Structure and function of the wild-type transmembrane oxidoreductase DsbB and the arylsulfate sulfotransferase from uropathogenic Escherichia coli

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Structure and function of the wild-type transmembrane

oxidoreductase DsbB and the

arylsulfate sulfotransferase from uropathogenic Escherichia coli

Doctoral Thesis Author(s):

Malojčić, Goran Publication date:

2008

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https://doi.org/10.3929/ethz-a-005561160 Rights / license:

In Copyright - Non-Commercial Use Permitted

Structure and function of the wild-type transmembrane oxidoreductase DsbB and the arylsulfate sulfotransferase from

uropathogenic Escherichia coli

A dissertation submitted to the

ETH Zurich

for the degree of

Doctor of

Seiences

presented by

Goran Malojcic

Dipl. Chem., University of Zagreb, Croatia born January 21, 1981

citizen of Croatia

accepted on the recommendation of Prof. Rudi Glockshuber, examiner

Prof. Nenad Ban, co-examiner Prof. Rauke Hennecke, co-examiner

2008

Chapter I

1.

1. Summary

Summary

Disulfide bond formation is a critical step in folding of extracytoplasmic proteins, and proteins that fail to form disulfide bonds correctly are rapidly degraded in cells. In bacteria, disulfide bonds are introduced by the proteins DsbA and DsbB. DsbA is a soluble periplasmic protein capable of binding nascent polypeptides and introducing disulfide bonds, whereupon it becomes reduced. It is reoxidized by membrane-bound quinones,viathe transmembrane catalyst DsbB. Here, the crystal structure of the wild- type DsbB in complex with DsbA and ubiquinone Q8 is reported. This structure, which represents a kinetically trapped reaction intermediate of DsbB, contains a charge-transfer complex between the Cys44 of DsbB and ubiquinone Q8 in its active site, and provides strong experimental evidence for the mechanism of DsbB in de novo protein disulfide bond generation.

Sulfotransferases are a versatile class of enzymes involved in a number of important physiological processes.In mammals, sulfation is involved in hepatic detoxification and extracellular signaling. A number of small molecules including hormones, sugars, and antibiotics were shown to undergo 3'.-phosphate 5'-phosphosulfate (PAPS) dependent sulfation. Very little is known about bacterial sulfotransferases. In bacteria, sulfated molecules are common mediators of cell-cell interactions, and are involved in host- pathogen interactions. In contrast to PAPS-dependent sulfotransferases, bacterial arylsulfate sulfotransferases transfer sulfate groups exclusively among aromatic compounds. Here, the crystal structure of the arylsulfate sulfotransferase (ASST) from the periplasm of the prototypic pyelonephritogenic uropathogenic Escherichia coli CFT073 is reported at 2.0 Aresolution. The structure of this enzyme, present specifically in pathogenic E. coli strains and upregulated in the uropathogenic habitat, differs fundamentally from those of all other structurally characterized sulfotransferases. Each subunit of the ASST homodimer, one of the largest enzymes in the periplasm, contains a 6-bladed ß-propeller domain fused with aß-sandwich domain. The active site is situated at the center of the funne1 in the beta propeller domain, and defined by His252, His356, Arg374, and His436 side chains, which presumably stabilize the negative1y charged

transition state. The results presented here provide a framework for understanding structure-function relationships of bacterial arylsulfate sulfotransferases, allow the comparison of these to PAPS-dependent sulfotransferases and form a basis for rational drug design targeting this bacterial protein.

Chapter I

1.2. Zusammenfassung

Summary

Die Bildung von Disulfidbrücken ist ein entscheidender Schritt bei der Faltung von vielen extra-zytoplasmatischen Proteinen. Falls inkorrekte Disulfidbrücken in einem Protein vorhanden sind, führt dies zu dessen schnellem Abbau durch die Zelle. In Bakterien werden Disulfidbrücken durch die Proteine DsbA und DsbB eingeführt. DsbA ist ein lösliches, periplasmatisches Protein, das an entstehende Polypeptidketten binden kann und dabei Disulfidbrücken einführt. In diesem Prozess wird DsbA selbst reduziert und anschliessend von membrangebundenen Chinonen reoxidiert. Diese Reaktion wird durch das membranständige Protein DsbB katalysiert. In dieser Arbeit wird die Herstellung, Kristallisation und die Kristallstruktur von Wildtyp-DsbB im Komplex mit DsbA und Ubichinon-Q8 beschrieben. Dieser Komplex stellt ein kinetisch gefangenes Reaktionszwischenprodukt dar. Er enthält einen "Charge-Transfer"-Komplex zwischen Cys44 und Ubichinon-Q8 im katalytischen Zentrum von DsbB. Dieses Zwischenprodukt stellt einen stichhaltigen Beweis für den Mechanismus von DsbB bei der de novo Generierung von Schwefelbrücken in Proteinen dar.

Sulfotransferasen bilden eine heterogene Enzymklasse und sind in viele wichtige physiologische Prozesse involviert. In der Leber von Säuglingen ist die Sulfatierung sowohl bei der Detoxifizierung, als auch für die extrazelluläre Signalweiterleitung entscheidend. Eine Vielzahl von kleinen Molekülen wie Hormone, Zucker und Antibiotika werden mittels 3'-Phosphat 5'-Phosphosulfat (PAPS) sulfatiert. Über die bakteriellen Sulfotransferasen ist dagegen wenig bekannt. In Bakterien sind sulfatierte Moleküle die üblichen Vermittler für Zell-Zell-Wechselwirkungen und in die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Pathogen involviert. Im Gegensatz zu PAPS- abhängigen Sulfotransferasen transferieren bakterielle Arylsulfat-Sulfotransferasen Sulfatgruppen ausschliesslich zwischen aromatischen Molekülen. Hier wird die Kristallstruktur der Arylsulfat-Sulfotransferase (ASST) aus dem Periplasma von uropathogenen E. coli CFT073 bei 2.0

A

Auflösung beschrieben. Dieses Enzym ist einerseits spezifisch für uropathogene E. coli Stämme und andererseits im uropathogenen Habitat hoch reguliert. Seine Struktur unterscheidet sich fundamental von den anderen

strukturell charakterisierten Sulfotransferasen. Das ASST-Dimer ist eines der grössten Enzyme im Periplasma. Jede Untereinheit enthält eine 6-Strängige-beta-Propeller- Domäne, die mit einer beta-Sandwich-Domäne fusioniert ist. Das katalytische Zentrum befindet sich im Zentrum des Trichters in der beta-Propeller Domäne. Es wird von den Aminosäureresten His252, His356, Arg374, und His436-Seitenketten gebildet, die vermutlich den negativ geladenen Übergangzustand stabilisieren. Die hier präsentierten Ergebnisse stellen einen wichtigen Beitrag für das Verständnis der Beziehung zwischen Struktur und Funktion der Arylsulfat-Sulfotransferasen dar. Sie ermöglichen einen Vergleich mit den PAPS-abhängigen Sulfotransferasen und bilden eine Grundlage für das rationelle Wirkstoffdesign gegen dieses bakterielle Protein.