Untersuchungen zur Suppression der NF-kappaB-Aktivierung in Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli (STEC) infizierten Säugerzellen

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Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH

35392 Gießen · Frankfurter Str. 89 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375

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1. Auflage 2007

© 2007 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany ISBN 978-3-939902-30-0 Verlag: DVG Service GmbH Frankfurter Straße 89 35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net www.dvg.net

Untersuchungen zur Suppression

der NF-

κκκκ

B-Aktivierung in

Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli

(STEC) infizierten Säugerzellen

Inauguraldissertation

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Humanbiologie

(Dr. biol. hom.)

des Fachbereichs Medizin

der Justus-Liebig-Universität Gießen

vorgelegt von Isabel Krabs

Tierärztin aus Unna

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie

Direktor: Prof. Dr. T. Chakraborty

des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen

Gutachter: Prof. Dr. Holger Hackstein

Gutachter: Prof. Dr. Michael U. Martin

Ich erkläre:

Ich habe die vorgelegte Dissertation selbständig, ohne unerlaubte fremde Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt, die ich in der Dissertation angegeben habe. Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht veröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten.

I

NHALTSVERZEICHNIS

A

Z

S

1

E

INLEITUNG

1.1 Enteropathogene Escherichia coli - Allgemeines 1

1.2 ETEC, EAEC und EIEC 2

1.3 EPEC und STEC/EHEC – A/E-Läsionen formende Darmpathogene 4

1.3.1 Shiga Toxin-produzierende Escherichia coli (STEC) 4 1.3.2 Pathogenitätsinsel – Locus of Enterocyte Effacement (LEE) 5 1.3.2.1 Typ-III-Sekretions-System (TTSS) 7 1.3.2.2 Escherichia coli secreted proteins (Esp) 7 1.3.2.3 "Attaching and effacing" (A/E) 8

1.4 Signaltransduktion 10

1.4.1 Mitglieder der Rel/NF-κB-Familie 11

1.4.2 Mitglieder der IκB-Familie 13

1.4.3 Mitglieder der IκB Kinase (IKK)-Familie 15 1.4.4 Mechanismus und Regulation der NF-κB-Aktivierung 17

1.4.5 Der NF-κB-Signaltransduktionsweg 18 1.4.5.1 Klassischer Signaltransduktionsweg 18 1.4.5.1.1 Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor-Signaltransduktionsweg 19 1.4.5.1.2 Toll/-IL-1-Rezeptor-Signaltransduktionsweg 20 1.4.5.2 p105 Signaltransduktionsweg 22 1.4.5.3 Alternativer Signaltransduktionsweg (p100) 23

2

M

ATERIAL

2.1 Bakterienstämme 29

2.2 Plasmide 30

2.3 Eukaryontische Zelllinien 30

2.4 Mauslinie 31

2.5 Nukleotide und Nukleinsäuren 31

2.6 Für die Gelretardationsexperimente verwendete doppelsträngige

Oligonukleotide 31

2.7 Antikörper 32

2.7.1 Antikörper für Western Blots 32

2.7.2 Antikörper für Gel-Supershift-Experimente 33

2.8 Chemikalien, Enzyme, Antibiotika 34

2.9 Lösungen, Puffer und Medien 34

2.9.1 Reagenzien zur Bakterienkultur 35

2.9.2 Medien und Medienzusätze für die Zellkultur 35

2.9.3 Puffer zur Proteinextraktion 38

2.9.3.1 Puffer zur Proteinextraktion aus Zellen permanenter Zelllinien 38 2.9.3.2 Puffer zur Proteinextraktion aus Primärzellen 39 2.9.4 Puffer und Lösungen zur Proteinanalytik 39 2.9.5 Puffer und Lösungen zu Protein-DNA-Bindungsstudien 41 2.9.6 Puffer für den Luciferase-Reportergen-Assay 42

2.10 Molekulargewichtsstandards 42

2.10.1 Protein-Größenstandard 42

2.11 Verwendete "Kits" 43

2.12 Gele 43

2.12.1 5%-iges, natives Polyacrylamidgel für Gelretardationsexperimente 43 2.12.2 Polyacrylamid-Trenngele zur Proteinanalytik 44 2.12.3 Polyacrylamid-Sammelgel zur Proteinanalytik 44 2.13 Geräte und sonstige Verbrauchsmaterialien 44

3

M

ETHODEN

3.1 Bakterienkultur 47

3.1.2 Anzucht von Escherichia coli für die Infektion von Zellen oder Mäusen 47

3.2 Zellkultur eukaryontischer Zellen 48

3.2.1 Permanente Zelllinien 49

3.2.1.1 Passagieren von adhärenten Zellen 49 3.2.1.1.1 Trypsinieren von Zellen (HeLa-Zellen) 49 3.2.1.1.2 Abschaben von Zellen (P388D1-Makrophagen) 50 3.2.1.2 Cryokonservierung und Auftauen von Zellen 50

3.2.1.2.1 Cryokonservierung 51

3.2.1.2.2 Auftauen 51

3.2.2 Primärzellen 51

3.2.2.1 Isolation muriner Knochenmarksmakrophagen 52 3.2.2.2 Differenzierung und Anzucht muriner Knochenmarksmakrophagen 52

3.2.2.3 Passagieren 52

3.2.3 Bestimmung der Lebendzellzahl eukaryontischer Zellen mittels

Trypanblau-Färbung 53

3.2.4 Infektion von Säugerzellen mit extrazellulären Bakterien 54 3.2.4.1 Infektion von permanenten Zelllinien mit extrazellulären Bakterien 54 3.2.4.2 Infektion von Primärzellen mit extrazellulären Bakterien 55 3.2.5 Inkubation von Säugerzellen mit verschiedenen Agenzien

(LPS, TNF-α, LMB, MG132) 55

3.2.6 Transfektion eukaryontischer Zellen 56

3.2.6.1 Transfektion mit FuGENE6 56

3.3 Bestimmung der T-Zell-Proliferationsfähigkeit nach in vivo

Infektion (Mausinfektionsmodell) 57

3.3.1 Infektion von Balb/C Mäusen 58

3.3.2 Milzzellisolierung 58

3.3.3 Milzellstimulierung mit Concanavalin A 58

3.3.4 Detektion mit WST-1 und Auswertung 59

3.4 Allgemeine molekulargenetische Methoden 59

3.4.1 Spektrophotometrische Konzentrationsbestimmung von DNA 59 3.4.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli im mittleren Maßstab

(Midi-Präp) 60

3.5 Proteinbiochemische Methoden 61

aus Säugerzellen 61 3.5.1.1 Extraktion zytoplasmatischer Proteine 62

3.5.1.2 Extraktion nuklearer Proteine 62

3.5.2 Bestimmung der Proteinkonzentration von zellfreien Extrakten mit dem ”Bio-Rad Protein Microassay“ 63

3.6 Proteinanalytik 64

3.6.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) [1] 64

3.6.2 Western Blot (Immunoblot) 65

3.6.2.1 Transfer von Proteinen auf PVDF-Membran 65

3.6.2.2 PonceauS-Färbung der PVDF-Membran 66

3.6.2.3 Western Blot-Entwicklung mit Antikörpern und Detektion

immunreaktiver Proteine 66

3.7 Protein-DNA-Bindungsstudien 67

3.7.1 Radioaktiv markierte DNA-Sonden 67

3.7.1.1 Hybridisierung (_{″Annealing″) von synthetischen, komplementären ss}

Oligonukleotiden 67

3.7.1.2 Radioaktive Markierung der doppelsträngigen (ds) Oligonukleotide 68

3.7.1.3 Reinigung der DNA-Sonde 68

3.7.2 Messung der spezifischen Aktivität einer radioaktiv markierten

DNA-Sonde 69

3.7.3 Gelretardationsexperiment (″Electrophoretic Mobility Shift Assay″)

[EMSA] 69

3.7.3.1 Protein-DNA-Bindungsreaktion 69

3.7.3.2 Elektrophoretische Auftrennung von Protein-DNA-Komplexen in

nativen Polyacrylamidgelen 70

3.7.4 Identifizierung spezifischer NF-κB-Proteine in Protein-DNA-Komplexen durch Verwendung von Antikörpern (″Gel-Supershift-Experiment″) 71

3.8 Luciferase-Reportergen-Assay 72

3.8.1 Infektionsversuch für den Luciferase-Reportergen-Assay 72

3.8.2 Zell-Lyse 73

3.8.3 Messung der Luciferase-Aktivität mit dem Dual-Luciferase

Reporter Assay 73

4

E

RGEBNISSE

infizierten HeLa-Zellen und P388D1-Makrophagen 75

4.2 NF-κκκκB-DNA-Bindungsfähigkeit in mit STEC 413/89-1 Wildtyp und STEC 413/89-1 "in frame"-Deletionsmutante ∆∆∆∆espB infi-

zierten ausdifferenzierten murinen Knochenmarksmakrophagen 78 4.3 Determinierung der spezifischen NF-κκκκB-Dimere in STEC-infi-

zierten ausdifferenzierten murinen Knochenmarksmakrophagen 79 4.4 Infektion/Stimulation von ausdifferenzierten

Knochenmarks-makrophagen mit STEC 413/89-1 WT und dessen Kulturüber-

stand unbehandelt und hitze-inaktiviert 81

4.5 Untersuchung der induzierbaren NF-κκκκB-Aktivierung 23 Stunden nach Infektion mit STEC 413/89-1 Wildtyp in Makrophagen 83 4.6 Untersuchung der NF-κκκκB-DNA-Bindungsfähigkeit in mit STEC

413/89-1 Wildtyp, E. coli HB101 (pMAR7/pCVD462) und E. coli DH5αααα (pMAR7) infizierten HeLa-Zellen

(ohne und mit TNF-αααα-Stimulation) 85

4.7 NF-κκκκB-Reportergen-Assay in STEC infizierten HeLa-Zellen 87 4.8 Untersuchung des nukleo-zytoplasmatischen Shuttlings von

NF-κκκκB durch CRM1/Exportin1 89

4.9 Untersuchung der IκκκκB-αααα-Degradation in STEC-infizierten

HeLa-Zellen 92

4.9.1 Darstellung der IκB-α-Degradation in STEC-infizierten HeLa-Zellen 92 4.9.2 Darstellung der IκB-α-Degradation in STEC-infizierten und an-

schließend TNF-α-stimulierten HeLa-Zellen 95 4.9.3 Darstellung von IκB-α und phospho-IκB-α-Ser32/36 in STEC-

infizierten und anschließend TNF-α-stimulierten HeLa-Zellen 97 4.9.4 Darstellung von IκB-α und phospho-IκB-α-Ser32/36 in STEC

413/89-1 Wildtyp und STEC 413/89-1 ∆espB infizierten HeLa- Zellen mit anschließender TNF-α-Stimulation nach vorheriger

Behandlung mit dem Proteasom-Inhibitor MG132 98 4.10 Nachweis des Transkriptionsfaktors PPAR-ββββ nach STEC-

4.11 Untersuchung der T-Zell-Proliferationsfähigkeit in vitro

nach STEC-Infektion im 2-Tages-Mausmodell in vivo 104

5

D

ISKUSSION

5.1 Die Suppression der NF-κκκκB-DNA-Bindungsaktivität durch Infektion mit STEC 413/89-1 wird auch in Makrophagen

hervorgerufen 110

5.1.1 STEC 413/89-1 Wildtyp supprimiert die initiale NF-κB-Aktivierung in P388D1-Makrophagen schneller und effizienter als in HeLa-Zellen 110 5.1.2 Die durch STEC 413/89-1 WT vermittelte NF-κB-Suppression sinkt

während der Infektion in ausdifferenzierten Knochenmarksmakro- phagen unter das Basalniveau unbehandelter, nicht infizierter Zellen 111 5.2 Wird der NF-κκκκB-supprimierende Faktor von STEC 413/89-1

in den Überstand einer Bakterienkultur sezerniert?

Ist die NF-κκκκB-Suppression irreversibel? 113 5.2.1 Nur ein vitales STEC 413/89-1 Wildtyp Bakterium kann NF-κB

supprimieren 113

5.2.2 Die Hemmung des NF-κB-Signaltransduktionsweges ist irreversibel 114 5.2.3 Der Locus of Enterocyte Effacement (LEE) ist nicht allein verant-

wortlich für die NF-κB-Inhibition durch STEC/EPEC 115 5.3 Auf welcher Stufe hemmt STEC 413/89-1 Wildtyp den NF-κκκκB-

Signaltransduktionsweg in eukaryontischen Zellen? 117 5.3.1 STEC 413/89-1 beeinträchtigt nicht die Genregulierung des κB-

Motivs am Gen selbst 117

5.3.2 Der nukleare Export von NF-κB während der Infektion mit

STEC 413/891 geschieht unabhängig vom CRM1/Exportin1-Weg 119 5.3.3 STEC 413/89-1 Wildtyp verhindert die Phosphorylierung von IκB-α 120 5.4 STEC 413/89-1 induziert den Transkriptionsfaktor PPAR-ββββ

stärker als der apathogene E. coli K-12 MG1655 124 5.5 Die STEC 413/89-1 Infektion im eukaryontischen Organismus

(Balb/C-Maus) – Die Inhibierung der T-Zell-Proliferations-

5.6 Ausblick 131

6

L

ITERATURVERZEICHNIS

7

A

NHANG

7.1 Dezimale Vielfache und Teile von Einheiten 148

7.2 Symbole für Aminosäuren 148

7.3 Relevante griechische Buchstaben 148

D

A

α α-Helical domain

AA Aggregative Adherence AAF Aggregative adherence fimbriae

Abb. Abbildung

A/E attaching and effacing APS Ammoniumpersulfat AP-1 Activator protein-1 Aqua dest. Destilliertes Wasser

AR Ankyrin repeat

ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosintriphosphat

BAFF B-cell activating factor Bcl B-cell-leukemia antigen Bfp Bundle-forming pili

bp base pairs

BSA Bovine serum albumin bzw. beziehungsweise

C Cytosin

°C Grad Celsius

ca. circa

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat CC1/2 Coiled-coil domain

CD Cluster of determination

CD40L CD40 Ligand

Ces Chaperone for E. coli secretion of EspD CFA Colonization fimbriae

cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat

Ci Curie

ConA Concanavalin A

COOH carboxy-terminales Ende eines Proteins cpm counts per minute

CRM1 Chromosome region maintenance 1 CT Cholera Enterotoxin

C-terminal carboxy-terminales Ende eines Proteins

Cul Cullin

∆espB in frame-espB-Deletionsmutante von STEC 413/89-1

DD Death domain

d = x cm Durchmesser in cm

DMEMHEPES DMEM mit HEPES gepuffert

DMSO Dimethylsulfoxid

dNTP Desoxynukleotidtriphosphat DNA Desoxyribonucleinacid ds double stranded (doppelsträngig)

DSMZ Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen u. Zellkulturen DTT Dithiothreitol

EAEC Enteroaggregative Escherichia coli EAF-Plasmid EPEC adherence factor-plasmid

EAST1 Enteroaggregative E. coli heat-stable enterotoxin 1 ECACC European Collection of Cell Cultures

ECL Enhanced chemiluminescence E. coli Escherichia coli

ECSIT Evolutionary conserved signaling intermediate in toll pathways EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGTA Ethylenglycol-(aminoethylether)-Tetraessigsäure EHEC Enterohämorrhagische Escherichia coli EIEC Enteroinvasive Escherichia coli ELAM Endothelial leucocyte adhesion molecule ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

ELKS Protein, das reich ist an folgenden konstitutiven Aminosäuren: Glutaminsäure (E), Leucin (L), Lysin (K), und Serin (S)

EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay EPEC Enteropathogene Escherichia coli Esc E. coli secretion

Esp E. coli secreted protein ETEC Enterotoxische Escherichia coli

FCS Fetal calf serum (Fötales Kälberserum) Femur Oberschenkelknochen

g, mg, µg Gramm, Milligramm, Mikrogramm

G Guanin

gk Gentamicin killed (Gentamicin getötet) GRR Glycine-rich region

H20dest. Destilliertes Wasser

HEPES 2-[4-(Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl]-Ethansulfonsäure hi hitzeinaktiviert (z.B. FCS)

HLH Helix-loop-helix domain HUS hämolytisch-urämisches Syndrom

ICAM-1 Intracellular adhesion molecule 1

Ig Immunglobulin

IFN-β Interferon β IκB Inhibitor of NF-κB

IKK IκB kinase

IL-1 Interleukin 1 IL-1R Interleukin-1 Rezeptor IL-1RAcP IL-1R Accessory protein

IRAK Interleukin-1 receptor associated kinase IRF3 Interferon-regulatory factor 3

K Abkürzung der Aminosäure Lysin

kDa Kilodalton

l, ml, µl Liter, Milliliter, Mikroliter

LB Luria Bertani

LBP LPS-binding protein

LEE Locus of enterocyte effacement Ler LEE-encoded regulator

LMB Leptomycin B

LPS Lipopolysaccharid LT hitzelabiles Toxin LT-α/β Lymphotoxin α/β

LU Light Units (Licht Einheiten)

Lys Lysin

LZ Leucine zipper

M Molar

mA Milliampere

Map Mitochondrion-associated protein MAP Mitogen-activated protein MAP3K MAP kinase kinase kinase

M-CSF Macrophage-colony stimulating factor MEKK3 MAP kinase kinase kinase 3

MHC Major histocompatibility complex

min Minute

mM Millimolar

µM Mikromolar

MOI Multiplicity of infection

MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88

N steht in Sequenzen für irgendeine Base NaCl Natriumchlorid

NBD Nemo binding domain NEA Non essential amino acids NEMO NF-κB essential modifier

NES Nuclear export signal NF-κB Nuclear factor-κB

NF-κB1 p50 und sein Vorläuferprotein p105 NF-κB2 p52 und sein Vorläuferprotein p100 NH2 amino-terminales Ende eines Proteins NI non infected (unbehandelt, nicht infiziert) NIK NF-κB-inducing kinase

NLS Nuclear localization sequence N-terminal amino-terminales Ende eines Proteins

O127:H6 Serotypenbezeichnung

OD Optische Dichte

Orf Open reading frame

p65 Synonym für RelA

p.A. pro Analysis

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAI Pathogenitätsinsel

PAMP Pathogen-associated molecular pattern PBS Phosphate Buffered Saline

PEST-Sequenz Proteinbereich, der reich ist an den Aminosäuren: Prolin (P), Glutamat (E), Serin (S) und Threonin (T)

pi post infectionem

PMA Phorbol-Myristat-Acetat PHA Phytohämagglutinin PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PPAR Peroxisome-proliferator activated receptor PPRE PPAR responsive element

PRR Pattern recognition receptor

Pu Purin-Base

Py Pyrimidin-Base

PVDF Polyvinyliden-Difluorid

RHD Rel homology domain RIP Receptor-interacting protein

RLU Relative Light Units (Relative Licht Einheiten) RNA Ribonucleinacid

rpm rounds per minute

RT Raumtemperatur

RXR Retinoid-X Receptor

SCFβTrcP Skp1/Cul1/F-box ubiquitin E3 ligase komplex;

β-Transducin repeat-containing Protein (Untereinheit von SCF)

SD Standardabweichung

SDS Sodium dodecyl sulfate Sep Secretion of E. coli proteins

Ser Serin

SODD Silencer of death domain

ss single stranded

ST hitzestabiles Toxin

STAT Signal transducer and activator of transcription STEC Shiga Toxin-produzierende Escherichia coli

Stx Shiga Toxin

TAB TAK binding protein TAD Transactivation domain TAK TGF-β-activated kinase TBE Tris-Borat-EDTA TBS Tris Buffered Solution

TEMED N, N, N‘, N‘-Tetramethylethylendiamin TGF-β Transforming-growth-factor β

Tir Translocated intimin receptor TIR Toll/IL-1R Domäne

TIRAP TIR domain-containing adaptor protein TLR Toll-like receptor

TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor α TNFR Tumor-Nekrose-Faktor-Rezeptor

TOLLIP Toll interacting protein

TRADD TNF-Receptor associated via death domain TRAF TNF-Receptor associated factor

TRAM TRIF-related adapter molecule

TRIF Toll/IL-1 receptor domain-containing adapter inducing IFN-β TRIS Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan

TTSS Typ-III-Sekretions-System

ÜNK Übernachtkultur UV Ultraviolettes Licht

V Volt

VCAM Vascular cell adhesion molecule

vgl. vergleiche

v/v Volumen pro Volumen

WT Wildtyp (gemeint ist damit der wildtypische Stamm STEC 413/89-1)

Ysc Yersinia type III secretion

Z Zink finger domain

z.B. zum Beispiel

Z

Die Erforschung der Infektionsstrategien pathogener Darmbakterien stellt einen wichtigen und notwendigen Beitrag zum Verständnis der Infektion, die diese Erreger hervorrufen, dar. Von besonderer Bedeutung sind dabei Keime, die im Tierwirt keine Symptome hervorrufen, im Menschen jedoch schwerwiegende Krankheitsbilder verursachen. Shiga Toxin-produzierende Escherichia coli (STEC) gehören zu diesen Erregern. Sie schädigen ihren Wirt, ähnlich wie Yersinia spp. und Salmonella spp., indem sie die wirtseigene Immunantwort durch Modulation von eukaryontischen Signaltransduktionswegen inhibieren. Dies wird ihnen durch in ihr Genom inserierte Pathogenitätsinseln, die für Virulenzfaktoren kodieren, ermöglicht, wodurch sie sich von apathogenen Escherichia coli unterscheiden, die solche Faktoren und Inseln nicht besitzen.

Die vorliegende Arbeit dient der Aufklärung des molekularen Infektionsmechanismus von STEC sowie der Untersuchung der pathobiologischen Bedeutung der STEC-Infektion für die angeborene Immunität. Die Untersuchungen basieren auf der von STEC hervor-gerufenen Suppression des Transkriptionsfaktors NF-κB in Epithelzellen, der die Transkription proinflammatorischer Zytokine initiiert und damit eine Proinflammation auslöst.

So zeigte sich, dass diese NF-κB-Suppression nach STEC-Infektion auch in Zellen, die der angeborenen Immunität angehören – Zellen der etablierten murinen makrophagen-ähnlichen Zelllinie P388D1 und ausdifferenzierte primäre Knochenmarksmakrophagen –, entsteht. Auffällig war dabei, dass die initiale NF-κB-Aktivierung und die anschließende Suppression in den Immunzellen wesentlich schneller und effizienter erfolgte als in den Epithelzellen. Somit ist die Inhibierung der Proinflammation kein Epithelzell-spezifisches Ereignis. Sie scheint vielmehr ein genereller Mechanismus für den Erreger zu sein. Auch die initiale NF-kB-Aktivierung scheint nicht nur eine Reaktion der Wirtszellen auf

'Pathogen-associated molecular patterns' (PAMPs), sondern vielmehr ein nötiger Mechanismus des Bakteriums zu sein, um letztendlich eine vollständige NF-κ B-Suppression herbeiführen zu können. Diese ist irreversibel, so dass auch nachfolgend, für mindestens 25 Stunden, keine Stimulation der Zellen mit bekannten NF-κB-aktivierenden Substanzen (LPS, TNF-α) mehr möglich ist.

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse kann mit Sicherheit gesagt werden, dass der bakterielle Faktor, welcher die Inhibierung der NF-κB-aktivierenden Signaltransduktions-wege bewirkt, nicht in den bakteriellen Kulturüberstand abgegeben, sondern direkt aus

dem bakteriellen Zytoplasma in das Zytoplasma der Wirtszelle transloziert wird. Folglich können nur lebende STEC-Bakterien die Suppression von NF-κB herbeiführen.

Die am besten untersuchte Pathogenitätsinsel (PAI) von STEC (sowie EPEC und EHEC) ist der 'Locus of enterocyte effacement' (LEE). Auf ihm ist das komplette Typ-III-Sekretions-System (TTSS), durch welches Effektoren aus der Bakterienzelle in die Wirtszelle transloziert werden können, lokalisiert. Ursprünglich nahm man an, dass der Effektor, der für die NF-κB-Suppression verantwortlich ist, auch auf dieser PAI liegt. Mit Hilfe von apathogenen E. coli, die den klonierten LEE von EPEC E2348/69 in sich tragen, konnte gezeigt werden, dass dies nicht der Fall ist. Das entscheidende Molekül muss demnach entweder von einer anderen PAI oder dem übrigen Genom kodiert werden. Dennoch wird der LEE benötigt, damit das TTSS aufgebaut und der Effektor transloziert werden kann.

Von viel größerem Interesse war jedoch die Stufe der zur NF-κB-Aktivierung führenden Signaltransduktionswege, die vom Bakterium moduliert wird. Durch die systematische retrograde Untersuchung konnte gezeigt werden, dass das κB-Motiv durch die STEC-Infektion nicht beeinträchtigt wird. Das in der Literatur beschriebene CRM1/Exportin1-abhängige nukleo-zytoplasmatische 'Shuttling' von NF-κB konnte weder für unbehandelte, nicht infizierte noch für STEC infizierte HeLa-Zellen beobachtet werden. Demnach scheint der Rücktransport von NF-κB aus dem Kern in das Zytoplasma CRM1/Exportin1-unabhängig zu verlaufen. Die eingehende Untersuchung der IκB-α-Phosphorylierung zeigte eindeutig, dass IκB-α im Verlauf der STEC-Infektion nicht mehr phosphoryliert wird. Daher muss die Stufe, auf der die Inhibierung von NF-κB-aktivierenden Signaltransduktionswegen durch STEC stattfindet, oberhalb von IκB-α liegen, was zukünftig noch zu eruieren ist.

Die Untersuchungen erweiterten sich auf den antiinflammatorischen Transkriptionsfaktor PPAR-β. Dessen stärkere Induktion durch STEC, als durch den apathogenen E. coli K-12 MG1655, lässt darauf schließen, dass nicht nur die Inflammation der Zelle gehemmt, sondern im Gegenzug die Antiinflammation aktiviert wird, was die Suppression der Inflammation durch den Erreger unterstützen würde.

Mit den durchgeführten Mausinfektionsversuchen konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit dem STEC 1 Wildtyp, im Gegensatz zur Infektion mit STEC 413/89-1 ∆espB, starke Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens der infizierten Mäuse bewirkt. Die parallel dazu festgestellte Inhibierung der T-Zell-Proliferationsfähigkeit scheint somit

die Hypothese zu stützen, dass die Signalweitergabe der Makrophagen auf die T-Zellen durch die Infektion mit STEC WT beeinträchtigt ist.

S

The investigation of infectious strategies of pathogenic gut bacteria represents an important and necessary contribution to the understanding of the infection caused by these pathogens. These bacteria are of particular interest because they do not cause any symptoms in their animal host but result in severe clinical manifestations in human. Shiga toxin-producing E. coli (STEC) are an example of such bacteria. Like Yersinia spp. and Salmonella spp., STEC inhibits the host specific immune response by modulating the eukaryotic signal transduction pathways using factors encoded on pathogenicity islands (PAI). Pathogenicity islands are discrete genetic elements that usually reside on the genome of pathogenic forms of Escherichia coli.

The present study examines molecular mechanism of STEC infection and investigates the pathobiological meaning of the STEC infection for innate immunity. The analyses are based on the STEC-dependent suppression of the transcription factor NF-κB in epithelial cells. NF-κB initiates the transcription of proinflammatory cytokines and thereby triggers the proinflammation.

It was shown that NF-κB suppression after infection with STEC is also a property seen in primarily involved in innate immunity i.e. either cells of the established murine macrophage-like cellline P388D1 or bone marrow derived macrophages. It was conspicuous that initial NF-κB activation and subsequent suppression were faster and more efficient in the immune cells than in the epithelial cells. Thus the inhibition of the proinflammation is not an epithelial cell specific event. It seems rather to be a general mechanism for the pathogen. Also the initial NF-κB activation seems not to be only a reaction of the host cell against pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) but also a necessary mechanism of the bacterium to finally lead to complete NF-κB suppression. This suppression is irreversible and no stimulation of the cells with well known NF-κB activators (LPS, TNF-α) is possible for at least 25 hours.

From studies reported here it is now clear that the bacterial factor which causes the inhibition of the NF-κB activating signal transduction pathway is not secreted into the bacterial culture supernatant but translocated directly from the bacterial cytoplasm into the cytoplasm of the host. Thus, only live STEC-bacteria are able to induce the NF-κB suppression.

The best analyzed PAI of STEC (both in EPEC and EHEC) is the 'Locus of enterocyte effacement' (LEE). It encodes the complete Type-III-secretion-system (TTSS), which is used for translocating effectors out of the bacterium into the host cell. Originally the effector responsible for the NF-κB suppression was thought to be located on this PAI. With the help of an apathogenic E. coli containing the cloned LEE from EPEC E2348/69, it was shown that this is not true. The crucial molecule must either be encoded by a gene on another PAI or present in the rest of the genome. The LEE is however needed for constructing the TTSS and translocating the effector.

Of much more interest was the step of the signal transduction pathways leading to NF-κB activation and modulated by the bacterium. We showed by systematic retrograde investigations of the NF-κB pathway that the κB motive was not impaired by the STEC infection. In the literature a CRM1/Exportin1-dependend nucleo-cytoplasmic shuttling of NF-κB has been described. We did not observe such an effect with either untreated, non-infected nor with STEC non-infected HeLa cells. Therefore, the transport of NF-κB out of the nucleus into the cytoplasm seems to be independent of CRM1/Exportin1. The detailed investigations of the IκB-α phosphorylation demonstrate unequivocally that IκB-α is not phosphorylated during the STEC infection. Thus the step of the NF-κB activating signal transduction pathway by STEC must be upstream of IκB-α. However, future studies are required for further details.

The investigations were extended to the anti-inflammatory transcription factor PPAR-β. STEC was able to induce the expression of this factor much more than the apathogenic E. coli K-12 MG1655. This suggests that not only the inflammation of the cell is inhibited but in the counterpart the anti-inflammation is activated. This would assist the suppression of inflammatory processes initiated by the pathogen.

We showed with mouse infection experiments that infection with STEC 413/89-1 wild type in contrast to infection with the STEC 413/89-1 ∆espB results in a strong reduction of the general state of health of the infected mice. The observation that inhibition of the T-cell-proliferation capability occurs, seems to support the hypothesis that the signal transduction from the macrophages to the T-cells is affected by the infection with STEC wild type.

1

E

INLEITUNG

1.1 Enteropathogene Escherichia coli – Allgemeines

Escherichia coli sind Gram negative, meist bewegliche, fakultativ anaerobe, stäbchenförmige Bakterien, welche zur Familie der Enterobacteriaceae gehören [2]. Sie wachsen auf herkömmlichen Agar- oder Blutnährböden bei 37°C und lassen sich daher leicht kultivieren. Ihr natürlicher Lebensraum ist der Gastrointestinaltrakt von Mensch und Tier. Daher gilt E. coli auch als Indikatorkeim für fäkale Verunreinigungen von Wasser und Lebensmitteln.

Als nicht-pathogenes Bakterium ist es Teil der intestinalen Normalflora und trägt somit wesentlich zu deren Homöostase bei. Gelangen jedoch diese Keime in Wunden oder andere Organsysteme, so rufen sie dort Infektionen in Form von Entzündungen hervor. Neben nicht-pathogenen E. coli, die typischerweise den Darm kolonisieren, existieren jedoch auch pathogene Escherichia coli, die neben verschiedenen Formen der Enteritis auch Infektionen des Urogenitaltraktes sowie Meningitiden und Sepsis hervorrufen. E. coli werden anhand verschiedener Antigenstrukturen eingeteilt. Dabei bildet jedes O-Antigen, welches spezifische Polysaccharidketten des Lipopolysaccharid-Komplexes der äußeren Membran darstellt, eine eigene Serogruppe. H-Antigene charakterisieren Proteine der Geißelantigene. Die Antigene der Kapseln werden als K-Antigene bezeichnet und bestehen aus linearen Polymeren der äußeren Membran, die aus sich repetierenden Kohlenhydrat-einheiten, gelegentlich auch Proteinen, aufgebaut sind. Sie können die Bakterienzelle dicht bedecken und eine O-Inagglutinabilität bedingen. Die spezifische Kombination aus O- und H-Antigenen definieren einzelne Serotypen. Im modifizierten Kauffman-Schema sind alle derzeit bekannten Serotypen aufgelistet [3].

Die Einteilung der pathogenen E. coli erfolgt aufgrund ihres jeweiligen Serotyps und ihrer jeweiligen Infektionsstrategien und -mechanismen. So unterscheidet man "Enterotoxische E. coli" (ETEC), "Enteropathogene E. coli" (EPEC), "Enterohämorrhagische E. coli"

(EHEC), "Enteroaggregative E. coli" (EAEC) und "Enteroinvasive E. coli" (EIEC) [3]. Ähnlich anderen, die Schleimhaut besiedelnde, Keimen, haben E. coli notwendige Strategien zur Haftung ihrer Infektion entwickelt. Unzweifelhaft steht die Kolonisierung der Mukosa an erster Stelle. Dem folgt zumeist die Umgehung der Wirtsabwehr mit anschließender Vermehrung des Erregers und abschließender Schädigung des Wirtes. Gerade die letztgenannten Punkte, die man als pathogene Strategien bezeichnen muss,

variieren bei den einzelnen E. colis: die Bildung und Sezernierung von Enterotoxinen ist typisch für ETECs und EAECs, EIECs bedienen sich des Mittels der Invasion, wohingegen EPECs und EHECs durch enge Haftung an die Wirtszelle mit anschließender Translokation von bakteriellen Proteinen ihren Wirt schädigen [4].

Um diese doch sehr unterschiedlichen Strategien ausführen zu können, muss das Genom pathogener E. coli sehr vielseitig sein. Daher besitzt es zwei prinzipielle genetische Konfigurationen: chromosomale Pathogenitätsinseln (z.B. LEE) und Virulenz-Plasmide (z.B. EAF-Plasmid [5-7]). Das Shiga-Toxin (Stx) der STEC wird durch Phagen kodiert [8].

1.2 ETEC, EAEC und EIEC

Enterotoxische E. coli (ETEC) sind durch die Bildung von Enterotoxinen charakterisiert [9]. Je nach Stamm werden entweder ein hitzelabiles (LT-I, LT-II) und/oder ein hitzestabiles (STa, STb) Toxin gebildet und nach Kolonisation der Mukosa abgegeben. Das LT weist große Ähnlichkeit mit dem Cholera Enterotoxin (CT) von Vibrio cholerae auf [10]. Sein Molekulargewicht beträgt 86 kDa. Es aktiviert in der Wirtszelle die Adenylatcyclase, was zu einer Erhöhung der cAMP-Konzentration und somit zur Sekretion von Chlorid-Ionen und der Inhibierung der NaCl-Absorption führt [11]. Es liegt eine osmotische Diarrhoe vor. Im Gegensatz dazu wirkt das kleinere ST (2-5.1 kDa) schnell. Sein Rezeptor ist die Guanylatcyclase C, die durch Aktivierung eine Erhöhung der cGMP-Konzentration bewirkt, was ebenfalls zu einer erhöhten Chlorid-Ionen-Sekretion und/oder inhibierten NaCl-Resorption führt, die eine intestinale Flüssigkeitssekretion nach sich zieht [12]. Die Enterotoxine sind, wie die Kolonisierungsfaktoren, Plasmid-kodiert. Die Kolonisierungsfaktoren sind Oberflächenfimbrien (CFA), die an den Enterozyten des Dünndarmes haften [13]. ETECs sind der Auslöser von Kleinkinderdiarrhöen in Entwicklungsländern und der so genannten Reise-Diarrhö.

Enteroaggregative E. coli (EAEC) produzieren per definitionem keine Enterotoxine (LT, ST) und haften an HEp-2-Zellen im Muster der Aggregative Adherence (AA) [14]. Die AA zeichnet sich durch eine prominente Autoagglutination der Bakterienzellen untereinander aus. Sie steigern die Schleimproduktion der Mukosa und schließen sich in einen Bakterien-Schleim-Biofilm ein. Es entsteht eine Verkürzung der Villi mit hämorrhagischer Nekrose der Villispitzen, sowie Ödembildung und mononukleare Infiltration der Submukosa [4]. Der AA-Phänotyp wird durch Adhärenzfaktoren, die auf einem 60-MDa-Plasmid liegen,

kodiert: die aggregative adherence fimbriae (AAF/I, AAF/II) sind flexible, Bündel formende Fimbrienstrukturen mit einem Durchmesser von 2 bis 3 nm [15]. Während die AAF/I von allen EAEC gebildet werden, werden die AAF/II nur von einer Minderheit der EAEC exprimiert. Es ist möglich, jedoch noch nicht bekannt, dass auch andere Adhärenzfaktoren an der Ausbildung des EAEC-Biofilms beteiligt sind. Auch wenn EAEC nach derzeitigem Stand der Wissenschaft keine Enterotoxin-Bildner sind, wird eine ST-Homolog, das Enteroaggregative E. coli heat-stable enterotoxin (EAST1), sowie ein weiteres Zytotoxin für EAEC beschrieben.

Derzeit besteht folgendes 3-Stufen-Pathogenese-Modell:

1. initiale Anheftung der Keime an die Darmmukosa und/oder den Mukus (AAF/I und AAF/II sind dafür möglicherweise verantwortlich);

2. erhöhte Mukusproduktion, die zu einer Ablagerung eines dicken Mukus-EAEC-Biofilm führt;

3. Bildung eines Zytotoxins, das zu einer Schädigung der Darmzellen führt. Auch dieses Pathovar spielt bei Säuglingsinfektionen in Entwicklungsländern eine Rolle [4]. Daneben konnte eine Zunahme von Lebensmittelinfektionen in anderen Ländern mit diesem Erreger beobachtet werden.

Enteroinvasive E. coli (EIEC) sind biochemisch, genetisch und pathogenetisch mit Shigella spp. eng verwandt und dringen in die Wirtszellen ein. Sie sind generell Lysin-Decarboxylase negativ, nicht-beweglich und Laktose negativ.

Das derzeitig bekannte Pathogenese-Modell sieht wie folgt aus [16, 17]: 1. Penetration der Epithelzellen;

2. Lyse der endozytischen Vakuole; 3. intrazelluläre Vermehrung;

4. gerichtete Bewegung durch das Zytoplasma; 5. Ausdehnung in angrenzende Epithelzellen.

Die inflammatorische Reaktion der Wirtszellen endet in deren Ulzeration. EIEC besitzen, so wie nicht-Shigella somnei Shigella-Serotypen, ein 140-MDa-Plasmid, welches Gene für ihre Invasivität trägt [18]. Es werden ein Homolog zum Typ-III-Sekretions-System von EPEC und EHEC, sowie sezernierte Proteine, vor allem Effektoren des invasiven Phänotyps angenommen [19]. Klinisch äußert sich die Infektion mit EIEC zuerst in einer wässrigen Diarrhö, gefolgt von eher kleinen Mengen ruhrähnlichem Stuhl, der Blut und Schleim enthält.

1.3 EPEC und STEC/EHEC – A/E-Läsionen formende Darmpathogene

Enteropathogene Escherichia coli (EPEC) und enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC), welche eine Untergruppe der Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli (STEC) darstellen, zählen zu den “attaching and effacing (A/E)“-Läsionen verursachenden darmpathogenen E. coli. Generell können EPECs und EHECs in insgesamt 4 Gruppen unterteilt werden: EPEC 1 (H6) und EPEC 2 (H2, non-motile), sowie EHEC 1 (O157:H7, enger verwandt mit dem atypischen EPEC O55:H7) und EHEC 2 (O26 und O111, enger verwandt mit typischen EPECs) [20].

Als Gemeinsamkeit haben sie die Fähigkeit, A/E-Läsionen hervorzurufen (siehe 1.3.3 [21-25]). Im Unterschied zu STEC/EHEC besitzen EPEC zusätzlich den Virulenzfaktor bfp, welcher die bundle-forming pili kodiert und somit für die initiale Anheftung der Bakterien verantwortlich ist. Dieser liegt auf dem 50-70 MDa EPEC adherence factor (EAF)-Plasmid [5, 6]. Des Weiteren können EPECs kein Shiga Toxin (STEC) und kein Hämolysin (EHEC) bilden. Die mitunter sehr schnell (innerhalb von drei Stunden [26]) eintretende Diarrhö bei EPEC-Infektionen scheint eine Folge des Mikrovilli-Verlustes zu sein, der mit einer Malabsorption einhergeht. Dabei scheint der signifikante Abfall des transmembranen Potentials den Influx von positiv oder den Efflux von negativ geladenen Ionen zu fördern. Die meisten Untersuchungen zu dem Geno- und Phänotyp der A/E-Läsionen wurden an dem humanen EPEC E2348/69 (O127:H6) und humanen EHEC EDL933 (O157:H7) durchgeführt. Daher gelten diese beiden Stämme als Prototypen für EPECs und EHECs. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente erfolgten mit dem bovinen STEC 413/89-1 (O413/89-126:H¯) [27].

1.3.1 Shiga Toxin-produzierende Escherichia coli (STEC)

Shiga Toxin-produzierende Escherichia coli (STEC) gehören zur Gruppe der Entero-hämmorrhagischen Escherichia coli (EHEC). Sie stellen als Erreger schwerwiegender gastrointestinaler Erkrankungen weltweit ein bedeutendes Gesundheitsrisiko dar [28]. Das durch STEC verursachte Krankheitsbild reicht von wässrigen und wässrigblutigen Durchfällen bis hin zum lebensbedrohlichen hämolytisch-urämischen Syndrom (HUS), welches durch drei Zustände definiert wird: akutes Nierenversagen - Thrombozytopenie - mikroangiopathische, hämolytische Anämie. Dies ist auf die nierenschädigende Wirkung

des in die Zirkulation gelangten Shiga Toxins zurückzuführen. Trotz der systemischen Implikationen bleibt die STEC-Infektion auf das Darmepithel begrenzt.

In den letzten 15 Jahren wurden die Virulenzfaktoren von EPEC und STEC/EHEC bereits weitreichend, jedoch nicht erschöpfend, untersucht. Die meisten Ergebnisse liegen uns heute für EPEC vor. Jedoch kann man diese auch auf STEC übertragen, da es in weiten Teilen Homologien zwischen den beiden Erreger-Gruppen gibt.

1.3.2 "Locus of Enterocyte Effacement" (LEE)

Ausgehend von dem Phänotyp der “attaching and effacing (A/E)“-Läsionen, identifizierten McDaniel et al. 1995 einen Locus im EPEC (EPEC E2348/69) und EHEC (EDL933) Genom, jedoch nicht im apathogenen E. coli-Stamm K-12, der neben anderen Faktoren auch das Gen für den Rezeptor Intimin enthält. Sie nannten diese Pathogenitätsinsel (PAI) Locus of Enterocyte Effacement, kurz LEE [29]. Er ist beispielhaft für Pathogenitätsinseln und ist sowohl in weiteren EPEC- als auch STEC-Stämmen [30] sowie im Genom von Citrobacter rodentium und Hafnia alvei inseriert [4, 31, 32]. Drei Jahre später, 1998, bestimmten Elliott et al. die gesamte DNA-Sequenz des LEE von EPEC E2348/69, welcher 35624 bp groß ist und 41 offene Leserahmen (open reading frames, Orf), die in 10 Operons (LEE1 - LEE10) gruppiert sind, enthält [33]. Der LEE von STEC 413/89-1 weist eine Größe von 59.4 kB auf und befindet sich bei 94 min auf dem E. coli Chromosom im pheU-tRNS-Locus [34, 35].

Abb. 1-1:

Locus of Enterocyte Effacement (LEE) von STEC 413/89-1.

Die wichtigsten Operons sind LEE1, LEE2, LEE3, tir/LEE5 und LEE4. LEE1 - LEE3 kodieren vor allem für die Gene des TTSS (esc und sep). Der LEE-encoded regulator (Ler) befindet sich ebenfalls in LEE1 und wird zur Expression der LEE Operons LEE2 bis LEE5 sowie von espF, espG und map benötigt [36]. LEE5 kodiert die Rezeptoren Intimin (eae)

und Tir (tir, Translocated intimin receptor) und LEE4 die Escherichia coli secreted proteins (esp). Das Mitochondrion-associated protein Map (map) erhielt seinen Namen, da es in der eukaryontischen Zelle um die Mitochondrien anzutreffen ist [35]. Man nimmt an, dass es das mitochondriale Membranpotential unterbricht, was typisch für Erreger ist, die Apoptose induzieren [37]. Wainwright und Kaper zeigten 1998, dass ein weiteres Protein, welches durch den LEE kodiert wird, cesD (Chaperone for E. coli secretion of EspD), als Sekretions-Chaperon für EspD dient und ebenfalls für die komplette extrazelluläre Sekretion von EspB benötigt wird [38].

Untersuchungen zur Homologie der LEE zwischen EPEC E2348/69 und EHEC EDL933 zeigten vor allem im Bereich der Gene, die für das TTSS kodieren, nahezu 100%-ige Übereinstimmungen, wohingegen die Homologien zwischen den Esp-kodierenden Genen weniger stark ausgeprägt sind [20].

Abb. 1-2:

Darstellung der EPEC und EHEC Homologie-Bereiche in der Pathogenitätsinsel LEE. Entnommen aus [20].

Dies lässt darauf schließen, dass die Erreger im Laufe ihrer Evolution die Strategien zur Virulenz und Überlebensfähigkeit erweitert und sich den gegebenen Umständen angepasst haben.

1.3.2.1 Typ-III-Sekretions-System (TTSS)

Die Sekretionssysteme der Gram negativen Bakterien zählen zu den Sekretions-Signalwegen. Neben bisher vier (Typ I - IV) definitiv beschriebenen, wird auch noch ein weiteres (V), bisher wenig untersuchtes, diskutiert [39].

Typ-III-Sekretions-Systeme sind meist in die Virulenz und Proteinsekretion von tierischen und pflanzlichen Pathogenen involviert. Dabei stellt das Typ-III-Sekretions-System (TTSS) eine direkte Verbindung zwischen Pathogen und Wirtszelle dar. Es wird durch bislang 10 identifizierte verschiedene Gene des LEE kodiert. Ursprünglich wurden diese Gene als sep (secretion of E. coli proteins) bezeichnet, später jedoch in esc (E. coli secretion) umbenannt. Diese etwas verwirrende Namensgebung resultiert aus früheren Untersuchungen in Yersinia spp. Dabei stellen die esc Homologe zu den ysc (Yersinia type III secretion) dar. Gene, die keine Homolgie zu ysc haben, aber in die Typ-III-Sekretion (TTS) involviert sind, werden nach wie vor als sep bezeichnet.

Zu den esc (alte Bezeichnung) zählen escC (sepC), escD (sepD), escF (orf28), escJ (sepD), escN (sepB), escR (sepI), escS (sepH), escT (sepG), escU (sepF) und escV (sepA). Augenblicklich sind vier Sep-Proteine bekannt: SepD, SepL, SepQ und SepZ. All diese Proteine sind an der TTSS Biogenese beteiligt, wobei die genaue Funktion jedes einzelnen noch nicht für alle genau geklärt ist. Man weiß, dass EscV, ein 72 kDa großes Protein, an der inneren Bakterienmembran verankert ist, wohingegen EscC (56 kDa) und EscD (110 kDa) in der äußeren Bakterienmembran eingelagert werden. EscN (31.5 kDa) besitzt eine ATP/GTP-Bindungsstelle und liefert das nötige ATP zur Proteinsekretion. Von SepD und SepL wird berichtet, dass sie zur effizienten Sekretion des Translokationsapparates benötigt werden, miteinander interagieren und an der Ausbildung der A/E-Läsionen beteiligt sind [40, 41].

Weitere Bestandteile des TTSS sind die so genannten "E. coli secreted proteins" (Esp) EspA, EspB und EspD.

1.3.2.2 Escherichia coli secreted proteins (Esp)

Die Escherichia coli secreted proteins (Esp) werden durch die LEE-kodierten esp-Gene gebildet. Bis heute sind folgende Esps bekannt: EspA, EspB, EspD, EspE (Tir), EspF, EspG und EspH. Sie stellen sowohl Translokatoren (EspA, EspB und EspD) als auch Effektoren (EspB, EspF, EspG und EspH) dar. Deibel et al. (1998) beschrieben EspE als

ein direkt in die Wirtszelle transloziertes und dort Tyrosin-phosphoryliertes 90 kDa Protein [42]. Fast zeitgleich wurde von Kenny et al. (1997) ein EPEC-Protein beschrieben, welches identisch mit Hp90 ist und als Rezeptor für das bakterielle Intimin fungiert, indem es in die eukaryontische Zellmembran eingebaut wird [43]. Man gab diesem Protein den Namen Tir für Translocated intimin receptor. Zwischen EspE und Tir herrscht eine hohe Homologie (66.9% identische Reste), so dass davon auszugehen ist, dass es sich bei EspE um ein EPEC-Tir-Homologon handelt. Im Weiteren wird daher nicht mehr von EspE, sondern nur noch von Tir gesprochen. Spätere Untersuchungen ergaben, dass das Gen, welches Tir kodiert, auf einem eigenen Orf (LEE5) liegt. Im Gegensatz dazu liegen die Esps A, B und D, die an der Ausprägung des TTSS beteiligt sind auf einem andern Orf (LEE4). Untersuchungen zu EspF ergaben, dass dieses Protein nicht an Adhärenz, Ausbildung des TTSS, Sekretion von Proteinen und Bildung der A/E-Läsionen beteiligt ist. Es scheint, dass es als typischer Effektor am Zelltod (Apoptose und Nekrose) mit verant-wortlich ist [44]. Welche Funktion EspG, ein 44 kDa Protein, hat, ist bislang noch unbekannt [45].

Besondere Bedeutung kommt EspA, EspB und EspD zu. EspA ist eine filamentöse Struktur, die in vitro von EPEC und STEC/EHEC nur in Zellkulturmedien exprimiert wird und einen Durchmesser von ~ 50 nm und eine Länge von bis zu 2 µm aufweist [46]. Es ist eine direkte tubulöse Verbindung zwischen Erreger und Wirtszelle, durch die die Effektorproteine in die eukaryontische Zelle transloziert werden. EspB und EspD werden ebenfalls durch diesen Translokations-Kanal geschleust und bilden in der Zellmembran eine Pore, womit ein geschlossenes System entsteht. Es scheint, dass EspB neben der Funktion als Translokator auch noch als Effektor wirkt [46-51], dessen Effekt jedoch noch unbekannt ist.

Nach der Ausbildung dieses Sekretions-Komplexes können Effektoren und vor allem der Rezeptor Tir in die Wirtszelle transloziert werden.

1.3.2.3 "Attaching and effacing" (A/E)

"Attaching and effacing" (A/E) stellt ein typisches histopathologisches Merkmal von EPEC und STEC/EHEC dar. Hierunter versteht man die lokale Rückbildung der Mikrovilli der Enterozyten (“effacement“) sowie die enge bakterielle Anheftung an die eukaryontische Oberfläche (“intimate attachment“) unter Ausbildung podestartiger Aktinstrukturen (A/E-Läsionen). Für die Ausprägung der A/E-Läsionen wird sowohl ein intaktes

Typ-III-Sekretions-System als auch ein Translokationsapparat, der durch die Escherichia coli secreted proteins A, B und D generiert wird, benötigt. Die Pathogenese erfolgt bei EPEC und STEC/EHEC in gleicher Weise. Der große Unterschied zwischen beiden Erreger-gruppen besteht in der initialen Anheftung der Bakterien. Nur EPEC besitzen das EAF-Plasmid, welches das bfp-Gen für die Bildung der bundle-forming pili kodiert. STEC/EHEC fehlt dieser Adhärenzfaktor.

A

B

C

D

Abb. 1-3:

Ablauf der Adhäsion von STEC und Entstehung von A/E-Läsionen, Details siehe Text.

Nach initialer Kontaktaufnahme des Bakteriums mit der Wirtszelle (Abb. 1-3 A) bildet der Erreger das Typ-III-Sekretions-System in seiner inneren und äußeren Membran aus. Hier hinein wird die Translokations-Röhre (EspA) inseriert. Nun können die ersten Proteine zur Wirtzelle transloziert werden. Dies sind EspB und EspD, welche eine Pore in der Wirtszellmembran formieren (Abb. 1-3 B). Durch das vollständig ausgebildete

Trans-lokations-System wird als erstes der Intimin-Rezeptor Tir geschleust (Abb. 1-3 C). Und dies ist sozusagen einmalig in der Bakterienwelt: der Erreger synthetisiert einen eigenen Rezeptor, den er in die Wirtszelle transloziert und der sich dort in die Zellmembran einlagert, um engen Kontakt zur Wirtszelle aufnehmen zu können. In der Wirtszelle angelangt, wird Tir an Tyrosin-Resten phosphoryliert und somit aktiviert. Nun kann das bakterielle Adhäsin Intimin an seinen Rezeptor binden (Abb. 1-3 D). Somit ist eine feste und dauerhafte Anheftung gegeben ("attaching"). Parallel dazu erfolgt die lokale Rückbildung der Mikrovilli der Enterozyten (“effacement“) sowie eine Umstrukturierung des Aktinzytoskletts unter Bildung von charakteristischen podestartigen Strukturen.

1.4 Signaltransduktion

Signaltransduktionswege (engl. Signal transduction pathways) sind für eukaryontische Zellen überlebenswichtige, molekularbiologische Reaktionen, die es Zellen ermöglichen, auf einwirkende Reize zu reagieren. Sie werden eng reguliert und besitzen kritische Schaltstellen. Dabei treten Proteine in Wechselwirkungen, welche dann zumeist von Kinasen aktiviert werden, was zu einem kaskadenartigen Ablauf des entsprechenden Weges führt. Gerade die kaskadenartig ablaufenden Reaktionen sind besonders wichtig. Wird solch eine Kaskade durch zum Beispiel äußere Einflüsse wie bakterielle Effektorproteine unterbrochen, kann sie nicht mehr bis zum Ende ablaufen, was zu einem Ausfall physiologischer Zellfunktionen führen kann.

Viele Signaltransduktionswege korrespondieren und interagieren miteinander. Zudem treten sie in Wechselwirkung miteinander, so dass es oftmals schwer fällt, einen einzelnen aus der Menge der existierenden, isoliert zu betrachten.

Das für die Untersuchungen dieser Arbeit, nach Infektion mit dem Shiga Toxin-produzierenden E. coli (STEC) 413/89-1, relevante Zielprotein ist der Transkriptionsfaktor Nuclear Factor-κB (NF-κB). Es existieren viele Signaltransduktionswege, die in einer Aktivierung von NF-κB resultieren. Daher werden die Teile der Signaltransduktionswege von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Lipopolysaccharid (LPS) und Interleukin-1 (IL-1), die in einer NF-κB-Aktivierung resultieren, unter 1.4.5.1 eingehend dargestellt.

1.4.1 Mitglieder der Rel/NF-κκκκB-Familie

Der vor 20 Jahren von Baltimore et al. (1986) entdeckte Nuclear Factor-κB (NF-κB) ist ein Transkriptionsfaktor, der seinen Namen erhalten hat, da er zuerst in den Kernen von B-Zellen gefunden wurde. Er bindet an die DNA-Sequenz, diedasAblesen der leichten Kappa-Kette des Immunglobulins verstärkt (Enhancer-Sequenz) [52]. Mittlerweile weiß man, dass er im Zytoplasma aller Zellen exprimiert wird. Dort liegt NF-κB als Komplex mit seinem spezifischen Inhibitorprotein IκB (Inhibitor of NF-κB) vor und wird dadurch an der Translokation in den Kern gehindert. Damit ist der Komplex von NF-κB und IκB transkriptionell inaktiv. Über unterschiedliche Signaltransduktionswege wird eine IκB Kinase aktiviert, die IκB phosphoryliert. Dieses erlaubt eine nachfolgende Polyubi-quitinierung. Die so zum Abbau markierte inhibitorische Untereinheit des zytoplas-matischen NF-κB:IκB-Komplexes wird am Proteasom abgebaut. Dadurch wird die bisher verborgene Kerntranslokationssequenz am NF-κB-Dimer frei und NF-κB selbst kann in den Kern translozieren. Dort bindet der Transkriptionsfaktor an dekamere κB-Motive mit der Konsensussequenz 5'-GGGPuNNPyPyCC-3' und ist aktiv. Somit aktiviert NF-κB vor allem die Transkription von Zielgenen, die in erster Linie der Inflammation und/oder Immunmodulation dienen. Dysregulation von NF-κB führt zur konstitutiven Überexpression von proinflammatorischen Zytokinen, welche man bei chronischen Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen, wie z.B. der rheumatoiden Arthritis, findet. Des Weiteren spielt es eine wichtige Rolle bei der Regulation der Expression anti-apoptotischer Proteine.

Heute weiß man, dass NF-κB ein evolutionär konserviertes Signalmodul ist.

Der Ausdruck 'NF-κB' wird inzwischen als Sammelbegriff für dimere Komplexe zwischen Mitgliedern der Rel/NF-κB-Familie verwendet. Diese Familie besteht aus fünf Elementen, die sich in zwei Gruppen unterteilen lassen:

1) Rel-Familie mit den Mitgliedern RelA (p65), RelB und c-Rel (Rel) 2) NF-κB-Familie mit den beiden Mitgliedern p50/Vorläuferprotein p105 (NF-κB1) und p52/Vorläuferprotein p100 (NF-κB2).

Abb. 1-4:

Mitglieder der Rel/NF-κB-Familie.

COOH – C-terminales Ende // DD – Death domain // GRR – Glycine rich region // LZ – Leucine zipper // NH2 – N-terminales Ende // PEST – Proteinbereich, der reich ist an Prolin (P), Glutamat (E), Serin (S) und

Threonin (T) // RHD – Rel homology domain // TAD – Transactivation domain. K(Zahl) – Lysin-Reste // S(Zahl) – Serin-Reste.

* markiert das nach Prozessierung entstehende C-terminale Ende von p50 und p52. Die Anzahl der Aminosäuren je Protein sind rechts angegeben.

Erstellt nach [53, 54].

Allen Mitgliedern der Rel/NF-κB-Familie ist das Vorhandensein einer Rel Homology Domain (RHD) gemein. Die sich am N-terminalen Ende befindliche, konservierte, 300 Aminosäuren große RHD, ist verantwortlich für die Dimerisierung der Monomere, Interaktionen mit IκB und die Bindung an die DNA. Sie enthält die Nuclear localization sequence (NLS, Kerntranslokationssequenz), die für die Translokation der NF-κB-Dimere aus dem Zytoplasma in den Zellkern sorgt. RelA, RelB und c-Rel, die drei Mitglieder der Rel-Familie, weisen zudem eine "Transactivation domain" (TAD) auf, die am C-terminalen Ende der Proteine lokalisiert und nötig für deren Transaktivierung ist [53]. Diese TADs fördern die Transkription, indem sie die Rekrutierung von Koaktivatoren und die Verdrängung von Repressoren erleichtern.

Die beiden Mitglieder der NF-κB-Familie, NF-κB1 (p105/p50) und NF-κB2 (p100/p52), lassen sich sowohl zur NF-κB- als auch IκB-Familie zählen. Als Vorläuferproteine p105 und p100 besitzen sie neben der für NF-κB typischen RHD ein C-terminales Ende, das eine Glycine-rich region (GRR), sieben Ankyrin-repeats (AR), eine Death domain (DD) sowie eine PEST-Sequenz, enthält. Die GRR ist das Stop-Signal für die Proteolyse der Vorläuferproteine zu den NF-κB-Monomeren. Bei p105 befindet sie sich zwischen den Aminosäuren 376 und 404. Die AR können an die RHD von anderen NF-κB-Monomeren

binden. Unter der PEST-Sequenz versteht man einen Proteinbereich, der reich ist an Prolin (P), Glutamat (E), Serin (S) und Threonin (T).

Generell kann gesagt werden, dass alle NF-κB-Monomere untereinander dimerisieren können. Dies kann als Homodimer, aber auch als Heterodimer geschehen. Eine Ausnahme bildet dabei RelB, welches lediglich mit p50 und p52 Heterodimere bilden kann [55]. Das erste beschriebene Dimer bestand aus RelA und p50. Diese Verbindung, die durch Heterodimerisierung entsteht, wird auch heute noch als Hauptkomplex angesehen. Andere NF-κB-Dimere können aber auch, in Abhängigkeit vom Zelltyp, ebenfalls in signifikanten Mengen detektiert werden.

Die Mitglieder der Rel-Familie werden, im Gegensatz zu denen der NF-κB-Familie, nicht als Vorläuferproteine synthetisiert. NF-κB1 und NF-κB2 haben eine Zwitterfunktion, da ihre Vorläuferproteine p105 und p100 genauso wie IκB als NF-κB-Inhibitoren fungieren.

1.4.2 Mitglieder der IκκκκB-Familie

Heute sind sieben Mitglieder der Inhibitor of NF-κB (IκB)-Familie bekannt. Dazu zählen IκB-α, IκB-β, IκB-ε, IκB-γ und Bcl-3 (B-cell-leukemia-3 antigen) (Abb. 1-5) sowie die beiden NF-κB1 und NF-κB2 Vorläuferproteine p105 und p100 (Abb. 1-4).

Ihnen allen gemein ist eine Ankyrin-Domäne mit fünf bis sieben Ankyrin-Repeats, die sich zu einem verlängerten Zylinder zusammensetzen und zur Bindung an die RHD von NF-κB befähigt sind. Durch diese Bindung bilden sie einen ternären Komplex mit dem NF-κ B-Dimer, und halten es im Zytoplasma zurück. Zudem weist IκB-α, jedoch kein anderes Mitglied der IκB-Familie, am C-terminalen Ende (Aminosäuren 265 bis 277) ein Nuclear export signal (NES) auf [56]. Dieses NES ist dafür verantwortlich, dass NF-κB:IκB-α -Komplexe aus dem Kernkompartiment zurück in das Zytoplasma exportiert werden können.

Somit fallen den IκB gleich mehrere Aufgaben zu. Zum einen bewirken sie durch die Bindung an NF-κB, dass dieses im Zytoplasma der Zelle zurückgehalten wird. Des Weiteren inhibieren sie durch diese Bindung die DNA-Bindungsfähigkeit der NF-κB-Dimere. Sie sorgen durch eine starke NES für den Rücktransport des Transkriptionsfaktors aus dem Zellkern in das Zytoplasma. Daher wird den IκB eine wichtige Rolle in der Regulierung des NF-κB-Signaltransduktionsweges zugeschrieben.

Abb. 1-5:

Mitglieder der IκB-Familie.

PEST – Proteinbereich, der reich ist an Prolin (P), Glutamat (E), Serin (S) und Threonin (T) // K(Zahl) – Lysin-Reste // S(Zahl) – Serin-Reste.

Die Anzahl der Aminosäuren je Protein sind rechts angegeben. Erstellt nach [53].

Damit NF-κB in den Kern translozieren kann, muss sein Inhibitor IκB zuvor abgebaut werden. Dies geschieht in zwei Schritten. Zuerst werden bestimmte Serin-Reste durch den IκB Kinase Komplex (IKK, 1.4.3) phosphoryliert. Anschließend werden ein bis zwei Lysin-Reste durch den SCFβTrCP (Skp1/Cul1/F-box; β-Transducin repeat-containing Protein) Ubiquitin E3 Ligase Komplex ubiquitiniert, wodurch das nunmehr markierte IκB als Substrat für das 26S Proteasom zur Verfügung steht, von dem es dann degradiert wird (siehe auch Abbildung 1-8).

IκB-α wird an Ser32 und Ser36, IκB-β an Ser19 und Ser23, IκB-ε an Ser18 und Ser22 phosphoryliert. Die Ubiquitinierung erfolgt bei IκB-α an Lys21 und Lys22, bei IκB-β und IκB-ε jeweils an Lys6.

NF-κB1/p50 und NF-κB2/p52 entstehen durch Prozessierung ihrer Vorläuferproteine p105 und p100. Unter der Prozessierung versteht man die partielle Proteolyse durch das Proteasom. Dazu werden die Serin-Reste der PEST-Sequenzen phosphoryliert und der Lysin-Rest von p100 ubiquitiniert. Bei p105 sind dies Ser923, Ser927 und Ser932 und bei p100 Ser865 und Ser869 sowie Lys855.

1.4.3 Mitglieder der IκκκκB Kinase (IKK)-Familie

Zur Familie der IκB Kinasen zählt man heute drei Mitglieder, welche in der Regel einen 700 bis 900 kDa großen Komplex bilden. Dabei stellen die Serin/Threonin-Kinasen IKK-α (IKK1) und β (IKK2) die katalytischen Untereinheiten dar, wohingegen IKK-γ/NEMO (NF-κB essential modifier) als regulatorische Untereinheit fungiert [57]. IKK-α (85 kDa) und IKK-β (87 kDa) können sowohl Homo- als auch natürlicherweise Heterodimere bilden. Die Dimerisierung ist abhängig von der Leucine zipper (LZ) Domäne, die auch für die Kinase-Aktivität benötigt wird [58]. Ihre Bindung an IKK-γ/NEMO (48 kDa) geschieht durch eine am C-terminalen Ende angeordnete Hexapeptid-Sequenz (Leu-Asp-Trp-Ser-Trp-Leu) welche daher die Bezeichnung Nemo binding domain (NBD) erhielt. Neben der NBD weisen sie ebenfalls am C-terminalen Ende eine Helix-loop-helix (HLH) Domäne auf. Diese HLH wird für eine voll ausgeprägte Kinaseaktivität benötigt. Daneben ist sie aber auch an der "Down"-Regulierung der Kinaseaktivität beteiligt. Die eigentliche Kinase Domain befindet sich am N-Terminus. Sie wird durch Phosphorylierung an jeweils zwei Serin-Resten (IKK-α: Ser176 und Ser180; IKK-β: Ser177 und Ser181) aktiviert. Die Bindung von IKK-γ/NEMO an IKK-α/-β benötigt die Aminosäuren-Reste 135 bis 231, welche in der ersten Coiled-coil (CC1) Domäne lokalisiert sind [53].

Abb. 1-6:

Mitglieder der IκB Kinasen-Familie.

α – α-Helical domain // CC1/2 – Coiled-Coil Domain // HLH – Helix-loop-helix domain // LZ – Leucine zipper // NBD – Nemo binding domain // Z – Zink finger domain

K(Zahl) – Lysin-Reste // S(Zahl) – Serin-Reste.

Die Anzahl der Aminosäuren je Protein sind rechts angegeben. Erstellt nach [53].

Untersuchungen zeigten, dass IKK-α und IKK-β unterschiedliche Präferenzen zur Iκ B-Phosphorylierung aufweisen. So ist IKK-α in der Lage, IκB-α direkt und spezifisch an den Serin-Resten 32 und 36 zu phosphorylieren, wohingegen IκB-β nicht mit der gleichen Effektivität an seinen beiden Serin-Resten 19 und 23 phosphoryliert wird (Ser23 wird gegenüber Ser19 der Vorzug gegeben) [59]. IKK-β phosphoryliert IκB-α und IκB-β in gleichem Maß an ihren Serin-Resten [58].

Von besonderer Wichtigkeit sind mögliche Interaktionspartner auf- und abwärts des IKK-Komplexes, da durch sie die Verbindungen zu aktivierenden Rezeptor/Liganden-Bindungen und den IκB vermittelt werden. Das Augenmerk sei dabei auf die NF-κB-inducing kinase (NIK) gelegt, da sie zum einen ein Interaktionspartner von IKK-α [59] und/oder IKK-β ist, und zum anderen anscheinend eine Verbindung zwischen Tumor-Nekrose-Faktor- und Interleukin-1-Signaltransduktionsweg darstellt [60]. NIK weist Homologien zur Familie der MAP3K (MAP kinase kinase kinase) auf und wurde durch Interaktion mit TRAF2 (TNF-Receptor-associated factor 2) identifiziert [60, 61]. Spätere Untersuchungen mit verschiedenen Zellarten einer NIK-deletierten Maus zeigten jedoch, dass die NF-κB-DNA-Bindungsaktivität nach Behandlung dieser NIK-null Zellen mit TNF-α oder IL-1 und LPS genauso stark war wie die der NIK-Wildtyp Maus. Diese Ergebnisse belegen, dass NIK anscheinend weder im TNF-α- noch im IL-1- und LPS-Weg zwingend benötigt wird, um eine NF-κB-Aktivierung zu initiieren. Die Rolle, die NIK in diesen NF-κB-Aktivierungswegen innehat, bleibt kontrovers. Gesichert scheint jedoch, dass NIK im alternativen NF-κB-Signaltransduktionsweg (siehe dafür 1.4.5.3) über den LT-β-Rezeptor IKK-α aktiviert [62].

IKK-α kann direkt mit NIK und IκB-α interagieren. Interagiert IKK-β mit NIK, so ist diese Bindung schwächer als diejenige zwischen IKK-α und NIK [59]. IKK-α weist eine höhere Affinität zu NIK auf als IKK-β, wobei IKK-β jedoch die effizientere IκB-Kinase ist. Im Gegenzug dazu ist IKK-α aber die effizientere p100-Kinase (siehe auch 1.4.5.3). Im Endeffekt scheint es jedoch, dass NIK auch mit dem IKK-α/IKK-β-Heterodimer in Verbindung tritt [58]. Des Weiteren kann NIK direkt an IκB-α binden, wodurch dieses an Ser32/36 phosphoryliert wird [59].