Untergruppen unterteilt (siehe Material und Methoden, Kapitel 2.2). Die Unterteilung erfolgte abhängig von der Vorbehandlung, die zwei Wochen vor dem Mikrodialyse-Sampling und der HFS durchgeführt wurde: Läsion der SNc (Subgruppe 1; n = 8) versus 6-OHDA-Läsion des VTA (Subgruppe 2; n = 8) versus keine 6-OHDA-Läsion (Subgrupe 3; n = 5). Die Messproben wurden parallel im NAc core und NAc shell entnommen.
4.5.1 Immunhistochemie:
Die SNc-Läsion verursachte eine 88,66 +/- 9,97 %ige Reduktion TH positiver nigraler Zellen im Vergleich mit der kontralateralen Kontrollseite (p < 0,05, Abb. 12 A+B). Die Läsion der VTA resultierte in einer 81,98 +/- 8,10 % Reduktion der TH positiven VTA Zellen, verglichen mit der kontralateralen Kontrollseite (p < 0,05, Abb. 12 C+D).
In die Auswertung wurden nur die Tiere (n=16) einbezogen, bei denen die Läsion der SNc bzw. der VTA zu einem Zelluntergang von nicht mehr als 15 respektive 30 % der TH ausschüttenden Neurone der angrenzenden VTA oder SNc bzw. im Vergleich zur intakten Seite führte (Abb. 12 B+D).
Abb. 12: Histologische Verifikation der Läsionsstelle: Mikroaufnahmen der Cresyl-Violett-gefärbten SNc (A + C) und VTA (B + D). A + B: Exemplarische Mikroaufnahme einer Ratte mit selektiver Läsion der SNc (A) mit intakter linker VTA (B). B + D: Exemplarische Mikroaufnahmen einer Ratte mit selektiver Läsion in der VTA (D) mit intaktem linken SNc (C). Die Pfeile markieren die Grenzen der intakten (ausgefüllte Pfeile) und lädierten (umrandete Pfeile) neuronalen Bereiche. Maßstabsbalken entspricht 100 µm.
4.5.2 Mikrodialyse:
Die Baseline-Konzentrationen der nicht lädierten Kontrolltiere betrugen 21,58 +/- 1,82 pmol DOPAC/20 l und 11,17 +/- 0,48 pmol HVA/20 l (n = 5). Bei den VTA-vorgeschädigten Tieren lagen die Basiswert-Konzentrationen von DA und der dopaminergen Metabolite unterhalb der Nachweisgrenze von 10 fmol/20 l Dialysat (n = 8). Entsprechend konnte hier eine statistische Analyse nicht durchgeführt werden. Die Basislinienkonzentrationen von SNc-vorgeschädigten Tieren betrug 7,39 +/- 1,21 pmol DOPAC/20 l, pmol und 4,89 +/- 0,53 HVA/20 l (n = 8). Diese Konzentrationen waren signifikant niedriger als die der Vergleichsgruppe der Kontrolltiere (p < 0.05). (Abb. 13).
Bezüglich der Kontrolltiere und der SNc-vorgeschädigten Tiere belegte der Two-Way-Anova-Test mit wiederholten Messungen lediglich eine signifikante Differenz über die Zeit für sowohl DOPAC, als auch HVA (siehe Tabelle in Abb. 13).
In der Gruppe der nicht vorgeschädigten Tiere führte die STN-HFS zu einem signifikanten und reversiblen Anstieg der extrazellulären Konzentrationen von DOPAC (max. 124,67 +/- 6,81) und HVA (max. 135,96 +/- 8,85) im Vergleich zu den Basiswerten (DOPAC: F(4,49) = 4,91, p < 0,05, t = 0-40 min, n = 5; HVA: F(4,49) = 5,93, p < 0,05, t = 0-100 min, n = 5; Abb. 13 A+B). Bei den VTA-vorgeschädigten Tieren ließ sich durch STN-HFS keine Veränderung des dopaminergen Metabolismus bei Vergleich mit Basiswerten nachweisen (n = 8; Abb. 13 A+B). Bei den SNc-vorgeschädigten Tieren erhöhte die STN-HFS signifikant und reversibel die extrazellulären Werte von DOPAC (max. 129,85 +/- 12,28) und HVA (max. 118,67 +/- 7,5) verglichen zu den Baselinewerten (DOPAC: F(7,79) = 2,79, p< 0.05; t = 0-40 min, n = 8; HVA: F(7,79) = 10,68; p < 0,05, t = 0–40, n = 8; Abb. 13 A, B). Allerdings waren die Effekte auf die HVA weniger ausgeprägt, als in den Kontrolltieren (DOPAC: t = 0-80 Minuten; HVA: t = 20-40 Minuten; Abb. 13 A+B).
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Abb. 13: Neurotransmission im NAc von Ratten, die im SNC prälädiert wurden: Extrazelluläres DOPAC (A) und HVA (B) des NAc vor, während und nach STN-HFS der Kontrollgruppe und bei SNc-lädierten Ratten. Basiswert-Konzentrationen der nichtlädierten Kontrollgruppe: 21,58 ± 1,82 pmol DOPAC/ µl und 11,17 ± 0,48 pmol HVA/ µl. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angegeben. §: Signifikanter Unterschied im Vergleich zur Baseline (p < 0,05). *: Signifikanter Unterschied zwischen lädierten Tieren und Kontrollgruppe der TH-stimulierten Ratten (p < 0,05). Der Totraum in den Mikroanalyse-Röhrchen verursachte eine Zeitverzögerung von 10 Min. vor der Analyse. Ausgefülltes Rechteck: Dauer der STN-HFS, ausgefüllter Kreis: SNc-Läsion, umrandeter Diamant: Kontrollgruppe. Die Tabelle unterhalb der Abbildung stellt die Zwei-Wege-Varianzanalyse zur Bestimmung des Effekts der Substantia-nigra-Pars-compacta-Läsion und der Zeit auf die hochfrequenz-abhängige Transmission von Dopamin-Metaboliten des subthalamischen Nukleus im NAc dar.
Dies oben beschriebenen Effekte trafen selektiv auf die STN-Stimulation mit hoher Frequenz (130 Hz) zu. In zusätzlichen Experimenten mit niedrig frequenter Stimulation (5 Hz) des STN konnten die beobachteten Effekte auf die dopaminerge Neurotransmission im NAc nicht nachgewiesen werden (Abbildung 14, 15 und 16).
Zeit (t min) Zeit (t min)
E xtr az ellul äres DO PA C (% d er B asi slin ie
Abb. 14 Abb. 15 time [min] -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 extra cellu lar DA ( % o f b ase li ne) 0 60 80 100 120 140 160 5 Hz controls time [min] -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 0 60 80 100 120 140 160 5 Hz controls Zeit (t min) E xtr az ellul äres Dopamin (% d er B asi slin ie ) Zeit (t min) E xtr az ellul äres DO PA C (% d er B asi slin ie )
Abb. 16
Abb.: 14 - 16: Neurotransmission im Nucleus accumbens core und shell. Extrazelluläres Dopamin (DA; Abb. 14), 3,4-dihydroxyphenyl-acetic acid (DOPAC; Abb. 15) und Homovanillinsäure (HVA; Abb. 16) vor, während und nach niedrig frequenter Stimulation (5 Hz) des STN. Baseline-Konzentrationen im NAc core und shell simultan: 15.2+/-0.6 fmol DA/20 l, 17.2+/-0.6 pmol DOPAC/20 l, and 10.6+/-0.02 pmol HVA/20 l. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben; p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe. Ausgefülltes Rechteck: Dauer der HFS, ausgefüllter Kreis: HFS des STN, umrandeter Kreis: Kontrollgruppe. §: p < 0,05 versus Basislinie, *: p < 0,05 versus nicht stimulierte Kontrollgruppe. time [min] -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 e x tr a c e llula r H VA (% of ba s e line ) 0 60 80 100 120 140 160 5 Hz controls Zeit (t min) E xtr az ellul äres H V A (% d er B asi slin ie )
5. Diskussion
Die vorliegende Arbeit basiert auf dem Postulat, dass die HFS des STN nicht motorische Funktionen über eine veränderte Neurotransmission im limbischen System beeinflusst.
Die am Tiermodell erarbeiteten Ergebnisse deuten in der Tat darauf hin, dass STN-HFS die dopaminerge Neurotransmission in limbischen Bereichen, die funktional mit dem STN verbunden sind, moduliert.
Die Verbindungen des STN innerhalb der limbischen Basalganglien-thalamocortikalen Regelkreise und die Ähnlichkeit zwischen durch Läsionen eines Hirnareals und STN-HFS-induzierten psychiatrischen Effekten sowohl in Menschen als auch in Ratten (Trillet et al. 1995; Absher et al. 2000; Stefurak et al. 2003; Hilker et al. 2004; Mandat et al. 2006; Temel et al. 2006; Trost et al. 2006) legen nahe, dass die in der vorliegenden Studie unter HFS auftretenden Veränderungen im Dopaminhaushalt zumindest partiell für die unter HFS auftretenden psychiatrischen Nebenwirkungen beim Patienten verantwortlich sein könnten.
So führte eine selektive Läsion dopaminerger Neurone der SNc sowie der VTA zu erlernt hilflosem Verhalten als Parameter für depressives Verhalten im 6-OHDA-Tiermodell für Morbus Parkinson (Shababi-Klein 2013) Der Schweregrad korrelierte dabei mit der Größe der Läsion. Ähnlich waren in einer anderen Studie Parkinson-assoziierte depressive Symptome mit einem defizitären Dopaminsystem assoziiert (Raskin et al. 2010; Leentjens 2011).
Der unter HFS im vorliegenden Modell beobachtete Anstieg der DA-Konzentration im NAc Shell mag zunächst dem Postulat einer HFS bedingten Depression widersprechen. Zu berücksichtigen ist jedoch, dass unter HFS die Dopamindosis beim Patienten reduziert werden kann (Abbruzzese et al. 2012), sodass hier möglicherweise der Auslöser für die Induktion depressiver Episoden gegeben ist. Zu erwarten wären jedoch in diesem Falle das Auftreten depressiver Phasen zeitlich kurz nach Beginn der HFS-Behandlung, das heißt, während der Adaptationsphase an die niedrigere L-Dopa Dosis.
Im Rahmen der Prozession motorischer, limbischer sowie assoziativer Informationen repräsentiert der STN im Basalganglien-Netzwerk ein zentrales Modulations- und Steuerungselement „Driving Force“ der Basalganglien (Benazzouz et al. 2000). In diesem Netzwerk scheinen veränderte Dopaminspiegel sowohl spezifische Symptome zu induzieren, als auch abzumildern. Der Beziehung zum limbischen System muss hierbei besondere Beachtung
