H = A + + Cu Bu Analytische Chemie

(1)

Herbstsemester 2013

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid, Dr. Martin Pabst | martin.pabst@org.chem.ethz.ch

HCI D323

Martin.pabst@org.chem.ethz.ch http://www.analytik.ethz.ch/

Zusammenfassung der letzten Einheit:

1) Abweichung von der idealen Peakform

Symmetrisch vs. asymetrisch tailing faktor

3) Beschreibung der Effizienz der Chromatographie

Theoretische Böden Van Deemter Gleichung

H = A + B

u + C u

A: Eddy-Diffusion B: Longitudinaldiffusion C: Massentransport-Effekte

(2)

Herbstsemester 2013 ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid, Dr. Martin Pabst | martin.pabst@org.chem.ethz.ch 3

C

_M

∝ 1 D

_M

S S

S D

C ∝ d C_M ∝ 1 D_M Massentransport

Cu = (Cm+Cs)u

Verursacht durch eigentlichen chromatographischen Prozess, nämlich durch die Einstellung des Verteilungsgleichgewichts Zeitaufwand zur Einstellung des Gleichgewichts

- Ort der Teilchen in den Phasen (Startpunkt) - Widerstand gegen „Massentransfer“ (Viskosität)

- Fluss der mobilen Phase (Flussprofil, Auseinandertreiben) Flüssigchromatographie

Gaschromatographie

Eddy Longitudinal

Zusammenfassung der letzten Einheit:

4

Resistance to Mass Transfer Resistance to mass transfer is one of the dispersion processes that cause the solute peak to broaden during its passage along the

chromatographic column. The dispersion process results from the exchange kinetics of the solute between the two phases. During passage through the column, the solute continually transfers from the mobile phase to the stationary phase and from the stationary back to the mobile phase. This process is not instantaneous because a finite time is required for the solute to transfer by diffusion through the mobile phase in order to enter the stationary phase. Thus, the molecules close to the stationary phase will enter it immediately, whereas those some distance from the stationary phase will enter it sometime later. However, as the mobile phase is moving, during the time the

molecules are diffusing towards the stationary phase they will be swept along the column and, thus, away from those molecules that were close and entered it rapidly.

This causes the solute peak to be dispersed (spread) and the process is called resistance to mass transfer in the mobile phase. Dispersion due to resistance to mass transfer in the stationary phase is exactly analogous to that in the mobile phase.

Those molecules close to the surface of the stationary phase will leave the surface and enter the mobile before those that have diffused further into the stationary phase and require a longer period to diffuse back to the surface. Thus, those molecules that quickly enter the mobile phase because they were close to the surface will be swept away from those molecules still diffusing to the surface. This process also causes the solute peak to be dispersed and this process is called resistance to mass transfer in the stationary phase.

Aus: http://www.chromatography-online.org/topics/resistance/to/mass/transfer.html

(3)

1. Abweichungen von der idealen Peakform (Abweichung vom Nernst Gesetz)

2. Überlagerung von Peaks

3. Auflösung (=Trennung) zweier Peaks

Flüssigchromatographie (LC) Detektoren

Trennsäule

Detektor

(4)

Leichte Abweichungen von der Nernst-Verteilung

Abweichungen von der idealen Peakform

8

Zeit t

(5)

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Abweichungen von der idealen Peakform

9

Zeit t

Intensität I

T: Asymmetrie-Faktor oder Tailing-Faktor

(oft werden Asymmetrien bis T<1.2 bzw. T>0.8 toleriert)

Abweichungen von der idealen Peakform

Asymmetrische Peaks sind meist auf Überladungseffekte zurückzuführen.

Überladung der mobilen Phase:

Der Analyt kondensiert auf der stationären Phase und wird erst nach und nach von der mobilen Phase abtransportiert. Es kommt also in der Form zu einer

asymmetrischen Verteilung, dass ein grosser Anteil der Moleküle später als im Idealfall die Säule verlässt.

Überladung der stationären Phase:

Die Bindungsstellen auf der stationären Phase sind mit Analyten belegt.

Analytenmoleküle aus der mobilen Phase können nicht mehr binden und werden

schlechter retendiert. Ein wesentlicher Anteil der Analytenmoleküle verlässt die

Säule also früher als bei idealer Retention.

(6)

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

11

Nernst-Gesetz:

ist bei konstanter Temperatur eine Konstante.

Daraus folgt: c

_S

= K

_C×c_M

Bei Abweichungen vom Nernst-Gesetz ist c

_S

= f(c

_M

) keine lineare Funktion mehr bzw. K

_C

ist keine Konstante.

Retentionsfaktor:

Daraus folgt:

K

_C

= c

_S

c

_M

k= t_R −t_M t_M = t ′ _R

t_M =K_C V_S V_M =K_C

β

′ t

_R

= t

_M

β ^K

^C

^bzw. ^t

^R

^′ ^∝ ^K

^C

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

12

Tailing:

Bei hoher Konzentration:

K_C

sinkt

Überladung der stationären Phase

Peak-Maximum verschiebt sich zu kleinerer t_R

t_R

sinkt

wegen

′ t

_R

= t

_M

β ^K

^C

^bzw. ^t ^′

^R

^∝ ^K

^C

Fronting:

K_C

steigt

Überladung der mobilen Phase

Peak-Maximum verschiebt sich zu höherer t_R

t_R

steigt

wegen

M S

C

c

K = c

^{= const. ?}

(7)

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

13

Beispiel: Fronting mit Verschiebung des Peakmaximums zu höherer t

_R

Peakformen Integrale

Peakformen und insbesondere Integrale zeigen:

Ein wesentlicher Anteil der Moleküle verlässt beim Frontig später die Säule als im Fall des Gauss-Peaks Überladung der mobilen Phase

Starke Abweichungen vom Nernst-Gesetz und Nicht-Gleichgewichtsbedingungen

• In der Praxis sind stärkere Abweichungen vom Nernst-Gesetz möglich

• In der Chromatographie wird praktisch nie der Endpunkt der Gleichgewichtseinstellung erreicht

Gründe, z.B.

- Langsame Gleichgewichtseinstellung z.B. wegen langsamer Stofftransportprozesse

- Bedingungen ändern sich dauernd (Transport der mobilen Phase, defekte o. inhomogene stationäre Phase)

Wie sich Peakformen unter diesen Bedingungen ändern, lässt sich kaum vorhersagen. Asymmetrische Peaks sind aber auch hier eine Folge von Überladungseffekten.

Fragen: Was geschieht auf der Ebene der Moleküle?

Verlässt ein wesentlicher Anteil der Moleküle früher oder später die

Säule?

(8)

Abhilfe bei Fronting/Tailing

15

• Asymmetrische Peaks sind meist eine Folge von Überladungseffekten.

• Einschränkung sowohl von qualitativer als auch von quantitativer Analyse

Abhilfe:

Verringerung des Probenvolumens bzw. der Probenkonzentration (weniger Analytenmoleküle auf der Säule)

Erst wenn das keinen Effekt hat:

Änderung der betroffenen Phase (z.B. Wechsel des Eluenten, Wechsel der stationären Phase, andere Gradienten)

Wechsel von mobiler und insbesondere stationärer Phase sind aber mit Zeitaufwand und Kosten verbunden.

16

Überlagerung von Peaks und

Koelution

(9)

Koelution

17

Zwei Analyten haben annähernd die gleiche Retentionszeit.

Ein für beide Substanzen sensitiver Detektor erfasst nicht die Einzelpeaks (gestrichelte Linien), sondern die Summe aus beiden (durchgezogene Linie).

Abhilfe:

• Optimieren der Trennbedingungen (Lineargeschwindigkeit, mobile Phase, stationäre Phase, Temperatur, Gradienten)

• Verwendung verschiedener Detektoren mit unterschiedlichen Empfindlichkeiten für die beiden Substanzen (oder: verschiedene Wellenlängen bei spektroskop. Detektor)

• MS-Detektion (jede Masse erzeugt ein eigenes Detektorsignal) Fronting?

II) Auflösung und

Optimierung einer Trennung

(10)

Definition der Auflösung einer Trennung

19

R

_S

= t

_{R 2}

− t

_R1

w

_b1

+ w

_{b 2}

2 

  

 

= 2 t (

_{R 2}

− t

_R1

)

w

_b1

+ w

_{b 2}

= Differenz der Retentionszeiten Mittelwert der Basisbreiten Auflösung R

_S

zweier benachbarter Peaks:

Auflösung

20

R_S

< 0.75

Überlagerung bzw. Koelution

R_S

> 0.75

Zwei Peaks erkennbar

R_S

> 1.5

Grundlinien- getrennte

Peaks

(11)

Auflösung

21

R_S = 2 t

(

_{R 2}−t_R1

)

w_b1+w_{b 2} ≈ t_{R 2}−t_R1

w_b = t_{R 2}−t_R1 4σ

Aus der Näherung kann man folgende Gleichung

herleiten:

R

_S

= α − 1 α



  

  k

₂

1 + k

₂



  

  N 4



  

 

α Trennfaktor k Retentionsfaktor

N Anzahl theoretischer Böden

α , k und N sind die “Schrauben”, an denen man zur Optimierung einer Trennung drehen kann.

Auflösung

R

_S

= α − 1 α



  

  k

₂

1 + k

₂



  

  N 4



  

 

α ^: Trennfaktor k: Retentionsfaktor

N: Anzahl theoretischer Böden

k ∝ t

_R

N ∝ 1 σ

²

α = t

_{R 2}

′

t

_R1

(12)

Auflösung _R

S

= α − 1

α









k 1 + k









N 4



 



 

k

k 1+k

αααα

N

N 4

k ∝ K

_C

k kann verändert werden, indem man K_Cändert:

• Temperatur

• mobile Phase ändern

• stationäre Phase ändern

N erhöhen:

längere Säule (aber:

Kosten, Analysezeit) Lineargeschwindigkeit optimieren (van-Deemter) N oft erst dann optimiert, wenn Optimieren von k und αnicht zum Ziel führt α von vielen Parametern

abhängig:

• Temperatur

• mobile Phase

• stationäre Phase

α in diesem Zusammenhang auch

“Selektivität” genannt

α = K

_{C 2}

K

_C1

Oft aber können

α

, k und N nicht unabhängig voneinander geändert werden

24

Auflösung _R

_S

₌ ^α ⁻ ¹

α









k 1 + k









N 4



 



 

k

k 1+k

αααα

N

N 4

Erhöhung von k:

bessere Auflösung, aber höhere Retentionszeiten

längere Analysenzeiten breitere Peaks

Erhöhung auf k > 10 bringt kaum Verbesserung

Erhöhung von N:

geringere Peakbreite (Standardabweichung σ⁾ Wurzelfunktion,

d.h. viermal höheres N bewirkt nur Verdopplung der Auflösung

Erhöhung von α:

grösserer Abstand der Peaks im Chromatogramm

αknapp über 1: kleine

Änderungen von αbewirken eine starke Änderung der Auflösung

t

_R

∝ k

(13)

Gradientenelution

25

Oft findet man mehrere ungenügend getrennte Peaks in einem Chromatogramm.

Optimieren eines Parameters kann gegenläufige Effekte auf verschiedene Peaks haben.

Abhilfe: Gradientenelution: stufenweise oder graduelle Änderung von Trennparametern

LC:

Lösungsmittel- gradient

Isokratische Trennung:

Lösungsmittelzusammensetzung konstant während der Trennung

Gradiententrennung:

Änderung des Eluenten

(z.B. Acetonitril-Wasser-Gemisch in verschiedenen Konzentrationen)

t t

Häufig: Erhöhung der Elutionskraft während der Trennung

Optimierung einer Trennung

Ziel der Optimierung ist es,

eine effektive Peakauflösung (R _S > 1.5) in möglichst kurzer Analysenzeit

zu erreichen

H = A + + Cu Bu Analytische Chemie

Analytische Chemie

(für Biol. / Pharm. Wiss.)

Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)

Dr. Martin Pabst

Zusammenfassung der letzten Einheit:

1) Abweichung von der idealen Peakform

Symmetrisch vs. asymetrisch tailing faktor

3) Beschreibung der Effizienz der Chromatographie

Theoretische Böden Van Deemter Gleichung

H = A + B

u + C u

C

∝ 1 D

Cu = (Cm+Cs)u

Zusammenfassung der letzten Einheit:

1. Abweichungen von der idealen Peakform (Abweichung vom Nernst Gesetz)

2. Überlagerung von Peaks

3. Auflösung (=Trennung) zweier Peaks

Flüssigchromatographie (LC) Detektoren

Leichte Abweichungen von der Nernst-Verteilung

Abweichungen von der idealen Peakform

Zeit t

Abweichungen von der idealen Peakform

Zeit t

(oft werden Asymmetrien bis T<1.2 bzw. T>0.8 toleriert)

Abweichungen von der idealen Peakform

Asymmetrische Peaks sind meist auf Überladungseffekte zurückzuführen.

Überladung der mobilen Phase:

Der Analyt kondensiert auf der stationären Phase und wird erst nach und nach von der mobilen Phase abtransportiert. Es kommt also in der Form zu einer

asymmetrischen Verteilung, dass ein grosser Anteil der Moleküle später als im Idealfall die Säule verlässt.

Überladung der stationären Phase:

Die Bindungsstellen auf der stationären Phase sind mit Analyten belegt.

Analytenmoleküle aus der mobilen Phase können nicht mehr binden und werden

schlechter retendiert. Ein wesentlicher Anteil der Analytenmoleküle verlässt die

Säule also früher als bei idealer Retention.

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

Nernst-Gesetz:

ist bei konstanter Temperatur eine Konstante.

Daraus folgt: c

= K

Bei Abweichungen vom Nernst-Gesetz ist c

= f(c

) keine lineare Funktion mehr bzw. K

ist keine Konstante.

Retentionsfaktor:

Daraus folgt:

K

= c

c

β

′ t

= t

β K

bzw. t

′ ∝ K

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

Tailing:

sinkt

sinkt

′ t

= t

β K

bzw. t ′

∝ K

Fronting:

steigt

steigt

c

K = c

Leichte Abweichungen vom Nernst-Gesetz

Beispiel: Fronting mit Verschiebung des Peakmaximums zu höherer t

Peakformen Integrale

Peakformen und insbesondere Integrale zeigen:

Ein wesentlicher Anteil der Moleküle verlässt beim Frontig später die Säule als im Fall des Gauss-Peaks Überladung der mobilen Phase

Starke Abweichungen vom Nernst-Gesetz und Nicht-Gleichgewichtsbedingungen

• In der Praxis sind stärkere Abweichungen vom Nernst-Gesetz möglich

• In der Chromatographie wird praktisch nie der Endpunkt der Gleichgewichtseinstellung erreicht

Wie sich Peakformen unter diesen Bedingungen ändern, lässt sich kaum vorhersagen. Asymmetrische Peaks sind aber auch hier eine Folge von Überladungseffekten.

Fragen: Was geschieht auf der Ebene der Moleküle?

β ^K

^bzw. ^t

^′ ^∝ ^K

β ^K

^bzw. ^t ^′

^∝ ^K

α ^: Trennfaktor k: Retentionsfaktor