Elektrochemische Mikrosensoren

Elektrochemische Mikrosensoren

Glucosesensor

Verfasser:

S. Lysenko, W. Dachtler

Übersicht

I. Hintergründe und Grundlagen

1. Was ist Diabetes ? 2. Sensorenarten

3. Funktionsprinzip des Glucosesensors 4. Aufbau des Glucosesensors

5. Herstellung der Sensoren

6. Elektrochemische Grundlagen

II. Charakterisierung des Sensors und

praktische Anwendung

1 Was ist Diabetes?

1.1 Wesen und Arten der Erkrankung

- Der Diabetes ist eine Stoffwechselstörung - Typ-1-Diabetes: - Insulin wird nicht gebildet

- Ursache: Zusammenwirken von Erbfaktoren, Virusinfekten und

Autoimmunerkrankungen

- Seltene Krankheit, an der in Deutschland zwischen 150000- 200000 Menschen leiden

-Typ-2-Diabetes: - Vorhandener Insulin wird nicht freigesetzt oder gelangt nicht richtig zum Einsatz

- Ursache: angeborene oder erworbene Insulinunempfindlichkeit

- In Deutschland 5-7 Mio. Typ-2-Diabeteskranke

- Insulin: Verdauungsenzym, das überflüssige Nährstoffe in Speicherformen umbaut; ermöglicht Abbau von Glucose; Bildung in der Bauchspeicheldrüse - Weltweit etwa 117 Mio. Diabeteskranke

- Beide Arten unheilbar

- Therapie: ständige Gabe von Insulin

1.1 Tägliche Kontrolle

- Zur Kontrolle der Therapie des Diabetes mellitus sind regelmäßige

Eigenmessungen – d.h. die Selbstkontrolle der Blut- und Harnzuckerwerte wichtig, um erhöhte oder erniedrigte Blutzuckerwerte sofort zu erkennen und zu behandeln.

- Durch den (dauerhaft) erhöhten Blutzuckerspiegel können körperliche Schwäche; Gefäßverschlüsse; Nierenversagen; Ketoacidose und Coma Diabeticum auftreten.

=> Motivation einen geeigneten Sensor zu bauen .

2 Sensorenarten

• Sensoren sind Messfühler, die eine bestimmte Messgröße erfassen können und diese z.B. in eine elektrische Größe transformieren.

• Unterteilung in a) Chemosensoren

- Reagieren auf die Anwesenheit eines bestimmten Analyten mit einem physikalisch-chemischen Prozess c) Biosensoren

- Nutzen zur Erkennung eines Analyten

biochemische Prozesse

2.1 Funktionsprinzip der Biosensoren

• Alle Biosensoren arbeiten nach einem einheitlichen

Funktionsschema

2.2 Biosensoren-Einteilung nach dem Detektionsprinzip

• Nach der Art des Detektionsprinzips erfolgt die Einteilung der Biosensoren in vier Gruppen

- Kalorimetrie

- Microgravimetrische Detektion - Optische Detektion

- Elektrochemische Detektion

2.2.1 Kalorimetrie (Temperatureffekte)

- Die Temperaturerhöhung einer exothermen Reaktion ist direkt proportional zu der Stoffmenge der Reaktionspartner

- Nachteile:

Temperatureffekte klein

Gut isolierte Gefäße notwendig Ebenso exakt die gleiche

Temperatur der

Reaktionspartner vor der

Messung

2.2.2 Mikrogravimetrische Detektion (Piezoelektrische Sensoren)

- Bei diesem Sensortyp reagiert ein in Resonanz schwingender Kristall auf die Veränderung der Massebeladung

- Nachteil:

Einmalige Anwendung (Allerdings geringe Herstellungskosten )

2.2.3 Optische Sensoren (Optoden)

- Gut geeignet für die Sauerstoffgehaltsmessungen in Flüssigkeiten (oder bei den Enzymreaktionen, bei denen Sauerstoff gebildet oder verbraucht wird) - Meßprinzip: Fluoreszenzlöschung

- Lichtwellenleiter mit einem Indikator als optische Meßeinrichtung

- Lumineszenz- oder Absorbtionseigenschaften des Indikators sind O

- Abhängig

- Vorteile:

- Räumliche Trennung von Meßgerät und optischer Meßeinrichtung

- Lichtwellenleiter sind von magnetischen oder elektrischen

Störfeldern unbeeinflußt

2.2.4 Elektrochemische Detektion

- 2 Unterarten: Amperometrie und Potentiometrie

- Amperometrie: Messung des Stromflusses bei konstanter Spannung. Gut geeignet für Stoffwechselprodukte, die leicht oxidiert bzw. reduziert werden können (H

O

).

- Potentiometrie: Messung des elektrochemischen Potentials von ionischen

Reaktionsprodukten (NH

, CO

, H

)

3. Funktionsprinzip des Glucosesensors

• Glucose und Sauerstoff werden durch das Enzym

Glucoseoxidase zu H

O

und Gluconolacton umgesetzt, das anschließlich zu Gluconsäure hydrolisiert:

O H

H O

H H O

H

H

H O H O H

O H

G O D O₂ H₂O

O H

H O

H H O

H

H O H O

O H

H₂O₂

C O O H H O H

O H

H O H H

O H C H₂O H H

β-D -G lu c o s e D - G lu c o n o la c to n

H y d ro ly se

D - G lu c o n s ä u re

• Das entstandene Wasserstoffperoxid wird bei einem Potential von U = +600 mV vs. Ag/AgCl an einer Platinelektrode oxidiert. Dadurch wird ein Stromfluss möglich:

• Der Stromfluss wird über ein hochempfindliches Amperemeter registriert.

=> Die Stromstärke ist dabei proportional zur Glucosekonzentration.

H ₂ O ₂ U = 600 mV

O ₂ + 2H ⁺ + 2e ^-

4. Aufbau des Glucosesensors

4.1. Chip-Layout

• Einkristallines Siliciumsubstrat als Basis, das pyramidenstumpfförmige Hohlräume

(Containments) aufweist

• Innere Oberfläche ist mit einer Elektrodenschicht aus Platin bedeckt

• Containments werden mit GOD in einer PVA-Matrix gefüllt

• Verschluss durch eine Verkapselungsschicht

• Messflüssigkeit wird mit einer konstanten

Fließgeschwindigkeit durch den Chip gepumpt

• Glucose kann durch die diffusionshemmende Membran in das Containment diffundieren

4.2 Vorteile der Containmenttechnologie

- Die Containmentsensoren werden auf der Rückseite kontaktiert Vereinfachte Verbindungs- und Verkapselungstechnik;

einfacher Anschluss an Durchflusszellen.

- Gute Verankerung der Stofferkennenden Membran

- Minimale Enzymauswaschung in der Stofferkennenden Membran gegenüber Immobilisierung von GOD auf planarer Oberfläche

- Mechanische Stabilität von Membranen und Biokomponente.

- Aufbringen mehrerer Analysensysteme auf einem Chip.

- Massenproduktionstauglichkeit

4.3 Abbildung des Glucosesensors

5. Herstellung des Glucosesensors

Sämtliche Prozesse zur Herstellung der Sensor-Chips erfolgen im Reinraum (gleichmäßige

Klimabedingungen und Vermeidung einer Contamination)

Einkristalline Si-Scheibe als Ausgangsprodukt 1) Vertiefung für Durchflüsskanal

2) Bildung der beiden Containments und Zu- bzw.

Ausführungsöffnungen

3) Metallisierung des Containments

4) Verschließung des Kanals mit einem Glasdeckel

5) Befüllung und Verkapselung

6. Elektrochemische Grundlagen

6.1. Dreielektrodenanordnung

• Der Glucosesensor arbeitet mit einer Dreielektrodenanordnung

• An der Arbeitselektrode findet die Redox-Reaktion statt

• Die hochohmigen Referenzelektrode und der Potentiostat kontrollieren das Potential

• Die niederohmige Gegenelektrode dient als Stromkontakt.

• Dreielektrodenanordnung: die Messung wird nicht von Stromabhängigen

Prozessen an der Gegenelektrode beeinflusst

Die Stromstärke ist somit nur noch vom

Stofftransport abhängig

6.2 Stofftransport

Stofftransport

- Migration: Wanderung aufgrund eines elektrischen Feldgradienten - Diffusion: Wanderung aufgrund eines Konzentrationsgradienten - Konvektion: durch eine Strömung verursachte Bewegung

Problem

- Diffusionsgrenzstrom ist proportional zur Konzentration Lösung

• Migration wird durch Leitelektrolytzusatz (NaCl) verringert

• Konvektion wird ausgeschlossen da im Elektrolyt keine Strömung auftritt

6.3 Mathematische Grundlagen

• Diffusionsgrenzstrom

• Nach dem 1. Fickschen Gesetz gilt:

• Für die elektrochemische Stromdichte gilt:

• Bei Überspannung geht c

gegen 0:

• Somit ist der Diffusionsstrom nur von der Anfangskonzentration abhängig:

dx D dc dt

dN = −

N i,0 El

i, 0

x Teilchen

Ladung

δ c zFD c

dx zFD dc j

zF

j −

 =



 



= 

⋅

=

=

A I δ

zFD c

j

N El i,

Ladung

= =

El i, N

Grenz

c

δ I = zFDA ⋅

ke

schichtdic Diffusions

Nernstsche N

δ

Elektrode;

der an ion Konzentrat ci,0

; Elektrolyt im

ion Konzentrat El

ci,

konstante;

Diffusions D

stante;

Faradaykon F

l;

Ladungszah z

=

=

=

=

=

=

II. Charakterisierung des Sensors und praktische Anwendung

7.1.Apparaturaufbau

Messlösungen Sensor mit den

Elektroden

7.2. Voltammetrie und Voltammogramm

• Voltammetrie

- Messung des Stromes in Abhängigkeit vom

Elektrodenpotential

- Ermittlung des Arbeitspotentials Voltammogramm

- Kein Signal für den Phosphatpuffer Keine Störung seitens des Puffers

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-4,0x10^-7 -2,0x10^-7 0,0 2,0x10^-7 4,0x10^-7 6,0x10^-7 8,0x10^-7 1,0x10^-6

1,2x10^-6 Voltammogramm eines 100 mM Phosphatpuffers

Stromstärke [A]

Spannung [V]

7.3. Ermittlung des Arbeitespotentials

• Ermittlung des

Arbeitspotentials für die

amperometrische Bestimmung von H

O

1. Beginn der Zersetzung von H

O

2. Sättigungswert oder

Diffusionsgrenzstrom 3. Verarmung von

Wasserstoffperoxid an der Elektrode, δ

wächst in die Lösung hinein

4. Zersetzung von H

O

-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

-2,0x10^-6 -1,0x10^-6 0,0 1,0x10^-6 2,0x10^-6 3,0x10^-6 4,0x10^-6

Voltammetrie einer Pufferlösung mit 2 mM H₂O₂

Stromstärke [A]

Spannung [V]

7.4. Kalibration des Glucosesensors

• Messung verschiedener Lösungen unterschiedlicher Konzentration

• Phosphatpuffer fängt die entstehenden H

-Ionen ab

• Kein Plateau bei 50 mM, nicht genügend Pufferkapazität

Erniedrigung der Aktivität der GOD

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

0,0 2,0x10^-7 4,0x10^-7 6,0x10^-7 8,0x10^-7 1,0x10^-6

Sensorkennlinie bei 100 mM Phosphatpuffer

50 mM 40 mM

30 mM 20 mM

15 mM

10 mM 4 mM 6 mM

2 mM Puffer 1 mM

Stromstärke [A]

Zeit [s]

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

0,0 2,0x10^-8 4,0x10^-8 6,0x10^-8 8,0x10^-8

30 mmol 40 mmol

15 mmol 20 mmol

6 mmol 10 mmol

2 mmol

Abhängigkeit der Sensorkennlinie von der Pufferkapazität

(20mmol Puffer)

Stromstärke [A]

t [sec]

7.5. Kalibrationskurve

• Auftragung von Stromstärke gegen Konzentration

• Abweichung der letzten beiden Werte ist auf ungenügende Pufferkapazität zurückzuführen

0 10 20 30 40 50

-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Signalabhängigkeit von der Pufferkonzentration

20mmol/L 100mmol/L

I [10-8 A]

Glucosekonzentration [mmol/L]

7.6. Paremeter zur Charakterisierung des Glucosesensors

1. Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit -Sauerstoffkonzentration im Reservoir -Glucosekonzentration

1. Fliessgeschwindigkeit 2. Selektivität

3. Störsubstanzen

4. Interferenzen nach heterogenem und homogenem Mechanismus

7.6.1. Einfluss der Sauerstoffkonzentration

• Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt unter anderem von der Sauerstoffkonzentration ab

• Zu kleine Sauerstoffkonzentration begrenzt den linearen

Messbereich

• Abhilfe: Verkapselung des Containments mit einer

sauerstoffpermeablen Membran

• Reaktionsgeschwindigkeit wird von der Glucosekonzentration beeinflusst

• Um die Konzentration gering zu halten wird eine

diffusionshemmende Membran an der Öffnung des Containments angebracht

Amperogramme zweier Sensoren

7.6.2. Fliessgeschwindigkeit

• Gemessene Stromstärke abhängig von der

Fliessgeschwindigkeit

0 500 1000 1500 2000 2500

0,0 5,0x10^-8 1,0x10^-7 1,5x10^-7 2,0x10^-7

Abhängigkeit von der Fliessgeschwindigkeit

5 µl/min

10 µl/min 5 µl/min

10 µl/min 5 µl/min

10 mM

2 mM

Puffer

Stromstärke [A]

Zeit [s]

7.6.3. Selektivität

• GOD reagiert selektiv auf Glucose

• Bei Fructose gibt es kein Signal

Hohe Selektivität des Sensors

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

0,0 1,0x10^-7 2,0x10^-7 3,0x10^-7 4,0x10^-7

5,0x10^-7

Selektivität des Glucosesensors

Puffer 10 mmol Fructose

10 mmol Glucose

Stromstärke [A]

Zeit [s]

7.6.4 Einfluss von Störsubstanzen

• Auch geringe Mengen Ascorbinsäure können das Ergebnis der

Messung stören

0 500 1000 1500 2000

0,0 1,0x10^-7 2,0x10^-7 3,0x10^-7 4,0x10^-7 5,0x10^-7

Einfluss von Störsubstanzen am Beispiel von Ascorbinsäure

Puffer

10 mmol Glucose + 1 mmol Ascorbinsäure 10 mmol Glucose

Stromstärke [A]

Zeit [s]

• Bei 600 mV oxidierbare Substanzen verursachen Störungen, z.B.

Ascorbinsäure, Harnsäure, Medikamentenrückstände u.s.w.

• Bei einem Potential von 600 mV kommt es zur folgenden Reaktion

O

OH HO

OH OH

O O

O O

OH OH

O U = 600 mV, Pt

+ 2 e^- + 2 H⁺

7.6.6. Ansätze zur Unterdrückung von Störungen

• Differenzmessung

• Parallelmessung ohne Glucose

• Differenz der Werte ergibt Glucosekonzentration

• Beide Sensoren müssen gleiche Diffusionseigenschaften aufweisen

• Diffusionsbarrieren für hochmolekulare Verbindungen

• Aufbringen einer nur für H

O

permeablen Membran

• Störsubstanzen können nicht in die Containments diffundieren

Literatur

• F. Scheller, F. Schubert, Biosensoren, Birkhäuser Verlag, Basel, 1989

• V. M. Schmidt, Elektrochemische Verfahrenstechnik, Wiley. VCH GmbH & Co. KGaA, 2003

• Knoll M., Verfahren zur Herstellung von miniaturisierten Chemo- und Biosensorelementen mit ionenselektiver Membran sowie von

Trägern für diese Elemente, Deutsches Patent, DE 4115414, 1991

• Knoll M., Miniaturisierte Durchflussmesskamer mit integrierten Chemo- und Biosensorelementen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung, Deutsches Patent, DE 44 08 352, 1994

• R. Holze, Leitfaden der Elektrochemie, B. G. Teubner Stuttgart- Leipzig, 1998

• Internet: www.diabeticus.de/infos/technik/biosensor.html