Etablierung von Laktat- und Pyruvatmessung im Plasma und Liquor cerebrospinalis zur Diagnostik von mitochondrialen Erkrankungen beim Hund
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med.vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Vanessa Löbert
aus Lünen
Hannover 2003
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Andrea Tipold 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. Heinz Nau
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2003
Meiner Mutter und meinem Großvater
1 Einleitung ... 9
2 Literaturübersicht ... 11
2.1 Mitochondrien ... 11
2.1.1 Morphologie ... 11
2.1.2 Aufgabe... 12
2.2 Mitochondriopathien – beim Menschen ... 13
2.2.1 Mitochondriale Myopathien/ Enzephalopathien... 13
2.2.1.1 Biochemische Defekte der Mitochondrien... 14
2.2.1.2 Klinische Erscheinungen ... 17
2.3 Mitochondriopathien – beim Tier ... 19
2.3.1 Fallberichte ... 19
2.4 Diagnostik von Mitochondriopathien ... 24
2.4.1 Diagnose beim Menschen ... 24
2.4.1.1 Liquor cerebrospinalis ... 26
2.4.2 Diagnose beim Tier... 28
2.5 Messung von Pyruvat und Laktat ... 29
2.5.1 Pyruvat... 29
2.5.1.1 Bildung... 29
2.5.1.2 Verwertung ... 31
2.5.1.3 Messmethoden ... 32
2.5.2 Laktat ... 33
2.5.2.1 Bildung... 33
2.5.2.2 Verwertung ... 34
2.5.2.3 Laktatazidose ... 34
2.5.2.4 Messmethoden ... 35
2.5.3 Beeinflussungsfaktoren der Messergebnisse... 36
2.5.3.1 Einfluss der Blutstauungszeit auf die Messwerte... 36
2.5.3.2 Einfluss der Tiefgefrierung auf die Messwerte ... 36
2.6 Ziel dieser Studie ... 37
3 Material und Methode... 38
3.1 Geräte und Materialien ... 38
3.2 Reagenzien ... 39
3.3 Untersuchungsmethoden... 39
3.3.1 Gewinnung der Blutproben ... 39
3.3.2 Gewinnung des Liquor cerebrospinalis ... 40
3.3.3 Pyruvatbestimmung ... 40
3.3.3.1Pyruvatmessung mit Hilfe eines Testkits der Firma Roche-Diagnostics (Hersteller 1) 40
3.3.3.2 Pyruvatmessung mit Hilfe des Testkits der Firma Sigma (Hersteller 2)... 41
3.3.4 Laktatmessung... 42
3.3.5 Zellzählung im Liquor cerebrospinalis und Zelldifferenzierung ... 42
3.3.6 Blutzucker ... 43
3.3.7 Blutleukozyten... 43
3.3.8 Blutgase ... 43
3.3.9 Biometrische Daten ... 43
3.4 Vorversuche ... 43
3.4.1 Einfluss der Venenstauung bei der Blutentnahme ... 44
3.4.2 Zeitpunkt der Enteiweißung ... 44
3.4.3 Tiefgefrierung... 44
3.5.1 Probanden mit verschiedenen Erkrankungen des ZNS ... 46
3.5.2 Neurologisch gesunde Kontrollgruppe ... 47
3.5.3 Hunde mit anstrengungsabhängiger Schwäche... 48
3.5.4 Statistische Auswertungsverfahren ... 49
4 Ergebnisse ... 50
4.1 Vorversuche ... 50
4.1.1 Pyruvatmessung mit Hilfe eines Testkits des Herstellers 1... 50
4.1.2 Einfluss der Venenstauung bei der Blutentnahme ... 51
4.1.2.1 Pyruvat... 51
4.1.2.2 Laktat ... 52
4.1.2.3 Verhältnis von Pyruvat zu Laktat... 53
4.1.3 Zeitpunkt der Enteiweißung ... 54
4.1.3.1 Pyruvat... 54
4.1.4 Tiefgefrierung... 55
4.1.4.1 Pyruvat... 55
4.1.4.2 Laktat ... 56
4.1.5 Reproduzierbarkeit ... 57
4.1.6 Belastungstest ... 57
4.2 Probanden mit verschiedenen Erkrankungen des ZNS ... 58
4.2.1 Pyruvat... 58
4.2.2 Laktat ... 59
4.2.3 Verhältnis von Pyruvat zu Laktat ... 60
4.2.4 Weitere Untersuchungen bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen des ZNS... 61
4.2.4.1 Blut – Glukose ... 61
4.2.4.2 Blut – Leukozyten ... 61
4.2.4.3 Blut – HCO3... 61
4.2.4.4 Blut – pH ... 61
4.2.4.5 Blut – Basenüberschuss (BE)... 62
4.2.4.6 CSF – Glukose ... 62
4.2.4.7 CSF – Zellzahl ... 62
4.2.5 Korrelationsanalyse ... 63
4.3 Probanden mit verschiedenen Erkrankungen des ZNS eingeteilt in Erkrankungsgruppen ... 65
4.3.1 Pyruvat... 65
4.3.2 Laktat ... 66
4.3.3 Verhältnis von Pyruvat zu Laktat der einzelnen Erkankungsgruppen ... 67
4.4 Probanden mit verschiedenen Erkrankungen des ZNS - eingeteilt in Altersgruppen ... 68
4.4.1 Pyruvat... 69
4.4.2 Laktat ... 69
4.4.3 Verhältnis von Pyruvat zu Laktat ... 70
4.5 Probanden mit verschiedenen Erkrankungen des ZNS - eingeteilt in drei Gewichtsklassen... 71
4.5.1 Pyruvat... 72
4.5.2 Laktat ... 73
4.5.3 Verhältnis von Pyruvat zu Laktat ... 73
4.6 Neurologisch gesunde Kontrollgruppe... 74
4.6.1 Pyruvat... 74
4.6.2 Laktat ... 76
4.6.3 Verhältnis von Pyruvat zu Laktat der neurologisch gesunden Kontrollgruppe... 78
4.6.4 Weitere Untersuchungen ... 79
4.6.5 Korrelationsanalyse ... 80
4.7 Probanden mit anstrengungsabhängiger Schwäche ... 81
4.7.1 Pyruvat... 81
4.7.2 Laktat ... 82
4.7.3 Weitere Untersuchungen ... 83
5 Diskussion ... 84
5.1 Methode der Substratbestimmung... 84
5.2 Resultate der Messungen... 88
6 Zusammenfassung ... 96
7 Literaturverzeichnis...101
8 Tabellarischer Anhang ...114
Abb. Abbildung
ACT Acyl-Carnitin-Transferase ADP Adenosin-diphosphat
ALT Alanin-Aminotransferase ATP Adenosin-triphosphat Azetyl CoA Azetyl-Coenzym-A BE Base Excess bzw beziehungsweise ca circa
CSF Cerebrospinalflüssigkeit ºC GradCelsius
Co No Control Number
DNS Desoxyribonukleinsäure EEG Elektroenzephalogramm EMG Elektromyogramm
HCO3 Hydrogencarbonat
HPLC High Performance Liquid Chromatography Fa. Firma
kg Kilogram
KSS Kearns-Syre-Syndrome LDH Laktatdehydrogenase max Maximalwert
MELAS Mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis
and strokelike episodes
MERRF Myoclonus epilepsy with ragged-red-fibres min Minuten
min Minimalwert ml Milliliter
mmol/l Millimol pro Liter
NAD Nicotinamidadenindinukleotid NADH Nicotinadenindinukleotidhydrogen nm Nanometer
p P-Wert (Signifikanz) Pat Patienten
PDH Pyruvatdehydrogenase
SNE Subakute nekrotisierende Enzephalopathie STD Standardabweichung
Tab. Tabelle
µl Mikroliter
x Mittelwert
z.B. zum Beispiel
ZNS zentrales Nervensystem
∆E Delta Extinktion
1 Einleitung
Mitochondriale Funktionsstörungen haben sich in den vergangenen Jahren als eine der Hauptursachen neurodegenerativer und neurometabolischer Erkrankungen beim Menschen herausgestellt. Sie umfassen Störungen der Fettsäureoxidation, des Zitratzyklus und der oxidativen Phosphorylierung. Insbesondere Defekte der Atmungskette und damit der Hauptenergiequelle der Eukaryonten sind die häufigsten biochemischen Störungen des mitochondrialen Metabolismus (DI MAURO et al.
1985). Beim Hund sind ebenfalls bereits Mitochondriopathien beschrieben worden (WENTINK et al. 1974; HOULTON et al.1980; BREITSCHWERDT et al. 1992; OLBY et al. 1997; BRENNER et al. 1997; u.a.)
Mitochondrien besitzen ein eigenes Genom, das neben dem nukleären Genom einen Teil ihrer Proteine kodiert. Punktmutationen und Deletionen der mitochondrialen Desoxyribonukleinsäure (mtDNS) werden maternal vererbt, können aber aufgrund der hohen Mutationsfrequenz der mtDNS häufig auch spontan auftreten. Daneben sind autosomal dominante bzw. rezessiv vererbte mitochondriale Erkrankungen bekannt, die auf Mutationen der nukleären DNS beruhen.
Aufgrund der unterschiedlichen Gendefekte, die einer mitochondrialen Erkrankung zugrunde liegen können, ist die klinische Manifestation sehr vielfältig. Betroffen sind initial vorwiegend Organe mit hohem Energiebedarf wie z.B. Gehirn und Muskulatur.
Die zufällige Verteilung normaler und mutierter DNS (mitotische Segregation) in verschiedenen Organen führt zu der variablen Ausprägung der Symptome.
Eine Laktatazidose ist ein häufig anzutreffender Befund bei Mitochondriopathien.
Diese resultiert aus einem gestörtem Sauerstoffmetabolismus einhergehend mit erhöhtem Verbrauch von Pyruvat im Krebszyklus (DI MAURO et al. 1985). Bei Patienten mit mitochondrialer Enzephalopathie kann es zu einer Erhöhung der Laktatkonzentration im Liquor cerebrospinalis kommen (MORGAN-HUGHES et al.
1994; SHAPIRA et al. 1994).
In der Kleintierpraxis werden häufig Hunde mit anstrengungsabhängiger Schwäche vorgestellt. Die Liste der Differentialdiagnosen ist bei diesem Symptom vielfältig. Eine mögliche Diagnose wäre eine Myopathie ausgelöst durch eine Störung der
Mitochondrien. Zusätzlich werden bei einigen Hunderassen, wie beim Husky (WAKSHLAG et al. 1999), Yorkshire Terrier (MATIASEK et al. 2002), Jack Russel Terrier (GRUBER et al. 2002) und Australian Cattle dog (BRENNER et al. 1997) Enzephalopathien, die mit Nekrosen oder Verkalkungen einhergehen und ebenfalls auf einer Störung der Mitochondrien beruhen, beschrieben. Beide Erkrankungsgruppen können nur histologisch bestätigt werden. Dies ist bei Myopathien relativ einfach mit Hilfe einer Muskelbiopsie, bei Enzephalopathien jedoch nur schwierig möglich. Bildgebende Verfahren wie Computertomographie oder Magnetresonanztomographie (MRT) haben die in vivo- Diagnostik deutlich verbessert. Labordiagnostisch könnten veränderte Laktat- und Pyruvatwerte hilfreich bei der Abklärung sein. Bisher liegen jedoch für Laktat im Liquor cerebrospinalis und für Pyruvat sowohl im Blut als auch im Liquor cerebrospinalis keine Referenzwerte für den Hund vor.
Im Rahmen dieser Studie sollten Referenzwerte für Pyruvat, Laktat und das Pyruvat/Laktat-Verhältnis im Blut erhoben werden. Bei Hunden mit definierten Erkrankungen des zentralen Nervensystems sollten diese Werte vergleichend auch im Liquor cerebrospinalis gemessen werden, um die Spezifität einer Veränderung der genannten Messwerte zur Diagnosestellung einer Mitochondriopathie erheben zu können. Zusätzlich sollte festgestellt werden, ob die Methode der Pyruvatmessung im Blut und im Liquor cerebrospinalis beim Hund in der Routinediagnostik anwendbar ist.
2 Literaturübersicht
2.1 Mitochondrien
Eine gebräuchliche Beschreibung für Mitochondrien lautet „Kraftwerke der Zelle“, da bestimmte Substanzen oxidiert werden und dadurch verwertbare Energie zur Verfügung gestellt wird. Eine vererbbare Schädigung der mitochondrialen Desoxyribonukleinsäure (mtDNS) oder Schädigungen derselben durch hochreaktive Sauerstoffverbindungen führt zu Informationsverlusten und zu einer Herabsetzung der Leistungsfähigkeit der Mitochondrien. Durch eine verminderte Energiebereitstellung der Zelle kann es zu unterschiedlichen Krankheitssymptomen kommen (STRYER et al. 1975).
2.1.1 Morphologie
Mitochondrien sind ovale Organellen mit einer Größe von etwa 2 µm und einem Durchmesser von ca. 0,5 µm (STRYER et al. 1975) und enthalten die Komplexe der Atmungskette, die Enzyme des Zitratzyklus und die der Fettsäureoxidation (LEHNINGER 1998). PALADE und SJÖSTRAND untersuchten Mitochondrien erstmals elektronenmikroskopisch und fanden heraus, dass sie aus einer äußeren glatten und einer inneren stark gefältelten Membran bestehen (STRYER et al. 1975).
Die Einstülpungen der inneren Membran werden Christae genannt. Durch diese Membranen werden die Mitochondrien in zwei Kompartimente geteilt, den Intermembranraum und die Matrix, welche von der inneren Membran begrenzt wird.
Die äußere Membran enthält viele Kanäle und ist für die meisten Moleküle und Ionen vollständig permeabel. Die innere Membran ist für fast alle Ionen und polaren Moleküle undurchlässig. Spezifische Trägerproteine übernehmen den Transport von z.B. Adenosin-diphosphat (ADP) und langkettigen Fettsäuren durch die innere Mitochondrienmembran. Ein Teil der Proteine der Mitochondrien wird nach einem genetischen "Rezept" hergestellt, das sich im Matrixraum der Mitochondrien selbst
befindet. Die den Mitochondrien eigenen DNS-Moleküle haben die Informationen für ca. 20 mitochondriale Proteine gespeichert. Dies entspricht in etwa 5% der gesamten Syntheseleistung, die für die Aufrechterhaltung des Stoffwechsels der Mitochondrien nötig ist. Alle durch mitochondriale DNS kodierten Proteine werden auch in den Mitochondrien hergestellt, während der überwiegende Teil der sich in den Mitochondrien befindlichen Proteine (95%) im Zellkern kodiert ist, im Zytoplasma transliert wird und dann über Membranproteine in die Mitochondrien aufgenommen wird (STRYER et al. 1975).
2.1.2 Aufgabe
Die Mitochondrienmatrix enthält den Pyruvat-Dehydrogenasekomplex, die Enzyme des Zitronensäurezyklus, die Enzyme für die β-Oxidation von Fettsäuren, sowie die Enzyme für die Oxidation von Aminosäuren (STRYER et al. 1975). Alle Oxidationen laufen demnach in der Matrix ab. Die Glykolyse bildet eine Ausnahme, sie findet im Zytosol statt. Spezifische Transportsysteme transportieren Pyruvat, Fettsäuren und Aminosäuren bzw. deren Ketoderivate in die Matrix, wo sie in den Zitronensäurezyklus eintreten. Im Austausch zu neu synthetisiertem Adenosintriphosphat (ATP) wird Adenosindiphosphat (ADP) ebenfalls über ein spezifisches Transportsystem in die Matrix transportiert. Die äußere Mitochondrienmembran enthält neben Elektronencarriern der Atmungskette (Komplexe I-IV), ADP-ATP-Translokasen und der ATP-Synthase noch einige andere Membrantransportsysteme (STRYER et al. 1975). Der Energiestoffwechsel läuft in allen Zellen eines Organismus ab. Werden Kohlenhydrate (z.B. Glukose) abgebaut, so wird in einer ersten Reaktionssequenz ATP durch Substratkettenphosphorylierung gewonnen. Dabei entsteht Pyruvat, das unter anaeroben Bedingungen zu Laktat umgesetzt wird und damit den Redox-Status der Zelle weitgehend konstant hält. Ein großer Teil des Laktats, das vom Muskel abgegeben wird, wird in der Leber zur Resynthese von Glukose bzw. Glykogen verwandt. Dabei werden viele Reaktionen der Glykolyse in umgekehrter Richtung durchlaufen (Glukoneogenese).
Im Skelettmuskel fehlen die Enzyme der Glukoneogenese. Dieses Gewebe ist daher auch bei Sauerstoffzufuhr nicht in der Lage, aus Laktat wieder Glukose aufzubauen.
Das Laktat wird vielmehr an das Blut abgeben und in der Leber zur Glukoneogenese verwendet. Bei anhaltender Arbeit der Skelettmuskeln kommt es somit zu einer Verschiebung von Glykogen vom Muskel zur Leber und von dort während der Erholungsphase in Form von Glukose wieder zum Muskel, der seine Glykogenreserven daraus aufbaut. Man bezeichnet dieses Wechselspiel zwischen Leber- und Muskelglykogen als Cori-Zyklus (STRYER et al. 1975). In Gegenwart von Sauerstoff kann Pyruvat im Krebs-Zyklus zu CO2 und Wasser abgebaut werden.
Auch in dieser Reaktionsfolge entsteht ATP aus einer Substratketten- phosphorylierung. Der Energiegewinn resultiert jedoch vorwiegend aus der Atmungskette, wo stufenweise der aus der Glukose stammende Wasserstoff zu Wasser oxidiert wird (STRYER et al. 1975).
2.2 Mitochondriopathien – beim Menschen
Unter dem Begriff Mitochochondriopathien versteht man im engeren Sinne all diejenigen klinischen Entitäten, die aufgrund von strukturellen und funktionellen Störungen der in den Mitochondrien lokalisierten Atmungskette (oxidative Phosphorylierung) entstehen.
2.2.1 Mitochondriale Myopathien/ Enzephalopathien
Der erste Fall einer Myopathie in Verbindung mit abnormalen Mitochondrien bei einem Menschen wurde von ERNSTER et al. (1959) beschrieben.
Mitochondriopathien können entweder nach dem zugrunde liegenden biochemischen Defekt, nach dem Typ der Mutation oder aufgrund von klinischen Symptomen klassifiziert werden (SENGERS et al. 1984; SPERL 1997). Eine Einteilung nach morphologischen Gesichtspunkten wie z.B. zunehmende Größe oder Anzahl von Mitochondrien, abnormale Dichte und Orientierung der Christae sowie das Vorhandensein von verschiedensten Einschlüssen ist nicht möglich (DI MAURO et al.
1985). MORGEN-HUGHES et al. (1977) fanden gleiche morphologische Veränderungen in Muskelbiopsien von Patienten mit definierten biochemischen Fehlern an unterschiedlichen Stellen der Atmungskette.
Morphologische Veränderungen der Mitochondrien müssen nicht zwangsläufig durch primäre Störungen des mitochondrialen Stoffwechsels entstehen (DI MAURO et al.
1985 ).
2.2.1.1 Biochemische Defekte der Mitochondrien
Im wesentlichen können drei Gruppen von biochemischen Defekten unterschieden werden (DI MAURO et al. 1985). Dazu gehören:
A. Störungen der Substratverwertung
B. Störungen der Kopplung von Oxidation und Phosphorylierung C. Defekte der Atmungskette
A. Störungen der Substratverwertung
A.1. Acyl-Carnitin-Transferase-(ACT) Defekt
Bei dem Acyl-Carnitin-Transferase-(ACT) Defekt, welcher erstmals 1973 von DI MAURO et al. beschrieben wurde, liegt eine Störung beim Abbau von langkettigen Fettsäuren vor. Dieser Abbau ist vor allem wichtig zur Energiegewinnung bei ausdauernden Belastungen. Betroffene Patienten zeigen nach starker Belastung Myoglobinurie. Beim Menschen wird dieser Defekt autosomal rezessiv vererbt (DI MAURO et al. 1980). Obwohl der Defekt in allen Organen auftritt, werden meist nur Symptome im Bereich der Skelettmuskulatur beschrieben (DI MAURO et al. 1985).
A.2. Carnitin-Mangel
Diese Störung des Carnitinstoffwechsels wurde bei einer Frau mit fortschreitender Schwäche beschrieben. Obwohl die Serum-Carnitin-Werte im Normbereich lagen, fielen bei dieser Patientin stark erniedrigte Carnitin-Werte der Skelettmuskulatur auf (ENGEL et al. 1973). Bis heute wurden mehrere Fälle dieser autosomal rezessiv vererbbaren Erkrankung bei verschiedenen Patienten entdeckt. Bei diesen Patienten
wurden viele Lipidtröpfchen im Muskel, gehäuft in den Typ1-Fasern gefunden (ENGEL et al. 1973).
A.3. Systemischer Carnitin-Mangel
Der systemische Carnitin-Mangel ist meistens bei Kindern zu beobachten und äußert sich in einer hepatischen Enzephalopathie, mit Symptomen wie Übelkeit, Erbrechen, Benommenheit, Teilnahmslosigkeit und Koma (DI MAURO et al. 1980; ENGEL 1981;
REBOUCHE et al. 1983). Eine allgemeine Schwäche wird erst relativ spät beobachtet. Durch Mutation am Carnitintransporter der Plasmamembran kommt es zu einer mangelnden Aufnahme von Carnitin ins Zytoplasma von Herz- und Skelettmuskelzellen. Carnitin kann im Nierentubulus nicht mehr rückresorbiert werden und wird mit dem Urin ausgeschieden, was zu einem zunehmenden Carnitin- Verlust führt. Die Krankheit verläuft schubweise. Hypoglykämie, erhöhte Ammoniakwerte und erhöhte Leberenzyme können im Blut gemessen werden. In Muskel-und Leberbiopsien werden Fettablagerungen gefunden. Die Carnitinkonzentration weist in der Leber, im Muskel und im Serum erniedrigte Werte auf (DI MAURO et al. 1985). Eine weitere Manifestation des systemischen Carnitin- Mangels stellt die Kardiomyopathie bei Kindern dar (TRIPP et al. 1981; WABER et al.
1982 ; DI MAURO et al. 1985).
A.4. Veränderungen im Pyruvatstoffwechsel
Ein Pyruvatdecarboxylasemangel äußert sich in einer verzögerten Entwicklung, Krämpfen und einer generalisierten Hypotonie (DE VIVO et al. 1983). Bei zwei Patienten wurden akkumulierte Fettablagerungen in Typ1-Fasern gefunden, die Mitochondrien zeigten sich unverändert (DI MAURO et al. 1985).
Bei der Pyruvatdecarboxylase (PDH) handelt es sich um einen Enzymkomplex bestehend aus fünf Einzelenzymen, wobei zwei, die Kinase und die Phosphatase, die Enzymaktivität durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung regulieren (DI MAURO et al. 1985).
B. Störungen der Kopplung von Oxidation und Phosphorylierung
Bei zwei Frauen mit Fieber, Hitzeintoleranz, Tachypnoe und Dyspnoe in Ruhe, Polydipsie und Polyphagie wurde eine erhöhte Stoffwechselrate gefunden (LUFT et al. 1962). Ein Hyperthyreoidismus lag nicht vor. Im Elektrokardiogramm (EKG) war eine Sinustachykardie festzustellen und das Elektromyogramm (EMG) ließ eine Myopathie vermuten. In Muskelbiopsien waren so genannte ragged-red-fibres, sowie markant erhöhte Oxidationsenzyme zu erkennen. Elektronenmikroskopisch ließ sich eine Akkumulation der Mitochondrien nachweisen, einige von diesen wiesen straff gepackte Christae sowie parakristalline und dunkle Einschlüsse auf. Weiterhin wurden viele Kapillaren zwischen den Fasern gefunden. An isolierten Muskelmitochondrien der Patienten liess sich eine maximale Respirationsrate nachweisen, ein Zeichen dafür, dass die respiratorische Kontrolle nicht möglich war.
Es konnte in keinem der Fälle ein Entkopplungsfaktor im Muskel gefunden werden, so dass davon ausgegangen werden musste, dass diese Abnormalität innerhalb der Mitochondrien zu finden war (LUFT et al. 1962; HAYDAR et al. 1971; Di MAURO et al. 1976). In einem anderen Fall wurde bei einer Frau, welche eine langsam fortschreitende Myopathie aufwies, ein Defekt der mitochondrialen ATPase nachgewiesen. Bei ihr wurden dieselben Muskelbefunde wie bei den oben genannten Patienten gefunden (SCHOTLAND et al. 1976).
C. Defekte in der Atmungskette
In den frühen 70-iger Jahren wurden die ersten Fälle von Defekten von Cytochrom b und Cytochrom aa3 entdeckt (SPIRO et al. 1970; FRENCH et al. 1972).
Veränderungen im Bereich der Komplexe I, III und IV wurden nach Untersuchung der oxidativen Phosphorylierung, des Spektrums der reduzierten bis oxidierten Cytochrome sowie durch Enzymanalysen nachgewiesen (DI MAURO et al. 1985). Ist die Oxidation von Nikotinamidadenindinukleotid (NAD)-abhängigen Substraten wie z.B. Glutamat und Malat gestört, aber nicht die der Flavoprotein abhängigen Substrate (z.B. Sukzinat), so kann man davon ausgehen, dass der Defekt am ersten Komplex lokalisiert ist. Ist aber die Oxidation beider Substratgruppen gestört, liefert
das einen Hinweis darauf, dass der Defekt unterhalb des Coenzyms Q zu suchen ist.
Auch bei diesem Defekt ist vor allem die Muskulatur betroffen (DI MAURO et al.
1985).
2.2.1.2 Klinische Erscheinungen
Klinisch zeichnen sich Mitochondriopathien durch eine breite Heterogenität aus.
Demnach ist es schwierig, Mitochondriopathien aufgrund ihrer charakteristischen Symptome zu identifizieren oder zu klassifizieren, da ähnliche Anzeichen bei Patienten mit unterschiedlichen biochemischen Defekten auftreten können (DI MAURO et al. 1985). Menschen können in jedem Lebensalter erkranken, jedes Organ und jedes Organsystem kann betroffen sein. Jedoch sind Organsysteme mit einem hohen Sauerstoffbedarf besonders anfällig (neuromuskuläres System, Herz).
Während der Differenzierung der Mitochondrien kommt es zur willkürlichen Verteilung eventuell auftretender Mutationen. Daher können unabhängige Organsysteme erkranken. Folgende Störungen sind beim Menschen am häufigsten zu beobachten (DI MAURO et al. 1985):
• Störungen der Skelettmuskulatur mit vermindertem Muskeltonus und Leistungsintoleranz
• Entwicklungsstörungen
• Enzephalopathien mit Krampfanfällen bzw. schlaganfallähnlichen Symptomen
In der Humanmedizin werden drei Symptomkomplexe unterschieden (DI MAURO et al 1985):
Das Kearns-Syre-Syndrome (KSS) tritt meistens im Alter von unter 15 Jahren auf.
Betroffene Patienten zeigen eine progressive Ophthalmoplegie, eine Pigmentdegeneration der Retina und zusätzlich entweder eine kardiale Insuffizienz oder zerebrale Ausfallerscheinungen, wobei ein erhöhter Proteingehalt im Liquor cerebrospinalis gemessen werden kann (BERENBERG et al. 1977; ROWLAND
1983; ROWLAND et al. 1983). Bei einem Patienten wurde ein Defekt des Coenzyms Q10 im Serum sowie in muskulären Mitochondrien gefunden. Nach Substitution mit Coenzym Q10 verbesserte sich das klinische Bild (DI MAURO et al. 1985).
Myoklonische Epilepsie mit ragged-red-fibres (MERRF) wurde erstmals von FUKUHARA et al. (1983) beschrieben. Das klinische Bild ist geprägt von Myoklonus, Ataxie, Asthenie (allgemeine Schwäche) und generalisierten Krämpfen (FUKUHARA 1983). Ein nicht-mendelscher maternaler Erbgang wird vermutet (FUKUHARA 1983;
ROSING et al. 1985).
Ein weiteres Syndrom wird als „MELAS“ bezeichnet. Diese Abkürzung steht für mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and strokelike episodes (PAVLAKIS at al. 1984). Die Patienten zeigen in den ersten Jahren ihres Lebens eine normale Entwicklung. Dann werden vermindertes Wachstum, episodisches Erbrechen, Krämpfe und schlaganfallähnliche wiederkehrende zerebrale Ausfälle festgestellt, welche eine Hemiparese, Hemianopia und kortikale Blindheit verursachen. Von PAVLAKIS et al. (1984) wurden zwei Geschwisterpaare mit MELAS-Syndrom beschrieben und ebenfalls eine maternale Vererbungslinie vermutet. Die schlaganfallähnlichen Momente unterscheiden das MELAS-Syndrom deutlich von den bereits beschriebenen Syndromen KSS und MERRF (DI MAURO et al. 1985).
Obwohl diese Syndrome durch spezifisch auftretende Symptome voneinander abgegrenzt werden können, gibt es doch einige gemeinsame Anzeichen. Dazu gehören Wachstumsstörungen, Demenz, intermittierender Hörverlust, Laktatazidose und zerebrale Verkalkungen.
Leigh´s Disease ist eine seltene, vererbbare, metabolisch-neurodegenerative Erkrankung. Sie ist auf einen mitochondrialen Enzymdefekt zurückzuführen. Dieser Enzymdefekt kann an jeder Stelle der Atmungskette lokalisiert sein. Je nachdem, welcher Defekt vorliegt, erfolgt die Vererbung autosomal rezessiv oder x- chromosomal. Die Erkrankung tritt meist im Kindesalter auf, nur selten wurden Fälle erwachsener Patienten bekannt.
Die klinischen Erscheinungen sind vielfältig. Beobachtet werden meist eine regressive psychomotorische Entwicklung, Blindheit, Hypotonie, Dystonie, Dysfunktionen des Gehirns, Ataxie, Nystagmus und eine metabolische Azidose mit erhöhten Laktat- und Pyruvatwerten im Blut sowie im Liquor cerebrospinalis.
Pathologisch häufig anzutreffende Befunde sind bilaterale nekrotische Stellen in der grauen und weißen Substanz, Zellschädigungen und Kapillarproliferationen (RAHMANN et al. 1996).
2.3 Mitochondriopathien – beim Tier
2.3.1 Fallberichte
Auch beim Tier sind Fälle von Mitochondriopathien beschrieben worden, jedoch beschränken sich diese auf einzelne Fallbeschreibungen.
Bereits 1974 wurde von WENTINK et al. der Fall eines Irish Terriers mit steifem Gang und Muskelatrophie beschrieben. Bei diesem Tier konnte ein metabolischer Defekt der isolierten Mitochondrien nachgewiesen werden.
HOULTON et al. (1980) untersuchten den Fall eines Sussex Spaniels, welcher wegen einer anstrengungsabhängigen Schwäche vorgestellt wurde. Ein Defekt der Pyruvatdehydrogenase konnte festgestellt werden. Dieser Hund zeigte in Ruhe erhöhte Laktat- und Pyruvatwerte, welche nach Belastung noch weiter anstiegen.
Zwei „Old English Sheepdogs“ wurden 1992 mit episodisch auftretender allgemeiner Schwäche vorgestellt. Diese Hunde zeigten eine Laktatazidose, eine erhöhte Anzahl von Mitochondrien und Glykogen in der Skelettmuskulatur und bei einem Hund wurden „ragged-red-fibres“ in den Muskelfasern nachgewiesen (BREITSCHWERDT et al. 1992).
Bei 3 Australian Cattle Dogs, welche mit progressiven spastischen Paresen vorgestellt wurden, konnte elektronenmikroskopisch eine erhöhte Anzahl von morphologisch abnormalen Mitochondrien in den Astrozyten festgestellt werden (BRENNER et al. 1997).
VIJAYASARATHY et al. (1994) beschrieben den Fall eines Bobtails, welcher mit anstrengungsabhängiger Schwäche und Laktatazidose vorgestellt wurde. Bei diesem Hund wurde ein partieller Cytochromoxidasedefekt diagnostiziert.
Bei vier Hunden aus drei unterschiedlichen Würfen von Alaskan Huskies wurden Leigh´s Disease ähnliche Befunde beschrieben. Ataxie wurde bei diesen Hunden erstmals in einem Lebensalter von 6-9 Monaten beobachtet. Nach 1-4 Monaten konnten Hypermetrie aller vier Gliedmaßen, Blindheit, Hyperästhesie der Nasen- und der Pharynxschleimhaut sowie Krämpfe beobachtet werden. In der Autopsie wurden Kavitationen vom Thalamus bis zur Medulla entdeckt. Es fanden sich reaktive Astrogliazellen, Kapillarhyperplasie mit Endothelzellhypertrophie und Makrophagenanhäufungen. Die histopathologische Diagnose lautete subakute nekrotisierende Enzephalopathie (SNE) (SUMMERS et al. 1995). Weitere Fälle von Enzephalopathie bei Alaskan Huskies wurden auch von BRENNER et al. (2000) beschrieben.
1999 wurde von WAKSHLAG et al. über die klinischen Befunde bei zwei Alaskan Huskies mit subakut nekrotisierender Enzephalopathie berichtet. Bei diesen Hunden beobachteten die Besitzer im Alter von einem halben Jahr einen abnormalen Gang.
Zum Zeitpunkt der Vorstellung waren die Hunde tetraplegisch mit starker Spastizität und hatten Symptome einer diffusen intrazerebralen Läsion mit Schwerpunkt im Hirnstamm.
Die Laktat- und Pyruvat-Werte im Liquor cerebrospinalis dieser Hunde wurden mit denen von vier gesunden Beagle verglichen. Im Vergleich mit den gesunden Hunden konnte keine signifikante Veränderung der absoluten Werte oder des Verhältnisses von Pyruvat zu Laktat erkannt werden. Die Art der Messung wurde nicht beschrieben. Die Hunde wurden auf Wunsch der Besitzer euthanasiert.
Die histopathologische Untersuchung ergab eine subakut nekrotisierende Enzephalopathie (SNE). Im Kernspintomogramm (MRT) war eine bilaterale Kavitation ausgehend vom Thalamus bis zur Medulla mit nicht deutlich ausgeprägten degenerativen Läsionen des Nukleus caudatus, des Putamens und des Claustrums zu sehen. Diese Befunde wurden bei der histologischen Untersuchung bestätigt. Es wurde weiter eine neuronale Degeneration im Kortexbereich festgestellt. Auf der Basis des pathologischen Befundes sowie der klinischen Erscheinungen lag der
Verdacht nahe, dass es sich um eine metabolische Erkrankung im Bereich der Mitochondrien handeln könnte (WAKSHLAG et al.1999). Eine ähnliche Erkrankung wurde von MATIASEK et al. (2002) bei einem Yorkshire Terrier beschrieben.
Es liegen weitere Fallberichte vor, in denen eine mitochondriale Myopathie/
Enzephalopathie vermutet wurde. So beschreiben OLBY et al. (1997) den Fall eines Jack Russell Terriers, welcher mit einer anstrengungsabhängigen Schwäche vorgestellt wurde. Der Hund wurde einer klinischen Untersuchung unterzogen, des Weiteren wurde eine spezielle orthopädische und neurologische Untersuchung durchgeführt. Bei allen Untersuchungen wurden keine Besonderheiten festgestellt.
Ein durchgeführter „Tensilontest“ (Gabe eines kurz wirksamen Azetylcholinesteraseblocker, um das Vorliegen einer Myastenia gravis aus- zuschliessen) führte zu keiner kurzzeitigen Besserung der klinischen Symptomatik und stellte sich somit als negativ heraus. Die Elektromyographie blieb ohne besonderen Befund. Eine metabolische Abnormalität wurde vermutet, weil der Hund vor und nach der Fütterung erhöhte Serumlaktatwerte und nach der Fütterung einen erhöhten Pyruvatwert sowie ein erhöhtes Pyruvat/Laktat-Verhältnis aufwies. Es wurde eine histochemische Untersuchung von Muskelbiopsien durchgeführt. Dabei zeigte sich eine subsakrolemmale Akkumulation von Mitochondrien und „ragged-red- fibres“, wobei alle Muskelfasertypen betroffen waren (OLBY et al. 1997).
Eine metabolische Enzephalopathie beim Hund wurde von BRENNER et al. (1997) beschrieben. Ein englischer Springer Spaniel wurde mit Ataxie und einer Verhaltensänderung vorgestellt. Die Vermutung einer Mitochondriopathie basiert auf einer elektronenmikroskopischen Untersuchung von Gliazellen, welche eine Veränderung der Mitochondrienstruktur zeigten.
Veränderungen, die dem MELAS-Syndrom des Menschen ähneln und mit fokalen Verkalkungen in Kleinhirn und Medulla oblongata einhergingen, wurden bei einem Jack Russel Terrier in Hannover beschrieben (GRUBER et al. 2002).
Ein weiterer Fall wurde in den USA dokumentiert (PLATT et al. 1999). Ein 6 Jahre alter Cocker Spaniel wurde mit Schwäche und progressiver Atrophie der Becken- und Hüftmuskulatur vorgestellt. Der Hund hatte eine physiologische Körperinnentemperatur, war apathisch, geringgradig dehydriert und zeigte Schmerzreaktionen bei Palpation der Muskulatur. Alle neurologischen
Untersuchungen zeigten keine Auffälligkeiten. Es wurden Biopsien des Muskulus vastus lateralis und des Muskulus trizeps brachii entnommen. Besonders in den Typ1-Muskelfasern fand sich eine hohe Anzahl von Lipidtropfen. Im Serum wurden eine leichte Leukozytose sowie erhöhte Werte für die alkalische Phosphatase und die Kreatinkinase festgestellt. Der Laktatwert im Plasma war in Ruhe geringgradig erhöht, nach zehnminütiger Belastung stieg er deutlich an. Es wurde der Verdacht einer metabolischen Störung, lokalisiert in den Mitochondrien, geäußert .
Identische Enzephalopathien sind auch bei anderen Haussäugetieren zu beobachten. So sind diese bei einem Swaldale Lamm (OLBY et al. 1997), mehreren Simmentaler Kälbern (STEFFEN 1994) und bei einem Vollblutaraber (VALBERG et al. 1994) beschrieben worden. Eine Übersicht über die bei Tieren dokumentierten Mitochondriopathien liefert Tabelle 2.1.
Tab. 2.1. Übersicht der Fallberichte - Mitochondriopathien bei Tieren
Tierart Anzahl
der Fälle Betroffene Organe und
klinische Symptome Merkmale, die eine
Mitochondriopathie vermuten liessen
Quelle
Irischer
Terrier 1 Skelettmuskel: steifer Gang, Schluckbeschwerden, Muskelatrophie mit erhöhtem Tonus
histologisch: degenerative myopathische Veränderungen , histochemisch: abnormale Enzymverteilung, metabolischer Defekt in isolierten Mitochondrien
1
Sussex
Spaniel 1 Skelettmuskel:
anstrengungsabhängige Schwäche
Laktatazidose,
Pyruvatdehydrogenasemangel 2 Old English
Sheepdogs 2 Skelettmuskel: episodische
Schwäche Laktatazidose, Akkumulation von
Mitochondrien und Glykogen im Skelettmuskel, „ragged-red- fibres“
3
Jack Russel Terrier
1 Skelettmuskel: fortschreitende anstrengungsabhängige Schwäche
Laktatazidose, „ragged-red- fibres“,
subsakrolemmale Akkumulation von Mitochondrien
4
Australian
Cattle Dog 3 Krampfanfälle, spastische
Tetraparese bilateral, symmetrische
Kavitationen im Hirnstamm und im Rückenmark, erhöhte Anzahl morphologisch normaler
Mitochondrien in den Astrozyten 5
English Springer Spaniel
1 Ataxie, leichte
Verhaltensänderung Atrophie der Sehnerven, bilaterale, symmetrische Spongiose im Hirnstamm, morphologisch abnormale Mitochondrien in den Neuronen
6
Cocker
Spaniel 1 Skelettmuskel: Schwäche,
Atrophie der Becken- und Hüftmuskulatur
Lipidtropfen in Typ 1- Muskelfasern,
erhöhte Serumwerte für alkalische Phosphatase, Kreatinkinase,
belastungsabhängiger Anstieg von Plasmalaktat
7
Bobtail 1 Skelettmuskel:
anstrengungsabhängige Schwäche
Laktatazidose,
Cytochromoxidasemangel 8 Alaskan
Huskies
2 abnormaler Gang,
später Tetraplegie, Spastizität
Subakute nekrotisierende Enzephalopathie (SNE), bilaterale Kavitation vom Thalamus bis zur Medulla,
9
Yorkshire
Terrier 6 abnormaler Gang,
später Tetraplegie, Spastizität Subakute nekrotisierende Enzephalopathie (SNE), bilaterale Kavitation vom Thalamus bis zur Medulla
10
Jack Russel Terrier
1 anstrengungsabhängige
Schwäche, zerebelläre Ataxie fokale Verkalkungen in Kleinhirn und Medulla oblongata 11 Simmen-
taler Rind > 30 Ataxie, kaudale Paresen,
plötzlicher Tod Bilaterale und symmetrische Malazie im Hirnstamm und teilweise im Rückenmark mit Kapillarproliferation
12
Vollblut
Araber 1 Skelettmuskel:
anstrengungsabhängige Schwäche
Laktatazidose, „ragged-red- fibres“, Aggregate von
vergrößerten Mitochondrien mit bizarr geformten Christae, Mangel von Komplex 1 der Atmungskette
13
Swaldale
Lamm nicht
bekannt ZNS-Symptome erhöhter Laktatspiegel im Liquor cerebrospinalis, bilaterale, symmetrische
Hirnstammläsionen
14
Quellenangaben zur Tabelle 2.1.
1: WENTINK et al. (1974) 2: HOULTON et al. (1980)
3: BREITSCHWERDT et al. (1992) 4: OLBY et al. (1997)
5: BRENNER et al. (1997) 6: BRENNER et al. (1997) 7: PLATT et al. (1999)
8: VIJAYASARATHY et al. (1994) 9: WAKSHLAG et al. (1999) 10: MATIASEK et al. (2002) 11: GRUBER et al. (2002) 12: STEFFEN et al. (1994) 13: VALBERG et al. (1994) 14: OLBY et al. (1997)
2.4 Diagnostik von Mitochondriopathien
2.4.1 Diagnose beim Menschen
Die Diagnose einer Mitochondriopathie erfolgte in den 60-iger Jahren durch morphologische und histologische Untersuchungen. Als charakteristisch neben veränderten Mitochondrien wurde das Auftreten von ragged-red-fibres, die mittels einer modifizierten Gomorifärbung identifiziert werden, beschrieben (ENGEL et al.
1963 ; OLSEN et al. 1971). Im nächsten Jahrzehnt wurden von BLASS et al. (1970) und WILLEMS et al. (1977) sowohl in der Atmungskette, als auch im Pyruvatdehydrogenasekomplex die ersten mitochondrialen Enzymdefekte beschrieben. 1981 gelang es ANDERSON das menschliche mitochondriale Genom vollständig zu sequenzieren. Auf dieser Grundlage konnte diese Erkrankung auch auf DNS-Ebene studiert werden.
Die Elektromyographie (EMG) zeigt keine spezifischen Veränderungen bei diesen Patienten. Die Nervenleitgeschwindigkeit kann bei einigen Patienten herabgesetzt sein, eine klinische Neuropathie wird sehr selten beobachtet (DI MAURO et al. 1985).
Laut DI MAURO et al. (1985) zeigt das Elektroenzephalogramm (EEG) bei allen Patienten unspezifische Veränderungen. Bei der Computertomographie kann man einzelne Dichteveränderungen und Verkalkungen der Basalganglien feststellen. Dies wird besonders häufig bei MELAS- und KSS-Patienten beobachtet, welche einen Hyperparathyroidismus entwickeln können.
Ein wichtiger aber nicht spezifischer Befund bei Mitochondriopathien ist das Vorhandensein einer Laktatazidose bei den meisten Patienten. Diese kommt durch den erhöhten Verbrauch von Pyruvat im Krebszyklus und der glykolytischen Aktivität im Muskel mit einem gestörten Sauerstoffmetabolismus zustande (DI MAURO et al.
1985). Pyruvat wird entweder durch die Laktatdehydrogenase zu Laktat abgebaut oder durch die Alanintransaminase zu Alanin überführt. Laktat, Pyruvat und Alanin müssen demnach im Blut von Patienten mit Mitochondriopathie einen erhöhten Wert zeigen (DI MAURO et al 1985). Wird keine oder nur eine moderate Erhöhung der Laktatkonzentration im Blut festgestellt, ist ein Laktatstresstest auf einem Fahrradergometer angezeigt (MORGAN-HUGHES et al. 1977; LAND et al. 1981;
LAND et al. 1981; JOHNSON et al. 1983). ZIERZ (1989) führte diesen Test bei 30 Menschen durch. Bei diesen Patienten wurden ragged-red-fibres als Hinweis für eine mitochondriale Störung in Muskelbiopsien gefunden. Der Belastungstest wurde auf einem Fahrradergometer über eine Zeit von 15 Minuten (min) konstant bei 30 Watt durchgeführt. Vor Beginn der Belastung mussten die Patienten eine 30 minütige Ruhepause einlegen. Durch einen Verweilkatheter wurde den Patienten vor der Belastung, in Abständen von fünf Minuten während der Belastung und 15 min nach der Belastung Blut entnommen und die Laktat-und Pyruvatkonzentration gemessen.
Die gleiche Untersuchung wurde auch bei einer Kontrollgruppe durchgeführt. Diese bestand aus 12 gesunden und 14 neurologisch erkrankten Menschen, ohne metabolische Myopathie. Bei der Kontrollgruppe kam es im Mittel nach 15 min Belastung zu keinem Anstieg von Laktat und Pyruvat oder deren Quotienten.
Individuell zeigten die Probanden allerdings einen 1,1-1,7 fachen Anstieg von Laktat gegenüber den Ruhewerten. Der Pyruvatwert stieg unter Belastung 1,1-2,5 fach an.
Der Quotient Pyruvat/ Laktat erhöhte sich bei Belastung um das 1,1-2,4 fache.
Bei den 30 Patienten mit mitochondrialen Myopathien fanden sich im Mittel in Ruhe signifikant erhöhte Laktatspiegel und Pyruvatspiegel sowie ein erhöhter Wert für den Quotienten Laktat/Pyruvat. Unter Belastung kam es bei den Patienten im Mittel zu einem zweifachen Anstieg von Laktat, einem 1,3 fachen Anstieg von Pyruvat und zu einem 1,5 fachen Anstieg des Quotienten Pyruvat/Laktat. Unter diesen Bedingungen war am häufigsten der Laktatspiegel mit 63% erhöht, während Pyruvat und der Quotient aus Pyruvat/Laktat nur in etwa der Hälfte der Fälle pathologisch erhöht waren (ZIERZ et al. 1989).
Ein ähnlicher Test wurde von FINSTERER et al. (1998) durchgeführt. An dieser Studie nahmen 31 gesunde Probanden, 10 mit nicht mitochondrial bedingten Myopathien und 26 Patienten mit Mitochondriopathien teil. Die Probanden hielten vor dem Test eine 30 minütige Ruhepause ein. Sie fuhren 15 min bei 30 Watt auf einem Ergometer. Vor Belastung, alle 5 min während der Belastung und 15 min nach der Belastung wurde durch einen Verweilkatheter Blut abgenommen. Zunächst wurde neben dem Laktat- auch der Pyruvatwert gemessen. Es zeigte sich aber, dass der Pyruvatwert aufgrund technischer Probleme sehr variabel war. Daher wurde auch der Quotient aus Pyruvat/Laktat als nicht aussagefähig bezeichnet. Die Autoren
beschränkten sich daher auf die Bestimmung des Laktatwertes. Bei den gesunden Probanden waren alle Laktatwerte im physiologischen Bereich. Dabei zeigte sich ein belastungsabhängiger Anstieg der Laktatwerte. Bei der vorletzten Messung lagen die Werte der weiblichen Teilnehmer signifikant höher als die der männlichen, bei den anderen Messungen zeigte sich in diesem Bereich keine Abhängigkeit. Die Probanden mit nicht mitochondrialen Myopathien wiesen, mit Ausnahme einer Testperson, im Vergleich zu den gesunden Probanden keine signifikanten Erhöhungen der Laktatwerte auf.
Verglichen mit den Kontrollgruppen zeigte sich in der Gruppe der Patienten mit mitochondrialen Myopathien eine deutliche Erhöhung der Laktatwerte zu jedem Blutentnahmezeitpunkt während des Testes. Bei 18 Patienten stieg der Laktatwert in einen pathologisch erhöhten Bereich. Die Sensitivität des Tests, aufgrund erhöhter Laktatwerte eine Mitochondriopathie zu erkennen, lag bei 69% bei einer Spezifität von 90%. 9 der Patienten hatten bereits in Ruhe einen pathologisch erhöhten Laktatwert. Insgesamt gesehen, konnte kein Zusammenhang zwischen den Laktatwerten und der Schwere der Symptome, die diese Patienten zeigten, entdeckt werden. Zusammenfassend ist laut FINSTERER et al. (1998) die Muskelbiopsie die wichtigste und genaueste Methode, um eine Mitochondriopathie sicher zu diagnostizieren. Allerdings sei der Laktat-Belastungstest ein hilfreicher Indikator, besonders, wenn man eine Muskelbiopsie umgehen möchte. Ein negativer Laktat- Belastungstest erlaubt aber nicht eine Mitochondriopathie auszuschliessen.
Nach SENGERS et al. (1984) ist die Grundlage für die Diagnose einer Mitochondriopathie das Zusammentreffen von histologisch oder histochemisch veränderten Mitochondrien und/ oder einem deutlichen Defekt auf biochemischer Ebene der mitochondrialen DNS. Dabei muss die klinische Symptomatik mit der mitochondrialen Pathologie im erkennbaren Zusammenhang stehen.
2.4.1.1 Liquor cerebrospinalis
Bei Menschen mit mitochondrialer Enzephalopathie kommt es, sofern eine Störung der zerebralen Mitochondrien vorliegt, zu einer Erhöhung der Laktatkonzentration im Liquor cerebrospinalis (MORGAN-HUGHES et al. 1994; SHAPIRA et al. 1994).
Die CSF ist eine wasserklare Flüssigkeit, welche den gesamten Ventrikel- und Subarachnoidalraum ausfüllt (TIPOLD 2002).
Etwa 0,047 ml/min werden beim Hund (abhängig von der Körpergröße) sezerniert.
An der Sekretion beteiligen sich sowohl der Plexus chorioideus als auch die die Hirnventrikel und den Zentralkanal auskleidenden Ependymzellen, sowie die Blutgefäße der Pia mater. Die Produktion erfolgt einerseits durch Ultrafiltration des Blutplasmas und darüber hinaus mit Hilfe von aktiven Transportmechanismen. Durch Diffusion können Vitamine, Glukose und Aminosäuren in die CSF gelangen. Der Liquor cerebrospinalis ist jedoch auch eine Flüssigkeit, die der Ausscheidung toxischer Metaboliten, die im zentralen Nervensystem gebildet werden, dient.
Toxische Metaboliten können auf diesem Weg wieder in den Blutkreislauf sezerniert werden (TIPOLD 2002).
Die CSF zirkuliert innerhalb des Ventrikelsystems und des Subarachnoidalraums. Bei Hunden sind sowohl eine nach kaudal fließende Strömung, als auch ein zirkulierender Fluss zu beobachten. Die Absorption erfolgt mit Hilfe von Mikrovilli (TIPOLD 2002).
Der Liquor cerebrospinalis erfüllt neben der Ausscheidung weitere Funktionen. Er dient dem mechanischen Schutz, gleicht hydrostatische Druckänderungen im Gefäßsystem aus und puffert Temperaturschwankungen. Aufgrund des ständigen Austausches mit dem Gewebe des zentralen Nervensystems (ZNS) kann eine Untersuchung der CSF eine gute Unterstützung in der Diagnosefindung von intrakraniellen Erkrankungen bzw. von Störungen des Rückenmarkes sein. Die CSF spiegelt teilweise die immunologischen bzw. metabolischen Vorgänge im ZNS wider (TIPOLD 2002).
Der Wassergehalt des Liquor cerebrospinalis ist mit 99% im Gegensatz zum Blut, hier liegt er bei 93% sehr hoch. Die Osmolalität beider Medien liegt bei 289 mOsm/L.
Der Glukosegehalt beträgt etwa 80% des Wertes, der im Blut gemessen werden kann. Der Proteingehalt (meist Albumin) ist ebenfalls geringer als im Blut (<20 mg/dl).
In gesunder CSF des Hundes finden sich 0-3 Zellen/µl, wobei es sich meistens um Lymphozyten handelt (TIPOLD 2002). Beim Menschen liegt der Laktatgehalt im CSF bei 1,1 – 2,1 mmol/l und der Pyruvatgehalt bei 0,193-0,557 mmol/l (DRÖNER 1992).
2.4.2 Diagnose beim Tier
Die Diagnostik einer Mitochondriopathie beim Tier steckt noch in den Kinderschuhen und stützt sich vor allem auf morphologische Kriterien.
Bei vielen Mitochondriopathien sind z.B in den Muskelfasern keine ragged-red-fibres zu finden (DE VIVO et al. 1983). Des Weiteren kann das Entstehen von ragged-red- fibres auch andere Ursachen, wie z.B. Hyperadrenokortizismus (BRAUND et al.
1981), haben. Somit kann das bloße Vorhandensein eines solchen Befundes nicht zur endgültigen Diagnose einer Mitochondriopathie führen. Eine abnormale Enzymaktivität kann nur bei frischen Gewebeproben mittels histochemischer Techniken nachgewiesen werden. Da die Enzymaktivität nach der Entnahme der Gewebeproben schnell nachlässt, ist hier meist nur eine Aussage über die Existenz einer Enzymaktivität möglich, allerdings nicht über deren Qualität (OLBY et al. 1997).
Als Befund werden bei einer mitochondrialen Enzephalopathie erhöhte Laktat- und Pyruvatwerte im Liquor cerebrospinalis erwartet (WAKSHLAG et al.1999).
Um zu einer definitiven Diagnose zu kommen, ist es nötig, den Enzymdefekt zu lokalisieren oder Mutationen der mitochondrialen bzw. nukleären DNS nachzuweisen, welche die klinischen Symptome hervorrufen. Da viele Enzyme bei der Energiegewinnung eine Rolle spielen, ist es sinnvoll, die biochemischen Abweichungen genau zu charakterisieren. Dies wird vereinfacht, wenn man die Enzyme nach einer Belastung oder Fütterung misst. Die Belastung kann bei den Patienten aufgrund ihrer Schwäche mitunter kaum möglich sein, so dass man die Messung nach der Fütterung durchführen sollte. Erhöhte Spiegel für Laktat und Pyruvat vor der Fütterung mit einem normalen Pyruvat-Laktat-Verhältnis können auf eine Störung der Pyruvatdehydrogenase hinweisen. Sinkt der Pyruvatwert nach der Fütterung ab und der Laktatwert bleibt erhöht, so dass der Quotient aus Pyruvat- und Laktat-Werten steigt, weist das auf einen Defekt des Elektronentransportes mit Störung der oxidativen Phosphatase oder auf einen Defekt der Pyruvatcarboxylase hin (OLBY et al. 1997). Referenzwerte für Laktat und Pyruvat im CSF bei gesunden Hunden und bei Hunden mit verschiedenen Erkrankungen des ZNS fehlen jedoch.
Lediglich bei vier gesunden Beagle wurde der Laktat- und Pyruvatgehalt im CSF
gemessen. Die Laktatkonzentration lag bei 2,57 – 2,85 mmol/l und die Pyruvatkonzentration bei 0,226 – 0,244 mmol/l (WAKSHLAG et al. 1999).
2.5 Messung von Pyruvat und Laktat
2.5.1 Pyruvat
Pyruvat (Anion der Brenztraubensäure) entsteht als Endprodukt der Glykolyse und wird von der Pyruvatdehydrogenase in Azetyl-CoA umgewandelt und so in den Zitronensäurezyklus geleitet (LEHNINGER 1998).
2.5.1.1 Bildung
Pyruvat entsteht beim Abbau von Glukose während der Glykolyse. Dabei werden aus einem Mol Glukose zwei Mol Pyruvat gespalten, wobei je zwei Mol ATP und Nicotin- adenindinukleotidhydrogen (NADH)+H+ entstehen. Unter anaeroben Bedingungen wird NAD+ durch Bildung von Laktat wieder regeneriert. Die Glykolyse dient allen Zellen zur Energiegewinnung und kann sowohl unter aeroben, als auch unter anaeroben Bedingungen ablaufen. Sie besteht aus 10 verschiedenen Reaktionen, wovon 7 umkehrbar sind (LEHNINGER 1998).
Abb. 2.1. Die Glykolyse
Enzyme: 1= Hexokinase, Glukokinase 2= Phosphohexoseisomerase, 3= Phosphofruktokinase, 4= Aldolase, 5= Triosephosphatisomerase, 6= Phosphoglycerinaldehyd-Dehydrogenase,
7= Phosphoglyceratkinase, 8= Phosphoglyceratmutase, 9= Enolase, 10= Pyruvatkinase, 11= Laktatdehydrogenase (LDH)
Bei der Glykolyse wird 1 Molekül Glucose in 2 Moleküle Pyruvat zerlegt. Zudem entstehen 2 Moleküle ATP und 2 Moleküle NADH + H+:
Abb. 2.2. Bilanz der Glykolyse
2.5.1.2 Verwertung
Bei guter Sauerstoffversorgung wird aus Pyruvat durch die Pyruvat- Dehydrogenasereaktion Azetyl-Coenzym-A (Azetyl-CoA) gebildet (oxidative Decarboxylierung). Nur Azetyl-CoA kann in den Zitratzyklus eingeschleust und umgesetzt werden. Pyruvat wird vom Zytosol in die Mitochondrien transportiert, dort findet diese Reaktion statt. Die Pyruvat-Dehydrogenasereaktion ist nicht reversibel, somit ist es nicht möglich aus Azetyl-CoA wieder Pyruvat zu synthetisieren. Bei Kohlenhydratmangel muss der Körper mit Hilfe der Glukoneogenese Glukose herstellen, um Zellen, die essentiell auf Glukose angewiesen sind, zu versorgen.
Unter der Glukoneogenese kann man prinzipiell die Umkehrreaktion der Glykolyse verstehen, lediglich drei Reaktionen der Glykolyse sind irreversibel und müssen umgangen werden. So ist auch die Reaktion Phosphoenolpyruvat zu Pyruvat nicht umkehrbar. Deswegen wird Pyruvat zunächst mit Hilfe der Pyruvatcarboxylase unter ATP-Verbrauch zu Oxalazetat umgewandelt. Zusammenfassend gesehen dient Pyruvat also als Verbindungsglied zwischen Aminosäuren- und Glukosestoffwechel und kann unter Umwandlung zu Azetyl-CoA wieder in den Zitronensäurezyklus eingeschleust werden (LEHNINGER 1998).
2.5.1.3 Messmethoden
Mehrere Messmethoden, um Pyruvat quantitativ zu erfassen, wurden beschrieben.
Eine Möglichkeit ist die Erkennung von Pyruvat mit Hilfe von Reagenzien wie z.B 2- Nitrophenylhydrazine, welche sich an spezielle Ketogruppen binden. Allerdings reagieren solche Reagenzien auch mit anderen 2-oxo-Säuren, so dass diese Methode nicht spezifisch ist (FRIEDEMANN et al. 1943).
Des Weiteren wurde die Möglichkeit einer gaschromatographischen Trennung von flüchtigen Derivaten zusammen mit einem spezifischen thermischen Nachweis (LIEBICK et al. 1981) oder Massenspektrometrie beschrieben (ROCCHICCIOLE et al. 1981). Für die Messung von Pyruvat in Plasma und im Urin wurde auch die Möglichkeit einer High Performance Liquid Chromatography (HPLC)-Bestimmung in Kombination mit kolorimetrischer (HAYASHI et al. 1982) oder fluorimetrischer (HAYASHI et al. 1983) Messung veröffentlicht. Die Proben werden dazu angereichert und auf Hydrazidgel vorgereinigt (TODORIKI et al. 1982). Des Weiteren liegt ein Bericht vor, indem die amperometrische Messung von Pyruvat mittels membrangebundener Oxidase gezeigt wurde (MIZUTANI et al. 1980).
Durch hochsensitive enzymatische Methoden wird die Veränderung der NADH- Konzentration fluorimetrisch gemessen (OLSEN 1971). Das Prinzip der Messung lautet wie folgt:
Pyruvat + NADH+H+ ↔ L-Laktat + NAD+
Die Abnahme der Pyruvatkonzentration, gemessen an der Veränderung der Absorption von NADH bei 339 nm (Hg 334 oder Hg 365), ist proportional zum Betrag der Pyruvatreduzierung. Die Laktatdehydrogenase muss frei von NADH-Oxidase- Aktivität sein (BERGMEYER et al. 1984). Sämtliche Reagenzien sollten bei 0 - 4°C gelagert werden (BERGMEYER et al. 1984). Die NADH-Lösung sollte wöchentlich erneuert werden (LIEBICK et al. 1981) und die Enzyme täglich (ROCCHICCIOLE at al. 1981). Wird ein Befall von Mikroorganismen vermieden, so sind die anderen Reagenzien auf unbestimmte Zeit haltbar (BERGMEYER et al. 1984).
Das zu untersuchende Blut sollte aus einer ungestauten Vene entnommen werden.
Unverzüglich sollten 2 ml Blut in ein Zentrifugenröhrchen, in welchem 2 ml eiskalte 1 molare Perchlorsäure vorgelegt sind, überführt werden (ROCCHICCIOLE et al.
1981). Eine Methode, bei der die Messung von Pyruvat ohne vorherige Enteiweißung erfolgt, wurde von KELLER et al. (1981) beschrieben. BERGMEYER et al. (1984) postulieren, dass nur Laktatdehydrogenase (LDH)-freies Plasma zur Messung von Pyruvat geeignet ist.
2.5.2 Laktat
Laktat wird im anaeroben Stoffwechsel durch die Laktatdehydrogenase aus Pyruvat unter Oxidierung von NADH gebildet, um die Glykolyse aufrechtzuerhalten.
Abb. 2.3. Bildung von Laktat aus Pyruvat unter anaeroben Bedingungen
2.5.2.1 Bildung
Laktat ist ein Stoffwechselprodukt der anaeroben Glykolyse. Die wesentlichen Organe der Laktatbildung sind der arbeitende Muskel, die Erythrozyten, das Gehirn und das Nebennierenmark. Der Herzmuskel deckt bis zu 60% seines Energiebedarfes aus Laktat. Nicht vom Herzmuskel verbrauchtes Laktat wird von der Leber und der Nierenrinde zur Glukoneogenese verwendet. Reguliert wird die Laktatbildung durch die Pyruvatkonzentration, den zellulären Redoxstatus und durch die aktuelle H+-Konzentration. Unter anaeroben Bedingungen, z.B. nach starker
Muskelarbeit, wird Pyruvat zu Laktat reduziert. Katalysiert wird diese Reaktion durch die Laktatdehydrogenase. Bei dieser Reaktion wird NAD+ regeneriert, diese Regeneration hält den Ablauf der Glykolyse aufrecht. Würde das NAD+ nicht regeneriert, könnte die Glykolyse ab einem bestimmten Punkt nicht weiter fortschreiten und somit würde kein ATP mehr entstehen (STRYER et al.1975).
2.5.2.2 Verwertung
Das peripher gebildete Laktat wird in die Leber aufgenommen und diese verwendet es zur Glukoneogenese oder es wird zurück in Pyruvat umgewandelt und in den Zitronensäurezyklus eingeschleust.
Bei körperlicher Belastung fällt mehr Pyruvat an und die Laktatkonzentration kann bis auf das 10-fache zunehmen. Die gleichzeitig freiwerdenden H+-Ionen werden abgefangen und durch die Pufferkapazität des Blutes pulmonal oder renal eliminiert.
Der Blut-pH-Wert bleibt konstant und die Hyperlaktatämie wird über den Cori-Zyklus in kurzer Zeit wieder normalisiert.
Bei Gewebshypoxie oder Anoxie wird der zelluläre Redoxstatus, dieser entspricht dem Quotienten NADH/NAD, zugunsten von NADH verschoben. Daraus resultiert eine vermehrte Laktatbildung.
Wird aufgrund einer Sauerstoffmangelversorgung die Stoffwechselleistung der Leber insuffizient, deckt sie selbst einen erheblichen Teil des Energieverbrauches durch anaerobe Glykolyse ab, produziert dann selbst Laktat und die Laktatkonzentration im Plasma steigt an (STRYER et al.1975).
2.5.2.3 Laktatazidose
Eine Laktatazidose entsteht weder durch eine selektive Laktatproduktionssteigerung, noch durch eine isolierte Störung der hepatischen Laktatverwertung. Erst wenn eine durch Hemmung der Zellatmung bedingte Anhäufung von H-Ionen und/oder eine reduzierte Pufferkapazität oder verminderte renale Säureelimination hinzukommen, entsteht eine Laktatazidose (STRYER et al.1975).
2.5.2.4 Messmethoden
Laktat ist ein stabiler Stoff, er kann mit Hilfe von LDH aus der Muskulatur oder aus Hefe, in Gegenwart von NAD im optischen Test in Pyruvat umgewandelt werden.
Interferenzen mit anderen Substanzen sind in biologischen Proben nicht beobachtet worden. Damit eine quantitative Umsetzung des Laktats erfolgt, müssen bestimmte Reaktionsbedingungen gegeben sein. Es muss ein alkalisches Milieu vorliegen, denn dadurch wird das Reaktionsgleichgewicht mehr zum Pyruvat hin verschoben und H+ Ionen werden abgefangen (BERGMEYER 1984). Durch eine Transaminierungsreaktion muss das Pyruvat aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Die Messung von Laktat mit Hilfe von NAD-abhängiger Laktatdehydrogenase aus der Muskulatur hat verschiedene Nachteile. Es dauert z.B.
sehr lange Zeit bis ein Gleichgewicht bei der Reaktion erreicht werden kann.
Verschiedene Methoden wurden beschrieben, um dieses Problem zu beheben. Der Gebrauch von alkalischer Lösung führt zu einer mehr oder weniger schnellen Inaktivierung von Enzymen. Carbamyl-Reagenzien, welche dazu benutzt wurden, das Reaktionsprodukt Pyruvat „herauszufangen“ reagieren auch mit NAD und bilden Stoffe, welche dann im selben UV-Bereich Licht absorbieren wie NADH (BERGMEYER 1984). WIELAND (1974) schlug den Gebrauch von LDH aus Hefe vor. Dieses Flavohämoprotein transferiert Hydrogen von L-Laktat auf Ferricytochrome. Die Möglichkeit, entweder Hexacyanoferat (III) oder Fe (III) - phenanthroline zu nutzen, wobei sich das zuletzt genannte als zehn mal sensitiver erwies, wurde beschrieben. Beide Stoffe sind für den Routinegebrauch geeignet.
Laktat wird mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion gemessen.
Das Prinzip der Messung lautet wie folgt:
A. L-(+)-Laktat +NAD+ LDH Pyruvat + NAD +H+
B. Pyruvat+L-Glutamat ALT L-Alanin+ 2-Oxoglutarat
Die erste Reaktion verläuft deutlich zugunsten des Laktats. Laktat wird von der Laktatdehydrogenase nur vollständig dehydrogenisiert, wenn Pyruvat durch die Alaninaminotransferase (ALT)–Reaktion in Alanin umgewandelt wird. Reaktion B ist aus diesem Grund als „trapping enzymatic reaction“ für Pyruvat notwendig. Glutamat dient sowohl als Substrat als auch als Puffer der Reaktion. Eine quantitative Messung von Laktat ist möglich, sogar wenn in der Probe eine hohe Pyruvatkonzentration vorhanden ist. Die Erhöhung der NADH-Konzentration, gemessen an der Absorptionsveränderung bei 339nm (Hg 334 oder Hg 365), ist proportional zu dem Gehalt an L-Laktat. Das Gleichgewicht der Reaktion ist stark vom pH-Wert abhängig. Für Pyruvat ist ein pH-Wert von 8.9 optimal. Dieser pH-Wert beeinträchtigt die ALT-Reaktion nicht. Die optimale Temperatur liegt bei 25°C. Für eine quantitative Messung von Laktat und für einen zügigen Ablauf der Reaktion ist eine hohe Konzentration von LDH und NAD nötig. Zur Messung wird ungestautes venöses Blut benötigt (BERGMEYER 1984).
2.5.3 Beeinflussungsfaktoren der Messergebnisse
2.5.3.1 Einfluss der Blutstauungszeit auf die Messwerte
Von ZIERZ et al. (1989) wurde beim Menschen in einer Versuchsreihe der Einfluss der Blutstauungszeit auf die Laktat- und Pyruvatkonzentrationen untersucht. Dazu wurde ungestautes sowie gestautes Blut entnommen. In diesen Experimenten an zehn gesunden Kontrollpersonen zeigte sich, dass eine 3 minütige Stauung zu einem 1,3- fachen Laktatanstieg und zu einem 1,5- fachen Pyruvatanstieg führte. Der Quotient aus Pyruvat/Laktat fiel nach 3 Minuten Stauung auf 81% des ungestauten Wertes.
2.5.3.2 Einfluss der Tiefgefrierung auf die Messwerte
In einer weiteren Voruntersuchung haben ZIERZ et al. (1989) Aliquote des enteiweißtem Überstandes für 24 Stunden bei -20°C eingefroren und die Laktat- und
Pyruvatwerte bei 4 menschlichen Probanden vor und nach Tiefgefrierung miteinander verglichen. Das Einfrieren führte zu einem 1,1-fachen Anstieg des Laktatspiegels und zu einem Abfall des Pyruvatspiegels auf 80%. Der Quotient Pyruvat/Laktat war nach dem Einfrieren 1,4-fach höher im Vergleich zu der frischen Probe (ZIERZ et al. 1989).
2.6 Ziel dieser Studie
Für den Hund ist die Bedeutung von Mitochondriopathien anhand von größeren Studien noch nicht nachgewiesen worden. Da die klinische Diagnostik dieser Krankheiten oft schwierig ist, sollte Ziel dieser Studie sein, Referenzwerte für Laktat und Pyruvat im Liquor cerebrospinalis, sowie im Blut bei Hunden zu ermitteln, um eventuell erhöhte Werte von an Mitochondriopathie erkrankten Hunden erkennen und interpretieren zu können. Zusätzlich wurden verschiedene Einflussfaktoren auf die Messergebnisse getestet. Es sollte ferner überprüft werden, ob die Messung von Laktat und Pyruvat bei Hunden mit anstrengungsabhängiger Schwäche aufgrund der aufwendigen Messmethode sinnvoll ist, oder ob eine Muskelbiopsie effektiver über das Vorliegen einer Mitochondriopathie Aufschluss geben kann.
3 Material und Methode
In vorliegender Arbeit sollten Referenzwerte für Laktat- und Pyruvatkonzentrationen in Blut- und Liquor cerebrospinalis beim Hund erhoben werden, um Mitochondriopathien klinisch diagnostizieren, bzw. als Verdachtsdiagnose erhärten zu können. Dazu wurden verschiedene Gruppen von Probanden gebildet. Neben klinisch gesunden Hunden wurden Hunde mit definierten neurologischen Erkrankungen untersucht, die nicht an einer Mitochondriopathie litten. Damit sollte die Spezifität des Testverfahrens eruiert werden. Die erhaltenen Werte wurden mit der Gesamtzahl an Leukozyten im Blut und CSF, dem Glukosegehalt und den Blutgasewerten korreliert, um deren Einfluss auf die Messwerte zu überprüfen.
3.1 Geräte und Materialien
• Acrylküvetten, Co.No. 67740, Fa. Sarstedt, Nümbrecht
• Analysensystem Hitachi, Fa. Roche Diagnostics, Mannheim
• Blutgasanalysegerät, Rapid Lab 865, Fa. Bayer Diagnostics, München
• Cellcounter, Technicon H1E, Co.No. IRH 160, Fa. Bayer Diagnostics, München
• Faltenfilter, Marke Selecta, Fa. Carl Schleicher und Schüll, Dassel- Kreis Einbeck
• Fluorid-Heparin-Röhrchen, Fa. Sarstedt, Nümbrecht
• Lithium-Heparin-Röhrchen, Fa. Sarstedt, Nümbrecht
• Mikroskop, Laborlux 12, Fa. Leica, Bensheim
• Pipettenspitzen, Fa. Brand, Plastibrand, Wertheim
• Pipetten, Fa. Brand, Wertheim
• SAS, Version 8.2, Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover
• Spectralphotometer, U-2000, Fa. Hitachi, Tokio, Japan
• Zählkammer nach Fuchs-Rosenthal, Fa. Brand, Wertheim
• Zentrifuge, CL-GPKR Co.No. 330130, Fa. Beckmann, München
• Zentrifugenröhrchen, Neuraltyp, Fa. Sarstedt, Nümbrecht
3.2 Reagenzien
• DiffQuick ®, (hämatologische Färbelösung) Fa. Labor und Technik, Berlin
• NADH. Co. 340-101, Fa. Sigma Diagnostics, Thum
• TRIZMA (Trishydroxymethylaminomethan) Base Reagent, Co. 728-4, Fa.
Sigma Diagnostics, Thum
• Pyruvatstandard, Co. 726-10, Fa. Sigma Diagnostics, Thum
• Perchlorsäure, Fa. Merck, Darmstadt
• Laktat-Reagenzien (Puffer, Enzyme), Co. 1822837, Fa. Sigma Diagnostics, Thum
3.3 Untersuchungsmethoden
3.3.1 Gewinnung der Blutproben
Die Blutentnahme wurde durch Punktion der gestauten Vena cephalica antebrachii bzw. der Vena saphena lateralis durchgeführt. Ca. 1 ml Blut wurde in einem Lithium- Heparin-Röhrchen für die Pyruvatbestimmung und ca.1 ml Blut in einem Natrium- Fluorid-Röhrchen für die Laktatbestimmung aufgefangen. Die erste Blutentnahme erfolgte vor Einleitung der Narkose, die zweite während der Narkose unmittelbar nach Gewinnung des Liquor cerebrospinalis. 1 ml Blut aus den Lithium-Heparin- Röhrchen wurde sofort in ein Röhrchen, in welchem 2 ml eisgekühlte 8%ige Perchlorsäure vorgelegt war, überführt und bei 4 °C über 5 min inkubiert. Durch den Zusatz der Perchlorsäure fallen aus dem Blut sämtliche Eiweiße aus. Danach wurde das Röhrchen bei 3000 U/min 10 min lang zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und erneut bei 3000 U/min 10 min zentrifugiert.
Das Natrium-Heparin-Röhrchen wurde sofort bei 3000 U/min 10 Minuten lang zentrifugiert.
3.3.2 Gewinnung des Liquor cerebrospinalis
Der Liquor cerebrospinalis wurde unter Allgemeinanästhesie aus der Cisterna magna in der atlanto-okzipitalen Region entnommen und in einem Kunststoffreaktionsgefäß aufgefangen. Zur Pyruvatmessung wurde 1 ml des Liquor cerebrospinalis in ein Röhrchen, in dem 0,5 ml eiskalte 8% ige Perchlorsäure zum Enteiweißen des Liquor cerebrospinalis vorgelegt war, überführt und 5 min bei 4 °C inkubiert. Im Folgendem wurde das Röhrchen bei 3000 U/min 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand abpipettiert.
3.3.3 Pyruvatbestimmung
3.3.3.1 Pyruvatmessung mit Hilfe eines Testkits der Firma Roche-Diagnostics (Hersteller 1)
Die Pyruvatbestimmung erfolgte zunächst mit Hilfe des Pyruvat-Test-Kits des Herstellers 1. Bei dieser Messung wurde das Blut bzw. der Liquor cerebrospinalis zuvor zu gleichen Teilen mit 8%-iger Perchlorsäure enteiweißt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 3000 U/min wurden 1,25 ml des Überstandes gewonnen, mit 0,625 ml der Lösung 1, welche vom Hersteller nicht genauer definiert wird, vermischt und 15 min in einem Eiswasserbad gelagert. Danach wurde das Gemisch durch ein kleines Faltenfilterpapier filtriert. Die Haltbarkeit dieses Filtrates liegt nach Herstellerangaben bei Lagerung zwischen +2 und -8°C bei 24 Stunden. 1 ml des Filtrates wurde zusammen mit 0,1 ml NADH (Lösung 2) in eine Küvette überführt.
Nach kurzem Mischen wurde die Extinktion E1 bei 340 nm im Handphotometer gemessen. Im Folgendem wurde 0,01 ml LDH (Lösung 3) hinzugefügt, kurz gemischt und ca. 10 Minuten der Stillstand der Reaktion abgewartet, um dann die Extinktion E2
zu messen. Kam die Reaktion nach 10 Minuten nicht zum Stillstand, wurden noch 3 bis 5 weitere Ablesungen im Abstand von 2 min vorgenommen. In diesem Fall wurde die Extinktion E2 auf die Zeit der Zugabe von Lösung 3 extrapoliert. Aus beiden Extinktionen wurde dann die Differenz (∆Extinktion) ermittelt. Die
